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Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie
Filière : Sciences biologiques
Master I
Biotechnologies et valorisation des plantes
COURS : Marqueurs moléculaires
Enseignante: Mme Rahmouni M.
ANNÉE UNIVERSITAIRE : 2020/2021
La réaction de polymérisation en chaine (PCR)
Définition
La PCR, ou réaction de polymérisation en chaine, permet de répliquer artificiellement un
morceau d’ADN in vitro, sans clonage. C’est une méthode strictement enzymatique, très
efficace, basée sur l’utilisation d’une enzyme présente dans les cellules, l’ADN polymérase :
elle assemble les nucléotides selon le « modèle » fournit par un brin : elle synthétise le brin
complémentaire.
1ere
étape : on sépare les deux brins de la molécule d’ADN à multiplier. Une augmentation de
température (95C°) permet cette séparation. Donc les deux brins sont séparés c’est la
dénaturation.
2eme
étape (hybridation des amorces) elle se déroule a une température située entre 40C° et
65C°: Des amorces, courtes séquences de nucléotides complémentaires des extrémités des
brins d’ADN sont ajoutées : ces petits poly nucléotides sont nécessaire au démarrage de la
synthèse par la polymérase. Les amorces se lient, par complémentarité des bases, aux
extrémités des brins. Cette technique suppose donc que l’on connaisse la séquence des
nucléotides des extrémités du morceau d’ADN à multiplier (pour pouvoir fabriquer les
amorces).
3eme
étape : L’élongation (72°C)
La polymérase et des nucléotides (synthétisées artificiellement selon les procédés de la
chimie organique) sont ajoutés. Dans le milieu placé à la température de 72°C (température
optimale pour l’activité de la polymérase) les nucléotides libres sont assemblés à partir des
amorces, sur toute la longueur des brins d’ADN : à partir d’une molécule d’ADN on en
obtient donc deux molécules d’ADN rigoureusement identiques. On peut enchainer les cycles
de copies : en 10 cycles on obtient plus de 1000 exemplaires de l’ADN à multiplier, et en 20
cycles on obtient 1million !
UTILISATION DE LA PCR
-Les applications de la PCR sont multiples. C’est une technique désormais incontournable en
biologie cellulaire et moléculaire.
-Elle permet notamment en quelques heures le « clonage acellulaire » d’un fragment d’ADN
grâce à un système automatisé, alors qu’il faut plusieurs jours avec les techniques standard de
clonage moléculaire.
D’autre part, la PCR est largement utilisée à des fins de diagnostic pour détecter la présence
d’une séquence d’ADN spécifique de tel ou tel organisme dans un fluide biologique.
Elle est aussi employée pour réaliser des empreintes génétiques, qu’il s’agisse de
l’identification génétique d’une personne dans le cadre d’une enquête judiciaire, ou de
l’identification de variétés animales, végétales ou microbiennes destinée à des tests de qualité
alimentaire, de diagnostic ou de sélection variétale.
La PCR est encore indispensable à la réalisation d’un séquençage ou d’une mutagénèse
dirigée
La multiplication des fragments d’ADN par clonage
L’étude d’un gène nécessite de disposer de celui-ci en morceaux exemplaires : Les
scientifiques disposent de deux méthodes pour multiplier les fragments d’ADN « à volonté ».
Le clonage des gènes par manipulation génétique
Cette technique consiste à introduire le morceau d’ADN que l’on veut multiplier dans une
cellule ou il va être répliqué.
Les cellules cultivées pour le clonage des gènes sont principalement les cellules procaryotes
(bactéries) mais certaines cellules eucaryotes permettent également de le faire (cellules de
levures par exemple).
Le clonage d’un gène dans une cellule nécessite un vecteur de clonage, c’est-à-dire une
« structure » qui va contenir l’ADN à cloner et l’introduire dans la cellule ou il sera répliqué.
Ces vecteurs sont fréquemment des plasmides, petites molécules d’ADN circulaires présentes
dans certaines bactéries (dans les cellules de levure il y en a également), qui se répliquent de
façon indépendante du chromosome unique de la cellule procaryote. Les plasmides pénètrent
naturellement dans cellules avec une fréquence de 1pour 106, fréquence que l’on sait
augmenter artificiellement.
Les techniques actuelles permettent également de fabriquer différents vecteurs de clonage
artificiels : cosmides, chromosomes artificiels (appelés YAC et BAC), ils ont l’intérêt de
pouvoir véhiculer de plus gros morceaux d’ADN que les vecteurs naturels
L’intégration du morceau d’ADN à cloner dans un vecteur fait intervenir une enzyme de
restriction qui ouvre le vecteur : on utilise la même enzyme que celle qui a permis d’obtenir le
fragment d’ADN à cloner : ainsi ils possèdent les mêmes extrémités cohésives. L’intervention
d’une ligase (enzyme) permet de lier ces extrémités qui son complémentaires : le morceau
d’ADN que l’on veut multiplier est ainsi intégré dans le vecteur.
La création d’un plasmide recombiné (voir schéma)
Le vecteur recombiné pénètre dans le cellule ou il se multiplie. Lorsque le vecteur de clonage
est un plasmide ou un vecteur artificiels, les cellules ou il pénètre vont-elles mêmes se diviser
et aboutir à la formation de clones de cellules (populations de cellules génétiquement
identiques).
Les types de clonage
Le clonage moléculaire : on prend des parties de l’ADN qui contiennent des gènes on les
duplique dans un milieu bactérien.
On utilise cette technique en génétique thérapeutique pour mettre au point des vaccins des
drogues et des tests génétique.
Le clonage cellulaire : on fait plusieurs exemplaires de la même cellule pour pouvoifaire des
recherches médicales.
Le clonage reproductif
Les vecteurs de clonage
1- Les plasmides: Petites molécules circulaires D’ADN capables de répliquer leur ADN
Indépendamment du chromosome bactérien. Servent à cloner des fragments d’au plus 30 kb.
2- Les vecteurs viraux: Offrent de nombreux Avantages pour le clonage et les applications
Des gènes clonés qui en découlent. Comme L’efficacité d’infection des virus est élevée, le
Gène cloné peut être introduit dans une cellule À une fréquence élevée. Servent à cloner des
Fragments de tailles définies.
3- Les cosmides: Vecteurs hybrides de phages Lambda et de plasmides. Leur ADN peut se
Répliquer dans la cellule comme celui d’un Plasmide et être empaqueté comme celui d’un
Phage. Servent à cloner des fragments d’au Plus 45 kb.
4 -Les vecteurs à large capacité: Permettent-le Clonage de larges fragments (maximum de
300 kb pour les BAC et de 400 kb pour les YAC). BAC: «Bactériale artificiel chromosome» ;
et YAC: «Yeast artificiel chromosome».
L’utilisation des Sondes moléculaires
Lorsque parmi de nombreux fragments d’ADN différents on souhaite en trouver un précis, on
utilise une sonde moléculaire pour le rechercher. Il s’agit d’une molécule d’ARNm ou d’un
brin d’ADN, complémentaire du fragment recherché. Cette molécule va servir
« d’hameçon » : mise en présence du morceau recherché, elle « s’accroche » à lui. La sonde
et le fragment recherché se lient par complémentarité des leurs bases azotées. On dit qu’il ya
hybridation moléculaires.
Cette technique ne permet de parvenir au but que si on a pris soin de marquer la sonde (sonde
radioactive ou fluorescente) afin de la rendre repérable, une fois qu’elle est hybridée avec le
morceau recherché. Il faut également avoir auparavant séparé les deux brins des fragments
d’ADN sur lesquels on mène la recherche (cela s’obtient par chauffage) pour que
l’hybridation soit possible.
La sonde utilisée est morceau d’ADN de structure connue : soit une copie d’un gène,
dénaturée de façon à séparer les deux brins, soit un brin d’ADN synthétisé à partir d’un
ARNm. Dans ce cas on utilise une enzyme, la transcriptase-inverse, qui réalise le processus
inverse de la transcription ( la transcription est la première étape de la synthèse des protéine
consistant à synthétiser un ARNm complémentaire des bases azotées d’un des deux brins). La
sonde peut également être un ARNm.
Il s’agit d’une technique d’hybridation ADN/ADN qui porte le nom de son inventaire
(Southern). Elle peut être résumée comme suit :
L’ADN est soumis à l’action d’enzymes de restriction
Une électrophorèse permet de séparer les fragments de restriction.
Les fragments d’ADN sont dénaturés, c’est-à-dire leurs deux brins séparés, puis les
deux brins d’ADN sont transférés sur un filtre de nitrocellulose : ce filtre devient une
empreinte (« blot ») du gel, les positions des brins d’ADN sont conservées.
Le filtre est immergé dans une solution contenant la sonde radioactive. L’hybridation a
lieu : la sonde se lie aux brins d’ADN complémentaire, le filtre est ensuite rincé pour
éliminer les sondes hybridées.
Le filtre est soumis à l’autoradiographie : seuls les emplacements ayant fixé la sonde
radioactive sont révélés : ils indiquent la présence du morceau d’ADN recherché
(bande noire). Les autres fragments d’ADN ne sont pas visibles.
Le séquençage des gènes
Le séquençage des gènes consiste à déterminer la séquence des nucléotides qui les
constituent. C’est une étape majeure dans la connaissance du génome. Il n’existe aucune
méthode directe de détermination de la séquence des nucléotides, mais aujourd’hui de
nombreuses manipulations nécessaires au séquençage. La méthode la plus pratiquée
aujourd’hui dans les laboratoires a été mise au point par Fred Sanger. Elle consiste à
interrompre la synthèse du brin d’ADN complémentaire à celui que l’on veut séquencer.
Le fragment d’ADN à séquencer doit être disponible en grande quantité (clonage ou PCR) et
les deux brins doivent être séparés. Ces brins sont placés en présence d’amorces qui
s’hybrident avec une des extrémités et qui permettront d’initier la synthèse du brin
complémentaire, puis repartis en quatre lots.
Chacun des lots reçois de l’ADN polymérase, des nucléotides (nucléotides à thymine, à
adénine, à guanine et à cytosine) ainsi qu’une certaine quantité d’un nucléotide modifié de
telle sorte qu’une fois incorporé dans l’ADN il empêchera la synthèse de ce brin de se
poursuivre (les nucléotides modifiés inhibent la synthèse d’ADN). Un des lots reçoit des
nucléotides modifiés à adénine, l’autre à cytosine, le troisième à guanine et le quatrième à
thymine. Dans ces conditions qui ressemblent à celles de la PCR, la synthèse du second brin
d’ADN a lieu : l’ADN polymérase incorpore les nucléotides, mais lorsqu’elle incorpore un
nucléotide modifié, la synthèse s’arrête.
Ainsi dans chaque lot il ya des molécules d’ADN qui n’ont pas toutes la même taille puisque
l’incorporation du nucléotide modifié est aléatoire et peut avoir lieu en n’importe quel endroit
du brin devant comporter ce nucléotide. En revanche, toutes les molécules se terminent par la
même base azotée (celle présente dans le nucléotide modifié).
Une électrophorèse permet de séparer les fragments d’ADN synthétisés en fonction de leur
taille. Les fragments des quatre lots sont sépares sur le même gel. Ils sont révélés par
autoradiographie si on a, avant le début des opérations marqué le brin qui sert de « matrice »,
ou l’amorce, ou un des quatre types de nucléotides au 32
P. Le plus souvent maintenant, ils sont
révélés par fluorescence : on peut en effet donner une couleur de fluorescence différente à
chaque nucléotide modifié. Il suffit donc d’observer la succession des couleurs sur le gel
d’électrophorèse, en allant du fragment le plus petit vers les plus longs, pour connaitre la
séquence des nucléotides du brin que l’on a séquencé. Actuellement cette opération est
automatisée : des machines sont capables de détecter les couleurs et d’afficher sur écran la
séquence des nucléotides correspondante.
Illustration de la technique de séquençage de l’ADN par la méthode Sanger
Imaginons que nous voulons séquencer le brin d’ADN suivant : GGTTGACATAGCA
Nous utilisons l’amorce CCAA
.Brin à séquencer, après hybridation avec une amorce : GGTTGACATAGCA
CCAA
Dans les quatre lots, la synthèse du brin complémentaire du brin à séquencer a lieu mais de
temps en temps c’est un nucléotide modifié (noté en gras) qui est incorporé, ce qui stoppe la
synthèse. Dans les différents lots on a donc des brins de tailles variables selon l’endroit ou un
nucléotide modifié a été intégré.
Lot contenant des
nucléotides modifiés à
thymine
Lot contenant des
nucléotides modifiés
à cytosine
Lot contenant des
nucléotides modifiés à
guanine
Lot contenant des
nucléotides modifiés à
adénine
6 CCAACT 5 CCAAC 7 CCAACTG 9 CCAACTGTA
8 CCAACTGT 11 CCAACTGTATC 12 CCAACTGTATCG
10 CCAACTGTAT
10 CCAACTGTATCGT
Le résultat de l’électrophorèse de ces brins donnerait un résultat que l’on peut schématiser
comme ci-dessous et qui permet de déduire la séquence des nucléotides indiquée à droite.
Le brin que l’on a séquencé est complémentaire du brin synthétisé, sa séquence de nucléotide
est donc la suivante (en oubliant pas l’amorce) : GGTTGACATAGCA
Le séquenceur automatique détecte et interprète les colorants fluorescents : les emplacements
de la guanine figurent en jaune ceux de la cytosine en bleu, l’adénine en vert et la thymine en
rouge.
