ANALYTICA CHIMICA ACTA 369

DOSAGE POLAROGRAPHIQUE DE LA TY ROSINE, DU TRYPTOPHANE ET DE LA PHtiNYLALANINE EN PRl%ENCE

LES UNS DES AUTRES

D MONNIER, J. VOGEL ET P.-E WENGER

Laborutosre de Chttrtc Mirrirale, dc Chtmre amafyl;qrre cl de M~crochrmte, Unaverstld, GenBve(Suasse)

(Requ Ic xg octobre xgsg)

Nous avons proposd dans diverses publicationsl, des mCthodes de dosage poluo- graphique de ces trois acides amin6. Ccs demiers se nitrent facilement, g l’encontre de la plupart des autres et les d&iv& que l’on obtient donnent des sauts polaro- graphiques parfaitement dessinQ dont le potentiel E, est touJours infCrieur B I V. Darts ce travail, pour rendre la methode encore plus spCcifique, nous avons cherchd B doser chacun d’eux en pr&ence des deux autres. La plupart des autres acides amin& ne se nitrent pas dans ces conditions et par consCquent ne gCnent pas. Dans chaque cas nous donnerons la pr&ision et la sensibilitd de la methode.

I. Dosage de la tyrosine en pre’sence de tvyPto$hane et de phknylalaninc

La tyrosine traitCe par l’acide nitrique o.rg N, A l’e%ullition pendant 2 h, donne un d&M nitrC qui se rCduit sur la goutte de mercure et donne un polarogramme dont le E+ vaut 0.64 V et dont la hauteur est, dans des limites d&ermin&s, rigoureuse- ment proportionnelle Q la concentration. La pr&ence de d&iv& sulfur& de la forme -SH (cystdine) de m*me que celle du tryptophane rend la nitration impossible dans les conditions in&q&es. Tous les essais que nous avons effect&s pour induire la r&action de nitration, sans augmenter la concentration d’acide nitrlque sont rest& va.ins. L’addition d’un cristal de nitrite de sodium provoque bien une rCaction mais les sauts polarographiques qui en rQultent ne correspondent plus B la concentration de tyrosine. Une sCparation s’av&re done indispensable. Or il se trouve que l’acdtate de mercure precipite l’un et l’autre de ces deu?r; compos&. Cette rCaction est lente mais quantitative, les produits de solubilit@ &ant t&s faibles; la mdthode s’applique aussi au dosage de tr&s petites qua.ntitCs de tyrosine. Pour ac&l&er la prbcipltation, il est bon de travaAler A. 50-60”, ce qui a l’avantage de donner un prCcipit& plus ais&ment filtrable. Les traces de mercure qui restent en solution ne g&lent pas la dCtermination. Une difficult& x pr&sente lorsque le prCcipitC tryptophane-mercure est trop abondant. En effet 11 adsorbe des quantitds non ndgligeables de tyrosine. C’est pourquoi nous proposons d’utiliser un back-carrier qui sera adsorb& A la place de la tyrosine. Nous avons montrC que la ph&nylalanine convient particuli&ement bien. car elle ne gene pas le dosage de la tyrosine, mdmc en grand exc&s et qu’elle est plus fortement adsorb& que cette derni&re sur le pr&ipit6 tryptophane-mercure. En effet nous avons pu montrer que la phhylalanine 6tait capable de remettrc en

L

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370 D. MONNIER, J. VOGEL, P.-E, WENGER

solution la tyrosine prealablement adsorb&e par le pr&ipitC. Nous avons done pro- cede de la faGon suivante:

Une solution contenant o.oxrg g de tyrosine et 0,080 6 de tryptophane a tfte divisCe en deux portions et la precipitation a &C faite. On a ensuite ajoute 0.070 g de phenyf- alanine dans l’une des solutions qui a 8t& chauff6e et bien agitee. Les polarogrammes effectues apres nitration ont montrd que Ia solutron ayant recu la phenylalanine donne un saut de 7% plus tSle& que la solution tdmoin, it semble done bien se produirc en prCsence de phCnylalanine une certaine rcmisc en libert6 de la tyrosine.

Nous avons cherche la quantite minimum de ph@nylalanine A ajouter a une solution renfermant des quantites d&ermmecs de tyrosine et de tryptophane, pour quc ce dermer ne g&c pas le dosage de la tyrosinc.

__-- T$+r0SS?:C 7 ~y~~~,hul~c

(mal ____

X0.8 80

IO.8 80

X0.8 80

10.8 80

Nous remarquons que la premike prise prBscnte un saut un peu faible, mais que les suivantes donnent par contre des hautcurs pratiquemcnt identiques. Ce resultat est parfaitement plausible, car les poids moldculaires de la pbCnylalanine et du tryptophanc &ant respectivement de 165.1g et 204.2, le rapport moltkulaire I/I

correspond B 64.7 mg de ph~nylalanine pour 80 mg de tryptophane. En dessous de cette llmrte, la quantittS de ph6nylalanine ne semble pas Ctre suffisante pour emp&her une certaine adsorption de la tyrosine.

MODE OPI?RATOIKE a, On place la prise contcnant environ IO ZI zo mg do tyrosmc dans un tube B centrrfugcr et on la dissout dans 30 ml d’acidc mtrlquc 0.x 5 N. On ajoutc B ccllc-ci unc quantitd dc plidnylalanmc corrcspondant aux 3/4 au moins du ponds de trytophanc Si cehn-cl n’cst pas connu, mcttrc un bon cxces (on peut controlcr on cffcctuant lcs mdmcs opbrationu sw unc pr~sc parall&lc contenant davantage dc phdnylalanmc) Trddrr ?A 50-60” pour facilitcr la muse en solution.

b, hjoutcr une quantrte do aolutron d’acdtatc mcrcuriquc (8 2% dans l’acide nrtrlquc 0.~5 N) tolle, qyc la solution dcvmnne totalcmcnt opaque au moment de l’adjonctton, plus un pctrt cx&s do 0.5 ml environ.

c Placer les tubes & ccntrifugcr dans un b&her d’cau mamtenue it environ Go0 et larsser reposer ains; B chaud pendant uno & deux heurcs

d. Ccntrafuger envrron r/q d’heurc et, SI nbct%airc, filtrcr sur double frltrc pour cnlevcr le dernicr trouble dventuel. Transvascr dans un cylindrc gradud ou clans un flacon jaugd Pour amencr h un volume connu ct. prdlevcr unc partic aliquote de cctte solutron (20 ou 35 ml).

c. Placer cette prrso dans un erlcnmoyer rode avec rdfrrgdrant a rcflux ct ajoutcr 20 ml d’acidc nitrique 0.15 N amsr quo quclqucs cristaux de mtrrtc dc sodrum. Porter h dbullitron durant dcux hcures, puis rcfrordrr sous l’cau courantc.

f. Ncutraltscr ensuito par I’hydroxydc clo potassrum h, ZOO/~ en controlant au moyen dc papicr indicateur universe1 Placer dans un flacon jaugd do 50 ml ct compldter par de l’cau brdlstillde.

g. Prdlevcr 5 B 7 ml do cottc solution, ajoutcr 2 ml de solution tampon dc pH 5* et compl&cr B xo ml. Chasser l’oxyg&na et polarographmr B. la sensibilitd convonable.

On cffectue les mknes opkatrons sur une pnse B laquellc on a ajoutt une quantitd connue de tyrosinc tdmoin (&talon interne) .

* 51.5 ml do Na2HPO4 0.2 M + 48.5 ml d’acrdc citrlquc o I N.

Anal. Clltm. Acta, 22 (x960) 369383

POLAROGRAPHIE DESACIDES AXINl?S 371

Des essais de controle ont et& faits et les r6sultats suivants ont CtC enregistrQ au moyen d’un polarographe Sargent XXI et h la sensibilite de 0.080 /LA/mm.

93 - 80 60 5.76 93 44 80 60 8-43 > 95

16 2 - 50 40 10-58 162

52 50 40 14-01 > rG05

APPLICATIONS

Dosrcgc do la fyrosiw dam l’nlbrmrittc drc saparg

Nous avons dose la tyrosmc sans hydrolyse prealable de l’albuminc, afin d’obtcnir la teneur en tyrosine ,,hbre”, puis nous avons cffectue la mCme determination sur la tyrosine li& aus chamcs peptldiqucs. Dans ce dernier cas, elk cst lib&& par l’uu dcs pro&d& d’hydrolyse classiquc.

On utrlisc prrncipalement lc trartement par ebullition B reflux en pnkence d’hydro- xydc de sodium. d’hydrosyde de potassium ou d’acide sulfurique avcc adjonction dventuellc de certains sels mintkaux tcls que le chlorure d’etain.

La littkature donncles chiffres suwants, concernant les divers proc@dds d’hydrolyse: Traitcments et pertes moyennes indiqu&es par lcs autcurs: BLOCK ET BOLLINC (1943) ?. Trartemcnt par NaOH 5 N; Dur6e 5 h; TcmpCrature

entre 1x5 et 1~5'; Pertes de tyrosine: II H x7:4,. LUGC (193S)“: NaOH 5 N ; Dur&z de zo a 30 h , ‘I’cmp@raturc xoo” ; Perks nullcs

de tyrosine. JOHPS (x932)2: NaOH 5 1V; DurCe dc 14 & 18 11; Temperature 100’; Per&s de

tyrosinc = 0 t go/& La major-it6 dcs auteurs considkent I’hydrolysc alcaiine par l’hydroxyde sodium,

eventueilenrent l’hydrosyde de potassium, comme Ctant la meilleure pour le dosage de la tyrosine. Nous conformant h cette mani&re de voir, nous avons appliqu6 la m&hode de BOLLING ET BLOCK. C'est la meilleure bien que la tyrosine ne soit pas entikement lib&Ce. L’erreur due aux pertes se maintient dans une limite raisonnable. ce qui permet l’utilisation d’un facteur correctif (x.18) determind sur un grand nombrc d’analyses. La duree de ce traitement n’est pas e?cag&6e.

Q. Dosage de ta Lyrosine lotale. Une prose d’albumme d’environ 30 mg est placCe dans un erlenmeyer rodd en prkence de 20 ml d’hydroxyde de sodium 5 N. On chauffe h reflus entre 1x5 et ~5~ pendant 5 h au moyen d’un bain d’huile ou sur une plaque chauffante Clectrique.

AprGs refroidissement, on neutralise par de l’actde nitrique concentrd et transvase d‘ans un cylindre grad&. On ajoute ensurte une quantlte d’acide nitrique telle que la concentration finale de l’aclde soit de 0.15 N. (Cl est inutrle de faire cette acidifica- tion avec grande prbcision, les essais ont montrC que de petits &arts n'influencent

pasla hauteur des vagues polarographiques).

On place B nouveau la Solution dansI'erlenmeyer rod& et,on fait bouillir a reflux -

And. Ghim. Acta, 22 (1960) 369-383

372 I). MONNIER, J. VOGEL, P.-E. WENGER

durant deux heures. Les essais qualitatifs preliminaires ont montre qu’il ne se produit aucune precipitation en presence d’acetate mercurique, il a done Cte inutile dans ce cas, d’utiliser ce reactif.

Apr&s refroidissement, on Porte la solution au volume de 50 ml dans un flacon jauge, on cn prCl&ve 7 ml auxquels on ajoute z ml de la solution tampon de PH 5

et on compl&te & IO ml. On polarographic aprt% avoir chassC l’oxygene. On pro&de de man&e analogue avec des prises contenant une quantitb connue

de tyrosine pure servant d’btalonnage interne. Nous avons cnrcgistrd les valeurs suivantes:

TABLEAU III

28 - 0 G2 28 8.0 5 s2 > 1 24 4.4

23 - 23 70

- _. 0 58 4 90 > 0 98s 4*3

----_ ----- ------ Lcs chrffrcs clc la colonnc 4 ont dtd calculds en tenant comptc du factcur corrcctlf 1.18. Lcs clnffrcs clc la colonnc 5 indqucnt la tcncur dc l’albummc cn tyrosmc

La qualitd des sauts est t&s bonne et il est possible de travailler h une sensibilitd encore plus grande que celle de o.ogo/dA/mm qui a CtC utilisee, ce qui facilite la mesure des hauteurs.

b. Dosage de la tyvosine Zibre. Comme il a et& dit plus haut, nous avons fait paralkle- ment un essai de nitration sur l’albumine non hydrolysec, de man&e 5 obtenir une courbe comparative. Nous constatons que dans ce cas, il ne SC produit pratiquement pas de saut. Seule une faible vague, a peine dcssinee, marque l’emplacement du saut de la tyrosine. Cette ldgere ondulation, parfaitement reproductible, est t&s probable- ment due h une petite quantitd de tyrosine rendue libre par une faiblc hydrolyse lors de la preparation de l’albumine.

Retnnrq~re: Les valeurs que nous avons obtenues pour la teneur de l’albuminc cn tyrosine sont en accord avec celle clue l’on peut trouver dans la litterature.

(Documcnta Geigy, Tables scientifiques3 = 4.66% ; I~LOCK ET BOLLING~ = cntre 3.9 et 7.3%; D. E. DUGGAN ET S. UNDENPHIEND~ = 5.5% pour l’albumine de sang de bovides).

Ces cssais nous ont permis de contrdler l’application de la methode de dosage h un melange complexe, en Bprouvant la technique operatoire. Pour les mesures quantita- tives rigoureuses, nous utiliserons un produit de synthese dont la cornposition est exactement connue.

Dosage de la tyrosine dans la N-carbobenzoxy-S-bewzyl-L-cystdinyl-L-tyrosine Nous avons pro&de Q l’analyse d’un produit de synthke aimablement mis B notre

disposition par MM. BOISSONNAS et cd.6 dont la composition cst exactement connue. 11 s’agit de la N-carbobenzoxy-S-bcnzyl-L-cystbinyl-L-tyrosine ; la moldculc de ce compose peptidique a un poids de 508.57. La tyrosine s’y trouve done dans le rap- port 18x/508.6 = 0.356.

AtmC. Chzm. Ada, 22 (1960) 3Gg-383

POLAROGRAPHIE DES ACIDES AMINtiS 373

Les dosages ont CtC condults de la maniere suivante:

On effectue deux prises traitees de facon identique, saufoque l’une d’elle resoit une

quantitd Ctalon de tyrosine pure. On ajoute IO ml d’hydroxyde de sodium 5 N et on

chauffe pendant 5 ha environ 120~. Apres refroidissement, on neutralise par de l’acide

nitrique concentre, on amene B 25 ml dans un cylindre grad&, tout en ajoutant 2.5 ml

d’acide nitrique 1.5 N et I ml de solution d’acetate mercurique h 2% dans l’acide

nitrique 0.15 N. On transvase dans une Cprouvette h centrifuger et on centrifuge

jusqu’j, obtention d’une solution tout a fait limpide, ce qui ne necesslte d’ailleurs clue

quelques minutes. On d&ante soigneusement et on prCl&ve 20 ml clue l’on place dans

un erlenmeyer rode. On ajoute encore IO ml d’acide nitrique 0.15 N et un ou deux

cristaux de nitrite de sodium, puis on fait bouilhr B reflux durant 2 h. L’analyse se

terminc ensuite de la man&e habltuelle (voir page 2).

Les rCsultats suivants ont 6td obtenus:

TABLEAU IV

65 ’ 97 - 0 755 65 ’ 97 52 2.84

1 I 88 -4.6

65 ’ 97 - o 80 65 ’ 97 52 2 84 > 2 03 +3

8.9 2 70 - 0 91 89 ‘z 70 53 2 67 1 2 75 + 1.85

z.i: 1.67 ’ 67 59 - o-578 2 675 1 I 63 -2.5

Nous voyons d’aprb ces chiffres clue les &arts se maintiennent dans une limite raisonnable, compte tenu de la petitesse des prises, rendue nkessaire par la faible quantite de produit disponible.

II. Dosage du try~~ofihanc en PrEscnce de lyrosine et de plhylalanine

a. Dosage drr fryplo/hw.c sertl otc cn prt?sence de ph?nyla&anine. Le tryptophane ne

se nitre pas avec I’acide nitrique 0.15 N utilisC pour le dosage cle la tyrosine. Par

contre l’acide x.5 N donne un compose quI se reduit au polarographe au PH 5, comme

dans le cas de la tyrosine. Les sauts sont parfaitement reproductibles et bien dessines.

La phCnyIalanine ne gkne en aucune faqon ; il faut, pour la nitrer, des conditions

beaucoup plus Cnergiques.

La vague du tryptophane, au ~II 5, se situe dans le voisinage de celle de la tyrosinc ?I 0.75 V (par rapport ?L la surface mercure/solution). Le mode operatoire est sernblable

a celui mis cn oeuvre pour le dosage de la tyrosine: On utilise 40 ml d’acide nitriquc 1.5 N pour une prise de l’ordre de IO A 30 mg de

tryptophane. On nitre par ebullition & reflux durant deux heures. On neutralise par l’hydroxyde de potassium a 20%.

On am&.ne B 50 ml. On prCl&ve une partie aliquote que l’on additronne de solution tampon de pH 5 (phosphate disodique/acide citrique). On polarographie cette solution.

Les valeurs suivantes ont CM obtenues en travaillant a la sensibilitd de o.o~o~A/~nm.

Anal. Chrim. Ada, 22 (1960) 369-383

374 D. MONNIER, J. VOGEL, P.-E. WENGER

TABLEAU v

II 0 77 5 68 13 55 15.2 106.4 744 =4 3 19.3 135 = 9 12 14 8 22 4 ~56 8 IO 16 ~5.65

Xofc. La valcur dc I< cst rdgulibrcmcnt crolssantc car la droltc d’Gtalonnagc trade B l’aide dc ccs pomts ne passe pas tout B fait par I’ongmc.

Les rdsultats sont .idcntiqucs clue le tryptophanc soit ou non en prQence de ph&ylalaninc.

b. Dosage &c Iry/~lofilwzc en fir&znce dc lyvosine. Lc dosngc diffkentiel n’est pas possible, il y a Interaction de ces composCs au tours de la r6actlon qul fait quc lcs sauts polarogtaphiques nc sont ni rcproductibles, ni proportionncls aux conccntra- tions de ces composk L’augmcntation de la concentration de l’acide nitrique ne donne pas de rkultats rneilleurs. Nous avons tent6 de d6truire la tyrosme, plus scnsiblc quc le tryptophane j l’oxydation. On y parvient avec le permanganate dc potassium par exemplc, mais cet oxydant ddtruit partiellcment le tryptophanc, il n’cst par conskluent pas utilisable.

Ccci a d’autre part 6tG montrd dans la these dc R. GUEIINE” qui indique que le snut du tryptophanc est dimin& d’environ 70% (il est probable quc lc saut cst alors donnC par les produits r&ultant de l’oxydation). Nous avons pens6 pouvoir utlliser, pour cette destruction, l’oxyg8ne par barbotage dans la solution chaude. MCme apr&s plus d’unc hcure, il nous a dtb impossible de faire dlsparaitre le saut dc la tyrosine. L’emploi de l’eau oxygCnCe n’a pas don& de rkultat. En conclusion, ii ne nous a pas Bte possible de ddtruire la tyrosinc en prCsence de tryptophanc sans provoquer des intcrfkences.

Etant don& ces resultats, une sdparation s’imposait. Pour cela, nous avons utllisd 1’acCtate de mercure(I1) qui nous a dCjh perrnis d’Chminer l’effet gbnant du trypto- pliane (voir page I).

Comme il a 6% dit pr&Sdcmment, le prdcipitd tryptophane-mercure est insoluble dans l’aclde nitrique dilu6, mQme B chaud. Mais si on le met en suspension dans l’acide nitrique 1.5 AP et qu’on fasse bouillir A reflux, lc pr6cipit4 prend une teinte jaune plus foncee, puis se dissout en quelques minutes. On obtient finalement une solution jaunt tout h fait limpide dans laquelle on pcut doser le tryptophane. Des cssais quantitatifs, conduits avec soin, ont && entrepris sur des solutions de cet acide amine.

On place dans un tube h ccntnfuger l’khantillon de tryptophane, on le dissout dans l’acidc nitrique 0.15 N. On introduit une solution d’acdtate mercurique B 2% (dans NOSH 0.15 N) en quantit6 telle qu’il se produise presquc immddiatement une prkipitation jaune pfile opaque (un exc&i est sans importance). On place ensuite le tube & centrifuger dans un b&her d’eau chaude servant de bain-mark qu’on maintient B environ Go” pendant z h, de manike 5 obtenir une prkipitation totale.

L’addition d’une nouvelle quantit6 d’ac&ate mercurique ne doit plus provoquer de trouble, on s’assure ainsi que la prkipitation a dti: quantitative. Dans ces conditions,

Anal. Cktm. A da, 22 (rg6o) 369-383

POLAROGRAPHIE DES ACIDES AMINkS 375

la solution surnageante n’est pas colorCe en jaune et sa polarographie nc prtkcnte pas de saut, rnQme si on le Porte B Cbulhtion ZL reflux.

Le prCcipitC obtenu est centrifugd durant 5 B IO min jusqu’8 ce que la solution soit tout B fait limpide.

On l’introduit ensuite dans un erlenmeyer rodC en ajoutant 20 ml d’acide nitriquc 1.5 N et on fait bouillir h reflux durant 2 h. Apr&s refroidlssement, on neutralist par une solution d’hydroxyde de potassium & 20%. on transvase dans un flacon jau& pour compl&er B 50 ml par de l’eau bidistillde et on pr&l&ve 7 ml de cctte solution. La prise est addition&e de 3 ml de solution tempon de PH 5 (phosphate disodiquc- acide citrique), on en Climine l’oxyg2ne et on polarographie.

Nous donnons ci-dessous les valeurs obtcnues pour une s&k d’analyscs:

TABLEAU VI

7.2 72 12 6 126 :.z +Z 18.8 188 I* ‘4 -0.8 ‘Lx 7 217 130 0

- -m--m

On pettt voir d’apr&s le tableau ci-dessus que l’utihsation du prCcipit6 tryptophane- mercure(iI) comme moyen de Gparation se prkente de manike favorable.

Remarque .- Au cours de la mtration, le mercure qui a serw 8 la prdcipitation du tryptophane est lib&t& mals au moment de la neutralisation par l’hydroxyde de potassium, il prdcipite 2 nouveau de faGon pratiquement quantitative de sorte qu’il ne gene pas la d&termination potarographique.

c. Dosage du tvyptopkune en pve’sence de tyrosine et de pht%aylalunine. Nous allons donner maintenant le mode opkatoire d’un dosage du tryptophane en pr&ence de tyrosine et de ph&ylalanine.

La pr&ence de phG.nylaIanine ne nkessite aucune prdcaution spkclale lors des op&rations de dosage. Par contre. il est nkessaire que la skparation de la tyrosine soit faite avec grand soin.

MODE OPkRATOTRE

a. Placer la pose contenant de 5 S 30 mg de tryptophane et une quantiti sufflsantc de phdnyl- alarune (en ajouter st ndcessiure; voz mode opdratolrc page z) dans un tube B ccntrifugcr; y youtrr 20, B 30 ml d’acrde nrttlque o.r5 N. Dwsoudre par Mger chauffagc.

b. Lntroduve unc solutxon d’acbtate mezLurque ZL z’X (clans l’acide mtnque o rg IV) jusqu’h obtcntron d’un troubfc Jaune pUc opaque

c. Maintemr au barn--marm B enwroa 60~ pendant I B 3 h. de man&e B assurer unc prdcipltation compl&te.

d! Centnfuger le prklprt6 form& et ddcanter 1~. solution lorsque ccllc-ci, cst tout B fait hmpldc Effkctuer un lnvage au moyens d’aclde artrique o rg 1V (enwron 20 ml) en rcmettant lc pr&clpltB en suspension,, puw centrrfugcr 5 nouveau

e. placer le compo80 tryptophanc-mcrcure(II) dans un crlcnmeyer rod6 de IOO ml CII ajoutant 30 ml d!acide mtmque 2.5% N. Chauffer ZL Bbulhtion & rcflux durant 2 11.

f. Apr&s.tefroidisscment, neutraliser par Lkydroxydc de potasmum k zoO/” et cantniugcr lc ldger tcouble q,ui se forme.

g. CornplBter ii SoOmLpn.r de l’eau bl&USe, prelever .+?L 7 ml.que l’on am&ne B IO ml au moycn dc In. solution tampon do pa 5.

h. Chasset l’oxyghne par up. courant d’azotc pur pendant.8 B IO min, puis polarograptcr.

Anal: Chim. Acfa, 22 (x960) a 369-383

376 D.MONNIER, J. VOGEL,P.-E. WENGER

Ziemuvquc : Aprbs la scconde dkantation (opkkion d), il cst prGf6rablc. afm d’kvlter un trans- vasagc du prdclpltd, d’mtrodulrc l’acidc mtrlque I 5 N dlrectement dans lc tube & centnfugcr contenant le composl tryptophanc-mcrcurc(I1) proprc On y commcncc lc chauffagc au moyen d’un barn--marlc bowllant dc man&c B cc quc Ic prkrpitd SC dissolve La solution est ensuite transvasBc quantltatlvcmcnt dans l’erlcnmcyer rod6 pour poursuivrc la nitration (op&atlon e). DC ccttc man&c on &v&c toutc pcrte dc product, cclui-cl cst cn cffct assez adhQrcnt aux parols et sa rkup6rstlon quantltatlve ndccssite dcs soms.

Nous donnons ci-dessous, les rdsultats de diffkentes analyses faites sur des prises contenant des yuantitds variables de tyrosine et de ph6nylalanine.

TAl31,I~AU VII --- --- -- --- ----

90 15 15 - 9.0 15 15 4 2 2: 1 8.8 -2.2

79 20 ;:: 30 - 4 98

s7: 20 30 2.2 - 6 42 1 76 -38

5 42 80 20 20 5.1

8 70 } 84 +5 ------__ - -..--_-_- ___ ____ _______ _ -_--. -- --.-_~

Nous voyons d’aprbs ccs r&ultats que la margc d’erreur que l’on observe est de -J-s%. Ellc est supkieure B cclle du dosage de la tyrosine (f374). Mais il faut tenir compte du fait que l’on a maintcnant un dosage comprenant une prkipitation suivie de lavage et de transvasage. Les opkations effectuCes sur un prCcipitC sont presque toujours moins prkises que celles ne nCcessitant que des manipulations de solutions

III. Dosage de la fiht?nylala?rine ert firhence de lyrosine et de tvy~lo~ltane

Le dosage de la phdnylalaninc a ddj& Ct6 d&rit 0. ICappelons dans les grandes lignes la m&hode utilis6e.

Lcs prises sont traitCes clans de petitcs dprouvcttcs zi fond plat, au moyen de 0.5 ml d’acide nitrique IO IV. On porte h dbullition sur une plaque chauffante Clectrique durant I 11 30 min tout en assurant un reflux convenable au moyen d’un rkipient contenant de l’eau froide. On neutralise en prCscncc de rouge de m&hyle, substance qui intervient ensuite au tours du dosage polarographique comme suppresseur de maximum. On polarographie la solution tamponndc au pkx G (phosphate disodique- acide citrique). Lcs &arts sont de l’ordre de z.~O/~ pour les concentrations de l’ordre du milligramme.

Xcmavq~~e: Lors de l’application dc cette m&hode, nous avons prCfCr6 utiliscr un bain d’huile pour assurer le chauffage des Bprouvettes. La tempdrature de IZOO

environ donne des rkultats comparables B ceux obtenus en travaillant directement sur la plaque dlectriquc B la tempkaturc d’8bullition de la solution. Comme cette tempQature est relativement ClcvCe, il SC produit frdquemment des projections qui risquent de causer des pertes de substances (l’emploi de pierres & Cbullition pour d’aussi faibles volumes n’est pas pratique). A 120°, la solution n’est pas encore en Bbullition et il n’y a par consCquent pas de projections possibles. Le bain d’huile nous assure d’autae part une tempkaturc uniforme entre lcs divers tubes & essai en tours de traitement.

Le dosage n’est Cvidemment pas possible en prQence de tyrosine et de tryptophane

A rral. Chtr. Acta, 22 (rgGo) 369-383

POLAROCRAPHIE DES ACIDES AMINfiS 377

qui sont partiellement dCtruits par cette nitration et dont les rCsidus perturbent la mesure polarographlque.

Une solution de tyrosine traitCe par le permanganate de potassium jusqu’h colora- tion rose persistante puis decoloration par l’eau oxygenee peut &e soumise dcux heures B l’action de l’acide nitrique sans presenter le moindre saut polarographiquc. On peut done en conclure que cet acide amine est entrQement oxydC et quc lcs produits d’oxydation qui en resultent nc peuvent Ctre nit& dans ces conditions.

Nous avons trait6 de la mCme maniere une solution de phenylalanine ct nous avons pu voir que la bauteur du saut polarographique,produit apr&s traitemcnt par HNOB IO AT n’est pas modifiee. Nous prCfCrons utiliser pour l’oxydation unc solutton con- cent& de permanganate (la solution saturke est B 64% environ) plutGt que dcs cristaux dont l’action est plus lente.

Le tryptophane soumis B l’action du permanganate, m&me Sr chnud et en prkxtce de nitrate d’argent lake subsister un saut, 11 ne peut done Ctre elimine de cettc man&c. Cependant, nous avons vu qu’ll est facile de le precipiter et c’est la combi- naison d’une oxydation et d’une prkipitation qui rendra possible le dosage dc la phenylalanine en presence des deux autres acides amiGns. Pour 1’6limination du tryp- tophane, la mt%hode qul conslste h le precipiter directement par l’achate de mercure est longare et dt%cate et les r6sultats manquent de pr6cisxon. Nous avons constat& clu’il est preferable de proceder d’abord Q la nitration du melange et d’eliminer ensuite swlement le tryptophane.

Eltminutim de Lu tyrosinr rt du try~to;b/tane aprt?s nittataort

Nous avons vu pr&9demment que Ie prkipitt2 que donne le tryptophane en prkence de mercure commence h se chssoudre au moment de l’ebullition de l’acide nitrlque r.5 N. M~IS si l’on amGne une solution de tryptophane nrtre B un pEI 16gerement aclde @kc comprrs entre a et 3), on s’aperqott qu’il se forme, en pr&z.nce d’un exc&s de mercure, un precipite jaune orange de tryptophane rut& (La sofutlon ne dolt Ctre ni trop acide, m neutre), Ce qui montre que la precipitation au tryptophane peut se faire aussi blen apres yu’avant la xutrahon,

MODE OPhATOtRE

On place 1;~ prise contenant un mllangc drs trorci armno-ac~de dnm un petit tube B Fonda plat (h pc&c se tit dwxtcment dann le tube) On ajoutc I mL d'ncldc nrtnqus ro AV On, place dane un bam~d’huh2 h t20° pendant L h 30 mm. Le rcflux L%t asew par un r&ziplent contenant de l’eau froidc, pIa sur l’ouverturc du tube

Ape&s rcfroldlswment, on) a.~oute do L’hydroxydc de potaswum B zoo/ au moyen d’unl comptc- gouttes t&s cffxlG, JU~~U:?L ncutibonl (vttlhlc prw le vlragc de la teinte h. l’orangc). On tranavase rmsuitu dans un tube S centnfugcr en ajoutant envwon 10 ml d’cau b1dkt1Ilc5c.

On rhcidxfic ldghrcmcnt WCC du l’aclde mtnquc dilu& do rnamcire k abtemr un prr’ compris entre 2 ct 3, pun, on aJOUb2 5 ml dc solutzon, dfackate mcrcunquc h 2%. On place dans un bain-mark h cnvlron Go? pendant L h 2 ltcurcv. on centrxfuge unsultci pendant quelques minutes, jusqu’8 obtentwn d’unc solution limplde.

Onldkante solgnousomcnt dans unl dcuxl&mc tube h~ccntslfugcr. on, a]outc 2 rnb d’acidc nitriquc 0~x1 IV. Zklasolut~on amsxlqpo 2 ou 3.gouttes de nrtrate &argent ir ~0%. puis,uno solution concentrh do pcmanganato do potassmm ~usqu!h coloration rose persukante (de 2 & 3,mL environ). On place autbain-mano ZL 60-80~ pendant I 5 minutes. (La pr&ence de nitrate d’argont est necossalre pour quo Xoxydationlse fasw dhne lo tamps mdiqu6; la tyrosine su?Gh~bienplus longtemps en l’sbsence dP: ce r&a&if& La colorations rose~finala dolt Btre bien not& et dqminer, 1s. coulour brunt duo au bicxydo do manganth; ai, $0 tend, b disparakre pehdant. le .chauffage;‘tajoutar un peu de per- manganatwde potassium):,

iInol.Chh.~cta. 22 (1960) 3~59-383

378 D. MONNIER, J. VOGEL, P.-E. WENGER

Apr&s oxydatron, on ajoutc quclques gouttcs d’eau oxygBnle pour d6trurrc l’exc&s de perman- ganatc

La solution cst cnsultc transvasdc dans un cylmdrc gradual ct neutral&e par de l’hydroxyde dc potassium ?I 20~/0; Ic mercure, lc mangan&sc ct l’argent prkrprtent On amenc cnsuite par dc l’cau bidtstrllk Ir un volume bmn dbtcrmmc ct on vcrsc dans un nouveau tube le hqurdc contenant Ic ddpOt On ccntrifugc quclqucs mmutcs ~usqu’ir obtcntron d’unc solution hmprdc de tcintc lbgbrc- mcnt jaunt (la tcmtc du d&w6 mtrd dc la phGnylalanme cst faiblc compardc B cclle que donncnt lcs autrcs ammo-acides)

On pr6lbvc unc partie ahquote aussr grandc quc posslblc, quc l’on ambnc 8 50 ml dans un flacon jaug6 On prcnd 7 ml dc ccttc solutron ct on complttc B IO ml au moyen dc la solutron tampon dc 1”’ 5

On clnrssc l’oxygbnc par un cow-ant d’azotc pur pcnclant 8 & IO min, puis on polarographm.

Lcs essais ont montre qu’il nc SC produit pas clc pcrtcs clc phenylalaninc au tours du traltcment. 11 SC produit en fait une faible perk par adsorption sur le tryptophane pr&zipite, mais comme nous I’indiquons plus loin, nous avons constat&, dans ces conditions, une nitration plus forte de la phenylalanine, ces deux ph&orn&ncs semblent se compcnser partiellemcnt.

Nous avons obtcnu par exemple les cluffres suivants, avcc des prises contenant dcs quantitk variables de phr2nylalanine.

TABLEAU VIII

7.9 20 20 3 16 8.x -i-2 5 90 20 20 3 52 89 -X.X 94 20 20 3.61 92 -2 I

2: ;: ;: 2 ’ 30 91 z*;, -G -i-2 3 IO 1 30 30 4 06 10.3 -t-2

Nous voyons quc les crreurs quc l’on commet dans le dosage de la phenylalanine en presence dc tyrosmc et dc tryptophane sont acceptables, elks nc depassent pas

ZtS%. Mais nous avons fait unc constatation importante. Si l’on effectue une nitration de

la phenylalanine pure clans les m&mes conditions de tcmpkature et de durde, on obtient rCguli&rement un saut d’environ 10% plus pctlt que clans le cas oh l’on est en presence de tyrosine ct de tryptophanc. Tout ce passe comme si la ph&nylalanine, en presence de ces deux acides amines, subissait une nitration induitc plus Bnergique quc lorsqu’elle cst sculc.

Le m&ne phenomenc SC procluit en prkencc de nitrite de sodium. Cc sel, quc l’on n’ajoute pas lorsqu’on travaille avec des concentrations acides aussi fortes, a cepen- dant, unc influence ccrtainc sur lc dkoulement de la nitration. Nous avons observd en effet que:

a. En prdsencc dc nitrite, la reaction s’amorce rapidement et la coloration jaune apparait en quelques minutes. La coloration finale est un peu plus intense que celle que l’on obtient lors du traitement de phbnylalanine pure. Le saut polarographique est Cgalement un peu plus fZlev&

b. Dans le cas de la phenylalanine nitrCe par l’acide nitrique IO iV pur, la reaction se produit tres progressivement et la coloration finale n’est atteinte qu’insensiblement.

Nous ne pouvons affirmer cependant quc, quantitativement, l’induction produite

AwaI. Chrm. Actn, 22 (rgGo) 369-383

POLAROGRAPHIE DES ACIDES AMINkS 379

par le nitrite est comparable B celle due B la tyrosine ou au tryptophane. 11 est done prCf&able de prodder & un Ctalonnage interne de la manike habituelle.

Remarque : Si, au tours des opdratlons, l’oxydation de la tyrosine ou la prdcipitation du tryptophane n’a pas 6tC faite correctement. On s’en aperqoit par le fait que les sauts se trouvent d&form&.

Dosage par t’lalonnage interne En procCdant de la manike qui a CtC d&rite plus haut (voir page 9), nous avons

effect& quelqucs dosages par btalonnage intcrne de la phCnylalanine en prCsence dc quantitCs cinq fois plus fortes de tyrosme et de tryptophane.

Nous avons obtenu les valcurs suivantes

TABLEAU IX

57 57

i::

4.1 4.1

- 56 - 5.9 - 57

I.38 2 79 >

0 90 2 30 1

0 945 2 29 1

59

3.8

40

f35

-5

-2.5

Pour clue lc dosage soit exact, il cst bien kidcnt qu’il cst nkcssaire d’Climincr soigncuscmcnt les deux amino-acidcs g&nants. Avec un cxc&s de mercurc et si l’on a attendu un temps suffisant, l’&minntion clu tryptophanc est compl&c. En cc clui concerne l’oxydation dc la tyrosinc, on doit, si l’on a dcs doutcs, faire une nouvcllc oxydation B chaucl de quelques mmutcs. Si la prcmi&re oxydation a Ctt5 totalc, on rctrouve un saut cxactemcnt identique, compte tenu de la pctlte dilution faite par l’introduction des diffdrents r&actifs nkcssaires.

IV. Dosage du try~to~hnm, de La tyrosim et dc la #h!~rylnia~rine egt /wEsemc tcs ICSS des azrtres

ZL La prise contenant les substances h closer cst mist en solution dans l’acldc nitriquc 0.15 lkt. On effectuc la prkipitation du tryptophane et on dose la tyrosinc dans la solution rCsultantc (voir page 2).

b. Le prkipitd rcnfermant lc tryptophanc est dlssous dans l’acidc nitriquc 1. 5 fir. On continue cnsuite le dosage selon la mCthodc habituelle (voir page 7).

c. Sur unc deuxi&mc prise dc substance, on pro&de & la nitration directc avcc l’acide nitrique IO ill; on prkipitc le tryptophane et on oxyde la tyrosinc dc sortc que le saut rdsultant donne la teneur en phdnylalanine (voir page 9).

Chaque polarogramme doit avoir la forme correspondante & celle des products purs. Les interfkences se signalent immbdiatement par des courbes irr&ull&res, des inflex ions dans le tract5 des sauts etc. Elles sont la preuve d’une mauvaise sCparation ou de la prkence de substances gknantes.

’ ‘,I- , ,Alla+ c+~,ActU, 22 (x960): 3cq383

-

380 D. MONNIER, J. VOGEL, P.-E. WENGER

A #$&cation ~2 I’analyse d’wze peptone

Nous avons yu nous procurer auprhs de la maison Moffmann-La Roche, un produit dont la teneur en acides amin& qui nous interesse est approximativement connue. Cette maison a utilise pour ses dosages des methodes biologiques.

Le produit est un hydrolysat de casdine (Peptone ,,Roche”) dont les teneurs suivantes nous ont Bte indiquees: Tyrosine = 2.4o/o ; Tryptophane = z.I~/~; Phenyl- alanine = ro.gO/& (L’ordre de grandeur de la precision de ces, valeurs n’a pu nous Qtre donne).

Cette peptone contient en outre les acides amines suivants (en %) : Alanine = 2.5,

Arginine = 3*x, Acide aspartique = x2.5, Cystine = 1.2, Acide glutamique = 16.5, Histidine = 2.5, Isoleucine = 8.7, Leucine = 8, MBthionine = 5.3, Proline = 1.9, SCrine = 8, Threonine = 6.3, Valine = 10.5, Lysine = 8.

L’analysc a 4th conduite comme il a BtB indique plus haut. MalgrE la complexite de la substance Ctudiee, les reactions se deroulent normalement et l’on obtient des courbes polarographiques de trbs bonne qualit&

a. Dosage dzt tryplophane. Lcs dosages en ce qui conccrnc le tryptophane ont don& les resultats suivants:

TABIJWU x

200

200

200

200 200

-

62

93

- 80

0 945 2.36

I 4 05 2 02

3.11

090 2.61 1 41 2.05

Valcur mdqu6c 2.x

2.36- 0.945 - 1.415

t /

Fig. I. Dosngc clu tryptoplrnnc: btalonnagc intornc double

Les calculs ont Bte faits par resolution graphique, le pro&de est tr&s pratique pour obtenir le resultat d’analyses par Btalonnage double. On effectue le trace de la manibre suivante: on Porte en ordonnCe positive les augmentations de hauteur de saut dues & l’introduction des temoins et en ordonnCe ndgative le saut dQ au produit seul. On Porte ensuite en abscisse positive le poids des temoins. On trace la droite moyenne

Anal. Chiwa. Acta, 22 (x960) $ig-383

POLAROGRAPHIE DES ACIDES AMINlk 381

passant par les deux points tCmoins et l’origine; l’endroit oti elle coupe 1’ordonnCe du saut du produit pur d&ermine en abscisse n&ative la teneur en produit cherchC (voir Fig. 1).

Les rCsultats trouvCs concordent bien avec la valeur indiquCe par la malson Hoffmann-La Rochc.

b. Dosage de la tyrosine. L’application directe de la mCthode mise au point pour ‘le dosage de la tyrosine n’a pas donn6 immtdiatement de bons rkultats dans le cas qui nous intkesse. Les sauts &aient de mauvaise qualitC et les rCsultats non reproductibles.

Nous nous sommcs done proposk dc rcconstituer la peptone 6tudiCe &. partw des acides amin& qui la constituent.

Nous nous sommes procurt ces amino-acides et les avons &udl&s sCparCment du point de vue dc lcur comportement vis-A-vis des divers rdactifs que nous utilisons au tours de l’analysc.

Nous pouvons constater qu’aucun de ces produits ne se nitre dans les conditions de travail utilisCes pour la tyrosine. L’adjonction de quelques cristaux de nitrite de sodium demeure sans effet. La tyrosine se mtre facilement et corrcctement en presence de tous ccs acides amint% et aucun d’entrc eux ne subit lui-mCme de nitration induite.

A la suite de ces cssais, nous avons repris 1’Ctude du dosage et il a pu Gtre constat que l’erreur provenait de l’cmploi d’un trop grand exctk de mercure.

(Ceci ne s’6tait pratiqucment jamais pro&it lors des cssais de mise au point sur des substances de composition connue. Certaincs perturbations occasionnelles, dues probablement & cette cause, avaient CtC attribudes h des erreurs dc manipulation).

En pr&,ence d’une quantltC d’acCtate mcrcurique trop considdrable et de cristaux de nitrite de sodium, la tyrosine forme une combinaison (de teinte lCg&rement rou- geritre) qui n’cst plus enti&rcmcnt d&tn.&e pendant les deux hcures de traitement par l’acide nitrique bouillant.

Pour Ctre dans les meillcurcs conditions possibles, nous avons modifiC un point de la mCthode de la manike suivante:

a. On prkipite le tryptophane cn milieu acide nitrique 0.15 lV de la manike habituclle. La prkipitation &ant une rCaction Icnte, il faut que les ions Hg+a restent en solution durant ce temps;

b. Au lieu de procGder ensuite dircctement h la nitration ir partir de cette solution, nous neutralisons par l’hydroxyde de potassium Q 20% de manikc h Climiner l’exc&s de mercure sous forme de HgO que l’on centrifuge. On ram&w ensuite Q la normalitd de 0.15 au moycn d’une quantit6 calcul& d’acide nitrique I N. On ajoute alors seulement le nitrite de sodium et on porte & Cbullition & reflux durant 2 h.

TABIXAU SI

200 - 200 9-5

200 - 200 5.7

0 810 3 43 > 4-7 z-35

0.788 1.73

> 4.75 2.38

Valcur in&p&e 2.4

- Anal. Cjtim: d&a, 22 (q60) r369383

382 D. MONNIER, J. VOGEL, P.-E. WENGER

Le reste des opdrations demeure sans changement. En procCdant de cette man&e, nous avons obtenu des sauts parfaitement rdguliers

et reproductibles. Les rdsultats ont &B enregistr& dans le Tableau XI. Les rdsultats trouvds concordent done sensiblement avec ceux indiqu& par la

maison Hoffmann-La Roche.

c. Dosage de la #h?nylalanine. Les rkultats que now avons obtenus sont les suivants:

TABLEAU XII

SRUf Valcur lrouv& (WR)

% IJA

100

100 IO0

100 100 IO0

-

65 9.3

- z*,”

I.035 2.68 3s45 I

4.1 4.’

x.057 2 ‘4 3.17 I

42 42

Valcur indrqdc 10.9

Les chiffres trouves sont ncttement inferieurs h celui qui nous a et& donne. I1 cst possible qu’unc partie de l’amino-acide soit encore lid et ne peut, par conskluent, pas Gtre mise en Evidence par notre mkhode. Afin de vkifier si l’hydrolysc peut Ctre poussee davantage, nous avons trait6 une prise de peptone par l’hyclroxyde de sodium 5 N a 120-125~ pendant 5 h, selon le pro&de indique par BLOCK ET BOLLING~.

Les analysts ont CtC ensuite refaites et nous trouvons lcs chiffres suivants:

2.13 100 - I.24 2 13 100 90 3*56 1 48 4.8

2 13 100 - I 26 2.13 100 92 3.65 I 4.85 4085

Les resultats sont plus dlevds clue ceux enregistrCs prkedemment, il y a done eu liberation suppldmentaire de phenylalaninc. Mais des hydrolyses plus poussCes nous donnent ensuite des valeurs pratiquemcnt constantes allant de 4.8 a 4.g%, il faut done admettre que la phCnylalanlne a et6 entierement lib&&.

La maison Hoffmann-La Roche ne pouvant garantir le chiffre qu’elle nous indique, la Constance de nos rkultats nous permet de croire qu’rls sont voisins de la tcncur rCelle en phenylalanine.

En resume :

Aode awnl Vdr1tr lrlJ:qlt& par tfoJ--nlarln La HodIe V&w obtcnuc

Tryptophane 21 2.02-2.05 Tyrosinc 2.4 2.35-2 38 Ph6nylalanmc 10 9 4 80-4.85

Ana. Chim. Ada, 22 (1960) 369-383

POLAROGRAPHIE DES ACIDES AMINkS 383

Selon les constatations faites au tours des essais de mise au point, la prCcision des chiffres indiquks est de l’ordre de j--O/, environ.

Rl%UMl?

11 cst propod unc mdthode polarographlque dc dosage dc la tyrosme, du tryptophane et dc la phdnylalanine en pr&sence les uns des autrcs La m&ho& est spdclfique car les autres acides aminds ne g&ent pas la dCtermination amsi qu’en tdmoigne le dosage de la peptone Hoffmann-La Roche. La mdthode consistc B mtrer les acldcs amm&, puls B polarographicr le d&-i& obtenu La mbthodc cst sensible et pr&se car lcs sauts sont parfaltcmcnt bicn dessm& En jouant sur la concentratton de l’acidc, sur la stabihtb diffQrcnte dc ces substances vis&v1s de l’oxydation ct sur la formation dc pr&zrpite en pr&cncc dc mcrcurc, 11 cst possible dc doser chacun dc ccs acidcs ammb en pr&cnce dcs deux autrcs.

SUMMARY A polarographlc method is described for the determination of tyrosinc, tryptophan and phcnyl- alanine in mlxturcs, in which the ammo acrds are fnst convcrtcd to thcrr nitro dcrrvativcs. Under smtablc condrtrons each of these animo acids can be detcrmmcd rn the prcscncc of the others.

ZUSAMMENFASSUNG

Es wud cinc polarographische Methode bcschricbcn zur Bestrmmung von Tyrosin, Tryptophan und Phcnylalanin m dcrcn Gcmlsch Zur Messung wcrdcn dlc Nitroderivatc verwcndct. Durch Emhaltung bestlmmtcr Bedingungcn konncn drc crnzclncn Amino&urcn m Gegcnwart dcr andercn bcstimmt werden

BIBLIOGRAPHIE D. MONNIER ET Y. RUSCONI, Helv. Chtm Acta, 34 (195x) 1927 Y. RUSCONI,D MONNIERET P.-E. WENGER, HcJv.Ctwn. Acla, 34(195x) 1943. D. MONNIER ET Y. RUSCONI, AnaLChrnr. A&a, 7 (1952) 567. D. MONNIER ET 2. BESSO, Helv Ckam. Acfa, 35 (1932) 777 2. BESSO, D. MONNIER ET P.-E. WENGER, Anal. Chtm. Acta. 7 (1952) 286. D. MONNIER ET R. GUP,RNE, Anal Churn. Actu, 19 (1958) go. P.-E. WZNG&R, D MONNHZR IST J. VOGEL, Mihrochim Acta, 3-4 (1957) 406. J. VOGEL, ThLse No. ra79, Genbvc. R. J, BLOCK ET D. BOLLING, The Ammo Acid Composition of Protcms and Foods, C. C. Thomas, Sprmgfleld, Ill, U.S A., 195x. Documenla Gctgy - Tables sclentrfiques (1955) D. E. DUGGAN 131 S. UNDENPRIEND, J. 13501. Chem., 223 (x956) 313. R. A. BOISSONNA~,ST.GUTTMANN, P. A. JAQUENOUD IZT J.-P. WALLER, HeJv.Cham. Acta. (1955) 1500. R. GUERNE, Thbe No. 1263, Gcn&vc (x957)

Anal Chum. AcJa. 22 (rgGo) 369-383

GRAVIMETRIC DETERMINATION OF ALUMINIUM IN BRONZES AND BRASSES

B. ALFONSI AND M. BUSS1

Research attd Control Laborakwy, Azrlo-AVIO, Flat, Torino (Italy)

(Rcceivcd July gth, 1959)

The preparation and properties of thioglycolic acid have long been knownl, but significant analytical applications of this acid have been made only recently; an example is the photometric determination of irona.

With the ions of some metals, e.g. Cu, Ag, Au, thioglycolic acid forms salts which are insoluble in water and in dilute mineral acids 8; with many other metal ions it

- Anal. Chim. Acla, 22 (rg6o) 383-391