T.A.S.S. 2BIOPHY 1/03/2018

ETSL, 95 rue du Dessous – des – Berges, 75 013 PARIS 1/6

DST n° 2

Techniques d’Analyses Spectrale & Séparative (1h00)

Documents non autorisés - Calculatrice autorisée

Justifier les calculs Séparer calcul littéral et numérique

Questions de cours : (6 points) 1) Dans le cadre de la spectroscopie de fluorescence moléculaire, définir les termes ci-dessous : (1,5 points) conversion interne : C’est un type de relaxation qui implique le transfert de l’excés d’énergie d’une espèce à partir du niveau vibrationnel inférieur d’un état électronique excité vers un état électronique inférieur. C’est une relaxation non rayonnante. fluorescence de résonance : C’est l’émission de lumière par une molécule fluorescente, à une longueur d’onde identique à celle qui a permis d’exciter au préalable cette molécule. 2) Indiquer les effets de la rigidité structurale ainsi que ceux de la température et du solvant sur la fluorescence et donc sur le rendement quantique. (1,5 points) La rigidité a pour effet d’augmenter la fluorescence. Dans la plupart des cas, la fluorescence diminue lorsque la température augmente parce que l’accroissement de la fréquence des collisions aux températures élevées augmente la probabilité qu’il y ait relaxation par collision. La diminution de viscosité du solvant conduit au même résultat. 3) Expliquez pourquoi la fluorescence moléculaire se produit à une longueur d’onde supérieure ou égale à la longueur d’onde d’excitation. (1 point) Pour qu’une molécule fluoresce, il faut l’exciter au préalabale avec une énergie telle que :

E!"# ≥ E!" ⟺ hcλ!"#

≥ hcλ!"

Ainsi, λem ≥ λexc 4) Quels sont les 4 grands types de chromatographie liquide ? (1 point) Chromatographie de partage (liquide-liquide), d’adsorption (liquide-solide), échangeuse d’ions et d’exclusion-diffusion.

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5) Parmi les 4 grands types de chromatographie, quelle est celle qui est la plus couramment employé. Préciser le type de molécule qu’elle permet de séparer. (1 point) La chromatographie de partage est celle qui est la plus couramment employé. Elle permet la séparation de molécules de poids moléculaire inférieur à 10 000 g.mol-1 couvrant un grand domaine de molarité excepté les molécules apolaires ou totalement ionisées. Exercice 1 : (7 points)

Nous désirons déterminer la teneur en acide acrylique résiduel après la fabrication d'absorbants utilisés dans les changes de nourrissons. La figure n°1 ci-dessous donne la formule développée de la molécule dosée.

Figure n°1 : Formule développée de l’acide acrylique.

Après extraction et concentration, le mélange est analysé. La séparation suivante a été obtenue en chromatographie liquide haute performance. Les conditions opératoires sont les suivantes :

• Phase stationnaire en silice greffée C18, • Longueur colonne : 15 cm • Débit : 1 mL.min-1 (mode isocratique) • Pression en tête de colonne : 55.105 Pa • Temps mort : 41 s • Détection : à 210 nm.

L’acide acrylique a un temps de rétention de 1,83 min et la largeur à la base du pic est de 0,15 min.

1/ Indiquer le nom des différents modules d’une chaîne HPLC directement sur l’annexe (ne pas oublier de rendre l’annexe correspondante). (2 points) 2/ Quel est le mode de séparation chromatographique utilisé ? (1 point) On utilise ici une chromatographie de partage en mode inverse. 3/ Préciser alors la polarité de la phase mobile utilisée et de la phase stationnaire. (1 point) La phase mobile est polaire alors que la phase stationnaire est apolaire. 4/ Donner la définition du mode isocratique. (1 point) Le mode isocratique indique que la composition de la phase mobile reste constante au cours de l’analyse.

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5/ Si nous changeons la colonne par une colonne de 25 cm de long, quel devrait être le temps de rétention de l’acide acrylique ? (1 point) Pour une longueur de 15 cm, le temps de rétention de l’acide acrylique est de 1,83 min, donc pour une longueur de 25 cm, le temps de rétention devrait être rallongé de 1,83 x 25 / 15 soit 3,05 min. 6/ Quel est le type de détection utilisé ? Justifier votre réponse. (1 point) C’est une détection photométrique UV, puisque l’énoncé indique une détection à 210 nm. Exercice 2 : Spectrofluorimétrie (7 points) Nous désirons doser l’acide salicylique dans une préparation pharmaceutique par fluorescence. Une étude préliminaire a permis d’obtenir les spectres d’excitation et de fluorescence représentés sur la figure n°2 ci-dessous.

Figure 2 : Spectres d’excitation et d’émission d’une solution à 1.10-3 mol.L-1 d’acide salicylique dans une solution à 1% (v/v) d’acide acétique dans le chloroforme.

1) Comment préparer 100 mL d’une solution à exactement 1.10-3 mol.L-1 en acide salicylique dans le même mélange que celui de l’étude préliminaire ? La masse minimale mesurable par la balance disponible est de 100 mg. Justifier le matériel et les réactifs utilisés. (1,5 points)

On a C = nV =

mM.V

Il faudrait donc peser m = C.M.V = 0,0138 g = 13,8 mg !

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Or la masse minimale mesurable par la balance est de 100 mg, on pèse donc 138 mg, que l’on dissout dans une fiole de 100 mL.

ainsi la concentration vaut ∶ C = 0,138 g

138 g.mol!! x 0,1 L = 10!! mol. L!!.

On prélève 10 mL que l’on place dans une fiole de 100 mL puis on complète avec de l’acide acétique dans le chloroforme jusqu’au trait de jauge pour obtenir 10-3 mol.L-1. 2) Déterminer les longueurs d’onde correspondantes aux pics présentés sur la figure n°2. Préciser en justifiant quelle est la longueur d’onde d’excitation λexc et quelle est la longueur d’onde d’émission λem. (1,5 points) λem = 338 nm et λexc = 284 nm car λem ≥ λexc 3) Quel type de cuve doit-on utiliser et pourquoi ? (1 point) Une cuve en quartz à 4 faces optiques, pour pouvoir mesurer la fluorescence perpendiculairement au faisceau d’excitation sans être perturbé par celui-ci ! 4) Quelle doit être la composition du blanc ? (1 point) De l’acide acétique dans du chloroforme. 5) La gamme d’étalonnage est lue contre le blanc dans les conditions prédéterminées et permet d’obtenir la droite ci-dessous.

Figure 3 : droite d’étalonnage permettant de doser l’acide salicylique.

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Nous prélevons 0,4 mL exactement d’un échantillon que nous déposons dans une fiole jaugée de 10 mL. Nous complétons avec le solvant adéquat. La solution obtenue est mesurée en même temps que la gamme et donne une intensité de 480. Déterminer la concentration en acide salicylique de l’échantillon. (2 points) La lecture sur le graphique permet d’obtenir 0,505 mmol.L-1. L’échantillon ayant subi une dilution, la concentration en acide salicylique dans l’échantillon est donnée par :

C!"# = 5,05. 10!! x 100,4 = 1,26. 10!! mol. L!!

Données : Masse molaire de l’acide salicylique = 138 g.mol-1

FIN DE L’ÉPREUVE

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ANNEXE À RENDRE AVEC LA COPIE