Détection des allergènes alimentaires...2014/01/24 · 2 1. introduction 2. législation 3. standards d’allergènes 4. méthodes analytiques – ELISA – ADN – MS 5. conclusions

Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire

Détection des allergènes alimentaires

Comité consultatif, 24/01/2014

Dr. P. DELAHAUT CER Groupe - Département Santé Comité scientifique de l’AFSCA


Agence fédérale pour la Sécurité de la Chaîne alimentaire 2

1. introduction

2. législation

3. standards d’allergènes

4. méthodes analytiques

– ELISA

– ADN

– MS

5. conclusions

Sci Com-Com Cons – Bruxelles, 24/01/2014


1. introduction

réaction à la nourriture

non-toxique

réaction immunologique allergie alimentaire

IgE non-IgE

réaction non-immunologique intolérance alimentaire

enzymatique pharmacologique indéfinie

toxique



background • Avis Sci Com 37-2006 & 18-2013 • L’allergie alimentaire peut être définie comme étant une

réponse anormale du système immunitaire à des aliments habituellement inoffensifs.

• Le développement d’anticorps IgE qui sont capables de reconnaître et de réagir avec une protéine d’un aliment spécifique, est la cause la plus fréquente des allergies banales et sévères.

‘One man’s food is another man’s poison’


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allergènes pertinents ? en principe, toutes les protéines alimentaires peuvent provoquer des réactions allergiques

→ thérapie: éviction


allergènes pertinents ?

a) prévalence des allergènes alimentaires b) gravité des réactions allergiques (symptômes) c) potentiel allergisant des aliments (valeurs seuils cliniques)


a) prévalence

• très difficile à déterminer - autorapportage: surestimation

- test de provocation: beaucoup de main-d'œuvre + onéreux

- variation: préparation des aliments, population choisie

• augmentation des allergies alimentaires

• enfants : 4,7 % en Europe

• adultes : 3,2 à 3,7 % en Europe



le % le plus bas et le plus élevé de personnes atteintes d’une allergie alimentaire (méta-analyse du projet EuroPrevall; enfants + adultes) (basé sur Zuidmeer et al., 2008 et Rona et al, 2007; Nørhede, 2008)

prévalence relative (%) (source: Moneret-Vautrin, 2008; sur base des données CICBAA)

allergène 0-1 an (n=14

7) 1-3 jans (n=359)

3-15 ans (n=468)

adultes(n=287)

oeufs 77,5 69,6 24,3 6,3

lait 29,2 25,6 7 3,5

arachides 19,7 37,6 49,3 10,1

fruits à coque 2,7 4,4 10,2 15,7

légumineuses 0,6 4,4 13,4 5,9

poisson 0,6 5 10 3,1

prunoïdés 0 0 0 31,3

avocat, banane, noix du Brésil, kiwi

0,6 1,3 5,3 22,6

apiacées 0 0 1,7 16,4

a) prévalence


b) gravité de la réaction - symptômes

• rhinite

• dermatite atopique

• angio oedème

• shock anaphylactique


b) gravité de la réaction - symptômes fréquence (%) suivant laquelle les allergènes alimentaires provoquent

l’ anaphylaxie

(a) Étude clinique européenne en coupe transversale sur des patients externes - EuroPrevall – résultats préliminaires (source: Montserrat Fernández Rivas, 2012)

(b) Étude française chez les adultes; Reseau Allergo Vigilance (novembre 2010) (source: Riziv, 2010)


c) valeurs seuils cliniques Allergène LOAEL (a)

(mg protéine) Dose de référence VITAL (b)

Dose (mg protéine)

risque quantitatif Qualité de la banque de données

Arachides 0,25-10 0,2 ED01* excellente Lait 0,36-3,6 0,1 ED01 excellente Œuf 0,13-1,0 0,03 ED01 et ED05 95% lci** excellente

Soja 88-522 1,0

ED05 95% lci Rem. : cette concentration ne protégera pas

certaines personnes sensibles au lait de soja

suffisante

Blé 1,0

ED05 95% lci Rem. : les consommateurs allergiques au blé

sont pour la plupart protégés lorsque les denrées alimentaires contiennent < 20 ppm

gluten

suffisante

Noix de cajou 2,0 (provisoire) ED05 95% lci marginalement suffisante

Moutarde 1-936 0,05 ED05 95% lci suffisante Lupin 4,0 ED05 95% lci suffisante

Graines de sésame 30 0,2 ED05 95% lci marginalement suffisante

Crevettes 10 ED05 95% lci marginalement suffisante

Céleri n/a *** insuffisante Poisson 1-100 n/a insuffisante Fruits à coque (noix, noix de pécan, amande, pistache, noix du Brésil, noix de macadamia)

0,02-7,5 insuffisante

Noisette 0,1 ED01 et ED05 95% lci bonne


2. législation: Règlement 1169/2011

• information sur la présence d’allergènes dans les aliments non pré-emballés

• étiquetage: clair et lisible • 14 allergènes : céréales contenant du gluten, crustacés,

œufs, poissons, arachides, soja, lait, noix, céleri, moutarde, graine de sésame, sulfite, lupin et mollusques


Qu’est-ce qu’un allergène alimentaire ? aliment

un allergène alimentaire – beaucoup d’épitopes allergéniques

composant alimentaire

protéines

épitopes

3. standards d’allergènes


variabilité des extraits protéiques

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échantillons • standard protéique • beurre d’arachide • arachide grillée • arachide grillée salée • arachide entière – grillée • arachide entière

1 2 3 4 5 6 250 kDa 150 kDa 100 kDa 75 kDa

50 kDa

37 kDa

25 kDa 20 kDa

15 kDa

• extraits de protéines de différents échantillons d’arachides • détermination de la concentration en protéine par BCA • comparaison des profils par SDS-PAGE (chaque échantillon est à 1 mg/mL de protéine)

Arah1

Arah3/4

Arah2

→ Quel extrait est le standard ?


pourquoi des tests ?

• mention sur l’emballage – mention d’absence – étiquetage de précaution

• chaînes d’approvisionnement – validations des mentions – surveillance des fournisseurs

• plaintes des consommateurs

4. méthodes analytiques


techniques

• techniques basées sur la détection de protéines: dosages immunologiques

• Elisa • LFD • Biosensor • FCA

• techniques basées sur la détection de l’ADN: PCR

• techniques physico-chimiques: LC/MS-MS


ELISA – caractéristiques principales

• basé sur l’interaction anticorps/antigène • les anticorps sont dirigés contre les protéines

allergéniques spécifiques • en général, cliniquement pertinent (relation avec la

réaction) • quantitatif (courbe standard) • méthode très spécifique et sensible (ppb - mg/kg) • largement utilisé par l’industrie et les organismes de

réglementation


sandwich ELISA

Anticorps spécifique coaté dans le puit

Enzyme lié à l’anticorps spécifique de l’antigène

S S S S

positif negatif

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

0,1 1 10

Abs

(DO

)

Concentration (ppm)


→ influence du process (ex. ‘cookies’)

A B C DE

baked

Not baked050

100150200250300350400450500

caséine

1000 ppm

A B C DE

baked

Not baked0

5

10

15

20

25

beta-lactoglobuline

1000 ppm


→ tests de diagnostics rapides

• lateral flow device • flow through • dipstick

– faciles d’utilisation – détection rapide (en quelques minutes) – spécifiques – sensibles

=> on site tests


principe LFD

https://www.cytodiagnostics.com/lateral-flow-immunoassays.php


techniques basées sur la détection de l’ADN PCR (Polymerase Chain Reaction)

DNA séquence spécifique

amplification par PCR utilisé pour

déterminer la présence de

l’arachide dans l’échantillon peut être séquencé

pour confirmation


protéines

technique LC-MS/MS - principe

digestion enzymatique

peptides un allergène alimentaire – de nombreuses protéines allergéniques

sélection requise de la protéine/du peptide cîble

analyse par MS/MS

approche instrumentale analyse d’échantillons biologiques pour identifier les peptides d’intérêts

approche théorique digestion de novo, sélection des peptides & prédiction des paramètres MS


α-S1-casein MKLLILTCLVAVALARPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPFPEVFGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIKQMEAESISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYLGYLEQLLRLKKYKVPQLEIVPNSAEERLHSMKEGIHAQQKEPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAYPSGAWYYVPLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTTMPLW

α-S2-casein MKFFIFTCLLAVALAKNTMEHVSSSEESIISQETYKQEKNMAINPSKENLCSTFCKEVVRNANEEEYSIGSSSEESAEVATEEVKITVDDKHYQKALNEINQFYQKFPQYLQYLYQGPIVLNPWDQVKRNAVPITPTLNREQLSTSEENSKKTVDMESTEVFTKKTKLTEEEKNRLNFLKKISQRYQKFALPQYLKTVYQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRYL

Ovalbumin MGSIGAASMEFCFDVFKELKVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVRFDKLPGFGDSIEAQCGTSVNVHSSLRDILNQITKPNDVYSFSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAADQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAIVFKGLWEKAFKDEDTQAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFRVASMASEKMKILELPFASGTMSMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLMAMGITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAGREVVGSAEAGVDAASVSEEFRADHPFLFCIKHIATNAVLFFGRCVSP

analyse d’oeuf et de lait dans le vin

→ chromatogrammes


MS – principales caractéristiques • la MS permet une bonne quantification des

allergènes - problème du standard interne à résoudre • les dosages par MS sont standardisés avec des

réactifs chimiques • la spécificité est supérieure à d’autres techniques • les méthodes MS peuvent être développées pour la

confirmation - avantage : méthode multi-allergènes • une validation complète: la variation interlaboratoire

est importante à évaluer • la MS nécessitera quelques années pour être

complètement reconnue • coût!!!


détectabilité vs. allergénicité 5. conclusions


comparaison des méthodes Méthodes Limites Avantages

ELISA •manque de robustesse au process

• rapidité + • semi-quantitatif

on site tests • qualitatif • rapidité ++ •utilisation sur site

PCR •qualitatif • échantillons positifs même en absence de protéines allergisantes

• complémentarité à l’ELISA

LC-MS/MS •délai et coût d’analyse •modification des protéines/peptides lors du process : impact sur le résultat

•multi-screening •quantitatif (! standard interne) • spécificité


MERCI à …

• groupe de travail: P. Delahaut (Sci Com), M. De Loose (ILVO), B. De Meulenaer (Sci Com), V. Dumont (CER), A. Huyghebaert (UGent), H. Lapeere

(UZGent), G. Maghuin-Rogister (ULg), M.-L. Scippo (Sci Com), C. Van Peteghem (Sci Com)

• Direction d’encadrement pour l’évaluation des risques

• AFSCA – Comité scientifique

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