Du génotype aux phénotypes

2013-2014M1 Phytem – ENS Cachan

Introduction

Les pois de Mendel (1866)Introduction

Pois lisse Pois ridé

Parents

F1

F2

Un croisement de deux lignées pures différant par un caractère

donne une F1 homogène.

Dans la descendance d’un croisement de deux F1, les caractères parentaux réapparaissent avec une proportion de 3 à 1

P. sativum

Le caractère qui se manifeste est dominant sur celui exclu.

x

Introduction

Les pois de Mendel (1866)Introduction

Pois lisse Pois ridé

Parents

F1

F2

A/A a/a

A/a

A a

x

A

A/A a/aA/a A/aX

X/x Génotype

Phénotype

Introduction

Théorie chromosomique de l’héréditéIntroduction

Morgan : Couleur des yeux de D. melanogaster

Sutton (1910) : Définition des groupes de liaison et des premières cartes génétiques

1.1 La découverte de l’ADN

Introduction Expérience de Griffiths

S. pneumoniae

S (lisse) R (rugueux)

+ +

I- Relation génotype-phénotype

Infectieux Non infectieux

1.1 La découverte de l’ADN

Introduction Expérience de Griffiths

S (lisse) mort R (rugueux)

+ +

S (lisse) mort

+

Principe transformant

I- Relation génotype-phénotype

1.1 La découverte de l’ADN

Introduction Travaux d’Avery, Mc Leod et Mc Carthy

R (rugueux)

Traitement avec+

Principe transformant = ADN

S (lisse) mort

+

Protéases RNases DNases

I- Relation génotype-phénotype

1.1 La découverte de l’ADN

Introduction Expérience de Griffiths

ADN Phénotype

(Caractère)

???

I- Relation génotype-phénotype

1.2 La structure de l’ADN

Introduction Structure de l’ADN

Crick, Watson et Wilkins

• Composition chimique de l’ADN

• Mesures de Chargaff

A - T

C - G

- Rapport (A+T)/(C+G) est constant pour une espèce donnée ... Mais variable entre espèces

- Rapport A/T = 1 et C/G =1 quelque soit les espèces

- Nombre de (A+G) = nombre de (C+T)

4 bases azotées : A, T, G, C

Structure de l’ATP

I- Relation génotype-phénotype

1.2 La structure de l’ADN

Introduction Structure de l’ADN

Crick, Watson et Wilkins

• Microscopie électronique

Diamètre : 2 nm

R. Franklin

Figure en croix caractéristique des structures en hélice

Suggérant deux chaînes de désoxyribose phosphate

• Clichés de diffraction aux rayons X

I- Relation génotype-phénotype

1.2 La structure de l’ADN

Introduction Structure de l’ADN

Crick, Watson et Wilkins

Introduction

- Hélice à double brins antiparallèles

- Appariement des bases par liaisons hydrogènes : A-T et G-C

- Agencement aléatoire des bases

- 10 bases par pas d’hélice et 0,34 nm entre 2 paires de bases

0,34 nm

Grand sillon

Petit sillon

I- Relation génotype-phénotype

1.3 Du gène à la protéine

Introduction Relation gène - fonction

Beadle et Tatum

N. crassa

Sauvage Mutants

Milieu minimum + ArgMilieu minimum

Mutant A

Mutant B

Mutant C

Mutagenèse (UV, RX, ...)

....

Expérience :

I- Relation génotype-phénotype

1.3 Du gène à la protéine

Introduction Relation gène - fonction

Beadle et Tatum

Résultats :

Souche Milieu minimum (MM)

MM + ornithine

MM + citrulline

MM + arginine

Sauvage + + + +

A - - - +

B - - + +

C - + + +

I- Relation génotype-phénotype

1.3 Du gène à la protéine

Introduction Relation gène - fonction

Beadle et Tatum

Modèle :

Précurseur ArgX Y

Enz C Enz B Enz A

Gène C Gène B Gène A

1 gène = 1 enzyme

Y = citrulline

X = ornithine

I- Relation génotype-phénotype

1.3 Du gène à la protéine

Introduction Relation gène - polypeptide

Yanofsky

Colinéarité entre mutation sur l’ADN et acide aminé modifié

Gène

Protéine

1 gène = 1 polypeptide

I- Relation génotype-phénotype

1.3 Du gène à la protéine

Introduction Le code génétique

Niremberg

Modèle :

Chaque acide aminé est codé par un triplet de nucléotides

Gène

Protéine

1 codon = 1 acide aminé

- Le code génétique est universel

- Le code génétique est redondant

I- Relation génotype-phénotype

1.3 Du gène à la protéine

Introduction Le code génétiqueI- Relation génotype-phénotype

I – La relation génotype - phénotype

Introduction Bilan

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

I- Relation génotype-phénotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction La transcription

Promoteur Gène

ARN pol

TerADN

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction La transcription

Gène TerTATACis

ARN pol

ADN

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction La transcription

Gène TerTATACis

ARN pol

ARN

ADN

A AGC T

T TCG A

T TCG A

GG

C C

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

3’

5’

3’5’

3’

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction La transcription

Gène TerTATACis

ARN pol

ARN

ADN

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction Bilan

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction La régulation de la transcription

Gène TerTATACis

ARN pol

ADN

ARNpo l : machinerie de transcription

Facteurs de transcription : activation spécifique de la transcription de certains gènes

FT

Quels gènes sont transcrits ?

(1)

(100-1000 …)

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction La régulation de la transcription

Gène TerTATACis

ARN pol

ADN

ARNpo l

Facteurs de transcription

FT

Quels gènes sont transcrits ?I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose

Métabolisme du glucoseMétabolisme du lactose

lactose glucose

lacY

ATP

lactose Glucose-6-P

Galactose + glucose

Allolactose

ADP

Glucose-6-P

AMPc

Voie métabolique

Voie m

étaboliqueE E

β-galactosidase

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose

LAC ALAC YLAC ZLAC I OpCRE

LACI

LACILACILACI

LACI

CAP

• En présence de lactose dans le milieu (sans glucose)

+1+1

PromoteurPromoteur

AMPc

Allolactose

β-galactosidase Perméase Transacétylase

ARN pol

Transcription FORTE

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose

LAC ALAC YLAC ZLAC I OpCRE

LACI

LACILACILACI

LACI

CAP

• Sans lactose dans le milieu (mais avec du glucose)

+1+1

PromoteurPromoteur

LACILACILACI

LACI

ARN pol

Transcription TRES FAIBLE

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose

LAC ALAC YLAC ZLAC I OpCRE

LACI

LACILACILACI

LACI

CAP

• En présence de lactose dans le milieu (avec glucose)

+1+1

PromoteurPromoteur

Allolactose

β-galactosidase Perméase Transacétylase

ARN pol

Transcription FAIBLE

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction Régulation de la transcription – l’opéron lactose

Bilan

Glucose

Lactose

Glucose +

Lactose

CAPActivité de

transcriptionCRELac I Opérateur

Lac I

Lac I-Allo

Lac I-Allo

CAP

CAP-AMPc

CAP

Non occupé

Non occupé

Non occupé

Non occupé

Occupé

Occupé FORTE

Faible

basale

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction Régulation de la transcription – rôle de la chromati ne

Structure d’un nucléosome

Structure en collier de perle

+

Octamère histones

ADN

Nucléosome

=

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction Régulation de la transcription – rôle de la chromati ne

Régulation de la transcription par des facteurs de remodelage de la chromatine

Complexe activateur

(HAT)

Complexe répresseur

(HDAC)

Transcription

Pas de transcription

Chromatine décompactée

Chromatine compactée

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.1 La transcription et sa régulation

Introduction Régulation de la transcription – rôle de la chromati ne

Régulation de la transcription par des facteurs de remodelage de la chromatine

Complexe activateur

(HAT)Transcription

FT

HAT

Chromatine décompactée

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

ARN polFT

HAT

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction Bilan

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

Maturation

FT cis/trans

Modification chromatine

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.2 La maturation des ARNm

Introduction Cas particulier – l’épissage

TerADN TATACis E1 E2 E3 E4I1 I2 i3

Gène

E1 E2 E3 E4I1 I2 I3ARNm AAAAAAA

E1 E2 E3 E4

Transcription

Epissage

Uniquement chez les eucaryotes

E : exon

I : intron

= Excision des introns

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.2 La maturation des ARNm

Introduction Cas particulier – l’épissage

TerADN TATACis E1 E2 E3 E4I1 I2 i3

Gène

E1 E2 E3 E4I1 I2 I3ARNm AAAAAAA

E1 E2 E3 E4

Transcription

Epissage

E1 E2 E4

E1 E3 E4

OU

OUEpissage alternatif

= Excision des introns …

… variable selon les cellules

Cellule A

Cellule B

Cellule C

Uniquement chez les eucaryotes

E : exon

I : intron

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction Bilan

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

Maturation

FT cis/trans

Modification chromatine

Epissage (alternatif)

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction Sortir du noyau chez les eucaryotes

Cellules procaryotes Cellules eucaryotes

Cytosol

Cytosol

Noyau

TRANSCRIPTION

TRADUCTION

EXPORT

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction Bilan

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

Maturation

FT cis/trans

Modification chromatine

Epissage (alternatif)

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.3 La traduction

Introduction La traduction

AAAAAAAUG

+1

AAAAAAAUG

+1

Ribosome

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.3 La traduction

Introduction La traduction

AAAAAAAUG

+1

A C G U G G A C AG C U

ARNt

polypeptide

Ribosome

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.3 La traduction

Introduction La traduction

AAAAAAAUG

+1

A C G U G G A C AG C U

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

polypeptide

Ribosome

2.3 La traduction

Introduction La traduction

AAAAAAAUG

+1

A C G U G G A C AG C U

stop

stop

RF1

RF3

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction Bilan

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

Maturation

FT cis/trans

Modification chromatine

Epissage (alternatif)

Maturation

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

ARNr, ARNt

2.4 La maturation des protéines

Introduction La structure des protéines

Primaire Secondaire Tertiaire Quaternaire

• Comment les protéines acquièrent-elles leur structu re tridimensionnelle ?

Structure tridimensionnelleBranden & Tooze, 1999

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.4 La maturation des protéines

Introduction

I- Relation génotype-phénotype

Interactions entre acides aminés

II- Phénotype = expression du génotype

Liaisons H. Interactions ioniques Ponts disulfures

Liaisons faibles Liaisons covalentes

Ox

Red

Stryer, 6e éd

O

H

O

O O

C

NH3+

-

2.4 La maturation des protéines

Introduction Structure secondaire des protéines

• Hélice α • Brin β

- Liaison H. entre C=O et NH des résidus n et n+4

- Structure stable pour une hélice droite

3,6 résidus par tour

- Les chaînes latérales projettent vers l’extérieur

- Impliqués dans la formation de feuillets β

Distance 0,15nm

Branden & Tooze, 1999

Branden & Tooze, 1999

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.4 La maturation des protéines

Introduction

Antarctique

Structure tertiaire des protéines

• Motifs structuraux : Les feuillets β

Feuillet β parallèle Feuillet β antiparallèle

- Liaison H. entre C=O et NH des résidus qui se font face

Branden & Tooze, 1999

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.4 La maturation des protéines

Introduction Structures tertiaire et quaternaire

• Structure de la protéine Cro

- 3 hélices α

- 3 brins β

Motif HBH

Organisation en dimère grâce au brin 3

Structure monomérique de Cro

Dimère de Cro

Branden & Tooze, 1999

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.4 La maturation des protéines

Introduction Adressage des protéinesI- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

SRP

SRP

SRP

Cytosol

Lumière du réticulum

Membrane

Adressage des protéines au réticulum endoplasmique

Séq. signal

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction Bilan

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

Maturation

FT cis/trans

Modification chromatine

Epissage (alternatif)

Maturation Repliement, structure II, III, IV

Adressage

ARNr, ARNt

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.5 Relation structure – fonction des protéines

Introduction La structure des protéines

Primaire Secondaire Tertiaire Quaternaire

Structure tridimensionnelleBranden & Tooze, 1999

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

Fonction

?Quelle est la relation entre leur structure tridimensionnelle et leur fonction ?

2.5 Relation structure – fonction des protéines

Introduction La structure primaire dicte t’elle la structure tridimensionnelle ?

Expérience d’Anfinsen

Antarctique

RNase A purifiée active

RNase A inactive

RNase A active

Urée + β-mercaptoéthanol

Dialyse lente pour éliminer urée + β-mercaptoéthanol

- Le repliement de la RNase A est spontané- Les informations nécessaires à son repliement sont contenues dans sa séquence primaire

Stryer, 6e éd

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.5 Relation structure – fonction des protéines

Introduction Cro, un facteur de transcription liant l’ADN

• Modèle d’interaction entre Cro et l’ADN

Cette organisation en dimère place les deux motif H BH à une distance de 3,4 nm correspondant exactement à un tour d’héli ce de l’ADN

Branden & Tooze, 1999

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.5 Relation structure – fonction des protéines

Introduction Cro, un facteur de transcription liant l’ADN

• Interaction non spécifique Cro et l’ADN

Entre le squelette sucre-phosphate et la liaison peptidique de la protéine

Permet par ajustement conformationnel de positionne r l’hélice de reconnaissance correctement dans le gra nd sillon

Branden & Tooze, 1999

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

2.5 Relation structure – fonction des protéines

Introduction Cro, un facteur de transcription liant l’ADN

• Interaction spécifique Cro et l’ADN

Entre les chaînes latérales des acides aminés et les bases de l’ADN

Les deux hélices 3 étant orientées en sens inverses,

la séquence d’ADN reconnue est palindromique et espacée

d’environ 10 pb.

T-G-T-T-X6-A-A-C-ABranden & Tooze, 1999

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction Bilan

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

Maturation

FT cis/trans

Modification chromatine

Epissage (alternatif)

Maturation Repliement, structure II, III, IV

Adressage

ARNr, ARNt

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction L’importance de l’environnement

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

Maturation

FT cis/trans

Modification chromatine

Epissage (alternatif)

Maturation Repliement, structure II, III, IV

Adressage

Environnement

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

ARNr, ARNt

II- Le phénotype : résultat de l’expression du génotype

Introduction L’importance de l’environnementI- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

Si trop de glucose dans le sang

Cellule du foie

glucagon

PKA

GlycogèneGlyS

+

P

glucose

GlyP P

active

peu active

Stockage

AdC

3.1 Connaître le génotype d’un individu

Introduction Allèles, mutations et conséquencesI- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

Pois lisse

A/a

Fleur

Fruits

ATGGCGCTACGCATT

ATGGCACTACGCATT

Lisse ou ridé ?

ou

diploïde

- DPI- Empreintes génétiques- Sélection génétique

Connaitre la séquence des gènes mais pourquoi ?

3.1 Connaître le génotype d’un individu

Introduction La PCR

ADN db

ADN sb

ADN sb Amorce

Dénaturation (95°C)

Hybridation (55-60°C)

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

ADN dbPolymérisation (72°C)5’

3’5’

3’

ADN polymérase thermostable

Dénaturation

Hybridation

Polymérisation

ADNpol

3.1 Connaître le génotype d’un individu

Le pyroséquençageIntroduction

Ajout NTP

- ADNn + NTP ���� ADNn+1 + NMP + PPi

+ cocktail enzymatique

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

Si p

as d

e N

dan

s la

séq

uenc

eS

i N d

ans

la

séqu

ence

- PPi + X ���� Lumière

Dégradation NTP

N = A ou C ou G ou T

- Lumière : captée par une caméra

ADN à séquencerN

ADNpol

3.1 Connaître le génotype d’un individu

Le pyroséquençageIntroduction

Cycle I Run A

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

A T G G C G C T A C G C A

Cycle II

Cycle III

Run C

Run G

Run T

Run A

Run C

Run G

Run T

Run A

Run C

Run G

Run T

Lum

ière

ém

ise

Lum

ière

ém

ise

Lum

ière

ém

ise

A

T

GG

C

G

3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée

La transcriptomique : Les puces à ADN Introduction

Sondes spécifiques (oligonucléotides, ...) de chaque gène

Support (nylon, verre-silicium, ...)

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

Oligonucléotide

3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée

La transcriptomique : Les puces à ADN Introduction

Echantillon 1 Echantillon 2

Extraction des ARN

Synthèse ADNc et marquage fluorescent

Mélange

Hybridation compétitive sur une puce

Lecture (LASER)

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

50% 50%

0 100

100 050

50

Lavage

2. Elimination des « résidus » d’ADN

3. Réaction de TRANSCRIPTION INVERSE

4. Inactivation de l’enzyme

AAAAAAAAAA5’ 3’TTTTTTTT

ARNm

5’

Amorce OligoT

RT

dNTP

ADNc

3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée

Synthèse des ADNc : La transcription inverse

1. Extraction des ARNm

Introduction

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée

La protéomique : L’électrophorèse bidimensionnelleIntroduction

Gel à forte porosité + ampholytes formant un gradient de pHi

Les ampholytes (espèces amphotères synthétiques) migrent jusqu’à leur pHi

Séparation selon la masse moléculaire

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

-

+

-

+

Séparation selon pHi

Séparation selon poids

moléculaire

1ère dimension : électrofocalisation

2ème dimension : gel dénaturant Révélation

Détection de spots de taille proportionnelle au contenu en protéines

3.2 Connaître les gènes exprimés dans une situation donnée

La protéomique : L’électrophorèse bidimensionnelleIntroduction

Echantillon 1 Echantillon 2

Extraction des protéines

Electrophorèse bidimensionnelle

Comparaison

Identification

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

III- Quelques méthodes d’étude

?

Qualitative et quantitative

Séquençage par spectrométrie de masse

Conclusion

Introduction

ADN

ARNm

Protéine

Génotype

Phénotype

Transcription

Traduction

Expression

Maturation

FT cis/trans

Modification chromatine

Epissage (alternatif)

Maturation Repliement, structure II, III, IV

Adressage

Environnement

I- Relation génotype-phénotype

II- Phénotype = expression du génotype

ARNr, ARNt

Séquençage

Observable, mesurable

Puce à ADN

Electrophorèse 2D

III- Quelques méthodes d’étude