e de l’activité hydratante et de l’action sur la

Centre de Recherches Biologiques

et d'Expérimentations Cutanées

Etude 19E4523

Mise en évidence de l’activité hydratante et de l’action sur la réparation de la barrière cutanée et sur la différenciation

cutanée d’une eau à partir d’explants de peau ex vivo

Selon le plan d’étude n° D19-248

Produit testé P : Eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX

Donneur d’ordre SUBLIO FRANCE

8 Rue René Coty85018 La Roche-sur-Yone-mail : [email protected]

Installation d’essai Laboratoire BIO-EC

1, Chemin de Saulxier 91160 Longjumeau FRANCE

Tél.+(33)1 69 41 42 21 Fax+(33)1 69 41 61 65 Contact [email protected] Contact www.bio-ec.fr

Directeur d’étude L. Peno-Mazzarino

Date de fin d’étude 23 Septembre 2019

Mise en évidence de l’activité hydratante et de l’action sur la réparation de la barrière cutanée et sur la différenciation cutanée d’une eau à partir d’explants de peau ex vivo.

Etude 19E4523 SUBLIO page 2 sur 56

FE-H-153-03 du 13/11/2015 selon la procédure PR-Q-003

Plan chronologique

Statut BPL Non BPL

Date de début de l’étude (date de signature du plan d’étude par le

directeur d’étude) 05 juillet 2019

Début de la phase technique de l’étude

18 juillet 2019

Responsable Phase ex-vivo

C. Durand

Date Signature

Responsable Phase histologie

C. Delpy

Date Signature

Responsable Phase expertise

L. Peno-Mazzarino

Date Signature

Fin de la phase technique de l’étude

13 septembre 2019

23.09.2019

23.09.2019

23.09.2019




SOMMAIRE

BUT DE L’ETUDE ......................................................................................................................................... 4

MATERIEL ET METHODES ........................................................................................................................... 4

1. Schéma de l’étude .............................................................................................................................. 4

2. Produit testé ....................................................................................................................................... 4

3. Préparation des explants .................................................................................................................... 4

4. Délipidation ........................................................................................................................................ 4

5. Utilisation du système Sublio Ionic Waterbox ................................................................................... 5

6. Répartition des explants ..................................................................................................................... 6

7. Application du produit........................................................................................................................ 6

8. Prélèvements ...................................................................................................................................... 6

9. Traitements histologiques .................................................................................................................. 6

9.1. Contrôle de la viabilité cellulaire .................................................................................................... 7

CONTEXTE SCIENTIFIQUE ........................................................................................................................... 8

1. Filaggrine ............................................................................................................................................ 8

2. Involucrine .......................................................................................................................................... 9

3. AQP3 ................................................................................................................................................. 10

RESULTATS & DISCUSSION ....................................................................................................................... 11

1. Viabilité cellulaire ............................................................................................................................. 11

2. Filaggrine .......................................................................................................................................... 14

3. Involucrine ........................................................................................................................................ 16

4. AQP3 ................................................................................................................................................. 17

CONCLUSION ............................................................................................................................................ 18

ANNEXES ................................................................................................................................................... 20

1. Viabilité cellulaire ............................................................................................................................. 20

2. Filaggrine .......................................................................................................................................... 33

3. Involucrine ........................................................................................................................................ 42

4. AQP3 ................................................................................................................................................. 46

DEVIATIONS .............................................................................................................................................. 52

ATTESTATIONS QUALITE ........................................................................................................................... 52

ARCHIVAGE DE L’ETUDE ........................................................................................................................... 54

RESUME DE L’ETUDE ................................................................................................................................ 55




BUT DE L’ETUDE

Cette étude a pour but de mettre en évidence l’activité d’une eau hyperpolarisée sur la réparation de la barrière cutanée, l’hydratation et la différenciation à partir d’explants de peau ex vivo.

Cette activité est évaluée par : - Un contrôle de la viabilité ;- Un immunomarquage de la filaggrine- Un immunomarquage de l’involucrine- Un immunomarquage de l’aquaporine-3 (AQP3)

MATERIEL ET METHODES

1. Schéma de l’étude

J0 J1 J2 J3 J4 J5 J6 J7 J8 J9 J10 J11

18-juil. 19-juil. 20-juil. 21-juil. 22-juil. 23-juil. 24-juil. 25-juil. 26-juil. 27-juil. 28-juil. 29-juil.

Jeudi Vendredi Samedi Dimanche Lundi Mardi Mercredi Jeudi Vendredi Samedi Dimanche Lundi

2. Produit testéLe donneur d’ordre a fourni le produit suivant:

Produit P : Eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX.L’eau ionique a été produite à partir de l’eau du réseau de distribution d’eau de laville de Longjumeau (eau du robinet).

3. Préparation des explants39 explants de 12±1 mm de diamètre (dont 15 délipidés), ont été préparés à partird’une plastie d’une femme de type caucasien âgée de 43 ans (référence P2175-AB43).Les explants ont été mis en survie en milieu BEM (BIO-EC’s Explants Medium) à37°C en atmosphère humide, enrichie de 5 % de CO2.

4. DélipidationA J0, une zone délimitée de la plastie a été délipidée par application d’un mélangeéther/acétone (1 :1) à la surface de la peau pendant 2 fois 2 minutes, puisessuyée. Sur cette zone, 15 explants notés « D », de 12±1 mm de diamètre, ontété préparés et mis en survie comme indiqué précédemment.

Délipidation

Prélèvement Application produit




5. Utilisation du système Sublio Ionic Waterbox

Photo représentant la version du SUBLIO IONIC WATERBOX en modèle réduit destiné à la conduction des études par BIO-EC.

1. De façon continue (24/24h), s’assurer que le filtre à eau (b) soit bien placé verticalement et que le générateur (c) soit constamment allumé avec le sélecteur en position 5.

2. Ouvrir la vanne d’induction d’eau (a) en la tournant vers le bas pour mettre le réacteur de traitement du système SUBLIO sous pression du réseau.

3. Préalablement à l'utilisation de l'eau ionique pour l’étude, purger le système d'environ 1 L d’eau en ouvrant franchement la vanne d'arrêt (d).

4. Fermer la vanne d’arrêt d’eau (d) et attendre 15 minutes pour effectuer le prélèvement de l’eau ionique destinée à l’étude.

5. Effectuer le prélèvement souhaité de l'eau ionique à l’aide d’un flacon stérile.

6. Fermer la vanne d’induction d’eau pour alimentation du système (a).7. Ouvrir d’environ un quart la vanne d’arrêt de sortie de l’eau ionique (d)

pendant 2 secondes afin d’éliminer la pression résiduelle.

NB : Répéter les étapes 1 à 7 pour chaque traitement.

Application produit




6. Répartition des explantsLes explants ont été répartis en 6 lots comme suit:

Lot Désignation Traitement Nb d’explants Arrêt

T0 Témoin plastie - 3 J0

D0 Témoin délipidation Ether / Acétone 3 J0

T Témoin non traité - 9 24h, J6, J11

P Produit P P 12 3h, 24h, J6, J11

D Délipidation Ether / Acétone 6 3h, 24h

DP Délipidation + produit P Ether/Acétone + P 6 3h, 24h

7. Application du produitA J0 (immédiatement après délipidation), J1, J4, J6 et J8, le produit P a étéappliqué en topique, à raison de 2 µl par explant (2 mg/cm2) et étalés à l’aided’une spatule. Après application du produit P, les explants restent 2h àtempérature ambiante. Les explants ont ensuite été en culture à 37°C dans lesconditions décrites auparavant.Les explants des lots T n’ont reçu aucun traitement, excepté le renouvellement dumilieu de culture.Le milieu de culture a été renouvelé pour moitié (1 ml par puits) à J1, J4, J6 et J8.

Conformément aux dispositions prévues dans le plan d’étude, les jours detraitement et d’arrêts ont été ajustés au planning des jours ouvrés.

8. PrélèvementsA J0, les 3 explants des lots T0 et D0 (immédiatement après la délipidation) ontété prélevés et coupés en deux. Une partie a été fixée dans une solution de formoltamponnée, et l’autre a été congelée à –80°C.A 3h et 24h après délipidation, J6 et J11, les 3 explants de chaque lot ont étéprélevés et traités de la même façon qu’à J0.

9. Traitements histologiquesAprès 24h dans le formol tamponné, les prélèvements ont été déshydratés etimprégnés en paraffine à l’aide d’un automate de déshydratation Leica PEARL. Ilsont été mis en bloc à l’aide d’une station d’enrobage Leica EG 1160.Des coupes de 5 µm ont été réalisées à l’aide d’un microtome type Minot, LeicaRM 2125 et montées sur des lames de verre histologiques Superfrost®.Les observations microscopiques ont été réalisées en microscopie optique, àl’aide d’un microscope Leica type DMLB ou Olympus BX43, en utilisant un objectif40x. Les prises de vue ont été réalisées avec une caméra Olympus DP72 et lelogiciel Cell^D.




9.1. Contrôle de la viabilité cellulaire La viabilité cellulaire des structures épidermiques et dermiques a été observée sur coupes en paraffine après coloration au trichrome de Masson variante de Goldner. Elle a été évaluée par un examen microscopique.

Lots concernés : tous.

9.2. Immunomarquage de la filaggrine La filaggrine a été marquée sur coupes en paraffine avec un anticorps monoclonal anti-filaggrine (Santa Cruz, ref. sc-66192, clone AKH1), dilué au 1/500ème dans du PBS-BSA 0,3%-Tween 20 à 0,05% pendant 1h à température ambiante, et révélé en AlexaFluor 488 (Lifetechnologies, ref. A11001). Les noyaux ont été contre-colorés à l’iodure de propidium. L’immunomarquage a été réalisé en utilisant un automate d’immunomarquage (Dako, AutostainerPlus) et évalué par un examen microscopique.

Lots concernés : T0, D0, T(24h), P(24h), D(3h, 24h), DP(3h, 24h), soit 24 explants.

9.3. Immunomarquage de l’involucrine L’involucrine a été marquée sur coupes en paraffine avec un anticorps monoclonal anti- involucrine (Novus Biologicals, réf. NB100-2727, clone SY5), dilué au 1/100ème dans du PBS-BSA 0,3% pendant 1 nuit à température ambiante avec un système amplificateur biotine/streptavidine et révélé en VIP, un substrat violet de peroxydase (Vector SK-4600). L’immunomarquage a été évalué par observation microscopique.

Lots concernés : T0, T(J6), P(J6), soit 9 explants.

9.4. Immunomarquage d’AQP3 L’aquaporine 3 (AQP3) a été marquée sur coupes paraffine avec un anticorps polyclonal anti-AQP3 (Chemicon, réf. AB3276), dilué au 1/1000ème dans du PBS-BSA 0.3%-Tween 20 0,05% pendant une heure à température ambiante avec un système amplificateur biotine/streptavidine, révélé en VIP, un substrat violet de peroxydase (Vector SK 4600). L’immunomarquage a été réalisé à l’aide d’un automate pour les immunomarquages (Autostainer, Dako) et évalué par observation microscopique.

Lots concernés : T0, T(J6, J11), P(J6, J11), soit 9 explants.




CONTEXTE SCIENTIFIQUE

1. Filaggrine

La filaggrine est synthétisée initialement sous forme de son précurseur, la pro-filaggrine, une protéine d’environ 400 kDa hautement phosphorylée et insoluble et qui représente le constituant principal des grains de kératohyaline de la couche granuleuse. Pendant la phase tardive de la différentiation épidermique, la pro-filaggrine est déphosphorylée et clivée, par la caspase-14, en plusieurs monomères de filaggrine (Fig.1). La filaggrine se lie ainsi aux filaments intermédiaires de kératine, en participant à leur agrégation en macrofibrilles et à la formation de l’enveloppé cornée. Au niveau de la zone intermédiaire du stratum corneum, les monomères de filaggrine sont ensuite protéolysés. Cette protéolyse participe à la formation d’un complexe très hygroscopique, le facteur naturel d’hydratation (Natural Moisturing Factor ou NMF). Le NMF permet le maintien de l’hydratation de la couche cornée et la souplesse de la peau.

Figure 1. En (a) mécanismes moléculaires impliqués dans la protéolyse de la pro-filaggrine pendant le programme de différentiation terminale épidermique (Sandllands et al., 2009 Journal of Cell Science 122, 1285-1294) et en (b) immunomarquage de la filaggrine révélé en FITC.




2. Involucrine

L’involucrine une protéine structurale localisée au niveau de l’épiderme supérieur. Elle est synthétisée initialement au niveau du stratum spinosum et ensuite réticulée par les transglutaminases au niveau du stratum granulosum. L’involucrine est une composante essentielle de l’enveloppe cornée (Fig. 2), la coque rigide et insoluble entourant les cornéocytes. En recherche dermo-cosmétique, elle est utilisée comme marqueur de la différentiation terminale des kératinocytes.

Figure 2. Représentation schématique de l’enveloppe cornée et immunomarquage typique de l’involucrine (Adapté à partir de Candi et al., 2005. The cornfied envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 6: 329-340). In (b), Immunomarquage de l’involucrine révélé en VIP. Abbreviations : SC, stratum corneum; E, Epiderme; d, derme; sPRP, small prolin-rich proteins.

(a) (b)

SC

d

E




3. AQP3

Les aquaporines (AQPs) sont une famille de protéines intégrales membranaires,de petite taille et hydrophobiques, impliquées dans le transport de l’eau à traversla membrane plasmique (Fig. 4). Jusqu’alors, 13 gènes codant pour 12 AQPs ontété identifiés chez les mammifères, qui ont été regroupés en deux groupes sur labase de leur perméabilité. Les AQPs sont exprimées chez une grande variété decellules, y compris les kératinocytes.L’aquaporine de type 3 (AQP3) est un transporteur membranaire spécifique pourl’eau et le glycérol et est normalement exprimée au sein de l’épiderme. Plusieursfacteurs, tels que certaines pathologies cutanées, tel que l’eczéma atopique,certains agents, notamment le rétinol ou encore des agents abiotiques tels que lesUVs peuvent affecter l’expression de l’aquaporine 3.

Figure 4. Rôle biologique de l’AQP 3 (a) et immunomarquage de l’AQP3 révélé en fastred (b).

(a) (b)

d

SC




RESULTATS & DISCUSSION

1. Viabilité cellulaire

La viabilité cellulaire de tous les lots est montrée ci-dessous :

Lot Viabilité cellulaire

Commentaires Epiderme Derme

T0 B B Stratum corneum (SC) faiblement épais

et modérément feuilleté

D0 AB B SC faiblement épais

et modérément feuilleté

P3h B B SC modérément épais et modérément feuilleté

D3h B B SC faiblement épais et faiblement feuilleté

DP3h B B SC faiblement épais et faiblement feuilleté

T24h B B SC modérément épais et modérément feuilleté

P24h B B SC modérément épais et modérément feuilleté

D24h B B SC très faiblement épais et très faiblement feuilleté

DP24h B B SC très faiblement épais et très faiblement feuilleté

TJ6 AB B SC modérément épais et modérément feuilleté

PJ6 AB B SC assez nettement épais et assez nettement feuilleté

TJ11 AB B SC assez nettement épais et assez nettement feuilleté

PJ11 AB B SC nettement épais

et assez nettement feuilleté

Légende de la morphologie : B= Bonne, AB= Assez bonne, TLA= Très légèrement altérée, LA= Légèrement altérée, MA= Modérément altérée, ANA= Assez nettement altérée, NA= Nettement altérée, TNA= Très nettement altérée




A J0,

Sur le lot témoin T0, la viabilité cellulaire est bonne dans l’épiderme et dans le derme. Le stratum corneum (SC) est faiblement épais et modérément feuilleté.

La délipidation D (D0) n’induit pas de modification de la viabilité des cellules de

l’épiderme et du derme, ni de modification de l’aspect du stratum corneum,

comparé à T0.

A 3h,

Effet du produit sur la viabilité cellulaire, après 3h, comparé à T0 :

- Le produit P n’induit pas de modification de la viabilité cellulaire mais

augmente légèrement l’épaisseur du SC.

La délipidation D après 3h (D3h) n’induit pas de modification de la viabilité des

cellules de l’épiderme et du derme, mais diminue légèrement l’aspect feuilleté du

stratum corneum sans modifier son épaisseur, comparé à T0.

Effet du produit sur la viabilité cellulaire, comparé à D3h :

- Le produit P n’induit pas de modification de la viabilité cellulaire ni de l’aspect

du SC.

A 24h,

Sur le lot témoin T24h, la viabilité cellulaire est bonne dans l’épiderme et dans le derme. Le stratum corneum (SC) est modérément épais et modérément feuilleté.

Effet du produit sur la viabilité cellulaire, comparé à T24h :


du SC.

La délipidation D (D24h) n’induit pas de modification de la viabilité des cellules

de l’épiderme et du derme, mais diminue modérément l’épaisseur et l’aspect

feuilleté du stratum corneum, comparé à T24h.

Effet du produit sur la viabilité cellulaire, comparé à D24h :


du SC.




A J6,

Sur le lot témoin TJ6, la viabilité cellulaire est assez bonne dans l’épiderme et bonne dans le derme. Le stratum corneum (SC) est modérément épais et modérément feuilleté.

Effet du produit sur la viabilité cellulaire, comparé à TJ6 :


augmente légèrement l’épaisseur et l’aspect feuilleté du SC.

A J11,

Sur le lot témoin TJ11, la viabilité cellulaire est assez bonne dans l’épiderme et bonne dans le derme. Le stratum corneum (SC) est assez nettement épais et assez nettement feuilleté.

Effet du produit sur la viabilité cellulaire, comparé à TJ11 :


augmente légèrement l’épaisseur du SC sans modifier son aspect feuilleté.




2. FilaggrineL’expression de la filaggrine à la base du stratum corneum sur tous les lots estmontrée ci-dessous :

TF F M AN N TN Fo

T0

D0

D3h

DP3h

T24h

P24h

D24h

DP24h

TF F M AN N TN Fo

TF=Très Faible F=Faible M =Modéré AN=Assez Net N=Net TN=Très Net Fo=Fort

A J0,

Sur le lot témoin T0, le marquage de la filaggrine est faible à la base du stratum corneum (SC).

La délipidation D (D0) n’induit pas de modification de l’expression de la filaggrine,

comparé à T0.

La délipidation D après 3h (D3h) induit une légère diminution de la filaggrine,

comparé à T0.

Effet du produit sur l’expression de la filaggrine, comparé à D3h :

- Le produit P induit une augmentation modérée.

Le produit P induit donc une protection complète contre la répression de

la filaggrine induite par la délipidation.

A 24h,

Sur le lot témoin T24h, l’expression de la filaggrine est modérée à la base du stratum corneum (SC).

Effet du produit sur l’expression de la filaggrine, comparé à T24h :

Le produit P n’induit pas de modification




La délipidation D (D24h) induit une diminution modérée de la filaggrine, comparé

à T24h.

Effet du produit sur l’expression de la filaggrine, comparé à D24h :

- Le produit P induit une augmentation assez nette.

Le produit P induit donc une protection complète contre la répression de

la filaggrine induite par la délipidation.




3. Involucrine

L’expression de l’involucrine dans la couche granuleuse de l’épiderme sur tous les lots est montrée ci-dessous :

TF F M AN N TN Fo

T0

TJ6

PJ6

TF F M AN N TN Fo


A J0,

Sur le lot témoin T0, le marquage de l’involucrine est assez net à net dans la couche granuleuse de l’épiderme.

A J6,

Sur le lot témoin TJ6, l’expression de l’involucrine est assez nette à nette dans la couche granuleuse de l’épiderme.

Effet du produit sur l’expression de l’involucrine, comparé à TJ6 :

- Le produit P induit une légère augmentation




4. AQP3

L’expression de l’aquaporine 3 (AQP3) dans l’ épiderme sur tous les lots est montrée ci-dessous :

TF F M AN N TN Fo

T0

TJ6

PJ6

TJ11

PJ11

TF F M AN N TN Fo


A J0,

Sur le lot témoin T0, le marquage de l’AQP3 est net à très net dans l’épiderme.

A J6,

Sur le lot témoin TJ6, l’expression de l’AQP3 est nette à très nette dans l’épiderme.

Effet du produit sur l’expression de l’AQP3, comparé à TJ6 :

- Le produit P induit une diminution légère

A J11,

Sur le lot témoin TJ11, l’expression de l’AQP3 est assez nette dans l’épiderme.

Effet du produit sur l’expression de l’AQP3, comparé à TJ11 :

- Le produit P induit une diminution assez nette




CONCLUSION

Selon les conditions expérimentales décrites ci-dessus et comparé au lot témoin T ou au lot délipidé D à J0, 3h, J1, J6 ou J11:

Variation vs T ou D Produit P

Viabilité cellulaire

Vs T0, après 3h

viabilité Epaisseur SC

Vs D3h viabilité SC

Vs T24h viabilité SC


Vs TJ6

viabilité Epaisseur SC

Aspect feuilleté SC

Vs TJ11 viabilité

Epaisseur SC

Filaggrine

Vs D3h

Vs T24h

Vs D24h

Involucrine Vs TJ6

AQP3

Vs TJ6

Vs TJ11

Diminution Augmentation Aucune variation

Légère

Moderée

Assez nette

Nette

Très nette

Forte SC Stratum corneum




Restauration de la barrière cutanée

La délipidation de la surface cutanée entraine une altération de la fonction barrière. En réponse, la peau tente de restaurer la fonction barrière, notamment, en dégradant la filaggrine pour augmenter les NMF (natural moisturizing factors) qui sont capables de fixer une grande quantité d’eau et assurer une bonne hydratation du stratum corneum. Lorsque le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) est appliqué après la délipidation, la filaggrine n’est pas dégradée. Donc, le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) a compensé ou restauré rapidement la fonction barrière, rendant inutile la dégradation de la filaggrine. L’eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX a

un excellent effet réparateur de la barrière cutanée.

Activité sur la différenciation Après 6 jours d’application, le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) induit une augmentation de l’involucrine. Il améliore la formation des enveloppes cornées nécessaire au cours de la différenciation et la formation du stratum corneum. L’eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX a

un effet notable et positif sur la formation et le renforcement du stratum corneum.

Activité hydratante Après 6 et 11 jours de traitement, le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) améliore notablement l’épaisseur et l’aspect feuilleté du stratum corneum, traduisant un meilleur état d’hydratation du stratum corneum. Après 6 et 11 jours d’application, le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) réduit l’AQP3. Cependant, il favorise la réparation de la fonction barrière (filaggrine après délipidation), améliore l’aspect du stratum corneum (morphologie) et favorise la formation des enveloppes cornées (involucrine). Ces activités montrent que le produit améliore le stratum corneum et sa fonction barrière, réduisant ses besoins en eau et donc pourrait expliquer la diminution de l’AQP3 qui régule les flux hydriques à travers l’épiderme. L’eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX

présente un bon effet hydratant notable.




ANNEXES

1. Viabilité cellulaire

50 µm T0_1-1

19E4523 TCM

Lot témoin à J0 (T0)

50 µm T0_3-3 19E4523 TCM




50 µm D0_7-13


19E4523 TCM

Lot D à J0 (D0)

50 µm D0_10-15 19E4523 TCM




50 µm P3h_13-24


19E4523 TCM

Lot P à 3h (P3h)

50 µm P3h_17-25 19E4523 TCM




50 µm D3h_14-35


19E4523 TCM

Lot D à 3h (D3h)

50 µm D3h_15-36 19E4523 TCM




50 µm DP3h_6-39


19E4523 TCM

Lot DP à 3h (DP3h)

50 µm DP3h_17-45 19E4523 TCM




50 µm T24h_4-47


19E4523 TCM

Lot témoin à 24h (T24h)

50 µm T24h_5-48 19E4523 TCM




50 µm P24h_4-57


19E4523 TCM

Lot P à 24h (P24h)

50 µm P24h_7-58 19E4523 TCM




50 µm D24h_2-64


19E4523 TCM

Lot D à 24h (D24h)

50 µm D24h_9-69 19E4523 TCM




50 µm DP24h_4-74


19E4523 TCM

Lot DP à 24h (DP24h)

50 µm DP24h_15-80 19E4523 TCM




50 µm TJ6_10-89


19E4523 TCM

Lot témoin à J6 (TJ6)

50 µm TJ6_11-90 19E4523 TCM




50 µm PJ6_24-101


19E4523 TCM

Lot P à J6 (PJ6)

50 µm PJ6_26-102 19E4523 TCM




50 µm TJ11_10-108


19E4523 TCM


50 µm TJ11_16-111 19E4523 TCM




50 µm PJ11_2-113


19E4523 TCM

Lot P à J11 (PJ11)

50 µm PJ11_4-114 19E4523 TCM




2. Filaggrine

50 µm Tm_2-92

19E4523 Filaggrine

Contrôle négatif sans anticorps primaire (Tm)




50 µm T0_5-5

Filaggrine

19E4523 Filaggrine


50 µm T0_8-8 19E4523 Filaggrine




50 µm D0_2-11

Filaggrine

19E4523 Filaggrine

Lot D à J0 (D0)

50 µm D0_6-15 19E4523 Filaggrine




50 µm D3h_4-31

Filaggrine

19E4523 Filaggrine

Lot D à 3h (D3h)

50 µm D3h_5-32 19E4523 Filaggrine




50 µm DP3h_1-55

Filaggrine

19E4523 Filaggrine

Lot DP à 3h (DP3h)

50 µm DP3h_6-60 19E4523 Filaggrine




50 µm T24h_1-46

Filaggrine

19E4523 Filaggrine

Lot témoin à 24h (T24h)

50 µm T24h_6-51 19E4523 Filaggrine




50 µm P24h_4-67

Filaggrine

19E4523 Filaggrine

Lot P à 24h (P24h)

50 µm P24h_7-70 19E4523 Filaggrine




50 µm D24h_5-77

Filaggrine

19E4523 Filaggrine

Lot D à 24h (D24h)

50 µm D24h_6-78 19E4523 Filaggrine




50 µm DP24h_6-87

Filaggrine

19E4523 Filaggrine

Lot DP à 24h (DP24h)

50 µm DP24h_8-89 19E4523 Filaggrine




3. Involucrine

50 µm Tem_3-30

19E4523 Involucrine

Contrôle négatif sans anticorps primaire




50 µm T0_7-4

Involucrine

19E4523 Involucrine


50 µm T0_8-5 19E4523 Involucrine




50 µm TJ6_2-10

Involucrine

19E4523 Involucrine


50 µm TJ6_8-15 19E4523 Involucrine




50 µm PJ6_2-20

Involucrine

19E4523 Involucrine

Lot P à J6 (PJ6)

50 µm PJ6_7-23 19E4523 Involucrine




4. AQP3

50 µm Tem_3-48

19E4523 AQP3

Contrôle négatif sans anticorps primaire




50 µm T0_12-6

AQP3

19E4523 AQP3


50 µm T0_15-9 19E4523 AQP3




50 µm TJ6_2-10

AQP3

19E4523 AQP3


50 µm TJ6_3-11 19E4523 AQP3




50 µm PJ6_7-23

AQP3

19E4523 AQP3

Lot P à J6 (PJ6)

50 µm PJ6_8-24 19E4523 AQP3




50 µm TJ11_2-29

AQP3

19E4523 AQP3


50 µm TJ11_3-30 19E4523 AQP3




50 µm PJ11_3-39

AQP3

19E4523 AQP3

Lot P à J11 (PJ11)

50 µm PJ11_6-40 19E4523 AQP3




DEVIATIONS

Aucune.

ATTESTATIONS QUALITE

L’étude qui fait l’objet de ce présent rapport a été réalisée dans l’esprit des Bonnes Pratiques du Laboratoire (Arrêté du 10 Aout 2004), ainsi qu’en respectant les procédures et modes opératoires validés par le Laboratoire BIO-EC. Les audits réalisés permettent de s’assurer que toutes les étapes de l’étude sont contrôlées. Les dates et les phases inspectées lors de nos différents audits sont indiquées dans le tableau ci-dessous :

Type d’audit

Date Etape contrôlée

Date de diffusion du rapport au Directeur d’Etude

Date de diffusion du rapport au

Directeur de l’installation

d’essai

Interne 11/04/2017 Ressources humaines 20/04/2017 20/04/2017

Interne 15/05/2017 Réception, conservation et

destruction des éléments d’essai 24/05/2017 24/05/2017


destruction des systèmes d’essai 24/05/2017 24/05/2017


destruction des réactifs et anticorps 31/05/2017 31/05/2017

Interne 07/06/2017 Environnement de l’étude et gestion

des déchets 16/06/2017 16/06/2017

Interne 19/07/2017 Documentation Qualité 28/07/2017 28/07/2017

Interne 11/09/2017 Equipement 15/09/2017 15/09/2017

Interne 10/11/2017 Archive 16/11/2017 16/11/2017

Interne 04/04/2018 Ressources humaines 09/04/2018 09/04/2018


destruction des éléments d’essai 16/05/2018 16/05/2018


destruction des systèmes d’essai 16/05/2018 16/05/2018


destruction des réactifs et anticorps 18/06/2018 18/06/2018

Interne 22/06/2018 Environnement de l’étude et gestion

des déchets 26/06/2018 26/06/2018




Ce rapport a été examiné par le Responsable Qualité qui atteste que les méthodes et les modes opératoires ont été entièrement respectés. Ce rapport a été examiné par le Directeur d’étude qui atteste que les observations et les résultats obtenus sont fidèlement indiqués et reflètent avec exactitude les données brutes de l’étude. Le directeur de l’installation d’essai a vérifié que la responsabilité de l’assurance de la qualité est assumée conformément à l’esprit des bonnes pratiques de laboratoire.

Directeur d’étude

Date et signa ture

Responsable Assurance Qualité

Date et signature :

Directeur de l’installation d’essai Date et signature :

L. Peno-Mazzarino M. Daniel E. Lati

23.09.2019

23.09.2019

23.09.2019




ARCHIVAGE DE L’ETUDE

Archivage des données brutes Les données brutes obtenues sont :

- Observations microscopiques - Résultats d’analyses d’images - Résultats de dosages - Résultats à l’aide d’appareils biométrologiques

Toutes ces données brutes sont conservées dans le dossier papier de l’étude, et une sauvegarde informatique est faite lorsque cela est possible (suivant les appareils).

Archivage des produits ; échantillons ; blocs et lames Les produits confiés au Laboratoire BIO-EC sont conservés pendant 1 an après la fin d’utilisation du produit. Les blocs en paraffine, les lames colorées et les immunomarquages révélés en peroxydase et phosphatase alcaline seront conservés 15 ans dans les locaux de BIO-EC. Les blocs congelés resteront en possession du laboratoire 2 ans à -80°C. Si les milieux de culture sont prélevés durant l’étude, ils seront conservés 2 ans à -80°C. Par la suite ils seront tous éliminés, sauf avis contraire dûment stipulé par le client.

Archivage du rapport final Le dossier d’étude papier est archivé et conservé pendant 20 ans. Le dossier d’étude informatique (données brutes, images, rapports préliminaires et rapport final) ainsi que toutes les données informatiques sont sauvegardées en local par duplication (KERTEL BOX2CLOUD en RAID 1) et font l’objet d’une sauvegarde externe journalière avec le service BackUpia (KERTEL Group). Notre système informatique est protégé par les services antivirus Microsoft Security Essential, F-Secure.




RESUME DE L’ETUDE

Produit P : Eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX Modèle Explants de peau humaine ex vivo. Délipidation des lots D (éther/acétone) à J0. Application topique du produit P à raison de 2mg/cm2 à J0 (après la délipidation), J1, J4, J6 et J8. Arrêt des explants à J0, 3h, et 24h après délipidation, J6 et J11. Paramètres analysés : viabilité cellulaire et immunomarquages de la filaggrine, l’involucrine, et AQP3. Conclusion Selon les conditions expérimentales décrites ci-dessus et comparé au lot témoin T ou au lot délipidé D à J0, 3h, J1, J6 ou J11:

Variation vs T ou D Produit P


Vs T0, après 3h viabilité

Epaisseur SC


Vs T24h viabilité SC


Vs TJ6 viabilité

Epaisseur SC Aspect feuilleté SC

Vs TJ11 viabilité

Epaisseur SC

Filaggrine

Vs D3h

Vs T24h

Vs D24h

Involucrine Vs TJ6

AQP3 Vs TJ6

Vs TJ11

Diminution Augmentation Aucune variation

Légère

Moderée

Assez nette

Nette

Très nette

Forte SC Stratum corneum




Restauration de la barrière cutanée

La délipidation de la surface cutanée entraine une altération de la fonction barrière. En réponse, la peau tente de restaurer la fonction barrière, notamment, en dégradant la filaggrine pour augmenter les NMF (natural moisturizing factors) qui sont capables de fixer une grande quantité d’eau et assurer une bonne hydratation du stratum corneum. Lorsque le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) est appliqué après la délipidation, la filaggrine n’est pas dégradée. Donc, le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) a compensé ou restauré rapidement la fonction barrière, rendant inutile la dégradation de la filaggrine. L’eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX a un

excellent effet réparateur de la barrière cutanée.

Activité sur la différenciation Après 6 jours d’application, le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) induit une augmentation de l’involucrine. Il améliore la formation des enveloppes cornées nécessaire au cours de la différenciation et la formation du stratum corneum. L’eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX a un

effet notable et positif sur la formation et le renforcement du stratum corneum.

Activité hydratante Après 6 et 11 jours de traitement, le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) améliore notablement l’épaisseur et l’aspect feuilleté du stratum corneum, traduisant un meilleur état d’hydratation du stratum corneum. Après 6 et 11 jours d’application, le produit « eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX » (P) réduit l’AQP3. Cependant, il favorise la réparation de la fonction barrière (filaggrine après délipidation), améliore l’aspect du stratum corneum (morphologie) et favorise la formation des enveloppes cornées (involucrine). Ces activités montrent que le produit améliore le stratum corneum et sa fonction barrière, réduisant ses besoins en eau et donc pourrait expliquer la diminution de l’AQP3 qui régule les flux hydriques à travers l’épiderme. L’eau ionique produite grâce au dispositif SUBLIO IONIC WATERBOX

présente un bon effet hydratant notable.

Documents

e de l’activité hydratante et de l’action sur la