N° ordre 2004ISAL0006 Année 2004

THESE

présentée devant L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

pour obtenir LE GRADE DE DOCTEUR

Spécialité Biochimie Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé

par Laurent COULON

Effet d’un hydroperoxyde lipidique et des LDL oxydées sur les enzymes impliquées dans la libération de l’acide arachidonique des phospholipides

plaquettaires

Soutenue publiquement le 28 janvier 2004 devant la Commission d’examen Directeurs de thèse : Professeur M. LAGARDE ; Docteur C. CALZADA JURY : Docteur D. BLACHE (rapporteur)

Docteur C. CALZADA Docteur M. HATMI (rapporteur)

Professeur M. LAGARDE Professeur C. VIAL Travail effectué au sein du laboratoire de Physiopathologie des Lipides et Membranes (INSERM U585) à l’INSA de Lyon

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OCTOBRE 2003 INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : STORCK A. Professeurs : AUDISIO S. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE BABOT D. CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENTS IONISANTS BABOUX J.C. GEMPPM*** BALLAND B. PHYSIQUE DE LA MATIERE BAPTISTE P. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BARBIER D. PHYSIQUE DE LA MATIERE BASTIDE J.P. LAEPSI**** BAYADA G. MECANIQUE DES CONTACTS BENADDA B. LAEPSI**** BETEMPS M. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE BIENNIER F. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BLANCHARD J.M. LAEPSI**** BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE BOIVIN M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES SOLIDES BOTTA H. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain BOULAYE G. (Prof. émérite) INFORMATIQUE BOYER J.C. MECANIQUE DES SOLIDES BRAU J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment BREMOND G. PHYSIQUE DE LA MATIERE BRISSAUD M. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE BRUNET M. MECANIQUE DES SOLIDES BRUNIE L. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION BUREAU J.C. CEGELY* CAVAILLE J.Y. GEMPPM*** CHANTE J.P. CEGELY*- Composants de puissance et applications CHOCAT B. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine COMBESCURE A. MECANIQUE DES CONTACTS COUSIN M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures DAUMAS F. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et Thermique DOUTHEAU A. CHIMIE ORGANIQUE DUFOUR R. MECANIQUE DES STRUCTURES DUPUY J.C. PHYSIQUE DE LA MATIERE EMPTOZ H. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION ESNOUF C. GEMPPM*** EYRAUD L. (Prof. émérite) GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE FANTOZZI G. GEMPPM*** FAVREL J. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS FAYARD J.M. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS FAYET M. MECANIQUE DES SOLIDES FERRARIS-BESSO G. MECANIQUE DES STRUCTURES FLAMAND L. MECANIQUE DES CONTACTS FLORY A. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATIONS FOUGERES R. GEMPPM*** FOUQUET F. GEMPPM*** FRECON L. REGROUPEMENT DES ENSEIGNANTS CHERCHEURS ISOLES GERARD J.F. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES GERMAIN P. LAEPSI**** GIMENEZ G. CREATIS** GOBIN P.F. (Prof. émérite) GEMPPM*** GONNARD P. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GONTRAND M. PHYSIQUE DE LA MATIERE GOUTTE R. (Prof. émérite) CREATIS** GOUJON L. GEMPPM*** GOURDON R. LAEPSI****. GRANGE G. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GUENIN G. GEMPPM*** GUICHARDANT M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GUILLOT G. PHYSIQUE DE LA MATIERE GUINET A. PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS GUYADER J.L. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GUYOMAR D. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE HEIBIG A. MATHEMATIQUE APPLIQUEES DE LYON JACQUET-RICHARDET G. MECANIQUE DES STRUCTURES JAYET Y. GEMPPM*** JOLION J.M. RECONNAISSANCE DE FORMES ET VISION JULLIEN J.F. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures JUTARD A. (Prof. émérite) AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE KASTNER R. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique KOULOUMDJIAN J. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION

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LAGARDE M. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LALANNE M. (Prof. émérite) MECANIQUE DES STRUCTURES LALLEMAND A. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LALLEMAND M. (Mme) CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique LAREAL P. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique LAUGIER A. PHYSIQUE DE LA MATIERE LAUGIER C. BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE LEJEUNE P. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE LUBRECHT A. MECANIQUE DES CONTACTS MASSARD N. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE MAZILLE H. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MERLE P. GEMPPM*** MERLIN J. GEMPPM*** MIGNOTTE A. (Mle) INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE MILLET J.P. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE MIRAMOND M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MOREL R. MECANIQUE DES FLUIDES ET D’ACOUSTIQUES MOSZKOWICZ P. LAEPSI**** MOURA A. GEMPPM*** NARDON P. (Prof. émérite) BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS NIEL E. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE NORTIER P. DREP ODET C. CREATIS** OTTERBEIN M. (Prof. émérite) LAEPSI**** PARIZET E. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PASCAULT J.P. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES PAVIC G. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE PELLETIER J.M. GEMPPM*** PERA J. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux PERRIAT P. GEMPPM*** PERRIN J. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PINARD P. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE PINON J.M. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION PONCET A. PHYSIQUE DE LA MATIERE POUSIN J. MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE PREVOT P. INTERACTION COLLABORATIVE TELEFORMATION TELEACTIVITE PROST R. CREATIS** RAYNAUD M. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux REDARCE H. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE REYNOUARD J.M. UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures RIGAL J.F. MECANIQUE DES SOLIDES RIEUTORD E. (Prof. émérite) MECANIQUE DES FLUIDES ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES ROUBY D. GEMPPM*** ROUX J.J. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON – Thermique de l’Habitat RUBEL P. INGENIERIE DES SYSTEMES D’INFORMATION RUMELHART C. MECANIQUE DES SOLIDES SACADURA J.F. CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux SAUTEREAU H. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SCAVARDA S. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE SOUIFI A. PHYSIQUE DE LA MATIERE SOUROUILLE J.L. INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE THOMASSET D. AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE UBEDA S. CENTRE D’INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES THUDEROZ C. ESCHIL – Equipe Sciences Humaines de l’Insa de Lyon UNTERREINER R. CREATIS** VELEX P. MECANIQUE DES CONTACTS VIGIER G. GEMPPM*** VINCENT A. GEMPPM*** VRAY D. CREATIS** VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) PHYSIQUE DE LA MATIERE Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. MECANIQUE DES CONTACTS CONDEMINE G. UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE COTTE-PATAT N. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE FRANCIOSI P. GEMPPM*** MANDRAND M.A. (Mme) UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE POUSIN G. BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE ROCHE A. INGENIERIE DES MATERIAUX POLYMERES SEGUELA A. GEMPPM*** Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS GRENIER S. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS RAHBE Y. BIOLOGIE FONCTIONNELLE, INSECTES ET INTERACTIONS

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Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : PRIGENT A.F. (Mme) BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MAGNIN I. (Mme) CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D’APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L’IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D’ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS

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INSA DE LYON DEPARTEMENT DES ETUDES DOCTORALE Septembre 2003

Ecoles Doctorales et Diplômes d’Etudes Approfondies

habilités pour la période 1999-2003

ECOLES DOCTORALES

n° code national

RESPONSABLE

PRINCIPAL

CORRESPONDANT

INSA

DEA INSA

n° code national

RESPONSABLE

DEA INSA

CHIMIE DE LYON

(Chimie, Procédés, Environnement)

EDA206

M. D. SINOU UCBL1 04.72.44.62.63 Sec 04.72.44.62.64 Fax 04.72.44.81.60

M. R. GOURDON 87.53 Sec 84.30 Fax 87.17

Chimie Inorganique 910643

Sciences et Stratégies Analytiques

910634

Sciences et Techniques du Déchet 910675

M. R. GOURDON Tél 87.53 Fax 87.17

ECONOMIE, ESPACE ET

MODELISATION DES COMPORTEMENTS

(E2MC)

EDA417

M.A. BONNAFOUS LYON 2 04.72.72.64.38 Sec 04.72.72.64.03 Fax 04.72.72.64.48

Mme M. ZIMMERMANN 60.91 Fax 87.96

Villes et Sociétés 911218

Dimensions Cognitives et Modélisation

992678

Mme M. ZIMMERMANN Tél 60.91 Fax 87.96 M. L. FRECON Tél 82.39 Fax 85.18

ELECTRONIQUE,

ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE

(E.E.A.)

EDA160

M. D. BARBIER INSA DE LYON 85.47 Fax 60.82

Automatique Industrielle 910676

Dispositifs de l’Electronique Intégrée

910696

Génie Electrique de Lyon 910065

Images et Systèmes

992254

M. M. BETEMPS Tél 85.59 Fax 85.35 M. D. BARBIER Tél 85.47 Fax 60.82 M. J.P. CHANTE Tél 87.26 Fax 85.30 Mme I. MAGNIN Tél 85.63 Fax 85.26

EVOLUTION, ECOSYSTEME,

MICROBIOLOGIE , MODELISATION

(E2M2)

EDA403

M. J.P FLANDROIS UCBL1 04.78.86.31.50 Sec 04.78.86.31.52 Fax 04.78.86.31.49

M. S. GRENIER 79.88 Fax 85.34

Analyse et Modélisation des Systèmes Biologiques 910509

M. S. GRENIER Tél 79.88 Fax 85.34

INFORMATIQUE ET INFORMATION

POUR LA SOCIETE

(EDIIS)

EDA 407

M. L. BRUNIE INSA DE LYON 87.59 Fax 80.97

Documents Multimédia, Images et Systèmes d’Information Communicants

992774 Extraction des Connaissances à partir des Données

992099

Informatique et Systèmes Coopératifs pour l’Entreprise 950131

M. A. FLORY Tél 84.66 Fax 85.97 M. J.F. BOULICAUT Tél 89.05 Fax 87.13 M. A. GUINET Tél 85.94 Fax 85.38

INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-

SANTE

(EDISS)

EDA205

M. A.J. COZZONE UCBL1 04.72.72.26.72 Sec 04.72.72.26.75 Fax 04.72.72.26.01

M. M. LAGARDE 82.40 Fax 85.24

Biochimie 930032

M. M. LAGARDE Tél 82.40 Fax 85.24

MATERIAUX DE LYON

UNIVERSITE LYON 1

EDA 034

M. J. JOSEPH ECL 04.72.18.62.44 Sec 04.72.18.62.51 Fax 04.72.18.60.90

M. J.M. PELLETIER 83.18 Fax 85.28

Génie des Matériaux : Microstructure, Comportement Mécanique, Durabilité

910527

Matériaux Polymères et Composites 910607

____________________________________________ Matière Condensée, Surfaces et Interfaces

910577

M. J.M.PELLETIER Tél 83.18 Fax 85.28 M. H. SAUTEREAU Tél 81.78 Fax 85.27 M. G. GUILLOT Tél 81.61 Fax 85.31

MATHEMATIQUES ET

INFORMATIQUE FONDAMENTALE

(Math IF)

EDA 409

M. F. WAGNER UCBL1 04.72.43.27.86 Fax 04.72.43.00.35

M. J. POUSIN 88.36 Fax 85.29

Analyse Numérique, Equations aux dérivées partielles et Calcul Scientifique

910281

M. G. BAYADA Tél 83.12 Fax 85.29

MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE

CIVIL, ACOUSTIQUE

(MEGA)

EDA162

M. F. SIDOROFF ECL 04.72.18.61.56 Sec 04.72.18.61.60 Fax 04.78.64.71.45

M. G.DALMAZ 83.03 Fax 04.72.89.09.80

Acoustique 910016

Génie Civil

992610 Génie Mécanique

992111

Thermique et Energétique 910018

M. J.L. GUYADER Tél 80.80 Fax 87.12 M. J.J.ROUX Tél 84.60 Fax 85.22 M. G. DALMAZ Tél 83.03 Fax 04.78.89.09.80 M. J. F. SACADURA Tél 81.53 Fax 88.11

En grisé : Les Ecoles doctorales et DEA dont l’INSA est établissement principal

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REMERCIEMENTS

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SOMMAIRE

AVANT-PROPOS__________________________________________________________ 11

Abréviations ______________________________________________________________ 12

Résumé __________________________________________________________________ 14

INTRODUCTION _________________________________________________________ 15

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES____________________________________________ 18

LES PLAQUETTES SANGUINES____________________________________________ 19 1. Origine et structure ________________________________________________________ 19 2. Physiologie________________________________________________________________ 21 3. Les lipides plaquettaires_____________________________________________________ 22

3.1. Les glycérophospholipides________________________________________________________ 23 3.2. L’acide arachidonique ___________________________________________________________ 23

LES PHOSPHOLIPASES A2 (PLA2) __________________________________________ 35 1. Généralités et classification __________________________________________________ 35 2. Les phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) _______________________________________ 40 3. Les phospholipases A2 indépendantes du calcium (iPLA2)_________________________ 42 4. Les PAF-acétylhydrolases ___________________________________________________ 43 5. Les phospholipases A2 cytosoliques (cPLA2) ____________________________________ 44

5.1. La PLA2 IVA (ou cPLA2α) _______________________________________________________ 44 5.2. La PLA2 IVB (ou cPLA2 β) _______________________________________________________ 50 5.3. La PLA2 IVC (ou cPLA2 γ) _______________________________________________________ 50

LES KINASES DE STRESS _________________________________________________ 51 1. Généralités sur les kinases ___________________________________________________ 51 2. Les ERKs_________________________________________________________________ 52 3. Les SAPKs________________________________________________________________ 53 4. ERK5 ____________________________________________________________________ 56 5. Kinases et cPLA2___________________________________________________________ 57 6. Rôle des protéines phosphatases dans l’activation des MAPKs_____________________ 57

STRESS OXYDANT________________________________________________________ 59 1. La lipoperoxydation enzymatique_____________________________________________ 59 2. La lipoperoxydation non enzymatique _________________________________________ 60

2.1. Notion de radical libre ___________________________________________________________ 60 2.2. Phase d’initiation _______________________________________________________________ 61 2.3. Phase de propagation ____________________________________________________________ 62 2.4. Phase de terminaison ____________________________________________________________ 63

3. Protection contre la lipoperoxydation _________________________________________ 64 3.1. Les enzymes antioxydantes _______________________________________________________ 64 3.2. Antioxydants non enzymatiques ___________________________________________________ 70

LES LIPOPROTEINES_____________________________________________________ 74 1. Structure _________________________________________________________________ 74

1.1. Partie lipidique_________________________________________________________________ 74

8

1.2. Partie protéique : les apolipoprotéines ou apoprotéines__________________________________ 75 2. Classification______________________________________________________________ 76 3. Métabolisme des lipoprotéines _______________________________________________ 78 4. Les lipoprotéines de basse densité (LDL) _______________________________________ 79

4.1. Composition des LDL humaines ___________________________________________________ 79 4.2. Modifications des LDL __________________________________________________________ 81 4.3. Interaction LDL / plaquettes ______________________________________________________ 81

Le diabète sucré et ses complications __________________________________________ 83 1. Le diabète de type 1 ________________________________________________________ 83 2. Le diabète de type 2 ________________________________________________________ 84 3. La toxicité du glucose _______________________________________________________ 84

3.1. La glycosylation non-enzymatique ou glycation _______________________________________ 85 3.2. Glycation des lipoprotéines _______________________________________________________ 88 3.3. Conséquences de la glycoxydation des lipoprotéines ___________________________________ 88

MATERIELS & METHODES _______________________________________________ 89

MATERIELS _____________________________________________________________ 90 1. REACTIFS _______________________________________________________________ 90

1.1. Produits ______________________________________________________________________ 90 1.2. Produits radioactifs _____________________________________________________________ 90 1.3. Autres réactifs _________________________________________________________________ 90

2. APPAREILS ______________________________________________________________ 91 METHODES _____________________________________________________________ 92

Préparation des plaquettes sanguines __________________________________________ 92 1. Isolement des plaquettes sanguines____________________________________________ 92 2. Numération plaquettaire ____________________________________________________ 92 3. Tests d’agrégation plaquettaire_______________________________________________ 92

Effet du 12-HpETE sur les plaquettes sanguines _________________________________ 93 1. Etude de la libération d’acide arachidonique des phospholipides membranaires ______ 93

1.1. Marquage des plaquettes par le [3H]-AA et mesure du pourcentage de [3H]-AA estérifié dans les phospholipides et non estérifié _________________________________________________________ 93 1.2. Quantification de l’acide arachidonique estérifié dans les phospholipides totaux plaquettaires par chromatographie en phase gazeuse ______________________________________________________ 94

2. Préparation des échantillons plaquettaires destinés à une étude par « western blotting » 97 2.1. Echantillons destinés à l’étude de la cPLA2___________________________________________ 97 2.2. Echantillons destinés à l’étude de la p38 MAPK_______________________________________ 98

3. Dosage protéique des échantillons_____________________________________________ 98 4. Analyse par « western blotting »______________________________________________ 98

4.1. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en milieu dénaturant (SDS-PAGE) ________________ 98 4.2. Electro-transfert ________________________________________________________________ 99 4.3. Traitements des membranes de nitrocellulose _________________________________________ 99 4.4. Révélation par ECL (Enhanced ChemiLuminescence) _________________________________ 100 4.5. Quantification des bandes _______________________________________________________ 101

5. Mise en évidence de la formation endogène de 12-HpETE________________________ 101 6. Dosage de l’activité GPx ___________________________________________________ 102

6.1. Principe _____________________________________________________________________ 102 6.2. Protocole ____________________________________________________________________ 102

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7. Dosage du TxB2___________________________________________________________ 103 Interactions des LDL avec les plaquettes ______________________________________ 105

1. Isolement des LDL ________________________________________________________ 105 1.1. Séparation des lipoprotéines par ultracentrifugation séquentielle _________________________ 105 1.2. Séparation des lipoprotéines par FPLC _____________________________________________ 105

2. Dosage des triglycérides ____________________________________________________ 107 3. Dosage du cholestérol ______________________________________________________ 108 4. Caractérisation des LDL ___________________________________________________ 109

4.1. Dosage des protéines ___________________________________________________________ 109 4.2. Dosage de la vitamine E_________________________________________________________ 109 4.3. Dosage du dialdéhyde malonique (MDA) ___________________________________________ 110 4.4. Electrophorèse sur gel d’agarose __________________________________________________ 111

5. Modifications des LDL in vitro ______________________________________________ 112 6. Interactions LDL / plaquettes sanguines ______________________________________ 113 7. Etude de la p38 MAPK plaquettaire__________________________________________ 113 8. Etude de la phosphorylation de la cPLA2 plaquettaire___________________________ 113 9. Dosage du TxB2___________________________________________________________ 114 10. Analyses statistiques_______________________________________________________ 114

RESULTATS ET DISCUSSION _____________________________________________ 115

Effets d’un hydroperoxyde lipidique, le 12-HpETE, sur les plaquettes sanguines humaines.________________________________________________________________________ 116

1. Effet du 12-HpETE sur la cPLA2 ____________________________________________ 116 1.1. Phosphorylation de la cPLA2 _____________________________________________________ 116 1.2. Translocation de la cPLA2 _______________________________________________________ 119

2. Etude de la libération de l’AA des phospholipides membranaires plaquettaires______ 121 2.1. Libération de [3H]-AA des phospholipides membranaires ______________________________ 121 2.2. Concentration d’AA estérifié dans les phospholipides totaux plaquettaires par chromatographie en phase gazeuse _____________________________________________________________________ 123

3. Effet du 12-HpETE sur la concentration basale de TxB2 _________________________ 126 4. Effet du 12-HpETE sur la p38 MAPK ________________________________________ 127

4.1. Effet d’un inhibiteur de p38 MAPK sur la concentration d’AA estérifié dans les phospholipides 127 4.2. Activation de la p38 MAPK par le 12-HpETE _______________________________________ 128 4.3. Effet du 12-HpETE « endogène » sur la phosphorylation de la p38 MAPK _________________ 131 4.4. Effet de la diminution de l’activité de la GPx sur la phosphorylation de la p38 MAPK ________ 134 4.5. Effet de la N-acétyl-cystéine sur l’activation de la p38 MAPK___________________________ 135 4.6. Activation de la p38 MAPK dans les plaquettes issues de patients diabétiques ______________ 136

5. Discussion _______________________________________________________________ 138 Effets des LDL sur les plaquettes sanguines humaines ___________________________ 143

1. Effets de LDL modifiées in vitro sur les plaquettes sanguines _____________________ 143 1.1. Modifications et caractérisation des LDL ___________________________________________ 144 1.2. Effet des LDL modifiées sur la p38 MAPK plaquettaire________________________________ 150 1.3. Effet des LDL modifiées sur la cPLA2 plaquettaire____________________________________ 152 1.4. Effet des LDL modifiées sur la concentration basale de TxB2 plaquettaire__________________ 154

2. Effets de LDL de patients diabétiques sur les plaquettes sanguines ________________ 155 2.1. Caractéristiques des patients diabétiques et des témoins ________________________________ 155 2.2. Isolement des LDL par FPLC ____________________________________________________ 155 2.3. Dosage du MDA des LDL _______________________________________________________ 157 2.4. Effet des LDL de patients diabétiques sur la p38 MAPK plaquettaire _____________________ 157

10

2.5. Effet des LDL de patients diabétiques sur la concentration basale de TxB2 plaquettaire _______ 158 3. Discussion _______________________________________________________________ 159

CONCLUSION & PERSPECTIVES _________________________________________ 164

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ______________________________________ 168

11

AVANT-PROPOS

Le travail exposé dans ce mémoire a fait l’objet de publications publiées ou en préparation. Ces résultats ont également été présentés par communications affichées lors de congrès ou de journées scientifiques. Publications

Calzada, C., Véricel, E., Mitel, B., Coulon, L. and Lagarde, M. 12(S)Hydroperoxy-eicosatetraenoic acid increases arachidonic acid availability in collagen-primed platelets. J Lipid Res, 2001, vol 42, 1467-1473 Coulon, L., Calzada, C., Moulin, P., Véricel, E. and Lagarde, M. Activation of p38 mitogen-activated protein kinase/cytosolic phospholipase A2 cascade in hydroperoxide-stressed platelets. Free Radic Biol Med, 2003, vol 35, 616-625 Calzada, C, Coulon, L., Halimi, D., Pruneta, V., Moulin, P., Véricel, E. and Lagarde, M. Effect of LDL modified by glycation and/or oxidation on human platelets. (en préparation) Communications

Coulon, L., Calzada, C., Moulin, P., Véricel, E., Lagarde, M. Role Du Stress Oxydant dans l’activation des Plaquettes sanguines. Congrès de l’Institut Multidisciplinaire Biologie des Lipides, Villeurbanne, France, 25 novembre, 2003. Coulon, L., Calzada, C., Moulin, P., Véricel, E., Lagarde, M. Role of oxidative stress in activation of platelets. Congrès GERLI, Paris, France, 1-5 Septembre, 2003. Coulon, L., Calzada, C., Véricel, E., Lagarde, M. Lipid hydroperoxides and human platelet cytosolic phospholipase A2. Congrès de l’Institut Multidisciplinaire Biologie des Lipides, Villeurbanne, France, 12 octobre, 2002. Calzada, C., Coulon, L., Véricel, E., Mitel, B., Lagarde, M. Hydroperoxydes lipidiques et phospholipases A2 cytosolique plaquettaire. Congrès GERLI-SFA, Montpellier, France, 24-25 avril, 2001. Calzada, C., Coulon, L., Véricel, E., Lagarde, M. Activation of platelet cytosolic phospholipase A2 by arachidonic acid hydroperoxide. 43rd International Conference on the Bioscience of Lipids (ICBL), Graz, Austria, 11-14 septembre, 2002. Calzada, C., Coulon, L., Moulin, P., Véricel, E., Lagarde, M. Role of oxidative stress in platelet activation. 44th International Conference on the Bioscience of Lipids (ICBL), Oxford, UK, 7-11 septembre, 2003.

12

Abréviations

aa acide aminé AA acide arachidonique AG acide gras AGPI acide gras polyinsaturé AGE « advanced glycation end-products » (produits finaux de glycation avancée) AMPc adénosine monophosphate cyclique BHT butylhydroxytoluène ou 2,6-di-tert-butyl-4-méthylphénol BSA « bovine serum albumin » (albumine sérique bovine) COX cyclooxygénase CCM chromatographie sur couche mince CML carboxyméthyllysine CPG chromatographie en phase gazeuse Da daltons DAG diacylglycérol DHA acide docosahexaénoïque (22:6 n-3) DTT 1,4-dithiothréitol DTNB acide 5,5’-dithio-bis-(2-nitrobenzoïque) EDTA ethylenediamine-tetraacetic acid EPA acide eicosapentaénoïque (20:5 n-3) GMPc guanosine monophosphate cyclique GPx glutathion peroxydase GSH glutathion réduit GSSG glutathion oxydé 12-HETE acide 12-hydroxy-eicosatétraénoïque 12-HpETE acide 12-hydroperoxy-eicosatétraénoïque HHT acide 12-hydroxy-5,8,10-heptadécatriènoïque HEPES acide (hydroxy-2-éthyl)-4-pipérazinyl-1,2-éthanesulfonique 4-HNE 4-hydroxy-2-nonénal HPLC « high performance liquid performance » (chromatographie liquide haute performance) IP3 inositol 1,4,5-triphosphate LOX lipoxygénase MDA dialdéhyde malonique min minute MS « mass spectrometry » (spectrométrie de masse) NO monoxyde d’azote PAF platelet-activating factor PC phosphatidylcholine PDGF « platelet-derived growth factor » PE phosphatidyléthanolamine PI phosphatidylinositol PIP phosphatidylinositol-4-phosphate PIP2 phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PG prostaglandine PGH synthase prostaglandine synthase PKC protéine kinase C

13

PL phospholipide PLA2 phospholipase A2 PLC phospholipase C PLD phospholipase D PPP plasma pauvre en plaquettes PRP plasma riche en plaquettes PS phosphatidylsérine ROS « reactive oxygen species » (dérivés réactifs de l’oxygène) rpm rotations par minute SDS-PAGE électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes-sodium dodécyl sulfate SOD superoxyde dismutase t-BuOOH tert-butyl-hydroperoxyde Tx thromboxane

14

Résumé De nombreux travaux soulignent le rôle significatif des peroxydes lipidiques dans le risque

vasculaire associé à certaines pathologies telles que le diabète. Ils pourraient notamment être

impliqués dans l’hyperactivité plaquettaire observée dans les phénomènes d’athérothrombose.

L’objectif de nos travaux a été d’étudier l’effet d’un stress oxydant, induit par des

hydroperoxydes lipidiques endogènes ou des LDL modifiées, sur les voies de signalisation

plaquettaire conduisant à la libération de l’acide arachidonique (AA) des phospholipides

membranaires (PL) et à la formation d’un des métabolites proagrégants de l’AA, le

thromboxane A2 (TxA2). Dans la première partie du travail, nous montrons que l’acide 12-

hydroperoxy-eicosatétraénoïque (12-HpETE), hydroperoxyde dérivé de l’AA via la 12-

lipoxygénase, active la p38 MAPK et l’un de ses substrats, la phospholipase A2 cytosolique

(cPLA2α). Ces activations ont été mises en évidence par l’étude du niveau de phosphorylation

de ces protéines, ainsi que par l’étude de la translocation de la cPLA2 du cytosol vers la

membrane plasmique. Concomitamment à cette double activation, une diminution de la

quantité d’AA estérifié dans les PL et une augmentation de la concentration de TxB2,

catabolite stable du TxA2, ont été observées. De plus l’inhibition partielle de l’activité de la

glutathion peroxydase favorise la formation endogène de 12-HpETE et résulte en une

augmentation de la phosphorylation de la p38 MAPK. Par ailleurs, une activation de la

p38MAPK a été observée dans les plaquettes issues de patients souffrant de diabète de type 2,

pathologie associée à un stress oxydant.

Dans la deuxième partie, nous montrons que des LDL oxydées ou glycoxydées in vitro,

augmentent la phosphorylation de la p38 MAPK et de la cPLA2 et in fine la concentration

basale de TxB2 plaquettaire. Par contre, les LDL natives ou glyquées in vitro sont sans effet

sur les plaquettes. De plus, des LDL issues de patients diabétiques de type 2 tendent à activer

la p38 MAPK plaquettaire et à augmenter la concentration basale de TxB2.

En résumé, le stress oxydant, notamment dû au 12-HpETE ou à des LDL modifiées, active la

cPLA2α via la phosphorylation de la p38MAPK et conduit à une formation accrue de TxA2. Il

pourrait jouer un rôle non négligeable dans l’hyperfonctionnement des plaquettes sanguines

observé dans certaines pathologies comme le diabète.

15

INTRODUCTION

16

Il semble de plus en plus évident que le stress oxydant joue un rôle important dans le

développement de l'athérosclérose (Lusis, 2000). L'hyperfonctionnement des plaquettes

sanguines est impliqué dans les complications thrombotiques de l'athérosclérose, à savoir

l'athérothrombose dont l'incidence augmente avec l'âge et dans certaines pathologies comme

le diabète. Au sein du laboratoire, des études ont permis de mettre en évidence dans les

plaquettes sanguines de personnes âgées un déséquilibre entre la production de peroxydes

lipidiques et les systèmes de protection contre ces peroxydes. Il a ainsi été montré que

l’hyperagrégabilité des plaquettes de personnes âgées était associée à une augmentation du

métabolisme de l’acide arachidonique (AA), via les voies de la 12-lipoxygénase et de la

prostaglandine H synthase, et à une diminution des défenses antioxydantes (Véricel et al.,

1988 & 1992). Parmi celles-ci, l'activité et la quantité de glutathion peroxydase cytosolique

(GPx1) sont diminuées (Rey et al., 1994). Or cette enzyme est la seule capable de réduire les

hydroperoxydes lipidiques dont l’acide 12-hydroperoxy-eicosatétraénoique (12-HpETE)

formé par la 12-lipoxygénase plaquettaire à partir de l’AA. Cela laisse donc supposer une

augmentation de la durée de vie des hydroperoxydes lipidiques et plus particulièrement du 12-

HpETE ce qui pourrait lui conférer un rôle significatif dans l'activation plaquettaire. Des

études au sein de l’équipe ont montré que le 12-HpETE diminue le seuil d’activation

plaquettaire en potentialisant l’agrégation de plaquettes stimulées par l’AA et la formation de

thromboxane B2 (TxB2), catabolite du TxA2, puissant agent pro-agrégant et vasoconstricteur

(Calzada et al., 1997). Par ailleurs, nous avons également montré que des concentrations

nanomolaires de 12-HpETE augmentent la concentration d’AA non estérifié dans des

plaquettes stimulées par des concentrations non agrégantes de collagène (Calzada et al.,

2001). De plus, l’addition d’un inhibiteur de la phospholipase A2 cytosolique (cPLA2),

enzyme principalement impliquée dans la libération d'AA des phospholipides membranaires,

s’oppose à l’augmentation de la concentration d’AA non estérifié, suggérant une activation de

la cPLA2 par le 12-HpETE.

Dans le but de préciser le mécanisme d'action du 12-HpETE, nos recherches se sont

poursuivies sur l’effet direct du 12-HpETE sur la voie de signalisation conduisant à la

libération d’AA des phospholipides membranaires via la cPLA2 et in fine à la production de

TxA2. Dans un premier temps, nous avons cherché à mettre en évidence l'activation

potentielle de la cPLA2 en déterminant son niveau de phosphorylation et sa translocation du

cytosol à la membrane sous l'action du Ca2+. Puis, l'impact du 12-HpETE sur la cascade de

l'AA a été étudié en quantifiant la concentration d’AA estérifié dans les phospholipides et le

17

taux de TxB2, catabolite stable du TxA2. Comme la p38 MAPK représente un signal clé

d'activation des voies de signalisation lipidique conduisant à l'agrégation plaquettaire

(Saklatvala et al., 1996) et est notamment impliquée dans la phosphorylation de la cPLA2 plaquettaire, son taux de phosphorylation a été déterminé dans les plaquettes stimulées par le

12-HpETE.

Dans des situations physiopathologiques s'accompagnant d'un stress oxydant, l'augmentation

de la peroxydation lipidique peut résulter d'une diminution des défenses antioxydantes. Nous

avons alors recherché si une diminution de l'activité de la GPx favorise l'accumulation de 12-

HpETE et augmente l’activation de la p38 MAPK plaquettaire. Enfin, nous avons déterminé

l’état d’activation de la p38 MAPK dans des plaquettes issues de patients souffrant d’un

diabète de type 2, pathologie caractérisée entre autres par une hyperactivité plaquettaire et un

stress oxydant.

Le stress oxydant survenant dans certaines pathologies comme le diabète de type 2, s’exerce

au niveau des éléments figurés du sang mais également au niveau des particules circulantes

riches en lipides, les lipoprotéines. Bien que les LDL oxydées soient principalement

impliquées dans la formation des plaques d’athérome, une faible quantité de LDL oxydées

pourrait également être présente dans la circulation sanguine (Hörkkö et al., 1999),

notamment lorsque les défenses antioxydantes plasmatiques sont altérées. Les lipoprotéines

de faible densité (LDL) de diabétiques peuvent donc subir des modifications liées à

l'environnement hyperglycémique ainsi qu'une oxydation des lipides résultant d'un

déséquilibre de l'état pro/antioxydant en faveur du premier et d’une auto-oxydation du

glucose. Sachant que les plaquettes des diabétiques sont hyperagrégables (Bensoussan et al.,

1975), nous avons émis l'hypothèse que l'interaction des LDL modifiées par glycation et/ou

oxydation avec les plaquettes de diabétiques pourrait contribuer à leur hyperfonctionnement.

Notre objectif principal a été de déterminer si des LDL modifiées in vitro par le glucose et/ou

par une oxydation modérée sont susceptibles d'activer les plaquettes et plus précisément la

voie de signalisation conduisant à l'activation de la cPLA2 via la p38 MAPK et à la synthèse

de TxA2. Un deuxième objectif a été de mettre en interaction des LDL issues du plasma de

diabétiques de type 2 avec des plaquettes de témoins et de définir l'effet de ces LDL sur le

taux de p38 MAPK phosphorylée et la concentration basale de TxB2 plaquettaires.

18

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

19

LES PLAQUETTES SANGUINES

1. Origine et structure

Les plaquettes sanguines sont les plus petits éléments figurés du sang (2 à 3 µm de diamètre).

Ce sont des fragments cellulaires anucléés provenant de mégacaryocytes médullaires ; ces

grosses cellules d’une taille moyenne de 30 µm proviennent des mêmes cellules souches

pluripotentes qui donnent également naissance aux érythrocytes et aux leucocytes. Chaque

mégacaryocyte donne environ 2000 plaquettes, cette maturation se déroule au niveau de la

moelle osseuse et est en partie régulée par une hormone, la thrombopoïétine. Dans le sang

humain, le nombre de plaquettes varie de 130000 à 400000 par µl et leur durée de vie est de 8

à 10 jours. A l’état normal, les deux tiers de la population plaquettaire circulent dans le sang

et un tiers est séquestré dans la rate. Elles sont ensuite phagocytées par le système

monocytaire macrophagique de la rate, du foie et de la moelle osseuse (revue Blache, 1992).

Les plaquettes présentent, à l’état de repos, une forme ovoïde d’un volume de 6 à 8 µm3

maintenue par un réseau de microtubules. Les plaquettes sont constituées (revue George,

2000) :

d’une membrane plasmique très riche en lipides et comportant des récepteurs

(glycoprotéines) d’agents induisant l’agrégation. Elle possède un réseau de

profondes invaginations, le système canaliculaire ouvert, qui a pour origine les

restes des membranes de démarcation qui séparent les zones plaquettaires de leurs

parents les mégacaryocytes. Ce dernier facilite les mécanismes d’endocytose et de

sécrétion des plaquettes. Parmi les autres systèmes membranaires, le système

tubulaire dense, équivalent du réticulum endoplasmique lisse dans les autres

cellules, renferme le calcium et les enzymes impliquées dans la synthèse de

prostaglandines.

d’un cytoplasme contenant plusieurs systèmes fibrillaires tels que les

microfilaments à base d’actine et de myosine, les microtubules et les filaments

intermédiaires. Ces derniers permettent de maintenir la structure des plaquettes au

repos et interviennent également lors du changement morphologique des

20

plaquettes activées. Le cytoplasme contient également différents organites tels

que :

Les granules denses : ils contiennent de l’ADP et du Ca2+, deux composés qui renforcent

l’activation plaquettaire, ainsi que de la sérotonine et de l’ATP.

Les granules alpha : contenant le facteur de von Willebrand et le facteur plaquettaire 4 qui

sont synthétisés dans les mégacaryocytes, le fibrinogène, acquis dans le plasma à partir de

récepteurs spécifiques, la β-thromboglobuline et le PDGF (Platelet Derived Growth Factor).

Les lysosomes : riches en enzymes de dégradation telles que des protéases, des hydrolases

acides et des collagénases.

Les peroxysomes : riches en catalase, enzyme réduisant le peroxyde d’hydrogène (voir chap.

stress oxydant, « antioxydants enzymatiques »).

Les mitochondries

Les granules de glycogène

Figure 1: Micrographie électronique de plaquettes au repos (A) et activées (B) (d’après George, 2000)

A B

21

2. Physiologie

A la suite de l’altération d’un vaisseau sanguin, l’exposition de certains facteurs, notamment

le collagène (Nakamura et al., 1999) et le facteur de von Willebrand (Zaffran et al., 2000),

entraîne l’adhérence des plaquettes au niveau du vaisseau endommagé et leur activation. Le

collagène interagit avec la glycoprotéine Ia/IIa (GPIa/IIa) et le facteur de von Willebrand avec

le complexe GPIb/IX. Ces interactions, outre la fixation des plaquettes à la matrice sous

endothéliale, conduisent également à la génération d’un signal intracellulaire qui induit

l’activation du récepteur GPIIb/IIIa. Une fois activé, ce dernier possède une forte affinité pour

le fibrinogène (Shattil, 1999). La fixation du fibrinogène sur son récepteur entraîne une

amplification de l’activation plaquettaire. Au cours de cette activation, les plaquettes sous

forme discoïde à l’état de repos, subissent une restructuration avec formation de pseudopodes

(Figure 1) et relargage des granules de sécrétion.

Il existe de nombreux agonistes impliqués dans l’activation plaquettaire, tels que : l’ADP, la

thrombine, le collagène, le facteur d’activation plaquettaire (PAF), la sérotonine,

l’épinéphrine. Il est intéressant de noter que certains agonistes contenus dans les granules de

stockage (ADP, sérotonine) (Cattaneo & Gachet, 1999) sont sécrétés lors de l’activation

plaquettaire et sont ainsi recrutés par les plaquettes avoisinantes ce qui renforce la formation

du thrombus. De plus, lors de l’altération d’un vaisseau sanguin, outre l’exposition des fibres

de collagène, les cellules endothéliales lésées libèrent de la thrombine, ce qui va activer la

cascade de coagulation et renforcer l’activation plaquettaire (Cassar et al., 2003).

L’interaction entre l’agoniste et son récepteur entraîne l’activation d’une phospholipase C

(PLC) indépendante du calcium via une protéine G. La PLC dégrade les phosphoinositides

membranaires pour former du diacylglycérol (DAG) et de l’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3).

La production de DAG et d’IP3 entraîne un afflux de calcium extracellulaire et la libération du

calcium présent dans le système tubulaire dense. L’augmentation de calcium intracellulaire

entraîne une activation de la phospholipase A2 cytosolique et de la libération d’acide

arachidonique (AA) qui est converti ensuite en agent pro-agrégant, le thromboxane A2

(TxA2). (Figure 2). L’ADP et le TxA2 générés réagissent eux-mêmes avec leurs propres

récepteurs et amplifient le signal d’activation plaquettaire.

Enfin, lors de l’altération d’un vaisseau sanguin, le clou hémostatique formé par les plaquettes

est consolidé par la fibrine pour former le thrombus blanc.

22

Figure 2: Activation plaquettaire, médiée par la PLC. PLC : phospholipase C ; PKC : protéine kinase C. PIP2 : Phosphatidyl inositol bis-phosphate. IP3 : inositol 1,4,5-triphosphate.

3. Les lipides plaquettaires

Les lipides plaquettaires comprennent les phospholipides (65-70%), les lipides neutres

(cholestérol, triglycérides et acides gras libres) (20-25%) et les glycolipides.

PIP2 DAG + IP3

Activation PKC

ADP Sérotonine

Sécrétion des granules de stockage

Mobilisation de Ca2+

Activation de cPLA2

Libération d’AA des PL membranaires

Activation de PLC via des Protéine G

Agoniste

TxA2

23

3.1.Les glycérophospholipides

Les glycérophospholipides membranaires (400 nmol/109 plaquettes) se divisent en 5 classes

majeures selon la nature du groupement polaire (Chap et al., 1977) :

Phosphatidylcholine (PC), 35%

Phosphatidyléthanolamine (PE), 26%

Phosphatidylsérine (PS), 10%

Phosphatidylinositol (PI), 6%

Sphingomyéline, 23%

Dans des plaquettes sanguines non stimulées, la position sn-1 du glycérophospholipide

comporte principalement des chaînes d’acide gras saturés (16:0 et 18:0) et monoinsaturés,

tandis que la position sn-2 comprend essentiellement l’AA (20:4 n-6) mais aussi les acides

oléique (18:1 n-9) et linoléique (18:2 n-6).

3.2.L’acide arachidonique

3.2.1 Les sources d’acide arachidonique

L’acide arachidonique (20:4 n-6) est un acide gras polyinsaturé (AGPI) à 20 atomes de

carbone comportant 4 doubles liaisons, aussi appelé acide 5, 8, 11, 14-eicosatétraénoïque. Il

s’agit de l’AGPI majeur des membranes cellulaires animales, hormis les cellules de la sphère

cérébrale (riches en acide docosahexaénoïque). Il provient en partie des phospholipides

d’origine animale apportés par l’alimentation. Outre cette source nutritionnelle, l’AA est

synthétisé, in vivo, par une série de réactions d’élongation/désaturation à partir de l’acide

linoléique (18:2 n-6). Le 18:2 n-6 ne peut être synthétisé par l’organisme et nécessite d’être

apporté par l’alimentation d’où son nom d’acide gras indispensable.

En dehors de son rôle structural dans les phospholipides membranaires, l’AA participe soit

directement, soit via ses métabolites oxygénés, les eicosanoïdes, à divers processus

biologiques.

24

3.2.2 Distribution de l’acide arachidonique dans les phospholipides

L’AA n’est pas uniformément distribué dans les différentes classes de lipides. Dans les

cellules de mammifères, la majorité de l’AA est estérifiée dans les glycérophospholipides,

presque exclusivement au niveau de la position sn-2. Deux voies d’incorporation des acides

gras dans les phospholipides ont été décrites : la voie de Kennedy ou voie de synthèse de novo

(Deykin & Desser, 1968 ; Lewis & Majerus, 1969) et la voie de Lands ou cycle de

désacylation-acylation (Lands & Merkel, 1963). Les deux voies nécessitent la formation de

l’acyl-coA correspondant catalysée par une acyl-coA synthétase et le transfert de l’acide gras

(AG) par une acyl-coA transférase (Lagarde, 1988). L’AA est très efficacement capté et acylé

dans les phospholipides plaquettaires, ceci étant dû à une arachidonoyl-coA synthétase

spécifique (Wilson et al., 1982). L’AA peut être transféré d’un phospholipide vers un

lysophospholipide sous l’action d’une transacylase (Snyder et al., 1992). Il représente 20 %

de la totalité des acides gras plaquettaires et est l’un des substrats les plus importants dans la

synthèse de médiateurs biologiques. On retrouve environ 30 µg d’AA estérifié / 109 plaquettes

au repos, soit environ 5 mM (Brash, 2001). L’AA non estérifié est présent en faible

concentration dans les cellules au repos, environ 0,1% de l’AA total soit environ 5 µM

(Burgoyne & Morgan, 1990).

3.2.3 Libération de l’acide arachidonique des phospholipides

membranaires

La principale étape limitante de la synthèse des médiateurs biologiquement actifs de l’AA est

la libération de l’AA du pool phospholipidique membranaire. Deux voies principales

conduisent à sa libération, la voie de la phospholipase A2 (PLA2) et celle de la phospholipase

C (PLC) via les acyl-glycérol lipases. Les voies des phospholipases A1 et D sont des voies

mineures (Figure 3).

a) Phospholipase A2

C’est l’enzyme principale qui libère les acides gras en position sn-2, dont l’AA (cf chapitre

PLA2).

25

b) Phospholipase C

Il existe 10 PLC d’origine mammifère que l’on sépare classiquement en 3 groupes (Rebecchi

et al., 2000) :

PLC β : 4 isoformes, β1, β2, β3, β4

PLC γ : 2 isoformes, γ1, γ2

PLC δ : 4 isoformes, δ1, δ2, δ3, δ4

Ce sont des protéines solubles, possédant plusieurs domaines (domaine C2, domaine PH,

domaine catalytique…), de masses moléculaires comprises entre 85 et 150 kDa. Elles

hydrolysent préférentiellement les phosphatidylinositides (phosphatidylinositol ou PI,

phosphatidylinositol-4-phosphate ou PIP, phosphatidylinositol-4,5-biphosphate ou PIP2) et

conduisent à la formation d’inositol phosphates (respectivement IP, IP2, IP3) et de DAG.

D’autres PLC hydrolysent principalement les PC en phosphocholine et DAG.

L’activation de ces phospholipases se fait via des récepteurs membranaires selon deux voies :

L’une est médiée par l’activation de protéines G hétérotrimériques (PLC β)

L’autre implique un système de tyrosine kinases (PLC γ)

Dans les plaquettes sanguines humaines, 7 isoformes sont présentes: γ2>β2>β 3>β1>γ1>δ1>β4 (d’après Lee et al., 1996).

Elles conduisent à l’hydrolyse du PIP2 en deux messagers :

L’inositol-1,4,5-triphosphate (IP3) se fixe à des récepteurs du système tubulaire dense

provoquant la libération dans le cytosol du Ca2+ contenu à l’intérieur de ce système

(Irvine, 1990), ainsi qu’ un influx de Ca2+ extracellulaire via les canaux CRAC (Ca2+-

released activated plasma membrane channels) de la membrane plasmique. A l’état

basal, la concentration de calcium cytosolique est approximativement de 100 nM mais

peut augmenter jusqu’à 1 µM sous stimulation par un agoniste. Cette hausse contribue

à l’activation de certaines voies effectrices (la protéine kinase C ou PKC, la PLD et la

PLA2) et est associée au changement de forme, à la sécrétion et à l’agrégation des

plaquettes (O’Rourke et al., 1987).

26

Le 1,2-diacylglycérol ou DAG permet la translocation de la PKC du cytoplasme vers

la membrane où elle est activée en présence de Ca2+ et de PS (Ha & Exton, 1993 ; Hug

& Sarre, 1993). L’activation de la PKC est associée à l’agrégation plaquettaire, à la

sécrétion et au métabolisme de l’AA (Nunn & Watson, 1987). En effet, la PKC permet

des modifications du complexe GPIIb/IIIa, induisant la fixation du fibrinogène (Shattil

& Brass, 1987) et agit en synergie avec le calcium pour activer la PLA2 (Halenda &

Rehm, 1987).

c) Phospholipase D

La phospholipase D (PLD), dont l’activité dans les plaquettes est faible (Randall et al., 1990)

clive la liaison phosphodiester des phospholipides membranaires, préférentiellement celle des

PC (Rubin, 1988), conduisant à la formation d’acide phosphatidique.

d) Phospholipase A1

Une phospholipase A1 (PLA1) a été décrite dans les plaquettes (Trugnan et al., 1979). Elle

induit la formation d’un lyso-1-phospholipide, l’action consécutive d’une lysophospholipase

permet la libération de l’AA en position sn-2.

27

R1 CO O CH2

R2 CO O CH

CH2 O P O X

O

O-

PHOSPHOLIPASE A1

PHOSPHOLIPASE A2

PHOSPHOLIPASE C

PHOSPHOLIPASE D

R2 COOH

+

Lysophospholipide

(AA)

+

Diacylglycérol (DAG)

R2 COOH (AA)

Glycérol

+

HO P O X

O

O-

DAG/MAG lipase

Figure 3: Action des phospholipases sur un glycérophospholipide et libération de l’AA. DAG : diacylglycérol. MAG : monoacylglycérol.

28

3.2.4 Métabolisme de l’acide arachidonique

Une fois libéré des PL par la PLA2 ou la voie des PLC/acyl-glycérol lipases, l’AA peut être

métabolisé par l’une des deux enzymes majeures, la prostaglandine H synthase (PGH

synthase) et la lipoxygénase (LOX), ou par la voie mineure des époxygénases (ou

cytochromes P450).

a) Voie de la prostaglandine H synthase (PGH synthase)

La PGH synthase est une protéine homodimérique (70kDa) et héminique (protoporphyrine).

Elle est ubiquiste et présente une spécificité de substrat assez étroite : elle requiert en effet 3

doubles liaisons en position 8, 11, 14 des AG à 20 carbones correspondant aux acides

dihomo-γ-linolénique ( 20:3 n-6), arachidonique (20:4 n-6) et eicosapentaénoïque (20:5 n-3),

l’AA étant de loin son substrat préférentiel. La PGHS produit les prostaglandines (PG)

intervenant dans les phénomènes d’inflammation ou de coagulation selon le type cellulaire où

elle s’exprime (revue Smith et al., 1991).

Cette enzyme est bifonctionnelle, elle comprend une activité cyclooxygénase qui forme la

prostaglandine G2 (PGG2) à partir de l’AA et une activité hydroperoxydase qui réduit la PGG2

formée en PGH2 (Figure 4).

29

Figure 4: Métabolisme de l’AA dans les plaquettes sanguines : voie de la PGH synthase. Pour les PGF2α, PGD2, PGE2, TxA2 et TxB2, la suite de la structure est identique à celle de la PGH2.

COOH

2O2Cyclooxygénase

2 e-Hydroperoxyd ase

COOH

OHO

HO

HO

HO

O

HO

COOH

OH+

O

O

O

O

O

OH

HO

Acide Arachidonique

PGG2

PGH2

PGE 2

PGD2

PGF2α

HHT

MD A

T XA 2

TXB2

H2O

Thromboxanesynthase

O

O

COOH

OOH

O

O

30

Deux isoformes distinctes de la PGH synthase ont été décrites, une forme dite constitutive

(PGHS-1) car elle est exprimée dans la plupart des tissus en l’absence de stimulation et une

forme dite inductible (PGHS-2) car exprimée en réponse à de nombreux agents comme les

cytokines (interleukines, TNFα (tumor necrosis factor) ou les facteurs de croissance (EGF

(epidermal growth factor)…) (Herschman, 1996) mais exprimée constitutivement dans

certains organes (prostate, rein, cerveau). La PGHS est activée par des concentrations

nanomolaires d’hydroperoxydes, plus précisement la PGHS-2 est activée par un taux

d’hydroperoxydes beaucoup plus faible (2,2 nM) que la PGHS-1 (21 nM). Il est à noter que

les plaquettes n’expriment que la PGHS-1 (Kulmacz & Wang, 1995).

Les 2 isoformes diffèrent également par la sensibilité à des molécules inhibitrices. Ainsi, les

anti-inflammatoires non stéroïdiens, qui agissent sur la composante cyclooxygénase et non sur

l’activité hydroperoxydasique, inhibent différemment les 2 isoformes. Par exemple, l’aspirine

inhibe irréversiblement la PGHS-1 mais partiellement la PGHS-2 qui produit alors du 15(R)-

HETE. (Lecomte et al., 1994). Les glucocorticoïdes inhibent quant à eux spécifiquement

l’expression de la PGHS-2 (Kujubu & Herschman, 1992).

La PGH2 ainsi synthétisée peut ensuite être isomérisée par différentes enzymes selon les

cellules : la thromboxane synthase, la prostacycline synthase et plusieurs prostaglandine-

isomérases ou réductases. Dans les plaquettes, la thromboxane synthase permet la synthèse

de thromboxane A2 (TxA2) par isomérisation de la PGH2. Le TxA2 est ultérieurement stabilisé

en produit inactif, le TxB2, par hydratation. La même enzyme catalyse la production d’un

acide gras hydroxylé, l’acide 12-hydroxy-5,8,10-heptadécatriénoïque (HHT) et du dialdéhyde

malonique (MDA) par coupure du cyclopentane de la PGH2. Ces deux composés peuvent être

également formés non enzymatiquement. Enfin, des isomérases ou réductases forment les

prostaglandines primaires (PGE2, PGD2, PGF2α) (cf Figure 4).

L’activité des prostanoïdes est très variable. Le TxA2, et dans une moindre mesure les PGG2

et PGH2, sont des agents proagrégants plaquettaires (Hamberg et al., 1974). HHT a, quant à

lui, un effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire induite par les analogues de PGH2 (Croset

& Lagarde, 1983).

b) Voie des lipoxygénases

Les lipoxygénases (LOXs) sont des protéines, d’une masse moléculaire de 75-80 kDa chez les

mammifères, qui catalysent l’addition d’une molécule d’oxygène dans les AGPI, conduisant à

31

la formation d’hydroperoxydes d’AG. Ces hydroperoxydes sont rapidement réduits par la

glutathion peroxydase (GPx) en dérivés hydroxylés.

Les LOXs sont largement répandues dans le règne végétal (Casey, 1999 ; Grechkin, 1998) et

animal (Brash, 1999 ; Kühn & Thiele, 1999). Une vingtaine de séquences ont été publiées

jusqu'à présent (Kühn & Thiele, 1999) qui représentent aux moins 7 isoformes différentes

réparties entre les différentes espèces.

On décrit classiquement les 5-, 12-, et 15-lipoxygénases selon qu’elles catalysent l’addition

d’une molécule d’oxygène sur le carbone 5, 12 ou 15 de l’acide arachidonique substrat

(Spector et al., 1988 ; Brash, 1999 ; Kühn & Thiele, 1999). Une autre classification, qui prend

en compte le mode de fonctionnement des enzymes et leur phylogenèse, est maintenant plus

classiquement utilisée. Ainsi, les LOXs de mammifères peuvent être divisées en 4 sous

groupes (Figure 5).

Figure 5 : classification des différentes LOXs (d’après Kühn & Borchert, 2002)

Ces enzymes possèdent un domaine « baril β » en N-terminal et un large domaine catalytique

contenant un atome de fer ferreux non héminique. L’atome de fer est fixé via des résidus

histidines et isoleucines présents dans la protéine.

12/15-LOXs

Famille des LOXs

LOXs épidermiques

5-LOXs 12-LOXs plaquettaires

15-LOX de lapin 15-LOX humaine 12-LOX leucocytaire porcine 12-LOX leucocytaire murine

12R-LOX épidermique humaine 12R-LOX épidermique murine 15S-LOX épidermique humaine

8S-LOX épidermique murine

5-LOX murine 5-LOX humaine 5-LOX de rat 5-LOX de hamster

12-LOX plaquettaire humaine 12-LOX plaquettaire murine

32

Le mécanisme d’action est composé de 3 étapes successives (Figure 6) :

Enlèvement stéréospécifique d’un atome d’hydrogène du groupement méthylène

d’une structure pentadiène, ce qui donne un radical pentadiényle. Plus précisément,

l’H sort sous forme de proton et l’e- résultant est capté par le fer ferrique.

Réarrangement radicalaire et formation d’une double liaison conjuguée Z, E.

Insertion stéréospécifique d’une molécule d’O2 en position C1 ou C4 de la structure

pentadiène précédemment formée. Le radical hydroperoxyle formé est ensuite réduit

sous forme anionique et l’enzyme est réoxydée sous forme ferrique.

Figure 6: Mécanisme de réaction possible des lipoxygénases (d’après Kühn & Borchert, 2002)

On peut noter que chez les mammifères cette enzyme est stéréospécifique et conduit à la

formation d’énantiomères de forme (S) bien qu’une forme (R) ait été décrite dans l’épiderme

humain (Boeglin et al., 1998). A l’opposé de la cyclooxygénase, la 12-LOX est beaucoup

moins spécifique car elle ne nécessite que le motif 1,4-cis,cis-pentadiène (Lagarde, 1988).

Elle possède une affinité plus grande pour les AGPI à 20 carbones, comme l’AA, mais des

substrats à 18 ou 22 carbones sont également métabolisés par la 12-LOX. Il est intéressant de

LOX-Fe2+·L

LOX-Fe3+

LOX-Fe3+ LOO-

LOX-Fe2+ LOO·

LH

H+

O2

LOOH

LOX-Fe2+

Activation par des peroxydes

33

noter que comme pour la Cox, une faible quantité d’hydroperoxyde (inférieure à 1 µM)

permet de diminuer le temps de latence au démarrage de l’enzyme (Yokoyama et al., 1986),

l’hydroperoxyde permettant le passage du fer de la forme ferreuse enzymatiquement inactive

à la forme ferrique.

COOHAcide

Arachidonique

12-lipoxygénaseO2

COOH

HOO12-HpETE

COOH

HO12-HETE

Glutathion peroxydase

Figure 7: Métabolisme de l’AA dans les plaquettes : voie de la 12-lipoxygénase

Dans les plaquettes sanguines, la 12-LOX (découverte en 1974 par Hamberg & Samuelsson)

est présente dans le cytoplasme puis transloquée à la membrane suite à l’activation des

plaquettes (Ozeki et al.,1999). Elle catalyse la fixation d’une molécule d’oxygène sur le

carbone 12 de l’AA et donne un hydroperoxyde, l’acide 12(S)-hydroperoxy-5,8,10,14-

eicosatétraénoïque (12(S)-HpETE). Celui-ci est principalement réduit en acide 12(S)-

hydroxy-5,8,10,14-eicosatétraénoïque (12(S)-HETE) par la glutathion peroxydase (cf Figure

7). Le 12-HpETE et le 12-HETE ont des actions variables sur l’agrégation plaquettaire. Ils ont

été considérés comme des inhibiteurs de l’agrégation induite par les PGG2/H2 et par le TxA2

34

(Croset & Lagarde, 1983). D’autres études ont montré que le 12-HpETE aurait un effet

inhibiteur sur l’agrégation induite par le collagène (Sekiya et al., 1990), mais potentialiserait

l’agrégation induite par la thrombine (Sekiya et al., 1991). Il a également été montré que de

fortes concentrations d’hydroperoxydes (5µM) inhibent la COX (Siegel et al., 1979) tandis

que de faibles concentrations (100 nM) l’activent (Hemler et al., 1979 ; Calzada et al., 1997).

De même, de fortes concentrations de 12-HpETE inhibent la thromboxane synthase et

l’activité diacylglycérol lipase (Hammarström & Falardeau, 1977 ; Rittenhouse-Simmons,

1980).

Enfin, le 12-HpETE est connu pour activer sa propre synthèse en augmentant l’activité de la

12-lipoxygénase plaquettaire humaine (Croset & Lagarde, 1985).

D’autres métabolites, en plus faible quantité, peuvent être formés par cette voie comme les

hépoxilines (métabolites du 12-HpETE comportant une fonction hydroxyle et une fonction

époxyde) (Pace-Asciak et al., 1995).

c) Voie des époxygénases ou cytochromes P450

Des produits d’époxygénase à cytochromes P450 sont formés par l’addition d’un atome

d’oxygène au niveau d’une double liaison conduisant à la formation d’époxydes, les acides

époxyeicosatriénoïques, qui sont ensuite hydrolysés en acides dihydroxyeicosatriénoïques.

Les métabolites formés sont impliqués dans la régulation du transport ionique, dans la

sécrétion d’hormone (insuline, glucagon…) et ont des propriétés vasoactives. Ils favorisent la

vasorelaxation (Imig et al., 1996) et inhibent l’agrégation plaquettaire (Heizer et al., 1991).

35

LES PHOSPHOLIPASES A2 (PLA2)

1. Généralités et classification

La famille des PLA2 (phosphatide 2-acylhydrolase ; E.C 3.1.1.4) est composée d’une vaste

classe d’enzymes catalysant l’hydrolyse de la liaison ester en position sn-2 d’un substrat

phospholipidique. Cette hydrolyse fournit deux produits, un acide gras libre et un

lysophospholipide. Les acides gras libérés par la PLA2, comme l’AA ou l’acide oléique (OA),

peuvent servir de source d’énergie mais de façon plus importante, l’AA agit comme second

messager (Gijon & Leslie, 1999 ; Berk et al., 1999) et précurseur d’eicosanoïdes tels que les

prostaglandines (PGs) et les leucotriènes (LTs) qui jouent un rôle important dans

l’inflammation et la transduction de signaux (Austin & Funk, 1999 ; Devillier et al., 1999).

De la même façon, certains lysophospholipides comme l’acide lysophosphatidique (LPA) ou

la lysophosphatidylcholine (LPC) sont biologiquement actifs par eux-mêmes et sont les

précurseurs d’autres médiateurs bioactifs comme le facteur d’activation plaquettaire (platelet-

activating factor ou PAF) (Moolenaar et al., 1997). Comme la production de ces médiateurs

lipidiques est régulée par un grand nombre de stimuli extracellulaires, il est important de

comprendre le fonctionnement et les mécanismes de régulation des PLA2 qui contrôlent

l’étape limitante de la synthèse de ces composés bioactifs.

Dès la fin du XIXème siècle, une activité enzymatique caractérisée par la suite comme une

activité PLA2 a été détectée dans du venin de cobra (Stephens et al., 1898). Par la suite, une

activité PLA2 sécrétée fut trouvée en grande quantité dans le pancréas de porc, elle fut

caractérisée comme dépendante du Ca2+, possédant de nombreux ponts disulfures ainsi que

des résidus histidine et aspartate dans son site catalytique. Au fil des années, de nombreuses

autres PLA2 sécrétées furent découvertes dans des venins et des sucs pancréatiques de

nombreux animaux. Deux groupes furent formés en fonction de la position des ponts

disulfures et de la localisation du site catalytique… Le groupe II des PLA2 fut

subséquemment étendu pour inclure les PLA2 de mammifères non pancréatiques appelées

sPLA2 car sécrétées dans la synovie et classées actuellement dans le groupe IIA (Kramer et

al., 1989 ; Seilhamer et al., 1989a). Ces vingt dernières années de nombreuses autres PLA2 sécrétées furent découvertes et malgré leurs ressemblances avec les précédentes, il fallut

établir de nouveaux groupes pour les classer (groupe V, IX, X et XI). Cependant en 1991,

cette classification de PLA2 devint obsolète lorsque la phospholipase A2 cytosolique fut

36

séquencée et clonée initialement dans les neutrophiles (Alonso et al., 1986) puis dans les

plaquettes sanguines (Clark et al., 1991). La séquence révéla une protéine de 85kDa,

contenant une sérine dans le site catalytique et aucun pont disulfure (Clark et al., 1991 ; Sharp

et al., 1991). Cette nouvelle PLA2 dite cPLA2 fut classée dans le groupe IV des PLA2. Par la

suite, d’autres groupes de PLA2 ont été découverts (groupes VI, VII et VIII) portant à 14 le

nombre total de groupes (cf. Tableau 1 & Tableau 2) (Balsinde et al., 2002).

Il est à noter que certains critères sont à respecter pour assigner une enzyme à un groupe de

PLA2 (Six & Dennis, 2000) :

La protéine doit hydrolyser l’ester d’acide gras en position sn-2 des phospholipides et

posséder une activité spécifique suffisante, même si elle possède d’autres activités par

ailleurs.

La séquence complète de la protéine doit être établie pour qu’un numéro de groupe et

de sous groupe lui soit assigné.

Les enzymes homologues d’une même espèce définies comme paralogues sont

désignées par des lettres de sous groupes (IVA, IVB, etc.) mais pas celles de

différentes espèces définies comme orthologues.

Les variants d’épissage sont distingués nominalement par un chiffre arabe accolé à

ceux des sous groupes (VIA-1, VIA-2, etc.).

Il existe deux types de classification. L’une historique, se base sur les propriétés biologiques

des PLA2 et est constituée de 4 groupes :

Les sPLA2 : PLA2 de petite taille, sécrétées, dépendantes du Ca2+.

Les cPLA2 : PLA2 de grande taille, cytosoliques, dépendantes du Ca2+.

Les iPLA2 : PLA2 indépendantes du Ca2+, intracellulaires.

Les PAF-acétylhydrolases : indépendantes du Ca2+, agissant sur le PAF (platelet

activating factor) et les lipides oxydés.

L’autre classification distingue les PLA2 en fonction de leur séquence. On distingue deux

groupes majeurs en fonction du résidu impliqué dans le site catalytique :

37

Groupes de PLA2 utilisant une histidine dans le site catalytique :

On retrouve dans ce groupe la famille des sPLA2. A l’intérieur de cette famille qui

regroupe 10 familles de PLA2 (7 d’origine mammifère) (cf Tableau 1), certaines

familles peuvent être reliées entre elles. Par exemple, les groupes I, II, V et X sont

proches et partagent le même mécanisme de clivage de la liaison ester sn-2 des

phospholipides.

Groupes de PLA2 utilisant une sérine dans le site catalytique :

Cette famille, comprend 4 groupes (IV, VI, VII et VIII) incluant les cPLA2, les iPLA2

et les PAF-acétylhydrolases (cf Tableau 2).

La classification en fonction des propriétés biologiques des PLA2 renferme quelques

incohérences, puisque la PLA2 IVC (ou γ) y est généralement classée comme une cPLA2 en

dépit du fait que ce soit une enzyme indépendante du calcium contrairement aux autres

cPLA2. Cependant, cette classification possède l’avantage d’être claire lorsque que l’on

expose de façon générale le rôle des PLA2.

38

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2. Les phospholipases A2 sécrétées (sPLA2)

Les sPLA2 sont des enzymes de faible masse moléculaire (environ 14 kDa) possédant une

structure tertiaire très rigide, 5 à 8 ponts disulfures (chez les mammifères) qui leur confèrent

une résistance contre la protéolyse et la dénaturation (Six & Dennis, 2000). In vitro, les sPLA2

ne manifestent pas de spécificité particulière vis-à-vis des acides gras en position sn-2 des

phospholipides mais nécessitent la présence de concentrations millimolaires de Ca2+ (Tableau

1). Pour le moment 9 sPLA2 ont été identifiées chez les mammifères, classées dans différents

sous-groupes (IB, IIA, IID, IIE, IIF, III, V, X et XII) en fonction de leur structure primaire et

caractérisées par le nombre et la position des résidus cystéines (Six & Dennis, 2000). Les

sPLA2 des groupes I, II, X sont étroitement reliées, ce sont des enzymes de 14-17 kDa

possédant 2 domaines assez bien conservés, la boucle de fixation du Ca2+ (X-Cys-Gly-X-Gly-

Gly) et le site catalytique (Asp-X-Cys-Cys-X-X-His-Asp). Par ailleurs, on peut distinguer

certaines sPLA2 (groupe IIA, IID, V) qui sont cationiques et se fixent donc à des héparanoïdes

anioniques tels que l’héparine ou les sulfates d’héparane (Murakami et al., 1996). Comme de

nombreuses surfaces cellulaires sont riches en protéoglycanes de type sulfates d’héparane,

une grande proportion de ces sPLA2 se retrouve fixée à ces membranes plutôt que d’être

sécrétée.

Mécanisme d’action :

Les sPLA2 utilisent un résidu histidyl dans leur site catalytique. Le résidu histidyl sert à

former une liaison hydrogène avec une molécule d’eau. Cette liaison étant nécessaire au

mécanisme d’action des sPLA2, ces dernières doivent, pour être activées, être à un pH

compris entre 7 et 9 (pKa de His) (Dennis, 1994 ; Scott et al., 1991 ; Arni et al., 1996). De

plus, près de l’histidine, un résidu aspartyl est conservé. Il permet la fixation du Ca2+,

entraînant la formation d’un oxyanion qui stabilise l’état de transition de la réaction. D’où la

dépendance vis-à-vis du Ca2+ en concentration millimolaire des PLA2 à histidine. Par ailleurs,

il y a d’autres résidus conservés tels que la tyrosine et la glycine qui participent au mécanisme

de réaction.

41

Rôles des sPLA2 :

La fonction la plus évidente des sPLA2 est leur intervention dans la digestion des

phospholipides alimentaires.

Leurs rôles dans la mobilisation de l’AA restent encore ambigus. Des études avec des

inhibiteurs des sPLA2 ont montré que la sPLA2-IIA participe à la libération immédiate d’AA

et à la phase tardive de biosynthèse des PGs (Kuwata et al., 1998 ; Akiba et al., 2001). De la

même façon elle interviennent dans la libération des lysophospholipides résultants comme

l’acide lysophosphatidique (LPA) ou la lysophosphatidylcholine (LPC) et leurs métabolites

tels que le PAF. La sPLA2-IIA possède également des propriétés antibactériennes (Weinrauch

et al., 1996 ; Foreman-Wykert et al., 1999) puisqu’elle est active contre les bactéries Gram+.

Elle intervient également dans les phénomènes d’exocytose de certaines cellules endocrines

(Matsuzawa et al., 1996). La sPLA2 IIA possède également une activité anticoagulante

(Mounier, 1996) qui serait indépendante de la présence de phospholipides et donc

indépendante de son activité catalytique. Elle se lie avec le facteur Xa et empêche ainsi la

formation du complexe prothrombinase (facteur Xa / facteurVa) intervenant dans le

mécanisme de coagulation. Elle est également impliquée dans les phénomènes

d’inflammation et aurait aussi été retrouvée au niveau des plaques d’athérosclérose

(Menschikowski et al., 1995) dont l’origine pourrait être plaquettaire ou macrophagique

(Emadi et al., 1998).

Dans les plaquettes sanguines humaines, on retrouve la sPLA2 de type IIA (Aarsman et al.,

1989) qui dériverait des mégacaryocytes (Emadi, 1998). Elle est associée aux granules α et est

libérée dans le milieu extracellulaire après activation des plaquettes par la thrombine et le

collagène (Horigome et al., 1987 ; Kramer et al., 1989). Une fois sécrétée, cette sPLA2 ne

semble pas impliquée dans la libération d’AA et dans l’activation plaquettaire (Mounier et al.,

1993). Cependant une équipe a mis en évidence une activation des plaquettes après ajout

exogène de sPLA2 de type II (Polgar et al., 1997).

D’une façon générale, le rôle exact des sPLA2 dans la mobilisation d’AA reste encore

controversé. Dans les cellules mésengiales, il semblerait qu’il y ait une interaction entre la

sPLA2 et la cPLA2 conduisant à la libération d’AA (Han et al., 2003).

42

3. Les phospholipases A2 indépendantes du calcium (iPLA2)

Les iPLA2 sont les membres de la famille PLA2 les plus récemment découverts. Dans la

littérature, lorsqu’il est fait référence aux PLA2 indépendante du Ca2+ (ou iPLA2), il s’agit le

plus souvent de la iPLA2 du groupe VIA-1 (ou iPLA2-A) qui a été initialement purifiée à

partir de la lignée P388D1 issue de macrophages (Ackermann et al., 1994). L’ADNc codant

pour cette protéine a été cloné et identifié dans de nombreuses espèces et types cellulaires,

incluant les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) (Tang et al., 1997), les lignées de

macrophages murins P388D1 (Balboa et al., 1997), les cellules des îlots pancréatiques de rats

(Ma et al., 1997), la lignée de lymphocytes B humains (Larsson et al., 1998) et on retrouve de

nombreux variants d’épissage du gène (Tableau 2) (Larsson Forsell, 1999). Un variant actif

de grande taille (88 kDa), avec 54 aa insérés dans les 8 motifs à ankyrine, a été trouvé et

classé comme PLA2 VIA-2 (ou iPLA2-B).

La PLA2 IVA-1 a une masse moléculaire de 84-85 kDa, pour environ 750 aa, mais existe sous

forme d’agglomérat et possède une activité lysophospholipase en plus de son activité PLA2.

La principale caractéristique des iPLA2, en dehors de l’absence de nécessité de Ca2+, est

qu’elles possèdent 8 motifs à ankyrine dans la structure de leur partie N terminale (Tang et

al., 1997). Elle est inactivée par des inhibiteurs de sérines réactives, ce qui semble indiquer la

présence d’une sérine dans son site catalytique. (Ackermann et al., 1995 ; Lio et al., 1996).

La iPLA2 fut initialement associée au groupe VIA au regard de son unique séquence, mais de

nombreuses autres activités iPLA2 ont été décrites dans la littérature (Ackermann & Dennis,

1995) et il est maintenant clair qu’il existe d’autres PLA2 Ca2+-indépendantes comme les

groupes IVC, VII et VIII.

Comme les sPLA2, les iPLA2 ne présentent pas de spécificité apparente pour l’AA en position

sn-2 dans les phospholipides. Elles partagent avec les cPLA2, la taille, la localisation

intracellulaire et probablement le mécanisme d’action d’hydrolyse des PL. On peut noter

qu’elles possèdent également une activité lysophospholipase, transacylase et PAF-

acétylhydrolase. Des expériences basées sur l’inhibition des iPLA2 par le bromoenol lactone

(BEL) ou l’utilisation d’oligonucléotides antisens spécifiques ont démontré que dans de

nombreux systèmes cellulaires, la iPLA2 joue un rôle clef dans le remodelage des

phospholipides (Ramanadham et al., 1999) et dans l’homéostasie par la production de

lysophospholipides.

43

4. Les PAF-acétylhydrolases

La PLA2 VIIA est la plus étudiée des « platelet-activating factor » acetyl-hydrolase (PAF-AH)

(Karasawa et al., 2003 ; Tjoelker et al., 2000 ; Derewenda & Ho, 1999 ; Stafforini et al.,

1997). Le PAF (1-alkyl-2-acétyl-sn-glycéro-3-phosphocholine) est un phospholipide à choline

avec une liaison éther en position sn-1 et une liaison ester (acétyl) en sn-2. Le PAF a de

nombreux effets physiologiques, incluant des effets proinflammatoires qui peuvent être

supprimés par l’hydrolyse de la liaison ester en sn-2 et la formation du lyso-PAF (Peplow,

1999).

La PLA2 VIIA a été clonée en 1995, c’est une protéine de 441 aa pour une masse estimée de

45 kDa, contenant un motif consensus lipase Gly—X—Ser—X—Gly. Elle possède une triade

catalytique classique composée des Ser273, Asp296, His351. Cette PLA2 possède également une

activité d’hydrolyse sur les courtes chaînes d’acides gras oxydés (jusqu’à 9 atomes de

carbone) en position sn-2 dans des PC ou des PE (Stremler et al., 1989 ; Min et al., 1999).

Cette PLA2 est circulante dans le flux sanguin de nombreux animaux et chez l’Homme est

associée à l’apoB 100, protéine constitutive majeure des LDL (low density lipoproteins), et

aux HDL (high density lipoproteins). Cette présence assure probablement un rôle protecteur

contre les lipides oxydés des lipoprotéines, connus pour être associés à certaines pathologies

comme l’athérosclérose.

Il existe d’autres PAF-AH comme la PLA2 VIIB qui est une enzyme intracellulaire isolée et

caractérisée initialement dans le cerveau de bovin (Hattori et al., 1993). Elle possède une

identité de séquence de 41% avec la PLA2 VIIA. C’est un monomère de 40 kDa composé de

392 aa et possédant également un motif lipase. Elle hydrolyse le PAF et les PL contenant une

liaison acyl en position sn-2, quelle que soit la taille de la chaîne carbonée (minimum de 5

carbones) (Hattori et al., 1995) mais posséderait une affinité plus grande pour les PL

peroxydés (Nigam & Schewe, 2000). Il est intéressant de noter que bien que cytosolique, elle

est capable de se transloquer rapidement vers les membranes, dans des conditions de stress

oxydant (Matsuzawa et al., 1997).

Enfin, les PLA2 VIIIA et VIIIB sont des sous unités d’hétérotrimères, les PAF-AHIb (Hattori

et al., 1995 ; Adachi et al., 1997) exprimées dans le cerveau. Ces hétérotrimères sont

composés d’un homodimère ou hétérodimère de VIIIA et/ou VIIIB associé à une sous unité

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régulatrice de 45 kDa (Hattori et al., 1994a). Leur séquence d’approximativement 230 aa

contient une sérine dans un pseudo motif lipase Gly—X—Ser—X—Val (Hattori et al.,

1994b). L’expression variable de ces sous unités dans différents tissus et la faible spécificité

pour le PAF posent encore de nombreuses questions sur sa réelle fonction.

5. Les phospholipases A2 cytosoliques (cPLA2)

Il existe 3 sous-groupes de cPLA2, la PLA2 IVA (ou cPLA2α, anciennement nommée cPLA2)

et deux protéines paralogues, la PLA2 IVB (ou cPLA2β) et la PLA2 IVC (ou cPLA2γ).

5.1.La PLA2 IVA (ou cPLA2α)

5.1.1 Structure (Figure 9)

Le gène codant pour la cPLA2α humaine est localisé sur le chromosome 1q25, près du gène

de la PGH synthase 2 (Tay et al., 1995) ; le transcrit de 3,4 kb est exprimé de façon

constitutive dans de nombreux types cellulaires humains, comme les gènes dits

« domestiques », et code pour une protéine de 749 résidus acides aminés et de 85 kDa de

masse moléculaire. Trois régions peuvent être distinguées :

Du côté N-terminal, il existe une séquence de 68 résidus acides aminés appelée domaine

« CaLB » (Ca2+ Lipid Binding domain). Ce domaine assure la liaison Ca2+-dépendante de la

cPLA2 à la membrane ou à un substrat phospholipidique (Nalefski et al., 1994). Ce type de

domaine se retrouve également dans la PLC et est similaire au domaine C2 de la protéine

kinase C. Le site actif de la cPLA2 fait intervenir la sérine 228 comme résidu nucléophile

(Figure 8) qui permet la formation d’un intermédiaire sérine-acyl dans la réaction de clivage

de l’AA (Reynolds et al., 1993). Cette sérine est présente dans un pentapeptide « G-L-S-G-

S » qui est similaire au « motif lipase » (G-X-S-X-G) trouvé dans les α/β hydrolases. En plus

de la sérine 228, l’aspartate 549 a été montré comme essentiel à l’activité de la cPLA2

(Pickard et al., 1996) mais à l’inverse d’autres sérine-estérases, aucun résidu histidine

n’intervient dans le mécanisme catalytique de cette enzyme. Un résidu différent intervient ici,

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il s’agit de l’arginine 200, ce qui suggère que la cPLA2 emploie un mécanisme catalytique

différent de celui des sérine-estérases classiques.

Figure 8 : Mécanisme d’action possible de la cPLA2α (d’après Dessen, 1999). HG :Head Group (=groupement polaire) ; AA : Acide Arachidonique ; C18 : acide gras à 18 carbones. Le groupement phosphate est en noir. Les résidus impliqués dans le mécanisme catalytique sont en vert. L’arginine 200 stabilise le groupement phosphate des phospholipides.

La cPLA2 contient également de nombreux sites de phosphorylation, à la fois pour des

Ser/Thr kinases et des tyrosine kinases (Sharp et al., 1991). Sur les 4 sérines phosphorylées

chez l’Homme (sérines 437, 454, 505 et 727), seules les sérines 505 et 727 sont conservées

dans les autres espèces (Figure 9).

On notera également la présence du coté C-terminal d’une région riche en proline qui pourrait

être responsable de la migration électrophorétique anormale de la cPLA2 (au niveau de 100

kDa).

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Figure 9 : Structure tridimensionnelle de la cPLA2 (Dessen et al., 1999). On observe un domaine CaLB (calcium lipid binding) permettant la fixation de la protéine à la membrane et un domaine catalytique lui permettant d’exercer son rôle d’hydrolase.

5.1.2 Localisation cellulaire

Chez l’Homme, la cPLA2 est ubiquiste à l’exception des lymphocytes T et B (Hirabayashi,

2000), on la retrouve ainsi dans les plaquettes sanguines (Takayama et al., 1991). Une fois

activée, la cPLA2 se transloque du cytosol vers la membrane dont la nature varie selon le type

cellulaire. Dans les plaquettes, il s’agit de la membrane plasmique (McNicol et Shibou, 1998)

alors que pour les autres types cellulaires, il s’agira de la membrane du noyau ou du réticulum

endoplasmique (Glover et a