CRef biotechnologies – 2004/2005 – Marc GENSSE SEPARATION DES ACIDES AMINES PAR ELECTROPHORESE SUR PAPIER

– Durée : 3H –

I. Objectifs :

• On se propose de séparer par électrophorèse les acides aminés d'un mélange : Proline (pHi= 6,30), Lysine (pHi = 9,74) et Aspartate (pHi = 2,98).

• Durant cette séance, nous mettrons donc en œuvre une technique de séparation des constituants d'un mélange différente de la CCM (technique qui aura déjà été abordée lors de l'étude des glucides), ce qui permettra de comparer les avantages et les inconvénients de ces 2 techniques ainsi que la notion du caractère amphotère des acides aminés (qui sera vue dans la partie cours).

• Les objectifs annexes sont : o Utilisation de la verrerie de laboratoire. o Sensibilisation aux dangers dans le labo de Biochimie et à la toxicité des réactifs.

II. Matériel et réactifs

Réactifs Préparation Répartition Noter Tampon Tris-

Barbital pH 6,3 Acheté déjà prêt à l'emploi Flacon de 1L/cuve d'électrophorèse Tp électrophorèse

Réactif à la ninhydrine

Peut être préparé la veille et conserver à + 4°C en flacon brun.

Ninhydrine………………1 g Ethanol………………196 mL Acide éthanoïque………4 mL

Flacon de 100 mL/ cuve

d'électrophorèse

Ninhydrine

Lysine 20 g/L + Proline 20

g/L + Ac. aspartique 20

g/L

L'acide aspartique se dissout en général mal dans l'eau. Il est

possible d'ajouter un peu d'HCl pour le dissoudre puis de ramener

le pH à 6,3

Flacon de 20

mL/classe

Mélange d'acides aminés

Matériel Quantité/élève

Papier Wathman N°3 ou 4 1 feuille/classePapier filtre 1 feuille/élèveBecher de 50 mL 1Cuves électrophorèse + générateurs 1 cuve/3 élèvesApplicateur pour électrophorèse ou lame de verre pour

microscope 1/classe

Eprouvette de 100 mL 1/classeBac plat de contenance 100 mL pour immerger les bandes de Wathman 2,5x16 cm

1/classe

Pince 1Gants 1 gant/élèveHotte à 90°C 1/classe

III. Technique/Manipulation/Mode opératoire 1. Préparation de la cuve d'électrophorèse

• Remplir chaque demi-cuve jusqu'au trait repère avec du tampon Tris-barbital pH 6,30. • Couper une bande de papier Whatman de 2,5 cm X 16 cm ; tracer un trait vertical au

crayon (très léger) au niveau duquel sera fait le dépôt. • Immerger la bande dans le tampon pH 6,3 puis l'essorer entre 2 feuilles de papier-filtre. • Tendre la bande sur le chevalet, comme sur le schéma ci-dessous :

Dépôt

Cathode (+) Anode (-)

Compartiments contenant le tampon

………..

………..

2. Dépôt du mélange d'acides amines

• Déposer sur la bande le mélange à l'aide d'une lame de microscope ou d'un applicateur. 3. Migration électrophorétique

• Brancher le générateur, et appliquer une tension continue de 150 V pendant 1h30. L'intensité doit se situer entre 12 et 21 mA. • Après 1h30, couper le courant, débrancher le générateur, retirer la bande et la sécher à l'air.

4. Coloration de la bande

• Sous la hotte, appliquer à l'aide d'un pinceau la ninhvdrine sur la bande posée sur du papier-filtre en évitant tout contact avec les doigts à l'aide d'une pince et port de GANTS obligatoire. • Mettre à l'étuve à 90°C en surveillant l'apparition de la coloration (2-3 min).

5. Compte-rendu

• Résultats o Coller la bande d'électrophorèse colorée, en y indiquant le sens des électrodes

par un (+) et un , leur nom, l'endroit du dépôt et la coloration effectuée. o Refaire un schéma montrant la position des électrodes ainsi que des 3 tâches

colorées. • Interprétation

o Sachant qu'un acide aminé a une charge quand le pH de la solution est > à son pHi et qu'inversement, il a une charge (+) quand le pH de la solution est < à son pHi, donner la position des 3 aminés à la justifiant.

o Que remarque-t-on pour la proline ? • Conclusion

o A quoi sert cette technique ? Comparaison avec la chromatographie sur couche mince

IV. Exploitation pédagogique • Schéma de la cuve d'électrophorèse

o Position des 3 acides aminés

Proline

Lysine

AspartateCathode (+)

Anode (-)

Compartiments contenant le tampon

On remarque que la proline n'a pas bougé car son pHi = pH de la solution alors que la lysine a migré vers l'anode (pHi > pH de la solution) et que l'acide aspartique a migré vers la cathode (pHi < pH de la solution).

• Couleur des acides aminés Avec la ninhydrine, tous les acides aminés sont colorés en violet, sauf la proline (et l'hydroxyproline) qui sont colorés en jaune.

• Toxicité des réactifs o Décrire la nature du danger rencontré :

Ninhydrine (hydrate de tricétohydrindène) : réactif cancérigène donc évidemment à manipuler avec précautions et à ne pas jeter à l'évier !

• Comparaison avec la CCM La CCM est une technique de séparation des molécules en fonction de leur affinité relative pour un support solide et un liquide (chromatographie de partage). Elle a un pouvoir résolutif assez faible, surtout pour les grosses molécules. L'électrophorèse possède un pouvoir résolutif beaucoup plus important mais ne marche que pour des molécules chargées. La conclusion est donc qu'il n'existe pas une technique universelle de séparation des molécules mais qu'il faut adapter la technique en fonction du but recherché. Remarque : ce TP peut être réalisé à l'identique avec des bandes d'acétates de cellulose, qui donnent un résultat beaucoup plus joli ; elles sont évidemment plus chères !