Evaluation comparative de la MRD de LALen Cytométrie en flux (4 couleurs) (N. Robillard, R.Garand,

CHU, Nantes)

et en biologie moléculaire (PCR/IgH-TCR compétitive) (H.Cave, Hôpital Robert Debré, Paris)

• CMF: 151 patients (345 prélèvements) • PCR: 120 patients (202 prélèvements)

1 aout 2007

• Nantes: 128 patients (300 prélèvements) Patients consécutifs, non sélectionnés

• Extérieurs: 23 patients (45 prélèvements)(7 centres)

Patients testés en CMF car PCR problématique

• N.Nés: 14 cas, Enfants: 127 cas, Adultes: 10 cas

hyper CD10++ instable 53%hypo CD20- (10+) médiocre 42%hyper CD22++ médiocre 30%hyper CD34++homogène médiocre 50%hypo CD24+diminué bon 31% (84)

hypo CD38+diminué bon 54%hypo CD45+diminué bon 37%hyper CD58++ bon 73%hyper CD123++ bon 60% (66)

asynchro. CD21+ CD10+ bon 14% (85)

asynchro. CD20+/79b+ CD34+ bon 13%illégitime My (13,15,33,117) bon 29%illégitime T (2/4/5/7) bon 3%

marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL B(Nantes; dg: 2000-2007)(n= 225)

1 aout 2007

nombre de LAP pour

MRD(n= 112)

n

LAP

CD10+

n=96

CD10-

n=16

2 94% 100%

#1Hématones

CD58-PE

CD10-FITC

CD123-PE

#2 LAL-B-CD10+

#3 LAL-B-CD10+Gate: CD19+

0%

99%

99%

95%

99%

CD38-PE

99%

5%

95%

99%

99%

90%

1 aout 2007

hypo CD2- CD4- CD8- moyen (<0,1%) 33%

hyper CD4+ CD8+ moyen (<0,2%) 21%

immaturité CD3- cCD3+ CD5+ moyen (<0,1%) 63%

immaturité CD45+dim bon (<0,01%) 60%

hyper CD99+ bon (<0,01%) 77%

immaturité CD34++ bon (<0,05%) 30%

immaturité TdT+ bon (<0,01%) 70%

immaturité CD1a+ bon (<0,01%) 42%

illégitime CD10 bon (<0,01%) 21%

illégitime My (13,15,33,117) moyen (<0,1%) 30%

marq. « Leucémiques » (LAP) – LAL T(Nantes+ext.; dg: 2003-2007)(n= 43)

1 aout 2007

n LAP LAL-T (n=43)

2 96%

Ly (CD45++) Blastes T (CD45+interm.)

CLO Fab LALTIII CD3-

cCD3-APC

CD99-PE

cCD3-APC

TdT-FITC

72%

92%

98%

79%

1 aout 2007

Combinaisons d’anticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-B de l ’enfant

Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 96% des prélèvements

3(4) Ac.Mo. Constants, conjugués APC, PerCP & FITC

• CD19APC – CD45perCP – CD10FITC*

(* si LAL-B CD10-: ajout du CD20FITC)

4e Ac.Mo. Variable, conjugué PE

• contrôlePE

• CD20PE / CD34PE / CD38PE / CD58PE / CD123PE

• CD11a / CD21PE / CD22PE / CD24PE / CD79bPE

• CD2PE / CD4PE / CD5PE

• CD13PE / CD33PE / CD36PE / CD117PE

1 aout 2007

Combinaisons d’anticorps (4 couleurs) utilisées pour la détermination de la MRD des LAL-T de l ’enfant

Au moins 2 combinaisons (+ 1 contrôle) : 76 / 85 (90%) des prélèvements

LAL-T CD3-• cCD3apc-CD3pc7-CD5pe-contrôlefitc

• cCD3apc-CD3pc7-CD5pe-TdTfitc

• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-contrôlepe

• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD99pe

• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD34pe

• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD1ape

• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD10pe

• cCD3apc-CD3pc7-CD2/5/7/45fitc-CD13/33/117pe

LAL-T CD3+Combinaisons « à la carte ». Incluant, par exemple: CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, TdT, CD56, CD99, T…

1 aout 2007

• Marquage à 4 couleurs (PerCP, APC, PE, FITC) • (FACScalibur, BD, USA) • En acquisition sélective (« live-gating »):

- des cellules CD19+ totales si LALB - des cellules cCD3+ totales si LALT CD3- ou CD3+ totales si LALT CD3+

• Puis quantification par fenêtrages successifs des cellules leucémiques

*Selon Campana D, Constan-Smith E, Cytometry 38:139, 1999

Méthode*

1 aout 2007

1e étape: exemple d’une LAL-B CD10+

• Réglages et compensations• Traçage de la fenêtre de sélection (live gate) CD19+ • Calcul du % de cellules B (hors débris)

95% 2,3%

10.000 évènements

cell. B totales (R1xR2): 2,2% cell. Nuclées totales

1 aout 2007

2e étape: exemple d’une LAL-B CD10+ avec MRD négative• sélection des cell. B totales du tube (live gate CD19+) puis repérage et comptage des blastes leucémiques par multi-fenêtrage

Blastes leucémiques (MRD)=%Btot.x (R2xR3xR4xR6)=

2,2% x 0,00% (<20 events)= 0%=> MRD-LAL=  <0,01%

(seuil de sensibilité maxi.)

22.000 évènementssélectionnés (/ 106 cell.)

R6

Blastes leucémiquesCD10+CD38+CD45-<0,01% cellules totales

HématogonesCD10+CD38++CD45+/++2,1% cellules totales

1 aout 2007

LAL-B CD10+ testée avec 6 combinaisons (+ 1 contrôle)

MRD

MRD MRD

MRD MRD

MRD

MRD

38+faible

34++homogène

10++fort 10++fort

10++fort 10++fort

10+

10++fort

45+faible

Blastes leuc. : 76,3% des cell.B tot(Phénotype: CD10++ CD13+ CD20- CD22+ CD34++ CD38+ CD45-/+

CD58+)MRD: 0,58% cellules totales

MRD LAL - Faisabilité

Technique Origine des

patients

Éval./total Faisabilité

CMF Nantes* 123 / 128 96%

Autres** 22 / 23 96%

total 145 / 151 96%

PCR Nantes* 101 / 116 87%

IGH/TCR Autres** - ** - **

* Patients consécutifs, non sélectionnés** Patients testés en CMF pour MRD problématique en PCR

1 aout 2007

MRD LAL - Faisabilitéselon le type immunologique*

Type Immunologique Éval./total Faisabilité

CMF B - CD10+ 84 / 87 97%

B – CD10- (MLL+: 12 / 13)

13 / 13 100%

T – imm. (TI, TII) 8 / 8 100%

T – mat. (TIII, TIV) 19 / 21 90%

PCR B - CD10+ 78 / 82 95%IGH/TCR B – CD10- (MLL: 10 / 11) 5 / 11 45%*

TCR T – imm. (TI, TII) 4 / 7 57%TCR T – mat. (TIII, TIV) 18 / 20 90%

Patients de Nantes (consécutifs, non sélectionnés), uniquement *p<0.001

1 aout 2007

MRD LAL - FaisabilitéCause des échecs de la détermination de la MRD en

CMF (9 prélèv.(3%); 6 patients (4%))# EGIL cause Pt de MRD inéval.

N1 B2 / CD10+ Sensib. Insuffis. (2LAP:22++,34++)

Excès d’hématogones (7%)

1 / 2 (J70)

(J35: OK)

N2 B2 / CD10+ Sensib. Insuffis.(1LAP: CD20-)

Excès d’hématogones (4-13%)

3 / 4 (J70,227,372)

(J35: OK)

N3 B2 / CD10+ Absence de LAP 1 / 1 (J35)

N4 T4 / CD3+T+

Sensib. Insuffis.(CD2- T+)

Excès de T+ normaux

1 / 3 (J117 post-allo.)

(J34,J57: OK=MRD++)

N5 T4 / CD3+T+

Sensib. Insuffis.(T+)

Résultats trop incertains

2 / 3 (J59,101)

(J31: OK=MRD++)

E5 T3 CD3-

/CD3+T+

2 clones de phénotype

impossible à distinguer

1 / 1 (J182)MRD ok en PCR-IG/TCR: 7 / 9 (78%) prélèvements

1 aout 2007

MRD LAL - Faisabilité de la CMF en cas de PCR IGH/TCR problématique

Type

Immuno.

B-CD10+

B–CD10-

T–immature / TCR-*

T–mature / TCR+*

Total

CMF évaluable

Total PCR problèm.

n. (%)

Cas

n.

prélèv

9 (26%) 20

9 (26%) 28

9 (26%) 29

7 (22%) 14

34 91

32 88

97%*surface T-cell receptor (CD3/T/T

1 aout 2007

MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le type immunologique

- nombre de prélèvements= 328/337 (97%)* -

Type n MRD négative MRD positive

Immuno. <0,01% <0,1% 0,01% –0,1% 0,1% –1% >1%

B-CD10+ 181 125

69%

19

10%

13 14

21%

10

B–CD10- 40 14

35%

4

10%

6 9

55%

7

T 107 66

55%

15

19%**

9 10

24%

7

Total 328 205

62%

38

12%

28

9%

33

10%

24

7%*prélèvements inévaluables en CMF exclus – n= 9 (3%) **comparaison MRD <0,1% LALT v LALB (tout type) p=0,03 (X2 test)1 aout 2007

MRD LAL - Sensibilité de la CMF Selon le point de suivi (nombre de prélèvements= 342*)

*prélèvements inévaluables en CMF exclus, **biaisés (fait en cas de pb clinique ou de cyto)***comparaison MRD1 v MRD2: p=0.01 (X2 test)

Pt de suivi n MRD négative MRD positive

<0,01% <0,1% 0,01% –0,1% 0,1% –1% >1%

MRD-J21**

(Per-induc.)

MRD-J35(post-induc.)

15

120

8

53%

75

63%

0

0%

7

6%

0

9

3

47%

13

31%

4

16

MRD-J90 (conso.1)

97 60

62%

18

18%***

9 5

20%

5

MRD3**

(tardif)

76 50

66%

8

10%

5 11

24%

2

MRD4**

(post-allo.)

34 21

62%

4

12%

4 4

26%

1

1 aout 2007

MRD LAL - Fiabilité de la CMF Comparaison des résultats de MRD des prélèvements étudiés

en PCR IGH/TCR et en CMF parallèlement (tandem study)(nombre de prélèvements évaluables= 165)

Concordance

CMF=PCR

155 94%

Discordance

CMF<PCR

7 4% B-CD10+ (3 LAP)

B-CD10+ (2 LAP) B-CD10+ (1 LAP)

T1 (4 LAP)

T3ab (2LAP)

MRD1: CMF+:0,7% /PCR+>1%

MRD4: CMF+:0,07% /PCR+ 0,1-0,5%

MRD4: CMF+:0,01% /PCR+ 0,1%

MRD1: CMF+:0,25% /PCR+>1%

MRD4: CMF+:<0,1% /PCR+ 0,5-1%

MRD1: CMF+:0,32% /PCR+>1%

MRD4: CMF+:<0,1% /PCR+ 0,1-0,5%

Discordance

CMF>PCR

3 2% T3ab (3LAP)(Rech.)

B-CD10+ (3LAP)

MRD1: CMF+:0,20% /PCR+<0.1%

MRD2: CMF+:0,32% /PCR+<0,1%

MRD1: CMF+:0,34% /PCR+<0.1%

1 aout 2007

Conclusions• Excellente concordance des résultats de MRD en CMF-4 couleurs et PCR IGH-TCR compétitive (94%)

• En cas de discordance, le niveau de MRD en CMF est généralement plus faible qu’en PCR

• Applicabilité de la CMF supérieure à celle de la PCR (95% versus 87%), particulièrement pour les LAL-B CD10- et les LAL-T immatures

• CMF-4 couleurs plus rapide, plus simple (et moins coûteuse?) que la PCR quantitative

• mais fiabilité des résultats dépendant du nombre et, surtout de la qualité (sensibilité et stabilité) des marq. leucémiques testés, tant en CMF, qu’en PCR

• limites de la CMF: Qualité des prélèv. (viabilité cellulaire++) & Reproductibilité inter-labo. de la CMF?