Evaluation de la PCR en temps réel pour la détection ... · L’antibiothérapie primaire repose sur une céphalosporine de troisième génération telle que la céfotaxime ou la

Evaluation de la PCR pour Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis et Haemophilus influenzae

Vanessa Bisco Travail de diplôme 2010‐2011

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Evaluation de la PCR en temps réel pour la détection simultanée de

Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis et Haemophilus influenzae

dans le LCR natif

Vanessa Bisco ICHV, Laboratoire de Bactériologie, Sion

Travail de diplôme 2010-2011

Mentor : Lysiane Tissières Lovey



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Sommaire

La méningite bactérienne est une maladie infectieuse grave qui doit être prise en charge en urgence. Le patient est traité à l’hôpital le plus rapidement possible dans le but d’éviter des séquelles ou le décès. C’est pour cette raison que le diagnostic doit être fiable et rapide. De plus, le diagnostic microbiologique détermine également les mesures de prévention pour l'entourage comme le maintien en isolement du patient et/ou la prophylaxie antibiotique. Les principaux agents responsables de méningites bactériennes sont Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae type b et Neisseria meningitidis. Actuellement au laboratoire de bactériologie de l’ICHV, la détection de ces bactéries repose sur la mise en culture du LCR. Cette méthode est longue et sa sensibilité est fortement diminuée si des antibiotiques ont été administrés avant le prélèvement du LCR.

Le but de ce travail est l'évaluation d'une PCR Multiplex en temps réel détectant le génome de ces trois bactéries directement dans les échantillons de LCR natif. Pour cette étude, nous avons testé des souches de Streptococcus pneumoniae, d’Haemophilus influenzae, de Neisseria meningitidis ainsi que des souches autres afin de déterminer la sensibilité et la spécificité de la méthode. L’évaluation de la méthode s’est avérée concluante avec une spécificité de 100% et une très bonne sensibilité allant jusqu’à ≤1 CFU/ml.

Mots‐clés :

• méningite bactérienne

• Streptococcus pneumoniae

• Neisseria meningitidis

• Haemophilus influenzae

• LCR natifs

• PCR Multiplex en temps réel



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Summary

Bacterial meningitidis is a severe and sometimes fatal infection of the central nervous system. The treatment must be administered as soon as possible to decrease long‐term irreversible damages or death of the patient. For these reasons the microbiological diagnosis has to be fast and reliable. Moreover the microbiological diagnosis also allows for preventive measures such as patient isolation and antibiotic prophylaxis for close contact. The three major pathogens causing bacterial meningitis are Streptococcus pneumonia, type b Haemophilus influenza and Neisseria meningitidis. Culture remains the reference method to find out the causative agent of bacterial meningitis. It is however a long process that can take up to 36 hours and its sensibility is dramatically decreased if the patient has received antimicrobial therapy before cultures (blood or CSF).

Advances in real‐time PCR technology have now made possible the selective amplification of multiple genes in one reaction. The purpose of this study is the evaluation of the Multiplex PCR for the detection of these three bacteria in native CSF samples. During this study, we have tested strains of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae (type b and other types), Neisseria meningitidis and strains of other species to determine the sensibility and specificity of the method.

The evaluation of the method proved successful with a specificity of 100% and a high sensitivity up to ≤ 1 CFU / ml.

Keywords :

• bacterial meningitidis




• native CSF samples

• real‐time PCR Multiplex



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Table des matières 1. Introduction…………………………………………………………………………………………………………………. 6

1.1 La méningite….................................................................................................................... 6

1.1.1 Diagnostic clinique ..................................................................................................................7

1.1.2 Diagnostic bactériologique......................................................................................................7

1.1.3 Diagnostic génomique.............................................................................................................7

1.1.4 Traitement...............................................................................................................................7

1.1.5 Epidémiologie..........................................................................................................................8

1.2 Caractéristiques des 3 principales bactéries responsables de la méningite………………..... 8

1.2.1 Haemophilus influenzae ............................... ………………………………………………………………………8

1.2.2 Streptococcus pneumoniae .......... ……………………………………………………………………………………10

1.2.3 Neisseria meningitidis………………………………………………………………………………………………………12

2. Objectif de l’étude………………………………………………….………………………………………………….. 14

3. Matériel et méthodes………………………………………………….………………………………………………15

3.1 PCR et PCR en temps réel……………………………………………………………………………………........ 15

3.1.1 Généralités ............................................................................................................................15

3.1.2 ADN .......................................................................................................................................15

3.1.3 MasterMix .............................................................................................................................16

3.1.4 Etapes de la PCR ....................................................................................................................18

3.1.5 Systèmes de détection des séquences amplifiées ................................................................20

3.2 Matériel………………………………………………………………………………………………………………........ 22

3.3 Extraction de l’ADN sur l’automate NucliSens easyMAG®………………………………………….. 23

3.3.1 Le NucliSens easyMAG® ........................................................................................................23

3.3.2 Principe de l’extraction .........................................................................................................23

3.3.3 Préparation des échantillons de LCR pour l’extraction.........................................................25

3.3.4 Préparation des souches de bactéries pour l’extraction ......................................................25

3.4 PCR « homemade » sur Rotor‐Gene 3000®………………………………………………………… ........ 25

3.4.1 Le Rotor‐Gene 3000® ............................................................................................................25



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3.4.2 Principe de l’amplification.....................................................................................................26

3.5 Déroulement de l’analyse………………………………………………………… ................................... 26

3.5.1 Résultats et interprétation................................................................................................28

4. Analyse des résultats .....................................................................................................30

4.1 Spécificité ......................................................................................................................... 30

4.1.1 Streptococcus pneumoniae ...................................................................................................30

4.1.2 Neisseria meningitidis ...........................................................................................................31

4.1.3 Haemophilus influenzae ........................................................................................................31

4.1.4 Autres souches ......................................................................................................................33

4.2 Sensibilité ......................................................................................................................... 34

4.2.1 Streptococcus pneumoniae ...................................................................................................35

4.2.2 Haemophilus influenzae ........................................................................................................36

4.2.3 Neisseria meningitidis ...........................................................................................................37

4.3 Echantillons de LCR natifs ................................................................................................ 38

4.4 Problèmes rencontrés...................................................................................................... 38

4.4.1 La sonde FAM........................................................................................................................38

4.4.2 La souche « 1 » Neisseria meningitidis..................................................................................38

4.4.3 La souche « 51 » Haemophilus influenzae ............................................................................38

5. Discussion ......................................................................................................................39

5.1 Sensibilité/spécificité ....................................................................................................... 39

5.2 Coût.................................................................................................................................. 39

6. Conclusion et synthèse ..................................................................................................41

7. Références bibliographiques ..........................................................................................42

8. Lexique ..........................................................................................................................45

9. Remerciements..............................................................................................................47

10. Annexe.........................................................................................................................48



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1. Introduction

Ce travail de diplôme a été réalisé dans le service de bactériologie à l’ICHV de Sion. Il a pour but de mettre en place une analyse de biologie moléculaire, une PCR Multiplex, permettant un diagnostic génomique des cas suspects de méningite.

1.1 La méningite Le cerveau et la moelle épinière sont entourés de membranes de tissu conjonctif protectrices appelées les méninges1. Lorsque celles‐ci sont enflammées, on parle de méningite. C’est une maladie infectieuse grave et parfois mortelle si elle n’est pas traitée le plus rapidement possible. Il existe de nombreuses formes de méningites dont les agents responsables peuvent être :

• des bactéries (dans 20% des cas), les plus fréquentes sont: Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, …

• des virus (dans 80% des cas): Coxsackie A virus, Herpès,…

• autres : Cryptococcus neoformans (champignons), Naegleria fowleri (amibes),…

Il existe également des méningites non infectieuses, par exemple d’origine tumorale (méningite carcinomateuse).

Si l’infection est d’origine bactérienne, la durée d’incubation, période entre la contamination et l’apparition des premiers symptômes, est généralement de quelques heures voire de quelques jours. La méningite se transmet généralement par voie aérienne sous forme de gouttelettes infectieuses. Il existe d’autres modes de contamination tels qu’une otite moyenne ou une infection pulmonaire sévère dont les agents pathogènes se diffusent dans le sang puis atteignent les méninges.

Chez les nouveau‐nés, les germes responsables de la méningite purulente sont surtout les Entérobactéries, les Streptococcus agalactiae et les Listeria. Les Streptococcus pneumoniae, les Neisseria meningitidis et les Haemophilus influenzae touchent généralement les enfants, les adolescents et les adultes.

La méningite surtout bactérienne peut entrainer de graves lésions au niveau cérébral, auditif ainsi que des troubles de l’apprentissage. La forme la plus grave de méningite bactérienne est la septicémie méningococcique se caractérisant par un collapsus respiratoire rapide et une éruption hémorragique.

Figure 1 : Structure du tronc cérébral

1 À partir de ce point, les mots soulignés sont cités dans le lexique



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1.1.1 Diagnostic clinique Le diagnostic clinique se fait par la constatation des symptômes variant selon l’âge du malade. Une raideur de la nuque, une fièvre élevée, de la photophobie, un état confusionnel, de violentes céphalées ainsi que des vomissements sont les symptômes les plus fréquemment rencontrés lors de méningite. Ils sont plus difficiles à diagnostiquer chez un nourrisson qui ne peut se plaindre de douleurs. Le médecin observera alors s’il y a présence de raideur dans la nuque, d’un bombement de la fontanelle antérieure et d’une hypoxie. Les symptômes peuvent être accompagnés de sensations de malaise général, de convulsions ainsi que de douleurs musculaires.

1.1.2 Diagnostic bactériologique Lors de suspicion de méningite, le médecin effectue une ponction lombaire qui permet de recueillir le LCR au moyen d’une aiguille fine. Ensuite, on procède à l’analyse de ce prélèvement dans le but de déterminer le germe pathogène responsable de la pathologie. En parallèle, l’analyse d’une ponction veineuse va permettre de détecter une éventuelle bactériémie.

Les prélèvements doivent être faits rapidement et, si possible, avant toute antibiothérapie pouvant tuer le germe pathogène.

La culture du LCR est la méthode de référence pour confirmer le diagnostic de méningite bactérienne. La spécificité de la mise en culture est absolue car le LCR est considéré comme un liquide normalement stérile. La sensibilité, elle, peut être diminuée si un traitement antibiotique a été instauré avant le prélèvement.

Figure 2 : Schéma d’une ponction lombaire

1.1.3 Diagnostic génomique

La PCR, technique de biologie moléculaire, permet une amélioration de la détection des bactéries dans le LCR même si le traitement antibiotique a déjà commencé. Elle détecte l’ADN de la bactérie qu’elle soit viable ou non. Cette méthode de diagnostic réduit le temps de l’obtention du résultat.

1.1.4 Traitement

Cette maladie doit être traitée à l’hôpital le plus rapidement possible afin d’éviter les lésions persistantes ou, dans le cas extrême, le décès du patient. Le traitement antibiotique, sous forme d’injection, est administré dès que les prélèvements sont effectués et le patient est isolé. L’antibiothérapie primaire repose sur une céphalosporine de troisième génération telle que la céfotaxime ou la céftriaxone. Dans certaines situations, une bithérapie associant par exemple une céphalosporine à la vancomycine est instaurée.



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Il est important de savoir que même si le traitement approprié est administré le plus tôt possible, le taux de mortalité reste tout de même élevé (13 à 27%).

1.1.5 Epidémiologie

La méningite virale est de loin la plus fréquente mais aussi la plus bénigne. Dans nos climats, elle se retrouve le plus souvent entre le mois d’avril et d’octobre. La méningite bactérienne à Neisseria meningitidis est la plus violente suivie par les méningites à Streptococcus pneumoniae.

Chez les enfants, la bactérie Neisseria meningitidis est le germe pathogène le plus fréquemment rencontré puisqu’elle est responsable de plus de la moitié des cas de méningite. Après cette bactérie, c’est le Streptococcus pneumoniae qui atteint le plus de personnes. On le rencontre surtout chez les enfants plus âgés. Chez les enfants plus jeunes, ce sont les méningites à Haemophilus influenzae qui prédominent. Chez les adultes et les adolescents, les deux bactéries les plus fréquemment isolée lors de méningite sont la Neisseria meningitidis et le Streptococcus pneumoniae.

En Suisse, les méningites bactériennes touchent environ 250 personnes par an dont 80 sont des enfants. Il est important de souligner que les sujets les plus exposés sont les enfants de moins de 5 ans et les personnes de plus de 65 ans.

1.2 Caractéristiques des 3 principales bactéries responsables de la méningite

Comme expliqué ci‐dessus, les trois principales bactéries provoquant la méningite sont Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae et Neisseria meningitidis. Les principales caractéristiques vont être décrites sous ce point.

1.2.1 Haemophilus influenzae

Histoire

Cette bactérie a été décrite pour la première fois en 1892 pendant la pandémie de grippe par le Docteur Robert Pfeiffer qui lui donna le nom de « bacille de Pfeiffer ». On pensait alors qu’elle était responsable de la grippe, d’où le nom « influenzae » qui lui a été attribué.

Morphologie et caractères culturaux

Appartenant à la famille des Pasteurellacae, cette bactérie est un coccobacille Gram négatif, aéro‐anaérobie facultative, immobile et peut être entourée d’une capsule polysaccharidique. Pour sa croissance, elle exige deux facteurs présents dans le sang : du Facteur X (l’hémine) et du Facteur V (NAD). Sur la gélose chocolat, les colonies sont grandes, opaques, plates, incolores à grises et ne font aucune hémolyse. Elles ont une odeur âcre rappelant l’indole.

Habitat et mode de transmission

C’est une bactérie spécifique à l’espèce humaine. Etant un commensal des voies respiratoires supérieures de l’Homme, les porteurs sains en ont dans leur nasopharynx. La bactérie se transmet par expiration de gouttelettes respiratoires.



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Pathogénicité Les infections les plus sévères de méningites sont essentiellement dues au sérotype b. En effet, il contient une capsule polysaccharidique qui protège la bactérie de la phagocytose. Elle possède des antigènes permettant de définir les 6 sérotypes existants: a, b, c, d, e et f.

L’Haemophilus influenzae peut être responsable de diverses maladies autres que la méningite. Il touche les voies respiratoires et peut engendrer des otites, des sinusites, des pneumonies et plus rarement des épiglottites. Souvent, chez le nouveau‐né, il est responsable de conjonctivites purulentes. Il n’est pas impossible que ces infections soient accompagnées de bactériémies.

Epidémiologie

Selon des estimations de l’OMS, l’Haemophilus influenzae du type b est responsable d’environ 3 millions de malades qualifiés comme grave et d’environ 386'000 de décès par an dus à des pneumonies et à des méningites. Il est important de noter que les victimes sont essentiellement des enfants de moins de 5 ans. Dans les pays en voie de développement, la méningite fait plus de victimes que dans les pays industrialisés. On peut compter entre 15 et 35% d’enfants survivant à cette maladie et étant atteints d’incapacités mentales ou de surdité.

Traitement et prophylaxie

Le traitement contre la méningite à Haemophilus influenzae de type b est essentiellement curatif par une antibiothérapie intensive et durable. Cette bactérie est sensible à de nombreux antibiotiques, mais certaines de ces souches ont acquis une β‐lactamase la rendant résistante aux aminopénicillines. Les céphalosporines de troisième génération administrées en monothérapie sont donc choisies pour combattre ce germe. Pour traiter une infection au niveau respiratoire, il est préférable de les utiliser en bithérapie en les associant à des aminopénicillines et à un inhibiteur de β‐lactamase.

La prophylaxie se fait au moyen d’un vaccin conjugué anti‐Hib pouvant être administré à partir du troisième mois de vie. Cette vaccination a été lancée au début des années 90 et a réduit considérablement le nombre de cas de méningite à Haemophilus influenzae de type b dans les pays industrialisés.

Figure 3 : Haemophilus influenzae vus au microscope



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1.2.2 Streptococcus pneumoniae

Histoire Appelé initialement Diplococcus pneumoniae, il a été rattaché au genre Streptococcus et rebaptisé Streptococcus pneumoniae en 1974 en raison de sa croissance en chaines dans les milieux liquides. De nos jours, il est plus connu sous le nom de « Pneumocoque » car il tient un rôle important dans les pneumonies.


Cette bactérie fait partie de la famille des Streptococcaceae. Au microscope, les Streptococcus pneumoniae apparaissent sous forme de diplocoques Gram positifs ovalaires et accolés par leur côté pour former un 8. Ils poussent aussi bien en aérobie qu’en anaérobie. Dans les produits pathologiques, on peut apercevoir une capsule entourant le germe qui lui est caractéristique et ainsi le protège de la phagocytose.

La culture de ce germe est très délicate car il peut se lyser spontanément. Pour sa croissance, il exige alors des milieux enrichis. Les colonies formées sont transparentes et en forme de fines gouttelettes. Elles sont lisses (« Smooth ») quand le germe est virulent donc encapsulé. L’hémolyse sur gélose au sang est de type alpha c’est‐à‐dire que le milieu se verdit par la transformation de l’hémoglobine en biliverdine.

L’identification du Streptococcus pneumoniae se fait donc par différents tests : l’aspect des colonies, la morphologie cellulaire, la sensibilité à l’optochine, la lyse par la bile et l’absence de l’enzyme catalase.


Le Streptococcus pneumoniae est une bactérie commensale des voies respiratoires supérieures de l’Homme et plus précisément du rhinopharyxnx. Cette forme commensale n’a pas de capsule et n’est donc pas virulente. Sa transmission est interhumaine et se fait sous forme de gouttelettes respiratoires.

Pathogénicité Sa virulence est en lien avec sa capsule polysaccharidique, ses diverses adhésines permettant la colonisation et sa pneumolysine jouant un rôle dans son pouvoir pathogène. La capsule est le plus important facteur de pathogénicité du Streptococcus pneumoniae car s’il la perd, il perd ainsi sa virulence.

Epidémiologie

Ce germe est responsable d’infections graves telles que les pneumonies, bactériémies, endocardites, otites, arthrites, péritonites, péricardites ou méningites. Il est responsable d’un grand nombre de décès surtout en période de froid. Introduit dans l’organisme, il provoque une vive réaction inflammatoire avec une production riche en polynucléaires et en fibrine. Lors de méningite, le point de départ de l’infection est otitique ou pharyngée. La production accrue de fibrine bloque la circulation du LCR et donc la diffusion des antibiotiques lors de traitement. Comme il est commensal des voies respiratoires, il provoque alors la méningite lorsqu’il traverse les muqueuses et atteint les méninges par le chemin du sang puis du LCR. La méningite à Streptococcus pneumoniae entraine une mortalité élevée de 20%.



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Le traitement est essentiellement curatif par antibiothérapie. Le choix se pose sur la pénicilline G mais on peut constater que les résistances par rapport aux aminopénicillines ont augmenté ces dernières années. Les aminosides sont inactifs et le Streptococcus pneumoniae est résistant naturellement aux sulfamides et aux tétracyclines. Le traitement pour les méningites contient une céphalosporine de 3ème génération à posologie élevée associée ou non à la vancomycine.

Un premier vaccin a été mis au point. Il utilise les antigènes capsulaires les plus fréquemment rencontrés. Toutefois, il ne permet pas d’obtenir une réponse immunitaire assez efficace chez les enfants. Il est tout de même recommandé pour les personnes à santé fragile. Plus récemment, le vaccin « Prevenar® » contenant des antigènes polysaccharidiques associé à un antigène protéique a été mis sur le marché et peut être utilisé chez les nouveau‐nés. Il les protège contre les sérotype 4, 6B, 9V, 18C, 19F et 23F.

Figure 4 : Aspect des colonies des Pneumocoques

Figure 5 : Streptococcus pneumoniae vus au microscope



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1.2.3 Neisseria meningitidis

Histoire La méningococcie a été décrite pour la première fois à Genève en 1805. La Neisseria meningitidis a été identifiée plus tard, en 1882, par Weichselbaum qui décrit cette bactérie comme l’agent causant la méningite cérébrospinale aiguë.


Cette bactérie fait partie de la famille des Neisseriaceae. Au microscope, Neisseria meningitidis est en forme de diplocoques Gram négatif dont les faces aplaties sont accolées. Ce germe est aéro‐anaérobie facultatif et a besoin de milieux enrichis et d’une atmosphère en CO2 car il est très fragile. Les colonies sont de couleur grisâtre, mesurent entre 1 et 1.5 mm de diamètre et leurs bords sont réguliers. Il acidifie les milieux au glucose et au maltose. On remarque que cette espèce se cultive assez bien sur des milieux sélectifs Neisseria.


Neisseria meningitidis est un commensal du rhinopharynx de l’Homme. Il est spécifiquement humain et peut se retrouver chez des porteurs sains. La transmission de ce germe se fait par voie aérienne sous forme de fines gouttelettes de sécrétions respiratoires. Il peut se transmettre rapidement dans les collectivités (école, armée,…).

En cas de méningite, il passe du rhinopharynx aux méninges en prenant le chemin des nerfs olfactifs ou du sang.

Pathogénicité Les facteurs jouant un rôle dans la pathogénicité sont les adhésines permettant l’adhésion de la bactérie aux muqueuses et la capsule protégeant la bactérie de l’action du complément et de la phagocytose. Il existe 12 sérogroupes de Neisseria meningitidis que l’on reconnaît grâce à des antigènes polysaccharidiques. Cinq d’entre eux sont connus pour provoquer des épidémies : A, B, C, W135 et X.

Neisseria meningitidis est le principal responsable des cas de méningites. L’endotoxine (toxine G.L.P) que possède cette bactérie est responsable du purpura fulminans. Cette maladie se traduit par la présence de pétéchies et de signes de coagulation intravasculaire disséminée (CIVD).

Epidémiologie

La méningite à Neisseria meningitidis frappe plus fortement l’Afrique subsaharienne (Sénégal‐Ethiopie) que les autres pays où elle agit sporadiquement. En période de froid, entre décembre et juin, les infections des voies respiratoires supérieures endommagent la muqueuse rhinopharyngienne et cela augmente le risque de méningococcie. La promiscuité des personnes favorise la transmission des infections par ce germe. On considère que le sérogroupe de type a est responsable des épidémies et que les sérogroupes de type b et c provoque plutôt des cas sporadiques.


Etant très virulent, le germe doit être combattu le plus tôt possible par une antibiothérapie. Celui‐ci est essentiellement curatif. Il est important que l’antibiotique utilisé doive être capable de passer la barrière méningée. Cette bactérie est sensible au β‐lactamines mais avec



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l’apparition de souches résistantes à cet antibiotique ces dernières années, on recommande de traiter avec des céphalosporines de troisième génération.

Le traitement prophylactique s’applique à l’entourage du patient atteint de méningite. Dès l’identification de la maladie, le cas doit être déclaré aux services médicaux et l’entourage sera traité avec de la rifampicine. La vaccination est un bon moyen de se protéger contre cette maladie. Il en existe deux types:

• les vaccins antiméningococciques polyosidiques peuvent être bivalents (groupe A et C), trivalents (groupe A, C et W) et tétravalents (A, C, Y et W135)

• les vaccins antiméningococciques conjugués tétravalents

Figure 6 : Neisseria meningitidis vus au microscope

Figure 7 : Aspect des colonies de Neisseria meningitidis sur une gélose PVX



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2. Objectif de l’étude Au laboratoire de bactériologie de l’ICHV, le diagnostic de la maladie dans le LCR natif se fait par la mise en culture du prélèvement et par l’isolement des bactéries. Ce processus biologique ne permet pas une sensibilité des résultats à 100% dans les cas suspects de méningite. Si une antibiothérapie précède la ponction lombaire, la croissance des germes pathogènes est inhibée à cause de la concentration d’antibiotique. En effet, les bactéries ne pousseront pas ce qui peut entrainer le risque de rendre un résultat faussement négatif.

Le but de cette étude est la mise en place, à l’ICHV, de la PCR Multiplex détectant dans le LCR natif :




Cette méthode de biologie moléculaire est capable de détecter l’ADN de ces trois bactéries de manière simultanée, même si celles‐ci sont détruites par l’action des antibiotiques.

Actuellement dans ce laboratoire, le diagnostic génomique ne se fait pas. En effet, les échantillons sont sous‐traités au laboratoire de bactériologie du CHUV. Cela entraine des contraintes telles que le coût élevé de l’envoi ainsi que le délai du résultat qui prend entre 3 et 4 jours. Si l’analyse fait partie du panel des tests de biologie moléculaire de l’ICHV, cela reviendrait moins cher et le résultat pourrait être rendu dans la journée ou au plus tard, le lendemain.

L’évaluation de la méthode est basée uniquement sur l’étude de C.E Corless et all :

Simultaneous Detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae and Streptococcus pneumoniae in Suspected Cases of Meningitis and Septicemia Using Real‐Time PCR

C. E. Corless,1 M. Guiver,1* R. Borrow,1 V. Edwards‐Jones,2 A. J. Fox,1 and E. B. Kaczmarski1

J Clin Microbiol. 2001 April; 39(4): 1553–1558.

doi: 10.1128/JCM.39.4.1553‐1558.2001.

Dans un premier temps, la spécificité de la méthode est évaluée en testant des souchesbactériennes connues. Dans un deuxième temps, des dilutions géométriques des souches ATCC d’Haemophilus influenzae, de Streptococcus pneumoniae et de Neisseria meningitidissont effecutées dans le but de déterminer la sensibilité de la méthode. Dans un troisièmetemps, des échantillons cliniques sont analysés.

L’efficacité de la méthode, la praticabilité, le coût et la durée de l’analyse sont desparamètres à évaluer.



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3. Matériel et Méthodes

3.1 PCR et PCR en temps réel

3.1.1 Généralités La PCR est une technique rapide de biologie moléculaire permettant d’obtenir d’un échantillon complexe et peu abondant, de l’ADN en quantité suffisante. Cette méthode utilise le principe de l’amplification in vitro de séquences d’ADN définies. En quelques heures, on peut obtenir jusqu’à un million de copies d’une séquence d’ADN spécifique. En 1985, Kary Mullis mit au point la technique de la PCR et pût la commercialiser grâce à la découverte d’une enzyme thermostable appelée « Taq polymérase ». Le rôle de l’enzyme est d’obtenir un brin complémentaire d’ADN grâce à sa capacité de ne pas se dénaturer lorsque les températures sont élevées.

Les appareils utilisés pour effectuer une PCR en temps réel, comme par exemple le Rotor‐Gene 3000 ®, possèdent un système de détection ou de quantification. En bactériologie, cette méthode permet de déceler la présence de microorganismes dans les prélèvements biologiques. Il est important de savoir qu’avant une PCR, l’échantillon doit avoir subi une extraction d’ADN.

Figure 8 : L’amplification PC

3.1.2 ADN L’acide désoxyribonucléique est une molécule contenant l’ensemble de l’information génétique et ainsi, le support de l’hérédité. Il permet de constituer le génome des êtres vivants en se transmettant lors de la reproduction.

L’ADN est une macromolécule. Dans une cellule humaine, la quantité d’ADN stockée est très importante. Si on le déroulait complètement, il pourrait atteindre 1.4 mètres de long. Pour former les chromosomes, l’ADN est d’abord enroulé autour de nucléosomes puis, par condensation, ils forment une fibre de chromatine de 30 nm.

En 1953, Watson et Crick découvrent que l’ADN contient deux brins et qu’ensemble, ils forment une double hélice. Sa structure est alors hélicoïdale et bicaténaire. Pour former cette double hélice, deux chaines de nucléotides complémentaires s’enroulent autour du même



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axe. L’appariement des deux chaines entre elles se fait dans une position antiparallèle, c’est‐à‐dire que les 2 chaines ont un sens inverse l’une par rapport à l’autre :

• Sens 5’ 3’

• Antisens 3’ 5’

Figures 9 et 10 : Molécule d’ADN

Un nucléotide, unité de base de l’ADN, est formé d’une base azotée, d’un sucre (le désoxyribose) et d’un phosphate. Le sucre ainsi que le phosphate forment le « squelette » de la molécule d’ADN tandis que les bases azotées se succèdent pour former le brin d’ADN. Il existe deux types de bases azotées :

• Pyrimidiques : Cytosine et Thymine

• Puriques : Adénine et Guanine

La complémentarité des brins est possible grâce à la liaison entre l’adénine et la thymine par 2 ponts hydrogène et entre la cytosine et la guanine par 3 ponts hydrogène.

3.1.3 MasterMix

Pour une réaction de PCR, plusieurs éléments sont nécessaires dans le milieu réactionnel:

L’ADN polymérase

En s’accrochant d’abord aux amorces, cette molécule synthétise un brin d’ADN correspondant. La plus utilisée et la plus connue est la Taq polymérase qui a la particularité d’être stable (thermostable) et de ne pas se dénaturer lors de variations de températures (de 4 à 95°). Cette enzyme est isolée à partir d’une bactérie thermophile appelée Thermophilus aquaticus se trouvant dans les sources chaudes du Parc National de Yellowstone (Montana ; USA).



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Figure 11 : Brin complémentaire synthétisé par la Taq polymérase

Les amorces (primers)

Durant la PCR, les amorces délimitent la séquence d’ADN à amplifier et elles lui sont spécifiques. Les amorces sont de petites séquences d’environ 20 paires de bases. Pour commencer, elles s’hybrident chacune à l’extrémité du fragment à amplifier. Cela est possible grâce à la complémentarité des séquences nucléotidiques. L’amorce « Reward » allonge le brin dans le sens 3’ 5’ et l’amorce Forward, dans le sens 5’ 3’. Grâce à leur extrémité 3’ OH libre, elles servent de point d’encrage à la Taq polymérase.

Figure 12 : Complémentarité des amorces aux fragments à amplifier

Les désoxyribonucléotides (dNTPs) Les désoxyribonucléotides libres sont utilisés lors de la polymérisation du brin d’ADN complémentaire au brin d’ADN matrice. Les dATP, dTTP, dCTP et les dGTP sont ajoutés successivement. Il est important que la concentration des divers désoxyribonucléotiques soit identique dans le but d’éviter des erreurs de la Taq polymérase.



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Adénine Thymine Guanine Cytosine

Figure 13 : Les molécules des désoxyribonucléotides

MgCl2

Le MgCl2 forme des complexes solubles avec les dNTPs. Il donne au milieu réactionnel un pH et une concentration saline optimale pour un bon fonctionnement de la Taq polymérase et des amorces. Il faut savoir que le magnésium est un cofacteur de l’enzyme.

3.1.4 Etapes de la PCR Les tubes contenant le MasterMix ainsi que l’ADN à amplifier, sont mis dans un thermocycler. Les tubes subissent alors des variations de températures définissant les trois étapes principales de cette méthode :

• La dénaturation : à une température élevée de 95°C, les liaisons hydrogènes maintenant les brins d’ADN ensemble sont rompues. A la fin de la dénaturation, on obtient alors deux simples brins d’ADN.



19

Figure 14 et 15 : La dénaturation

• L’hybridation : la température s’abaisse entre 45° et 65°C. Les amorces s’hybrident aux brins d’ADN cibles par complémentarité des bases. Après s’être fixées, elles servent de point de départ à la polymérisation du brin complémentaire à l’ADN matrice.

Figure 16 : L’hybridation

• L’élongation : à une température de 72°C, l’ADN polymérase commence à polymériser en ajoutant des désoxyribonucléotides libres. Chaque base est complémentaire à la base correspondante sur le brin matrice. La polymérisation se fait dans le sens 5’ 3’.

Figure 17 : L’élongation

Dans notre étude, les étapes d’hybridation et d’élongation ont été réalisées en une seule étape, à 60°C.

Les nouveaux brins synthétisés lors de chaque cycle servent à leur tour de matrice pour le cycle suivant. Ces trois étapes se répètent alors en boucle dans le but d’obtenir environ un million de copies d’ADN. En théorie, la quantité de séquences double à chaque cycle, donc le taux d’amplification est de 2n. L’amplification est donc exponentielle.



20

Figure 18 : Réaction cyclique de l’amplification

Le fait que la séquence cible soit supérieure au reste du génome, la rend facilement manipulable et analysable. L’appareil va effectuer entre 30 et 50 cycles. Chaque cycle dure quelques minutes.

3.1.5 Systèmes de détection des séquences amplifiées

Il existe plusieurs méthodes pour détecter les séquences amplifiées.

Electrophorèse

Cette technique sépare l’ADN selon son poids moléculaire. Sur gel d’agarose, les acides nucléiques migrent dans un champ électrique. Les amplicons sont révélés par un agent intercalant fluorescent appelé « bromure d’éthidium ». C’est un marqueur des acides nucléiques. Utilisant un appareil aux rayonnements ultraviolets, les bandes de migration sont alors visualisées et analysées.

Figure 19 : Bandes de migration d’une électrophorèse

La PCR en temps réel

La PCR en temps réel est la méthode utilisée durant cette étude. La formation de produits PCR est suivie en temps réel. En effet, il n’y plus besoin de l’analyser par électrophorèse.



21

Cette technique offre de nombreux avantages par rapport à une PCR classique :

1. Elle est plus rapide car l’amplification peut être visualisée pendant la réaction et le résultat est donné dès la fin de la PCR

2. Elle est plus spécifique

3. Elle donne des résultats qualitatifs et quantitatifs

4. La réalisation de PCR multiplex est réalisable. En effet, elle permet d’amplifier plusieurs fragments différents et ainsi, de mettre plusieurs organismes ou mutations différents en évidence simultanément dans l’échantillon

Les amplicons sont détectés soit par une substance émettant de la fluorescence (SYBR Green), soit par des sondes spécifiques portant des fluorophores (TaqMan, FRET). Dans cette étude, j’ai utilisé des sondes spécifiques TaqMan.

Les sondes d’hydrolyse TaqMan

Les sondes TaqMan dont la taille représente environ 25‐30 nucléotides portent deux molécules, un fluorochrome ou « reporter » en 5’ et un extincteur ou «quencher » en 3’. Sur la sonde, le quencher et le reporter sont très proches. Le rôle du quencher est d’empêcher le reporter d’émettre de la fluorescence lorsque celui‐ci est excité.

• S’il y a élongation du brin d’ADN à partir d’une amorce par la Taq polymérase, cette dernière se heurte à la sonde TaqMan.

• La Taq polymérase hydrolyse irréversiblement la sonde hybridée car elle possède une activité exonucléasique en 5’. Le reporter se détache alors de la sonde.

• Le reporter n’est plus rattaché au quencher. Etant suffisamment éloigné du quencher, il peut alors émettre sa fluorescence.

Figure 20 : Le rôle de la sonde TaqMan

Comme la quantité d’ADN servant de matrice double à chaque cycle, le nombre de sondes Taqman pouvant s’hybrider double également, de même que la fluorescence émise. Cette fluorescence est donc proportionnelle au nombre de copies synthétisées. L’appareil mesure la fluorescence émise par le produit PCR.



22

3.2 Matériel

→ Sondes d’hydrolyse TaqmanTM

• Haemophilus influenzae (HiProb: 100 nM)

CY5‐CACCACTCATCAAACGAATGAGCGTGG‐BHQ2 (Microsynth)

• Neisseria meningitidis (NmProb : 75 nM)

FAM‐CATTGCCACGTGTCAGCTGCACAT‐TAMRA (Microsynth)

• Streptococcus pneumoniae (SpProb : 100 nM)

JOE‐TGGCGCCCATAAGCAACACTCGAA‐ BHQ1 (?) (Microsynth)

→ Amorces/Primers (concentration : 300 nM chacune)

• Hi1 :GGCGAAATGGTGCTGGTAA

• Hi2 :GGCCAAGAGATACTCATAGAACGTT

• Nm1 : GCTGCGGTAGGTGGTTCAA

• Nm2 :TTGTCGCGGATTTGCAACTA

• Sp1 :TGCAGAGCGTCCTTTGGTCTAT

• Sp2 :CTCTTACTCGTGGTTTCCAACTTGA

Le design des amorces et des sondes est tel que décrit dans l’article. Le fluorochrome TET de la sonde Haemophilus influenzae a été changé par le fluorochrome Cy5 et le fluorochrome VIC de la sonde Streptococcus pneumoniae a été changé par le fluorochrome JOE.

→ MasterMix

AbsoluteTM QPCR Mix contient:

• la polymérase ( Thermo‐StartTM DNA Polymerase)

• un tampon (Proprietary reaction buffer)

• du MgCl2

• des désoxynucléotides (dNTP)

Le MasterMix a été fraîchement préparé et des aliquots ont été congelés. La reprise en parallèle des mêmes échantillons avec ces aliquots n’a montré aucun changement dans la sensibilité de la méthode (CT identiques).

→ Souches de bactéries (138 au total)

• 23 souches de Streptococcus pneumoniae : 21 sérotypes différents et 2 souches ATCC

• 20 souches de Neisseria meningitidis

• 57 souches Haemophilus influenzae : dont 14 souches de type b, 1 souche de type c



23

• 38 autres souches

→ 2 pools d’environ 50 LCR natifs stériles

Ces 2 pools de LCR natifs stériles ont servi de diluant lors de l’étude de la méthode. Préalablement, ils ont fait l’objet d’une amplification afin d’exclure toutes fausses détections lorsqu’ils sont utilisés comme diluant. Ensuite, ils ont été conservés au réfrigérateur à 4°C.

→ 21 prélèvements de LCR

Ces 21 prélèvements de LCR sont des échantillons cliniques qui ont été mis en culture au préalable. Ils ont été conservés au réfrigérateur à 4°C minimum un mois.

3.3 Extraction de l’ADN sur l’automate NucliSens easyMAG®

Figure 21 : L’appareil NucliSens easyMAG®

3.3.1 Le NucliSens easyMAG®

L’appareil NucliSens easyMAG® procède à l’extraction des acides nucléiques en provenance d’échantillons biologiques. La silice, composé chimique de dioxyde de silicium, est capable de fixer les acides nucléiques. Cette propriété est importante pour le bon fonctionnement de cette plateforme automatisée.

3.3.2 Principe de l’extraction L’extraction se déroule en deux étapes :

1. La lyse

Tout d’abord, l’échantillon est mélangé avec un tampon contenant un agent chaotropic. Cet agent détruit la structure spatiale dans les macromolécules telles que les protéines, l’ADN et l’ARN. Ensuite, tous les organismes présents dans l’échantillon clinique sont lysés ce qui libère les acides nucléiques. Cette étape dure environ une dizaine de minutes.



24

2. L’extraction

Cette étape dure environ 40 minutes.

Avant d’initier le programme d’extraction de l’appareil, on ajoute un mélange de particules magnétiques de silice. Les acides nucléiques sont capturés par ces particules magnétiques (A).

Un système d’aimantation attire les billes magnétiques au fond de la cupule durant les nombreux lavages du complexe par les deux tampons (B).

Lors de l’élution, les acides nucléiques sont séparés des particules de silice et sont concentrés en un volume final que l’utilisateur spécifie. Ce processus peut être accéléré si l’on expose les billes à une température élevée (C).

Pour finir, les billes magnétiques sont sépa‐ rées de la solution d’élution finale à l’aide du système aimanté (D).



25

Figure 22 : Les étapes de l’extraction d’ADN

3.3.3 Préparation des échantillons de LCR pour l’extraction Programmation du NucliSens EsayMAG®

• Volume de l’échantillon : 1ml

• Volume de l’éluat : 55 µl

Préparation des billes de silice pour 8 échantillons

• Pipeter 550 µl d’eau stérile dans un tube stérile

• Ajouter 550 µl de préparation de billes de silice préalablement vortexées

• Distribuer 100 µl de billes de silice dans les cupules d’échantillons lysés puis mélanger

• Lancer le programme d’extraction

Conservation de l’ADN extrait

• Transférer les éluats dans des tubes étiquetés

• L’ADN se conserve à ‐20°C

3.3.4 Préparation des souches de bactéries pour l’extraction La préparation des souches de bactéries a été faite de deux manières différentes :

• Premièrement, une solution Mac Farland 0.5 a été préparée en utilisant les colonies de bactéries dans de l’eau physiologique. Ensuite, elle a été diluée géométriquement afin de vérifier la sensibilité. Pour tester la spécificité, la solution Mac Farland 0.5 a été diluée de 100X.

• Deuxièmement, l’eau physiologique a été remplacée par du LCR natif testé stérile. Afin de tester la sensibilité, des dilutions géométriques ont été effectuées comme précédemment, tandis que pour tester la spécificité, une colonie de bactéries a été prélevée au moyen d’une anse calibrée puis mise dans 200 µl de LCR.

Il arrivait que les éluats soient dilués encore 10X quand le signal de détection était trop fort.

3.4 PCR « homemade » sur Rotor‐Gene 3000®

3.4.1 Le Rotor‐Gene 3000® Cet appareil permet la réalisation de PCR ou de RT‐PCR en temps réel. Les sondes utilisées habituellement lors de l’utilisation du Rotor‐Gene 3000® sont les sondes Taqman.

Figure 23 : L’appareil Rotor‐Gene 3000®



26

3.4.2 Principe de l’amplification

Ce schéma démontre l’éclairage des tubes et les signaux détectés de l’intérieur de la chambre de réaction.

Figure 24 : Fonctionnement du Rotor‐Gene 3000®

Sur le carrousel sont placés les tubes qui, à chaque tour, passent devant un détecteur à la vitesse de 1 tour/150 millisecondes. Six sources de lumières différentes (LED Light Source Assembly) peuvent être utilisées en association avec six filtres différents. Afin d’accroître la sensibilité, un photomultiplicateur a été ajouté et détecte tous les signaux optiques.

Figure 25 : La détection par le Rotor‐Gene 3000®

3.5 Déroulement de l’analyse

Le MasterMix

Composé Quantité pour 1 échantillon [µl]

Absolute QPCR Mix Abgene 10 µL Primer Nm1 1 µL Primer Nm2 1 µL Sonde NmProb FAM 0.5 µL Primer Hi1 1 µL Primer Hi2 1 µL Sonde HiProb Cy5 0.5 µL Primer Sp1 1 µL Primer Sp2 1 µL Sonde SpProb Joe 0.5 µL H2O 2.5 µL



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Le MasterMix et l’ADN extrait de l’échantillon clinique sont ensuite mélangés dans des capillaires en plastique et sont placés dans un rotor conçu pour le Rotor‐Gene 3000®.

Figure 26 : Rotor et capillaires en plastique

Les échantillons

Dans chaque capillaire, on pipette 20 µl du MasterMix puis, on ajoute pour :

Le patient : 5 µl d’ADN extrait

Contrôle positif : 5 µl d’un mélange contenant de l’ADN des 3 bactéries (Hi, Sp et Nm) préparé à l’ICHV.

Contrôle négatif : 5 µl d’H2O

CQI : 2,5 µl de l’échantillon + 2,5 µl de contrôle positif

Le contrôle de qualité interne (CQI) permet d’exclure les faux négatifs liés à la présence d’inhibiteurs de la PCR. Habituellement, il est inclus dans le kit commercial. Dans le cas de notre PCR « homemade », nous utilisons des solutions ne contenant pas de CQI. En conclusion, chaque échantillon doit être testé à double.

La programmation du Rotor‐Gene :

Quand les tubes sont placés dans le Rotor‐Gene 3000®, le programme suivant est lancé :

1) 15 minutes à 95°C

2) 15 secondes à 95°C 2) et 3)

3) 60 secondes à 60°C 45 cycles

4) Cooling



28

3.5.1 Résultats et interprétation

Cycling Cy5

Rouge : contrôle positif Bleu : Hi 10‐5

Vert : Hi 10‐6

Rose : Hi ‐7

• Si un signal émit par la sonde Cy5 est détecté : le résultat est positif et l’échantillon contient de l’ADN de la bactérie Haemophilus influenzae de type b ou c.

Cycling FAM

Rouge : contrôle positif

Vert : Nm 10‐4

Rose : Nm 10‐5

Noir : Nm‐6

Bleu : Nm‐7

• Si un signal émit par la sonde FAM est détecté : le résultat est positif et l’échantillon contient de l’ADN de la bactérie Neisseria meningitidis.



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Cycling JOE


Bleu : Sp 10‐5

Violet : Sp 10‐6

Rose : Sp‐7

• Si un signal émit par la sonde JOE est détecté : le résultat est positif et l’échantillon contient de l’ADN de la bactérie Streptococcus pneumoniae.

Résultat négatif


• Si aucun signal n’est détecté par les sondes JOE, FAM et Cy5: le résultat est négatif, l’échantillon ne contient donc pas l’ADN de ces trois bactéries. Mais ceci est validé à condition que le contrôle positif et le CQI soient positifs.



30

4. Analyse des résultats Dans un premier temps, les trois PCR (Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae et Streptococcus pneumoniae) ont été techniquées séparément, puis ensemble sur les mêmes échantillons. Les résultats des CT sont identiques et ne nous montre aucune variation de la sensibilité.

4.1 Spécificité Afin d’évaluer au mieux la spécificité de la méthode, 139 souches de microorganismes ont été testés durant cette étude. Voici les résultats obtenus :


N= NLAB S. pneumoniae Résultats CT

1 03‐25962 Sérotype 1 Pos. avec JOE 22.94



4 03‐00964 Sérotype 6a Pos. avec JOE 18.34

5 03‐23395 Sérotype 7f Pos. avec JOE 18.53


7 01‐40158 Sérotype 9v Pos. avec JOE 18.63






13 01‐20125 Sérotype 18c Pos. avec JOE 18.11

14 04‐04493 Sérotype 19a Pos. avec JOE 17.07



17 05‐01807 Sérotype 23f Pos. avec JOE 21.11





22 49619 Souche ATCC Pos. avec JOE 21.45

23 6305 Souche ATCC Pos. avec JOE 21.74

21 sérotypes différents de Streptococcus pneumoniae ont été testés ainsi que deux souches ATCC. Toutes les souches sont sorties positives à un CT entre 14.25 et 22.94.



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21 souches de Neisseria meningitidis ont été testées. 20 souches sont sorties positives à un CT entre 14.77 et 16.96. La souche « 1 » n’a pas été détectée lors de la PCR. Ceci est traité et expliqué sous le point 4.4 « Problèmes rencontrés ».


N= NLAB N.meningitidis Résultats CT

1 CQ M1 ‐‐‐ ‐‐‐

2 2900 M2 Pos. avec FAM 15.93

3 3594 M3 Pos. avec FAM 16.96

4 12614 M4 Pos. avec FAM 15.43

5 11375 M5 Pos. avec FAM 15.74

6 12614 M6 Pos. avec FAM 15.49

7 14842 M7 Pos. avec FAM 16.36

8 13924 M8 Pos. avec FAM 15.63

9 3642 M9 Pos. avec FAM 16.71

10 9448 M11 Pos. avec FAM 15.64

11 13443 M12 Pos. avec FAM 15.16

12 16333 M13 Pos. avec FAM 15.34

13 8363 M15 Pos. avec FAM 16.13

14 9396 M16 Pos. avec FAM 14.77

15 4740 M17 Pos. avec FAM 15.56

16 4218 M18 Pos. avec FAM 15.66

17 1235 M20 Pos. avec FAM 15.24

18 9905 M21 Pos. avec FAM 15.43

19 11210 M22 Pos. avec FAM 16.08

20 11113 M23 Pos. avec FAM 15.12

21 11092 M24 Pos. avec FAM 14.95

N= Numéro H. influenzae Résultats CT

1 04‐12720 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

2 06‐15564 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

3 06‐22879 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

4 09‐06529 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

5 10‐28126 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

6 11‐21440 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

7 12‐29942 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

8 04‐12071 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

9 07‐31619 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐



32

10 09‐05238 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

11 01‐13751 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

12 03‐30509 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

13 07‐01942 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

14 07‐16207 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

15 10‐02573 type b Pos. avec Cy5 15.39

16 10‐02546 type b Pos. avec Cy5 16.90

17 11‐29361 type b Pos. avec Cy5 18.16

18 11‐29374 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

19 12‐33183 type b Pos. avec Cy5 16.03

20 01‐01279 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

21 03‐03016 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

22 412‐15491 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

23 412‐13242 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

24 412‐12973 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

25 412‐10965 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

26 412‐5973 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

27 412‐5743 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

28 411‐22695 type c Pos. avec Cy5 24.83

29 411‐10061 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

30 411‐13951 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

31 411‐21726 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

32 410‐02488 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

33 410‐13044 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

34 410‐03510 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

35 410‐06488 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

36 410‐06287 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

37 410‐09117 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

38 410‐10724 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

39 410‐11816 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

40 410‐01058 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

41 411‐02443 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

42 411‐02909 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

43 411‐02891 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

44 11‐10604 type b Pos. avec Cy5 18.70

45 01‐01185 type b Pos. avec Cy5 15.78

46 05‐23627 type b Pos. avec Cy5 17.02

47 09‐20823 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

48 03‐02989 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

49 02‐10560 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

50 10948931 ‐‐‐ ‐‐‐ ‐‐‐

51 10730601 type b ‐‐‐ Négatif



33

57 souches d’Haemophilus influenzae ont été testées. 13 souches sur 14 de type b et une souche de type c sont sorties positives à un CT entre 15.39 et 24.83. Ce sont les seuls sérotypes que la méthode met en évidence. La souche « 51 » n’a pas été détectée lors de l’amplification. Ceci est traité et expliqué sous le point 4.4 « Problèmes rencontrés ».

4.1.4 Autres souches

38 autre

s souch

es que

52 10515288 type b Pos. avec Cy5 17.84

53 892562 type b Pos. avec Cy5 16.61

54 795606 type b Pos. avec Cy5 17.47

55 5896 type b Pos. avec Cy5 18.09



N= Numéro Autres souches Résultats CT

1 ATCC 15305 Staph. saprophyticus ‐‐‐ ‐‐‐

2 ATCC 12228 Staph. epidermidis ‐‐‐ ‐‐‐

3 ATCC 25923 Staph. aureus ‐‐‐ ‐‐‐

4 ATCC 29213 Staph. aureus MRSA ‐ ‐‐‐ ‐‐‐

5 ATCC 10556 Strepto. sanguis ‐‐‐ ‐‐‐

6 21004‐27490

7 ATCC 12386

8 ‐9384

Strepto. agalactiae (3X) ‐‐‐ ‐‐‐

9 ATCC 19615 Strepto. pyogenes ‐‐‐ ‐‐‐

10 ATCC 12388 Strepto. groupe C ‐‐‐ ‐‐‐

11 ATCC 13294 Strepto. groupe G ‐‐‐ ‐‐‐

12 ATCC 12392 Strepto. groupe F ‐‐‐ ‐‐‐

13 CQ Strepto. mitis oralis ‐‐‐ ‐‐‐

14 CQ Strepto. gordonii ‐‐‐ ‐‐‐

15 02‐03968 Strepto. anginosus ‐‐‐ ‐‐‐

16 ATCC 25922

17 ATCC 35218

E. coli (2X) ‐‐‐ ‐‐‐

18 ATCC 33495 Klebsiella pneumoniae ‐‐‐ ‐‐‐

19 21004‐28857 Klebsiella oxytoca ‐‐‐ ‐‐‐

20 07‐05372

21 ‐22645

Neisseria gonorrhoeae (2X) ‐‐‐ ‐‐‐

22 21004‐29867+ 915

Neisseria sp. (2X) ‐‐‐ ‐‐‐

23 ATCC 12423

24 ‐7930

Proteus mirabilis (2X) ‐‐‐ ‐‐‐

25 03‐07988 Haemo. aphrophilus ‐‐‐ ‐‐‐

26 ATCC 7901 Haemo. parainfluenzae ‐‐‐ ‐‐‐

27 21004‐30477 Aerococcus urinae ‐‐‐ ‐‐‐

28 21004‐28647 Enterococcus sp. ‐‐‐ ‐‐‐

29 ATCC 29212 Enterococcus faecalis ‐‐‐ ‐‐‐

30 ATCC 27853 Pseudo. aeruginosa ‐‐‐ ‐‐‐

31 21004‐26976 Clostridium perfringens ‐‐‐ ‐‐‐

32 21004‐31075 Candida albicans ‐‐‐ ‐‐‐

33 21004‐28002 Pseudo. fluorescens ‐‐‐ ‐‐‐

34 21004‐30134 Serratia marcescens ‐‐‐ ‐‐‐

35 21004‐30034 Morganella morganii ‐‐‐ ‐‐‐

36 21004‐30472 Campylobacter jejuni ‐‐‐ ‐‐‐

37 21004‐29681 Citrobacter koseri ‐‐‐ ‐‐‐

38 CQ Branhamella catarrhalis ‐‐‐ ‐‐‐



34

celles à rechercher ont été analysées pour tester la spécificité de la méthode. Aucune d’elles n’a été détectée lors de l’amplification.

4.2 Sensibilité Afin d’évaluer au mieux la sensibilité de la méthode, les 3 souches ATCC Streptoccocus pneumoniae, Haemophilus influenzae et Neisseria meningitidis ont été diluées géométriquement d’abords dans de l’eau physiologique, puis ensuite dans du LCR natif stérile. Voici les résultats obtenus :


Dilutions Nombre de

colonies/ 100 µL

Dans l’eau physiologique

[CT]

Nombre de colonies/ 100 µl

Dans le LCR [CT]

100’000 [10‐3]

>> 24.68 PAS TESTE PAS TESTE

10’000 [10‐4]

247 28.85 202 29.60

1’000 [10‐5]

29 31.13 22 32.93

100 [10‐6]

1 34.01 0 ‐‐‐

10 [10‐7]

PAS TESTE 37.05 0 ‐‐‐



35

0 [10‐8]

PAS TESTE PAS TESTE 0 ‐‐‐

• Dans l’eau : On extrapole que dans le Mac Farland 0.5, il y a 2.5*107 bactéries. Si on prend le tube 10‐6, il y a 10 bact. /ml, donc 0.01 bact. /µl. On utilise 5 µl de l’échantillon, donc 0.01*5= 0.05 bactérie. (≤ 1 CFU)

• Dans LCR : On extrapole que dans le Mac Farland 0.5, il y a 2.2*107 bactéries. Si on prend le tube 10‐5, il y a 220 bact. /ml, donc 0.22 bact. /µl. On utilise 5 µl de l’échantillon, donc 0.22*5= 1.1 bactérie. (1 CFU)

Il est intéressant de remarquer que dans la concentration 10‐7, l’ADN du germe pathogène est toujours détecté même si rien ne pousse sur les géloses. Cela montre une très bonne sensibilité de la méthode.


Dilutions Nombre de colonies/

100 µL


[CT]


Dans le LCR [CT]

100’000 [10‐3]


10’000 [10‐4]

>> 25.41 >> 23.56

1’000 [10‐5]

190 29.12 190 26.49

100 [10‐6]

18 31.54 31 29.49

10 [10‐7]

PAS TESTE 33.17 0 33.01



36

0 [10‐8]


• Dans l’eau : On extrapole que dans le Mac Farland 0.5, il y a 1.8*108 bactéries. Si on prend le tube 10‐6, il y a 180 bact. /ml, donc 0.18 bact. /µl. On utilise 5 µl de l’échantillon, donc 0.18*5= 0.9 bactérie. (≤ 1 CFU)

• Dans LCR : On extrapole que dans le Mac Farland 0.5, il y a 3.1*108 bactéries. Si on prend le tube 10‐6, il y a 310 bact. /ml, donc 0.3 bact. /µl. On utilise 5 µl de l’échantillon, donc 0.3*5 = 1.5 bactéries. (1 CFU)

Il est intéressant de remarquer que dans la concentration 10‐7, l’ADN du germe pathogène est toujours détecté même si rien ne pousse sur les géloses. Cela montre une très bonne sensibilité de la méthode.


Dilutions Nombre de colonies/

100 µL


[CT]


Dans le LCR [CT]

100’000 [10‐3]


10’000 [10‐4]

356 23.28 >> 24.98

1’000 [10‐5]

100 26.76 129 27.21

100 [10‐6]

9 29.13 18 30.48

10 2 34.19 0 ‐‐‐



37

[10‐7]

0 [10‐8]


• Dans l’eau : On extrapole que dans le Mac Farland 0.5, il y a 107 bactéries. Si on prend le tube 10‐6, il y a 90 bact. /ml, donc 0.09 bact. /µl. On utilise 5 µl de l’échantillon, donc 0.09*5= 0.45 bactérie. (≤ 1 CFU)

• Dans LCR : On extrapole que dans le Mac Farland 0.5, il y a 1.29*107 bactéries. Si on prend le tube 10‐6, il y a 180 bact. /ml, donc 0.18 bact. /µl. On utilise 5 µl de l’échantillon, donc environ 0.18*5= environ 0.9 bactérie. (≤ 1 CFU)

4.3 Echantillons de LCR natifs Vingt LCR natifs censés être négatifs ont été testés séparément selon la méthode. Aucun de ces prélèvements ne s’est révélé positif car il n’a pas eu d’amplification lors de la PCR en temps réel. Un LCR positif au Streptococcus pneumoniae lors de la mise en culture a montré une amplification avec un CT à 18.68.

4.4 Problèmes rencontrés

4.4.1 La sonde FAM

Lors des premières amplifications, la sonde FAM donnait un signal faible. En doublant la concentration de la sonde, les résultats de l’amplification n’étaient pas meilleurs. La concentration de la sonde NmProbe FAM fût alors triplée ce qui améliora considérablement la détection des produits PCR par le Rotor‐Gene 3000®. Pour des raisons pratiques, le volume de la sonde FAM n’a pas été changé sur le protocole. Mais c’est lors de la reconstitution de la sonde NmProbe FAM que seulement 3 ml d’eau est rajoutée, au lieu des 9,7 ml d’eau habituels, ce qui triple la concentration à [75 nM].

4.4.2 La souche « 1 » Neisseria meningitidis

La souche « 1 » de Neisseria meningitidis, testée deux fois après dilution, n’a pas été détectée à la PCR. Un bouillon BHI a été ensemencé avec cette souche dans le but d’effectuer un Gram,



38

une oxydase et un API NH. L’oxydase est positive et l’observation du Gram montre des cocci Gram négatif en grain de café. Le API NH donne comme résultat une Neisseria sp.

Cette souche provenait d’un CQ et a été isolée en 1991. Pour des raisons évidentes de sécurité, les centres de contrôle de qualité n’envoient pas de Neisseria meningitidis.

4.4.3 La souche « 51 » Haemophilus influenzae

Seule cette souche de type b, testée deux fois après dilution, n’a pas donné d’amplification lors de la PCR. La souche est bien de type b car il y a eu une agglutination avec un antisérum de type b.

C’est un résultat faussement négatif. Il s’agit d’une souche de notre collection isolée en 2000 à partir d’une hémoculture.

5. Discussion 5.1 Sensibilité/spécificité

La sensibilité d’un test est sa capacité de donner un résultat positif si le sujet est atteint de la maladie considérée. Cette notion prend alors en compte le nombre de faux négatifs.

La spécificité d’un test est sa capacité de donner un résultat négatif si le sujet n’est pas atteint de la maladie. Cette notion prend alors en compte le nombre de faux positifs.

Il est important de noter que la précision des valeurs de sensibilité et de spécificité est dépendante du nombre d’individus testés, c’est‐à‐dire que plus le nombre est élevé, plus les valeurs de précision ressemblent à la réalité.

Pour le diagnostic de la méningite, il est d’une réelle importance que la sensibilité soit bonne dans le but de détecter tous les personnes atteintes et malades. Étant donné de la gravité et de la contagiosité de cette maladie, le personnel hospitalier doit prendre rapidement des mesures de précautions et des mesures d’isolement.

Spécificité



39

Afin d’évaluer la spécificité de la méthode, plusieurs souches d’espèces de bactéries ont été nécessaires. L’appareil EasyMAG® a été utilisée afin d’extraire l’ADN de ces souches et le Rotor‐Gene 3000® a permis de procéder à leur amplification.

Je conclue que la spécificité de la méthode est très bonne et qu’il n’existe aucune interférence entre les amorces et d’autres souches.

Sensibilité

Afin d’évaluer la sensibilité de la méthode, les 3 souches ATCC Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae et Neisseria meningitidis ont été diluées de façon géométrique à partir d’un Mac Farland 0,5 d’abord dans de l’eau physiologique puis, dans du LCR. Chaque produit de dilution a été ensemencé soit sur une gélose Columbia + 5% de sang de mouton (S.pneumoniae), soit sur Chocolat Polyvitex (N. meningitidis et H. influenzae). En parallèle, ils ont été extraits par l’appareil EaysMAG® puis amplifiés par PCR en temps réel sur le Rotor‐Gene 3000®.

5.2 Coût L’analyse sur le Rotor‐Gene 3000® comprend :

• 1 contrôle positif

• Le patient

• 1 CQI

• 1 contrôle négatif

Il ne faut pas oublier de compter le volume mort. En tout, cela fait 5 volumes pour chaque analyse.



40

Volume Prix CHF

Extraction Par échantillon 1 8.50.‐

Réactif 1.5 ml 750.‐ Sondes

Par analyse 7.5 µl 3.75.‐

Réactif 27.3 ml 54.50.‐ Amorces

Par analyse 30 µl 0.05.‐

Pièce 0.1 Capillaire

Par analyse 4 0.4

Réactif 2.5 ml 212.‐ Absolute QPCR Mix Abgene Par analyse 50 µl 4.25.‐

Prix total de l’analyse 16.95.‐



41

6. Conclusion et synthèse Actuellement au laboratoire de bactériologie de l’ICHV, la mise en culture des prélèvements de LCR n’offrait pas un diagnostic de certitude face aux cas suspects de méningites, surtout si l’antibiothérapie avait débuté avant le prélèvement. Dans ce but, nous avons adapté et évalué une méthode de biologie moléculaire, une PCR Multiplex, pour ainsi introduire cette nouvelle analyse dans le panel des tests de biologie moléculaire. Elle est capable de détecter simultanément l’ADN des souches Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae et Neisseria meningitidis dans les prélèvements de LCR natif. Décrite par C.E. Corless and all, j’ai ainsi pu évaluer sa spécificité, sa sensibilité, ainsi que la durée d’analyse, sa praticabilité, son efficacité et son coût.

A la fin de l’étude, nous avons pu conclure que la spécificité ainsi que la sensibilité sont très bonnes. Premièrement, les éléments contenus dans le MasterMix n’interagissent en aucun cas avec une autre souche que celles à détecter, puis deuxièmement, la technique permet une détection d’une quantité infime de l’agent pathogène, de l’ordre de ≤ 1 CFU/ml. Il faut aussi tenir compte du coût et du gain de temps pour le rendu des résultats.

En conclusion, il est alors possible d’introduire cette analyse dans le panel des tests de biologie moléculaire réalisés dans le laboratoire de l’ICHV.

Conclusion personnelle

Ce travail de diplôme m’a apporté beaucoup de satisfactions. N’ayant pas effectué de stage en biologie moléculaire durant ma formation, il m’a permis de me familiariser avec les techniques du laboratoire, d’approfondir mes connaissances théoriques dans ce domaine et d’acquérir une autonomie dans les manipulations. J’ai porté un grand intérêt à la pratique de ce travail car c’est une chance que d’avoir l’opportunité d’introduire une nouvelle analyse au sein d’un laboratoire.

De manière générale, j’ai beaucoup apprécié de pouvoir effectuer mon travail de diplôme au laboratoire de bactériologie à l’ICHV.

Perspective

Lors de l’achèvement de mon étude, le laboratoire de bactériologie de l’ICHV projetait d’effectuer une autre étude sur la détection d’agents pathogènes présents dans les échantillons de LCR natifs. Elle consisterait à évaluer une PCR Quadriplex en vue de la détection de germes provoquant la méningite en intégrant, en plus de Streptococcus pneumoniae, de Haemophilus influenzae et de Neisseria meningitidis, la recherche de Listeria monocytogenes.



42

7. Références bibliographiques

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• Prlliy, E. (1982). Maladies infectieuses : à l’usage des étudiants en médecineet des praticiens. Lille : Crouan & Roques

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Brochures • Bertholom, C., Professeure de Microbiologie ENCPB‐Paris (01.06.2010). Diagnostic

des méningites. Genève : bioMérieux

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Figure en‐tête:http://la‐nutrigenomique.e‐monsite.com/rubrique,deuxieme‐partie,380500.html

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44




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8. Lexique Amplicons : fragments d’ADN amplifiés par PCR

Bactériémie : passage éphémère de bactéries dans le sang, ne présente pas de signes cliniques

Biliverdine : pigment de couleur verte contenu dans la bile et provenant de l’hémoglobine

β‐ lactamase : famille d’enzymes responsables de résistance des bactéries vis‐à‐vis des antibiotiques bêta‐lactamines

Céphalées : maux de tête

Collapsus respiratoire : affaissement des poumons qui peut être dû à un épanchement pleural, à un pneumothorax ou par une tumeur

Commensal : ce dit d’une relation entre deux organismes quand le commensal profite de la nourriture de l’hôte. Cette relation n’est pas réciproque.

Conjonctivite : inflammation de la membrane muqueuse qui tapisse l’intérieur des paupières

Curatif : qui a pour but de guérir les maladies

Endotoxine : toxine contenue dans certaines bactéries, on peut l’extraire seulement quand la bactérie est détruite

Extincteur : élément de la sonde TaqMan capable d’inhiber l’activité du fluorochrome à émettre de la fluorescence lorsqu’ils sont attachés l’un à l’autre

Fibrine : protéine insoluble et élastique contenue dans le plasma sanguin, qui est responsable de la coagulation

Fluorochrome : substance chimique et élément de la sonde TaqMan capable d’émettre de la fluorescence après excitation

Fontanelle : espaces membraneux qui permettent de séparer les différents os du crâne. Elles sont présentes chez les bébés.

Hypoxie : oxygénation insuffisante des tissus

LCR : liquide céphalo‐rachidien protégeant le cerveau et la moelle épinière en amortissant et en absorbant les mouvements ou les chocs

Méninge : composé de trois enveloppes qui recouvrent et protègent le système nerveux central. Ils se nomment : la dure‐mère, l’arachnoïde et la pie‐mère

PCR : Polymerase chain reaction, technique de biologie moléculaire permettant l’amplification de séquences d’ADN



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Pétéchies : petites taches de couleur rouge apparaissant sur la peau qui sont signes de petites hémorragies

Photomultiplicateur : dispositif permettant la détection des photons. Sous l’action de la lumière, des électrons sont arrachés d’un métal, le faible courant électrique ainsi généré est amplifié pour obtenir un gain important.

Photophobie : sensibilité à la lumière qui survient lors de certaines maladies

Polynucléaires : ce dit d’une cellule qui a plusieurs noyaux, comme les leucocytes

Prophylaxie : mesures à prendre dans le but de prévenir une maladie

Purpura fulminans : forme grave de septicémie

Septicémie : infection grave se caractérisant par la présence de germes pathogènes dans le sang

Sporadique : maladie qui n’atteint que quelques personnes isolément

Thermocycler : appareil utilisé en biologie moléculaire pour effectuer une PCR

Thermostable : ce dit de quelque chose qui reste stable lors de variations de températures



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9. Remerciements

Pour commencer, je souhaite remercier le Dr. Gérard Praz, médecin chef du laboratoire de bactériologie, ainsi que le Dr. Olivier Péter, biologiste‐adjoint, qui m’ont permis de réaliser cette étude au sein du laboratoire de bactériologie de l’Institut Central des Hôpitaux Valaisans (ICHV) à Sion.

Je remercie également toute l’équipe du laboratoire de bactériologie de l’ICHV pour leur disponibilité, leurs précieux conseils, leur patience, leur bonne humeur et leur gentillesse.

Un grand merci tout particulièrement à Mme Lysiane Tissières Lovey, laborantine‐cheffe du laboratoire de bactériologie et mentor de mon travail de diplôme, qui a consacré son temps précieux tout au long de cette étude afin de me suivre et de me conseiller au mieux.



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10. Annexe

PCR Multiplex LCR Protocole no: n Date: 20.07.2010 PCR Rotorgene Nbre échantillons

PCR 1 5 Progr. Rotorgen PCR

Absolute QPCR Mix Abgene 10 µL 50 µL 1) 15 min. 95 °C

Primer Nm1 1 µL 5 µL 2) 15 sec 95 °C Primer Nm2 1 µL 5 µL 3) 60 sec 60 °C 2-3 45x Sonde NmProb FAM 0.5 µL 2.5 µL 4) cooling Primer Hi1 1 µL 5 µL Primer Hi2 1 µL 5 µL Sonde HiProb Cy5 0.5 µL 2.5 µL Primer Sp1 1 µL 5 µL Primer Sp2 1 µL 5 µL Sonde SpProb Joe 0.5 µL 2.5 µL

H2O 2.5 µL 12.5 µL Sous-total 20 µL 100 µL Echantillon 5 µL Total 25 µL RESULTATS

1 C+

2 le patient

3 CQI

4 C négatif



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Documents

Evaluation de la PCR en temps réel pour la détection ... · L’antibiothérapie primaire repose sur une céphalosporine de troisième génération telle que la céfotaxime ou la