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Ecole Doctorale en Sciences Pharmaceutiques
Etude de l’interaction des souches cliniques de Staphylococcus aureus avec
une surface abiotique
Jean-Marie LIESSE IYAMBA
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences
Biomédicales et Pharmaceutiques
Promoteur et co-promoteur:
Prof. Jean-Paul DEHAYE (Laboratoire de Chimie biologique et médicale et de Microbiologie
pharmaceutique, Faculté de Pharmacie)
Prof. TAKAISI KIKUNI (Laboratoire de Microbiologie Expérimentale et Pharmaceutique,
Faculté des Sciences Pharmaceutiques, Université de Kinshasa)
Composition du jury:
Présidente: Prof. Véronique MATHIEU (Faculté de Pharmacie, Université Libre de
Bruxelles)
Secrétaire: Prof. Paule BOUSSARD (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles)
Membres:
Prof. Stéphanie POCHET (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles)
Prof. Caroline STEVIGNY (Faculté de Pharmacie, Université Libre de Bruxelles)
Prof. Philippe COURTOIS (Jury externe, Faculté de Médecine, Université de libre de
Bruxelles)
Dr. Thierry BERNARDI (Jury externe, Membre du groupe européen de recherche COATIM)
Octobre 2012
Faculté de Pharmacie
2
DEDICACE
Je dédie ce travail
En mémoire de ma mère Marguerite SOSA BAMELA
A ma très chère et tendre épouse Nicky KIMBUTA pour son amour, sa patience, son soutien
permanent et surtout pour son dévouement à l’éducation de nos enfants en dépit de ses
nombreuses occupations.
A mes chers enfants Muriel et Daniel LIESSE pour tous les moments difficiles passés loin de
vous.
3
REMERCIEMENTS
Je voudrais remercier vivement le Professeur Jean-Paul DEHAYE pour m’avoir permis
d’intégrer son laboratoire et pour l’encadrement dont j’ai bénéficié de sa part tout au long de
mes travaux de thèse. Votre disponibilité, vos critiques et remarques et surtout vos
connaissances scientifiques très poussées ont concouru à l’aboutissement heureux de ce
travail.
Je tiens à exprimer toute ma gratitude au Professeur TAKAISI KIKUNI pour avoir accepté de
co-diriger ce travail. Vous avez su me convaincre avec beaucoup de bienveillance et patience
afin que j’entreprenne ces études et m’avez entouré de meilleures conditions pour mener à
bien mes recherches. Que ce travail soit le témoignage de ma grande reconnaissance.
Je remercie l’initiateur de ce travail, le Professeur Michel DEVLEESCHOUWER. Durant
mes études pour l’obtention du Diplôme d’Etudes Approfondies, vous n’aviez ménagé aucun
effort pour m’offrir des conditions de travail idéales, sans oublier l’accueil chaleureux dont
j’ai rencontré au sein de votre bienveillante famille.
Je remercie les membres de mon comité d’accompagnement, Professeurs Stéphanie POCHET
et Philippe COURTOIS, dont les pertinentes remarques et suggestions m’ont permis
d’améliorer ce travail.
Je voudrais aussi exprimer toute ma gratitude aux Professeurs Véronique MATHIEU, Paule
BOUSSARD, Stéphanie POCHET, Caroline STEVIGNY, Phillipe COURTOIS et au Docteur
Thierry BERNARDI, pour avoir accepté de participer au jury de cette thèse et
particulièrement pour le temps consacré à lire et à juger ce travail en vue de l’amélioration de
la version finale.
Je remercie la Coopération Technique Belge (CTB) dont la bourse m’a permis de réaliser
cette thèse.
Je remercie également toute ma famille, ma belle famille ainsi que tous mes proches pour leur
soutien moral indéfectible tout au long de ce parcours.
Je remercie le Docteur Michel SEIL et Mme Sara DULANTO pour leur expertise dans les
études de biologie moléculaire.
4
Mes très sincères remerciements à mes collègues Carole NAGANT et Malika EL OUAALITI
pour avoir généreusement mis à ma disposition respectivement les matériels et réactifs pour
les études du biofilm et les macrophages.
Je remercie Mme Naima EL MANSSOURI et Mr Charaf EL KHATTABI pour leur
gentillesse et disponibilité.
Je remercie aussi les Dr. Ariane DEPLANO et Olivier DENIS ainsi que Mr Raf De RYCK du
Centre National de référence Staphylococcus aureus de l’Hôpital Erasme pour avoir accepté
avec promptitude de réaliser les études de typage moléculaire des souches de Staphylococcus
aureus.
5
LISTE DES ABREVIATIONS
ADN: Acide désoxyribonucléique
agr: Accessory gene regulatory
Arl: autolysis –related locus
ARN: Acide ribonucléique
ARNr: Acide ribonucléique ribosomal
ATCC: American Type Culture Collection
Bap: Biofilm associated protein
BFI: Biofilm Forming Index
BFRT®: Biofilm Ring Test
®
BHI: Brain Heart Infusion
ccr: Cassette chromosomal recombinase gene
CDC: Center for Disease Control and Prevention
CHIPS: Chemotaxis inhibitory protein of staphylococci
Clf: Clumping factor
CLSI: Clinical and Laboratory Standard Institute
CLSM: Confocal laser scanning microscopy
CMI: Concentration minimale inhibitrice
Cna: Collagen binding protein
CV: Cristal violet
ddNTP: Didésoxyribonucléotide triphosphate
DHFR: Dihydrofolate réductase
6
DHPS: Dihydroptéroate synthétase
DMSO: Diméthylsulfoxide
DNases: Désoxyribonucléases
dNTP: Désoxyribonuléotide triphospahate
D.O: Densité optique
EDTA:Acide éthylène diamine tetraacétique
EGTA:acide éthylèneglycol tétraacétique
EPS: Extracellular polymeric substances
ET: Epidermolytic toxin
FEM: Factor Essential for Methicillin Resistance
FnBP: Fibronectin Bindin Protein
gap: Gène codant pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase
GISA: Glycopeptide Intermediate-Sensitive Staphylococcus aureus
HEPES: 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazine éthane sulfonique
HGPRK: Hôpital Général Provincial de Référence de Kinshasa
Ica: Intercellular adhesin
LPV: Leucocidine de Panton et Valentine
LukE-LukD: Composés de classe E et D de la LPV
MATS test: Microbial adhesion to solvents test
mec: Methicillin resistant gene
Mgr: Multiple gene regulators
MSCRAMM: Microbial surface components recognising the adhesin matrix molecules
7
NAG: N-acétylglucosamine
NAM: Acide N-acétylmuramique
NCCLS: National Committee for Clinical and Laboratory Standard Institute
pb: Paires de base
PBP: Penicillin binding protein
PCR: Polymerase Chain Reaction
PGNA: poly-N-acétylglucosamine
PI: Periodate de sodiun
PIA: Polysaccharide intercellular adhesin
PK: Protéinase K
PSM: Phenol-Soluble Modulins
qRT-PCR: Quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction
QS: Quorum sensing
RIP: Ribo Nucleic Acid III-Inhibiting Peptide
Rot: Repressor of toxins
Sae: Staphylococcal accessory element
sar: Staphylococcal accessory regulator
SARM: Staphylococcus aureus résistant à la méticilline
SasC: Staphylococcus aureus surface protein C
SasG: Staphylococcus aureus surface protein G
SASM: Staphylococcus aureus sensible à la méticilline
SAT test: Salt aggregation test
8
SBI: Suspension Bactérienne Initiale
SCCmec: Staphylococcal Cassette Chromosome mec
SEM : Scanning electron microscopy
SpA: Staphylococcal Protein A
Srr: Staphylococcal respiratory response
TBE: Tampon tris-borate-EDTA
Tpn: Transferrin-binding protein
Tris: Tris (hydroxyméthyl) aminométhane
TSA: Tryptone soya agar
TSB: Tryptone soya broth
TSS: Toxic shock syndrome
TTSS-1: Toxic shock syndrome toxin 1
UFC: Unités formant une colonie
VISA: Vancomycin intermediate-sensitive Staphylococcus aureus
VRSA: Vancomycin resistant Staphylococcus aureus
9
TABLE DES MATIERES
1. RESUME ............................................................................................................................. 15
2. INTRODUCTION .............................................................................................................. 17
2.1. STAPHYLOCOCCUS AUREUS ..................................................................................... 17
2.1.1. Caractères généraux de Staphylococcus aureus ............................................................. 17
2.1.1.1. Caractères morphologiques et culturaux ..................................................................... 17
2.1.1.2. Génome ....................................................................................................................... 17
2.1.1.3 Constituants de la paroi cellulaire ................................................................................ 18
2.1.2. Pouvoir pathogène de S. aureus ..................................................................................... 19
2.1.2.1. Colonisation de l’hôte ................................................................................................. 19
2.1.2.2. Facteurs de virulence ................................................................................................... 22
2.1.2.3. Portage et infections dues au Staphylococcus aureus ................................................. 25
2.1.3. Staphylococcus aureus et résistance aux antibiotiques .................................................. 26
2.1.3.1. Les β-lactamines .......................................................................................................... 26
2.1.3.1.1. Mécanismes d’action et de résistance ...................................................................... 26
2.1.3.1.2. Résistance à la pénicilline ........................................................................................ 27
2.1.3.1.3. Résistance à la méticilline ........................................................................................ 27
2.1.3.1.3.1. Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) .................................... 27
2.1.3.1.3.2. Mécanismes de résistance de S. aureus à la méticilline ........................................ 28
2.1.3.1.3.3. Facteurs influençant l’expression de la méticillino-résistance .............................. 28
2.1.3.2. Les glycopeptides ........................................................................................................ 29
2.1.3.2.1. Mécanisme d’action ................................................................................................. 30
2.1.3.2.2. Résistance de S. aureus aux glycopeptides .............................................................. 30
2.1.3.2.2.1. SARM de sensibilité intermédiaire à la vancomycine (VISA) ............................. 31
2.1.3.2.2.2. SARM résistant à la vancomycine (VRSA) .......................................................... 31
2.1.3.3. La mupirocine ............................................................................................................. 32
10
2.1.3.4. Les autres antibiotiques utilisés contre S. aureus ........................................................ 32
2.2. LE BIOFILM BACTERIEN .......................................................................................... 34
2.2.1. Introduction .................................................................................................................... 34
2.2.2. Structure et organisation ................................................................................................. 35
2.2.3. Physiologie du biofilm ................................................................................................... 36
2.2.4. Biofilms staphylococciques ............................................................................................ 37
2.2.4.1. Infections liées à la présence des biofilms de S. aureus .............................................. 37
2.2.4.2. Base moléculaire de la formation du biofilm de S. aureus ......................................... 38
2.2.4.2.1. Adhésion ................................................................................................................... 39
2.2.4.2.1.1. Adhésion aux surfaces abiotiques ......................................................................... 39
2.2.4.2.1.2. Attachement aux surfaces biotiques ...................................................................... 39
2.2.4.2.2. Multiplication des bactéries et maturation du biofilm.............................................. 39
2.2.4.2.2.1. Adhésine polysaccharidique intercellulaire (PIA) ................................................ 40
2.2.4.2.2.2. Biosynthèse du PIA ............................................................................................... 40
2.2.4.2.2.3. Mécanismes indépendants de l’opéron ica ............................................................ 41
2.2.4.2.3. Détachement du biofilm ........................................................................................... 42
2.2.4.3. Facteurs favorisant la formation du biofilm ................................................................ 42
2.2.4.3.1. Caractéristiques de la surface du substrat ................................................................ 43
2.2.4.3.1.1. Les propriétés physico-chimiques de la surface .................................................... 43
2.2.4.3.1.2. La rugosité de la surface ........................................................................................ 44
2.2.4.3.2. La présence d’une couche protéique ou film conditionnant .................................... 44
2.2.4.3.3. Les caractéristiques du milieu .................................................................................. 44
2.2.4.3.4. Les propriétés de la surface cellulaire ...................................................................... 44
2.2.4.4. Quorum sensing et biofilm de S. aureus ..................................................................... 45
2.2.4.5. Résistance du biofilm .................................................................................................. 45
2.2.4.6. Lutte contre les biofilms de S. aureus sur les implants médicaux .............................. 46
11
2.2.4.6.1. Inhibition de l’adhésion microbienne ....................................................................... 46
2.2.4.6.1.1. Les solutions verrous ............................................................................................. 46
2.2.4.6.1.2. Traitements par incorporation d’agents antimicrobiens ........................................ 46
2.2.4.6.2. Action sur le QS ....................................................................................................... 47
2.2.4.6.3. Le traitement du biofilm staphylococcique préformé .............................................. 47
3. BUT DU TRAVAIL ........................................................................................................... 49
4. MATERIEL ET METHODES .......................................................................................... 50
4.1. MATERIEL ..................................................................................................................... 50
4.1.1. Souches bactériennes ...................................................................................................... 50
4.1.1.1. Souches testées et types de prélèvement ..................................................................... 50
4.1.1.2. Identification, transport et conservation de souches ................................................... 51
4.1.2. Milieu de culture pour la formation des biofilms ........................................................... 51
4.1.3. Substances antibiofilms .................................................................................................. 51
4.1.4. Microplaques permettant la formation du biofilm ......................................................... 52
4.1.5. Dispositif du Biofilm Ring Test® (BFRT
®) ................................................................... 52
4.1.6. Les amorces utilisées ...................................................................................................... 52
4.2. METHODES .................................................................................................................... 54
4.2.1. Caractérisation des souches de S. aureus ....................................................................... 54
4.2.1.1. Antibiogrammes .......................................................................................................... 54
4.2.1.2. Caractérisation génomique des souches de S. aureus ................................................. 54
4.2.1.2.1. Détection de gènes codant pour l’ARNr 16S, la résistance à la méticilline et pour la
thermonucléase de S. aureus par une PCR triplex ................................................................... 54
4.2.1.2.1.1. Extraction de l’ADN ............................................................................................. 55
4.2.1.2.1.2. PCR triplex ARNr 16S, mecA et nuc .................................................................... 55
4.2.1.2.2. Typage moléculaire des souches de S. aureus par spa typing .................................. 56
4.2.1.2.2.1. Extraction de l’ADN ............................................................................................. 56
4.2.1.2.2.2. PCR de la région X du gène spa ........................................................................... 56
12
4.2.1.2.2.3. Séquençage de l’ADN ........................................................................................... 57
4.2.1.2.2.4. PCR de séquençage ............................................................................................... 57
4.2.1.2.3. Détection du gène gap, et des gènes impliqués dans la résistance à la méticilline et à
la mupirocine ............................................................................................................................ 58
4.2.1.2.3.1. Extraction de l’ADN ............................................................................................. 58
4.2.1.2.3.2. PCR de fragments des gènes gap, mecA, femB, ileS-2 (mupR) ............................. 58
4.2.1.3. Détermination du taux de croissance des cellules bactériennes .................................. 60
4.2.1.4. Détermination des propriétés de surface des cellules bactériennes ............................. 60
4.2.1.4.1. La méthode MATS (Microbial Adhesion To Solvents) ........................................... 60
4.2.1.4.2. La méthode SAT (Salt Aggregation Test) ................................................................ 62
4.2.1.5. Test de l’adhérence bactérienne sur tube de cathéter .................................................. 62
4.2.2. Etudes sur la formation du biofilm ................................................................................. 63
4.2.2.1. Etude de la formation du biofilm par la méthode in vitro de «Biofilm Ring Test®
» .. 63
4.2.2.2. Etude de la formation de biofilm par la méthode in vitro de coloration au cristal violet
(CV) .......................................................................................................................................... 64
4.2.2.3. Exploration de la composition de la matrice du biofilm de SASM et de SARM par
BFRT® et CV: Effet de la protéinase K et du periodate de sodium sur la formation et la
déstructuration du biofilm ........................................................................................................ 65
4.2.2.3.1. Effet du periodate de sodium (PI) ............................................................................ 65
4.2.2.3.1.1. La méthode du BFRT®
.......................................................................................... 65
4.2.2.3.1.2. La méthode de coloration au CV ........................................................................... 65
4.2.2.3.2. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm ....................................... 66
4.2.2.3.2.1. La méthode de BFRT®
.......................................................................................... 66
4.2.2.3.2.2. La méthode de coloration au CV ........................................................................... 67
4.2.2.3.3. Etude de l’effet du periodate de sodium et de la protéinase K sur la mobilité des
billes ......................................................................................................................................... 67
4.2.2.4. Etude de l’activité de l’EGTA sur les biofilms de SASM et de SARM ..................... 67
4.2.2.4.1. Evaluation de l’activité de l’EGTA sur les biofilms en formation et préformés ..... 67
13
4.2.2.4.2. Evaluation de la toxicité de l’EGTA sur les cellules eucaryotes par le test MTT ... 67
4.2.2.4.2.1. Culture des cellules ............................................................................................... 67
4.2.2.4.2.2. Viabilité cellulaire ................................................................................................. 68
4.2.2.5. Détection de gènes codant pour IcaA et pour les protéines de surface impliquées dans
la formation des biofilms .......................................................................................................... 69
4.2.2.5.1. PCR de fragments des gènes sasC, sasG, fnbA, fnbB, clfA, clfB et icaA ............... 69
5. RESULTATS ...................................................................................................................... 71
5.1. Sensibilité aux antibiotiques ........................................................................................... 71
5.2. Gènes codant pour la résistance à la méticilline et à la mupirocine ........................... 72
5.3. spa typing ......................................................................................................................... 75
5.4. Croissance bactérienne ................................................................................................... 76
5.5. Caractérisation des propriétés de surface des souches bactériennes.......................... 78
5.6. Formation du biofilm ...................................................................................................... 81
5.6.1. Adhérence bactérienne sur une surface par le BFRT®
................................................... 81
5.6.2. Etude de la formation du biofilm par la méthode de coloration au cristal violet ........... 83
5.6.3. Composition de la matrice du biofilm ............................................................................ 86
5.6.3.1. Recherche par PCR d’un fragment de icaA................................................................. 86
5.6.3.2. Effet du periodate de sodium (PI) sur l’adhésion, la formation et sur la déstructuration
du biofilm ................................................................................................................................. 88
5.6.3.2.1. Effet du PI sur l’adhésion par le BFRT®
.................................................................. 88
5.6.3.2.2. Effet du PI sur la formation du biofilm par la méthode de coloration au cristal violet
.................................................................................................................................................. 91
5.6.3.2.3. Etude par la méthode de coloration au CV de l’effet du PI sur la déstructuration du
biofilm préformé de 24 heures ................................................................................................. 93
5.6.3.3. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm .......................................... 95
5.6.3.3.1. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm de 6 heures par BFRT®
. 95
5.6.3.3.2. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm de 24 heures par la
méthode de coloration au cristal violet .................................................................................... 98
14
5.7. Effet de l’EGTA sur les biofilms .................................................................................. 101
5.7.1. Effet de l’EGTA sur l’immobilisation des billes magnétiques par les souches
bactériennes dans le BFRT®
................................................................................................... 101
5.7.2. Effet de l’EGTA sur l’adhérence bactérienne sur des tubes de cathéter ...................... 104
5.7.3. Effet de l’EGTA sur la formation du biofilm par la méthode de coloration au cristal
violet ....................................................................................................................................... 106
5.7.4. Effet de l’EGTA sur les biofilms préformés de 24 heures par la méthode de coloration
au cristal violet ....................................................................................................................... 108
5.7.5. Effet de l’EGTA sur la croissance bactérienne ............................................................ 111
5.7.6. Effets des cations sur l’adhésion et la formation des biofilms ..................................... 113
5.7.7. Toxicité de l’EGTA sur les cellules eucaryotes ........................................................... 115
5.8. Détection des gènes codant pour les protéines de surface de S. aureus .................... 116
6. DISCUSSION GENERALE ............................................................................................ 119
6.1. Caractérisation des souches cliniques et de référence de S. aureus. ......................... 119
6.2. Adhésion et formation du biofilm par BFRT® et méthode basée sur la coloration au
CV .......................................................................................................................................... 122
6.3. Activité de l’EGTA sur l’adhésion et la formation du biofilm .................................. 125
6.4. Les protéines de surface de S. aureus. ......................................................................... 128
7. CONCLUSION GENERALE ......................................................................................... 130
8. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ....................................................................... 132
ANNEXES ............................................................................................................................. 159
15
1. RESUME
Staphylococcus aureus est l’une des causes majeures des infections communautaires et
nosocomiales. Ce germe est responsable des infections aiguës et chroniques dont la plupart
sont dues à sa capacité à adhérer sur les implants médicaux et à former un biofilm. D’après le
Center for Disease Control and Prevention (CDC), 65% des infections bactériennes sont dues
à la présence des biofilms. En outre, les infections associées aux biofilms constituent un
problème majeur en clinique et sont la cause de l’augmentation de la mortalité et du coût de
traitement.
Chez S. aureus, la formation du biofilm se déroule en deux phases principales: la première
phase est l’attachement initial des cellules sur une surface, et la seconde est la multiplication
et la formation d’une communauté structurée, mature et multicouche des cellules
bactériennes. A l’intérieur du biofilm, les bactéries développent plusieurs types d’interactions
et accroissent leur résistance aux agents antimicrobiens et aux défenses immunitaires de
l’hôte, ce qui constitue un véritable problème de santé publique.
Les objectifs de ce travail étaient: (1) de caractériser des souches cliniques de S. aureus
sensibles et résistantes à la méticilline (SASM et SARM) par une analyse phénotypique et
génotypique; (2) d’étudier la répercussion des propriétés de membranes sur l’adhésion et la
formation du biofilm; (3) de rechercher un moyen pour la prévention de l’adhésion et de la
formation d’un biofilm sur une surface abiotique.
Deux souches de référence et 12 souches cliniques de S. aureus (4 SARM et 8 SASM)
collectées à Kinshasa ont été caractérisées par la résistance aux antibiotiques, par le typage
d’une région X du gène spa codant pour la protéine A de S. aureus et par la détermination des
propriétés de la surface cellulaire. L’adhésion à une surface et la formation du biofilm ont été
respectivement étudiées par la méthode de Biofilm Ring Test®
(BFRT®) et par celle de
coloration au cristal violet. Ces deux méthodes ont été utilisées pour l’évaluation de l’activité
de l’acide éthylèneglycol tétraacétique (EGTA) sur l’adhésion et la formation du biofilm.
L’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) d’un fragment du gène mecA a
confirmé l’appartenance des souches étudiées au phénotype SARM ou SASM. L’analyse par
PCR des répétitions présentes dans la séquence codante de la protéine A de S. aureus (spa
16
typing) a permis d’identifier 7 types spa pour toutes les souches SARM et SASM2 dont un
nouveau type spa t10715.
Les résultats du test MATS (Microbial Adhesion to Solvents) ont montré que les souches de
S. aureus sensibles et résistantes à la méticilline possédaient des propriétés membranaires
différentes susceptibles de modifier l’adhésion ou la formation d’un biofilm. Les souches
sensibles à la méticilline avaient une paroi plus hydrophobe que celle de souches résistantes
dont la paroi était acide, acceptrice d’électrons.
Les études sur l’interaction entre des souches cliniques de S. aureus et des surfaces abiotiques
ont montré que les souches SARM adhéraient moins vite à une surface et formaient moins de
biofilms que les souches SASM.
Les études de l’activité de l’EGTA, un chélateur des cations divalents, ont montré que ce
dernier inhibait l’adhésion de souches SARM à une surface abiotique comme un tube de
cathéter et empêchait la formation d’un biofilm par toutes les souches sensibles et résistantes
à la méticilline. Cette action inhibitrice sur la formation du biofilm était réversible en présence
d’un cation divalent (magnésium, calcium ou manganèse).
L’ensemble des données obtenues sur l’adhésion et la formation du biofilm par la méthode de
BFRT® et par celle de coloration au cristal violet ont montré que le BFRT
® était la méthode
de choix dans les études de l’adhésion initiale des souches de S. aureus sur une surface
abiotique. Le BFRT®
pourrait être utilisée dans le screening rapide de produits contre
l’adhésion bactérienne à la surface des implants médicaux à base de polystyrène ou de
silicone.
17
2. INTRODUCTION
2.1. STAPHYLOCOCCUS AUREUS
2.1.1. Caractères généraux de Staphylococcus aureus
2.1.1.1. Caractères morphologiques et culturaux
Staphylococcus aureus, espèce membre de la famille des Staphylococaceae, est un coque à
Gram positif, sphérique, de 0,5 à 1 µm de diamètre, immobile, non sporulé, parfois encapsulé,
pouvant se présenter isolé, en paires, ou le plus souvent en grappes. Cette bactérie est aéro-
anaérobie facultative, à catalase positive et à oxydase négative (Sperber et Tatini, 1975;
Foster, 1996). S. aureus se cultive plus facilement dans les milieux usuels et dans des milieux
sélectifs contenant des fortes concentrations en sels (NaCl 7,5%) dans des conditions de pH et
de température variables. La production d’une coagulase et d’un pigment caroténoïde jaune
doré (d’où le nom de staphylocoque doré), et la présence d’une protéine A dans la paroi
caractérisent S. aureus.
Figure 2.1: Colonies de S. aureus sur une gélose de Chapmann
Figure 2.2: Aspects caractéristiques en amas de coques à Gram positif de S. aureus
(1) (2)
2.1.1.2. Génome
Le génome de S. aureus est constitué d’un chromosome circulaire comprenant 2,7 à 2,9.106
paires de bases (pb) (Mlynarczyk et al., 1999; Holden et al., 2004; Baba et al., 2008), avec des
prophages, des plasmides, des transposons et d’autres éléments génétiques tels que les
cassettes chromosomiques. Le contenu en paires G-C est de 33%. Les gènes de virulence ou
de résistance aux antibiotiques sont rencontrés sur le chromosome et sur des éléments
extrachromosomiques (Kuroda et al., 2001).
18
2.1.1.3 Constituants de la paroi cellulaire
Le peptidoglycane constitue l’essentiel de la paroi de S. aureus. La structure de base est
formée de longues chaînes linéaires polysaccharidiques. La structure de ces chaînes contient
une séquence répétitive d’un disaccharide comprenant la N-acétylglusosamine (NAG) liée par
une liaison β 1-4 à l’acide N-acétylmuramique (NAM). Certains résidus de NAM fixent une
extension tétrapeptidique sur la fonction carboxylique. Ce tétrapeptide a une composition
variable mais on y retrouve, en général, deux résidus d’alanine, un résidu de lysine et un
résidu d’acide glutamique (AEKA). Ces peptides vont être utilisés pour relier entre elles les
chaînes de polysaccharides. En effet, une pentaglycine réalise des liens peptidiques avec des
peptides AEKA attachés à des chaînes polysaccharidiques différentes (Figure 2.3). Ces
pentapeptides forment un pontage entre les longues chaînes de polysaccharides et les
organisent en forme de réseau (Schleifer et Kandler, 1972).
Figure 2.3: Représentation schématique de la réticulation de deux chaînes glycaniques
dans le peptidoglycane de S. aureus.
D’après (Stapleton et Taylor, 2002)
La synthèse du peptidoglycane est sous la dépendance de plusieurs enzymes dont notamment:
la transglycosylase qui synthétise la chaîne glycanique à partir des sous-unités
monosaccharidiques et la transpeptidase qui achève la réaction de réticulation des chaînes
glycaniques préalablement synthétisées par formation des ponts peptidiques (Tipper et
Strominger, 1965). Les ponts pentaglycine sont préformés dans le cytoplasme par une famille
de protéines, les peptidyl transférases non ribosomales, qui attachent les résidus de glycine
19
aux résidus L-lysine et D-alanine de la chaîne tétrapeptidique (Ehlert et al., 1997).
L’importance des peptidoglycanes est attestée par le fait que leur synthèse est la cible des
pénicillines. Ces antibiotiques sont en effet des inhibiteurs de la transpeptidase (Blumberg et
Strominger, 1974).
Les autres constituants importants de la paroi sont (i) des acides teichoïques qui sont des
polymères du ribitol ou du glycérol phosphate; soit ils se fixent par liaison covalente au
peptidoglycane (acides téichoïques de la paroi), soit ils traversent la couche de
peptidoglycane et se lient aux lipides de la membrane plasmique (acides lipoteichoïques ou
acides teichoïques de la membrane) (Knox et Wicken, 1973; Xia et al., 2010), et (ii) des
protéines intrinsèques et des protéines périphériques ou de surface (Bien et al., 2011).
La transferrin-binding protein (Tpn ou protéine liant la transferrine) est une protéine de 42
kDa localisée dans la paroi cellulaire, décrite chez S. aureus et chez un grand nombre de
staphylocoques à coagulase négative. Elle appartient à la famille multifonctionnelle des
glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénases associées à la paroi cellulaire. Cette protéine
catalyse la phosphorylation oxydative du glycéraldéhyde-3-phosphate en phosphoglycérate-3
phosphate et permet au S. aureus de lier la transferrine humaine. Le gène codant pour la Tpn
ou pour la glycéraldéhyde-3- phosphate déshydrogénase (gap) a été décrit comme un outil
taxonomique utile pour les staphylocoques (Yugueros et al., 2000).
2.1.2. Pouvoir pathogène de S. aureus
2.1.2.1. Colonisation de l’hôte
L’adhérence bactérienne à la surface des cellules épithéliales des muqueuses représente la
première étape menant à la colonisation et, éventuellement, à l’invasion de l’hôte. L’adhésion
de S. aureus aux molécules de l’hôte (ou aux surfaces inertes de type cathéters) est médiée par
des adhésines qui sont aussi appelées MSCRAMMs (Microbial Surface Components
Recognizing Adhesive Matrix Molecules). Les adhésines de S. aureus les mieux caractérisées
sont les protéines de liaison à la fibronectine, FnBPA et FnBPB, la protéine de liaison au
collagène Cna, les protéines de liaison au fibrinogène (Clumping factor) ClfA et ClfB, et la
protéine A (SpA pour staphylococcal protein A) (Foster et Hööker, 1998; Corrigan et al.,
2009; Burke et al., 2010). Les MSCRAMMs ont une structure commune incluant une
séquence signal à leur extrémité N-terminale, un domaine contenant le site de liaison au
20
ligand, un domaine exposé contenant des séquences répétitives, et un domaine C-terminal
contenant le motif consensus LPXTG (Leu-Pro-X-Thr-Gly) responsable de la liaison
covalente au peptidoglycane de la paroi bactérienne. La figure 2.4 illustre les structures de
ClfA et de Cna. Le motif LPXTG est reconnu par une famille d’enzymes, les sortases, qui
vont lier de façon covalente l’adhésine au peptidoglycane de la paroi bactérienne (Marraffini
et al., 2006; Schneewind et Missiakas, 2012).
Figure 2.4: Structure de la protéine de liaison au fibrinogène (ClfA) et de la protéine de
liaison au collagène (Cna) de S. aureus
S: peptide signal, A: domaine de fixation du ligand, B: séquences répétitives, SD: répétition du dipeptide sérine-
aspartate ou région R, W: région pariétale, M: région membranaire, LPXTG: motif consensus (Foster et Höök,
1998; Heilmann, 2011).
La protéine A (42 kDa) de S. aureus contient à son extrémité N-terminale 5 domaines
conservés (E, D, A, B et C) de liaison aux immunoglobulines. La partie C-terminale de cette
protéine, aussi appelée région X, est dépourvue de toute capacité de liaison aux
immunoglobulines. Par contre, elle permet la fixation de la protéine A au peptidoglycane de la
paroi bactérienne (Löfdal et al., 1982; Shopsin et al., 1999). La région codant pour X est
divisée en deux sous-régions: une région polymorphe Xr contenant des courtes séquences
répétitives (1 à 22) de 24 paires de base et une région constante Xc n’ayant aucune séquence
répétitive (Uhlén et al.; 1984; Garofalo et al.; 2012) (Figure 2.5). La variation de séquence de
la région codant pour Xr est générée soit par une délétion, une duplication, soit par des points
de mutations et, est actuellement utilisée comme un outil épidémiologique pour le typage
moléculaire de S. aureus (Shopsin et al., 1999, Hallin et al., 2007).
ClfA
Cna
21
Figure 2.5: Diagramme du gène spa avec chaque boite illustrant les domaines de la
protéine codés par les différents segments du gène ainsi que la localisation des amorces
sens et antisens
S: peptide signal, [A-D]: sites de fixation des immunoglobulines, [E]: région homologue à A-D; [X]: extrémité
COOH-terminale, [Xr]: région contenant des courtes séquences répétitives, [Xc]: séquence d’attachement à la
paroi (Shopsin et al; 1999).
Mongodin et al. (2002) et Nashev et al. (2004) ont montré que les protéines de liaison à la
fibronectine (Figure 2.6) étaient impliquées dans l’adhésion de S. aureus à l’épithélium
respiratoire et à l’épithélium nasal chez l’homme. Deux gènes distincts, fnbA et fnbB, codent
pour ces deux protéines.
Figure 2.6: Structure des protéines de liaison à la fibronectine de S. aureus
Les deux protéines FnBPs présentent des régions hautement conservées, particulièrement dans la séquence de
liaison à la fibronectine. Les pourcentages d’homologie sont indiqués entre les régions délimitées par des lignes
verticales. Les parties N-terminales de FnBPA et FnBPB contiennent un peptide signal S, un domaine A de
fixation du fibrinogène et de l’élastine et subdivisé en trois sous-domaines N1, N2 et N3. Les domaines A
suivants contiennent des motifs de liaison à la fibronectine répétés en tandem. Ils contiennent un site unique de
fixation de la fibronectine. Les domaines A de FnBPA et FnBPB contiennent respectivement 37-511 résidus et
37-480 résidus. PRR: répétitions riches en proline, W: région pariétale, M: région membranaire, LPETG: motif
consensus (Burke et al., 2010).
22
D’autres protéines de surface de S. aureus ont été récemment identifiées et partagent les
propriétés de tous les MSCRAMMs. Il s’agit de la protéine de surface de S. aureus G (SasG)
impliquée dans l’adhérence de S. aureus à l’épithélium nasal (Roche et al., 2003) et de la
protéine de surface SasC impliquée dans l’adhésion intercellulaire (Schroeder et al., 2009)
2.1.2.2. Facteurs de virulence
La pathogénicité de S. aureus est essentiellement due à l’expression de plusieurs facteurs de
virulence (Figure 2.7). S. aureus sécrète des enzymes qui lui permettent de dégrader les tissus
humains et qui favorisent l’extension du foyer infectieux. Les principales enzymes
extracellulaires sont des protéases, l’auréolysine, une désoxyribonucléase, une lipase, une
phosphatase, une catalase, une hyaluronidase et une coagulase. S. aureus produit plusieurs
toxines cytolytiques ayant la capacité de détruire les cellules de la défense de l’hôte en
formant des pores au niveau des membranes cellulaires. Parmi elles, on peut citer les
hémolysines (α-δ), les peptides PSM (phenol-soluble modulins) ou «phenol-soluble peptides»,
la leucocidine de Panton Valentine (LPV), et la leucocidine LukE-LukD. En plus des toxines
cytolytiques citées ci-dessus, certaines souches de S. aureus produisent également des toxines
à activité épidermolytique (exfoliatines ou épidermolysines ETA, ETB et ETD), et des
protéines CHIPS (Chemotaxis Inhibitory Proteins of Staphylococci) dont l’action est
d’inhiber le chimiotactisme des neutrophiles et des monocytes. D’autres souches de S. aureus
produisent des toxines (superantigènes) responsables de syndromes spécifiques (entérotoxines
A-E et toxine du choc toxique staphylococcique 1 [TSST-1]) (Dinges et al., 2000; Bien et al.,
2011). La majorité des souches cliniques produisent une capsule polysaccharidique qui
confère à la bactérie la capacité de résister à la phagocytose (O’Riordan et Lee, 2004). La
protéine A quant à elle se fixe aux immunoglobulines et empêche l’opsonisation (Peterson et
al., 1977).
23
Figure 2.7: Facteurs de virulence de S. aureus
Les protéines de surface et protéines sécrétées en fonction de phases de croissance bactérienne. Phases de
croissance contrôlées par le système de quorum sensing agr (Gordon et Lowy, 2008).
La transcription de gènes de virulence est régulée par une molécule d’acide ribonucléique
(ARN) de 510 nucléotides, appelée ARNIII (Tegmark et al., 1998). L’ARNIII est un
composant du système global du quorum sensing (QS) agr (accessory gene regulator) qui
active la transcription de gènes codant pour les facteurs de virulence, et qui réprime la
transcription de gènes codant pour les protéines de surface (Heilmann et Götz, 2010). Le
système agr est constitué de deux gènes sous le contrôle de deux promoteurs P2 et P3 et dont
la transcription, en orientation opposée, génère les transcrits ARNII et ARNIII (Figure 2.8).
L’unité de transcription P2 est un opéron qui code 4 protéines qui participent au mécanisme
de QS agr. La protéine AgrC est le senseur d’un système de traduction de signal à deux
composants dont AgrA est le régulateur de réponse. La protéine transmembranaire AgrB clive
le produit du gène agrD au niveau d’une cystéine et libère un oligopeptide de 7-9 acides
aminés avec un cycle thiolactone à son extrémité C-terminale. Cet oligopeptide, appelé
peptide auto-inducteur (PAI), est sécrété dans l’environnement extracellulaire et son
accumulation agit comme un signal de densité cellulaire conduisant à l’activation de
l’ensemble du système agr. Ce phénomène de régulation est appelé «déclenchement par un
seuil» (quorum sensing). Le PAI se fixe sur AgrC le senseur ayant une activité histidine
kinase. L’interaction entre PAI et AgrC stimule l’activité kinase de ce dernier qui phosphoryle
le régulateur de réponse AgrA. Cette protéine va augmenter la transcription de l’opéron P3,
24
avec comme conséquence une augmentation de la concentration intracellulaire de l’ARNIII,
indispensable à l’expression des exoprotéines (Novick et Geisinger 2008). La variation de
séquence dans la région agr B-D-C a conduit à l’identification d’au moins quatre groupes
différents d’agr. Le PAI produit par une souche ayant une séquence agr d’un groupe inhibe la
synthèse de PAI par une autre souche ayant une séquence agr différente (Novick et Geisinger,
2008).
Figure 2.8: Système de quorum sensing agr
L’opéron P2 (via ARNII) code pour le mecanisme de signalisation. Le transcrit de l’opéron P3, ARNIII, agit
comme une molécule effectrice du locus agr. On y trouve aussi des régulateurs additionnels de la réponse QS et
des gènes de virulence (Yarwood et Schlievert, 2003).
Un autre exemple du régulateur transcriptionnel global le mieux étudié et capable d’influencer
l’expression des protéines sécrétées dans le milieu est le système sarA (Staphylococcal
accessory regulator A) (Cheung et al., 1992). Le système sarA agit en coopération avec le
système agr du fait de la présence de plusieurs sites de liaison dans la région intergénique
comprise entre les promoteurs P2 et P3 (Rechtin et al, 1999). Cette liaison permet de ce fait
l’activation de ces deux promoteurs.
D’autres régulateurs capables d’influencer l’expression des protéines sécrétées et de contrôler
l’expression de facteurs de virulence ont été étudiés. Il s’agit (i) du système SaeRS
(Staphylococcal accessory element) qui répond à plusieurs stimulis environnementaux
(Steinhuber et al., 2003, Rogasch et al., 2006), (ii) du système ArlSR (autolysis –related
locus) qui s’oppose à l’autoinduction du système de quorum sensing agr en reprimant la
production des hémolysines et des exoenzymes (Fournier et al., 2001), (iii) du système SrrAB
25
(Staphylococcal respiratory response) qui régule l’expression de gènes impliqués dans le
métabolisme énergétique (Yarwood et al., 2001), (iv) du système Rot (Repressor of toxins)
(McNamara et al., 2000), (v) du facteur sigma alternatif σB (Wu et al., 1996, Bischoff et al.,
2001) qui affectent l’expression de nombreux gènes de virulence et (vi) du système Mgr
(Multiple gene regulator) qui contrôle l’autolyse, la virulence et l’activation des pompes à
efflux chez S. aureus (Luong et al.,2003).
2.1.2.3. Portage et infections dues au Staphylococcus aureus
S. aureus est un agent commensal de la peau et des muqueuses de l’homme et des animaux à
sang chaud. Il présente le potentiel de pathogénicité le plus important de toutes les espèces du
genre Staphylococcus. Les fosses nasales antérieures (Kluytmans et Wertheim, 2005)
constituent, avec la peau (Aly et al., 1977), le site réservoir essentiel de S. aureus. Cette
bactérie est aussi rencontrée au niveau du pharynx (Mertz et al., 2007), du périnée (Ridley,
1959), du tractus gastro-intestinal (Acton et al., 2009) et urinaire. La prévalence du portage
nasal permanent est d’environ 20% et approximativement 30% chez les porteurs intermittents
(Gordon et Lowy, 2008). Elle diminue avec l’âge dans la population en général.
Les mécanismes qui conduisent à la colonisation nasale par S. aureus sont multifactoriels. On
trouve, entre autres, les facteurs liés à l’hôte, avec un taux de portage élevé dans la population
de race blanche, des facteurs liés à la bactérie (les protéines de surface SasG et ClfB), et des
facteurs environnementaux (Wertheim et al., 2008; Sivaraman et al., 2009).
S. aureus est responsable de nombreux types d’infections chez l’homme et compte parmi les
agents pathogènes les plus souvent isolés des infections nosocomiales et communautaires
(Vincenot et al., 2008; Kurlenda et Grinholc, 2012; Otto, 2012). Les infections suppuratives
superficielles cutanéo-muqueuses tels les furoncles, les folliculites, les impétigos, les sinusites
et les otites sont les plus couramment rencontrées. Ces infections peuvent se compliquer par
une diffusion hématogène de la bactérie ou par une extension loco-régionale de l’infection.
S. aureus est aussi responsable de méningites, des infections respiratoires et urinaires. Des
infections non suppuratives d’origine toxique appelées toxémies staphylococciques sont, elles,
dues à la diffusion de toxines à partir d’un foyer infectieux ou à l’ingestion d’une toxine
préformée dans un aliment contaminé. Ces toxémies regroupent les syndromes cutanés
staphylococciques par les exfoliatines, le choc toxique staphylococcique (TSS) par la TSST-1
26
et les intoxications alimentaires par les entérotoxines (Foster, 1996; Harris et al., 2002). En
plus des infections aiguës, S. aureus peut provoquer des infections chroniques. La plupart
d’entres elles sont dues à la capacité de ce pathogène à adhérer sur les implants médicaux
temporaires (ex: cathéters) ou permanents (ex: prothèses orthopédiques, valves cardiaques) et
à former un biofilm (von Eiff et al., 2005; Harris et Richards, 2006; Bernard, 2006).
2.1.3. Staphylococcus aureus et résistance aux antibiotiques
2.1.3.1. Les β-lactamines
Depuis la découverte par Alexander Fleming en 1928 de l’effet inhibiteur de la moisissure
Penicillium sur une colonie de S. aureus (Kong et al., 2010), les β-lactamines demeurent
jusqu’à ce jour les antibiotiques les plus utilisés en médecine humaine pour combattre les
infections bactériennes. Ces antibiotiques possèdent tous un noyau β-lactame sur lequel sont
greffés différentes chaînes latérales (Demain et Elander, 1999). Ils sont divisés en 4 classes,
avec différents spectres d’activité: pénicillines (pénicilline G, oxacilline, méticilline,
cloxacilline,…), céphalosporines (céfalexine, céfuroxime, ceftriaxone, céfépime,…),
carbapénèmes (imipénème, méropénème et ertapénème) et monobactames (aztréonam).
2.1.3.1.1. Mécanismes d’action et de résistance
La cible des β-lactamines est un ensemble d’enzymes de la membrane cytoplasmique
nécessaires à la formation du peptidoglycane. Ces molécules se fixent de façon covalente aux
transpeptidases, aussi appelées protéines liant la pénicilline (PBP pour Penicillin Binding
Protein). Le substrat normal de ces PBP est l’acétyl-D-alanyl-D-alanine (Tipper et
Strominger, 1965). La pénicilline et les autres β-lactamines agissent comme analogues des
substrats empêchant la synthèse de la paroi cellulaire. Ainsi, la fixation d’une β-lactamine sur
les PBP va altérer la structure de la paroi cellulaire en la rendant notamment moins stable,
plus fragile et incapable de résister à la pression osmotique interne très élevée. Ceci
provoquera la lyse secondaire de la bactérie (Blumberg et Strominger, 1974).
Deux principaux mécanismes sont impliqués dans la résistance acquise de S. aureus aux β-
lactamines. Il s’agit de la production des β-lactamases, et de la modification de la cible des
antibiotiques (Lowy, 2003).
27
2.1.3.1.2. Résistance à la pénicilline
La β-lactamase est une enzyme inductible codée par le gène blaZ porté par un plasmide. Cette
enzyme hydrolyse le noyau β-lactame de la pénicilline G et ses analogues de structure.
L’expression du blaZ est régulée par deux gènes, blaR1-blaI situés en amont et transcrits en
direction opposée à blaZ (Hackbarth et Chambers, 1993; Gregory et al., 1997).
2.1.3.1.3. Résistance à la méticilline
2.1.3.1.3.1. Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM)
Entre 1940 et 1950, la pénicilline était l’antibiotique de choix pour traiter les infections à S.
aureus. Cependant la sensibilité à la pénicilline a été de courte durée suite à l’apparition de
souches résistantes productrices des β-lactamases. Des nouvelles molécules furent alors
commercialisées et deux ans après l’introduction de la méticilline en 1959 comme
antistaphylococcique puissant, les premières souches résistantes à la méticilline ont été
décrites. Ces souches résistantes à la méticilline ont actuellement une distribution mondiale
(Appelbaum, 2006).
Les SARM sont responsables d’infections nosocomiales. La prévalence des SARM varie d’un
continent à un autre. Elle est supérieure à 30% aux Etats-Unis d’Amérique, en Australie, et
dans les pays asiatiques. En Europe, la prévalence des SARM varie aussi énormément selon
les pays, avec des proportions très faibles dans les pays nordiques (< 1% dans les pays
scandinaves) et supérieure à 40% dans les pays du Sud de l’Europe (Appelbaum, 2006).
En Afrique, l’épidémiologie des SARM n’est pas très documentée. Les données semblent plus
hétérogènes selon les pays: si le nombre des souches de SARM est plus élevé en Afrique
noire (21 à 30%), il est plus faible au Maghreb avec des pourcentages inférieurs à 10% (4,8%
en Algérie et 8,1% en Tunisie). Les études menées dans 8 pays d’Afrique par Kesah et al.
(2003) ont montré une forte prévalence des SARM au Nigeria (29,6%), au Kenya (27,7%), et
au Cameroun (21,3%). Une étude plus récente menée en République Démocratique du Congo
sur le portage nasal des staphylocoques conclut à une prévalence des SARM de 63,1%,
66,7%, et 23,3% respectivement chez les patients hospitalisés, le personnel soignant et chez
les patients en ambulatoire (Vlieghe et al., 2009). Les SARM sont aussi la cause des
infections communautaires tant humaines qu’animales. Elles sont provoquées par des souches
hospitalières qui ont disséminé en-dehors de l’hôpital. Le plus souvent, les SARM
28
communataires sont plus impliquées dans les infections cutanées et des tissus mous dans
lesquelles la LPV joue un rôle déterminant (Eady et Cole, 2003) plutôt que dans les infections
pulmonaires (Herold et al., 1998). Comme décrit dans d’autres parties du monde, S. aureus est
aussi responsable d’infections communautaires en Afrique (Brerec et al., 2011, Kacou-
N’douba et al., 2011). Le profil génétique des souches africaines semble différent de celui
rencontré dans les autres parties du monde (Shrestha et al., 2005). Les voyageurs et les
migrants sont maintenant considérés comme des vecteurs majeurs de ces infections parmi les
populations.
2.1.3.1.3.2. Mécanismes de résistance de S. aureus à la méticilline
S. aureus produit 4 types de PBPs impliquées dans la transpeptidation: PBP1, PBP2, PBP3, et
PBP4. La résistance à la méticilline par modification de la cible est due à la production par S.
aureus d’une 5ème
PBP appelée PBP2a ou PBP2’ présentant peu d’affinité pour la méticilline
et toutes les autres β-lactamines par rapport aux PBPs normales (Utsui et Yokota, 1985). La
PBP2a est codée par le gène mecA (Matsuhashi et al., 1986). Le «Staphylococcal cassette
chromosome mec» (SCCmec) est l’élément génétique véhiculant le gène mecA qui code pour
la résistance à la méticilline (Katayama et al., 2000). Chez S. aureus cinq types majeurs de
SCCmec (types I à V) ont été identifiés (Hanssen et Ericson- Sollid, 2006); ils diffèrent par
leur taille (20,9 – 66,9 kb) et leur composition génétique. Pour ses mouvements, SCCmec
contient une paire de gènes codant pour les recombinases A et B appelées «cassette
chromosomal recombinase genes A et B» (ccrA et ccrB). SCCmec types I (34,4 kb), IV (20,9-
24,3 kb) et V (28 kb) codent pour la résistance exclusive aux β-lactamines. SCCmec types II
(53,0 kb) et III (66,9 kb) contiennent des sites privilégiés où les plasmides et transposons
s’intègrent entraînant ainsi la résistance aux antibiotiques non β-lactamines (fluoroquinolones,
macrolides, kanamycine et tobramycine) et aux métaux lourds. SCCmec de types I-III
caractérisent les souches SARM hospitalières isolées actuellement et disséminées dans le
monde. Les types IV et V ont été décrits récemment dans les souches émergentes des SARM
dites communautaires (Deresinski, 2005).
2.1.3.1.3.3. Facteurs influençant l’expression de la méticillino-résistance
Plusieurs autres gènes sont impliqués dans l’expression de la résistance à la méticilline. Il
s’agit des gènes auxiliaires fem (pour «factors essential for methicillin resistance») nécessaires
dans l’expression de la résistance de haut niveau chez les souches présentant une résistance
29
hétérogène à la méticilline (Berger-Bächi, 1983 et 1995). Leur existence a été initialement
suspectée devant l’absence de relation d’une souche à l’autre entre le niveau de résistance et
le niveau d’expression de PBP2a. Ces autres gènes de résistance sont trouvés chez toutes les
souches de S. aureus, indépendamment de la présence du gène mecA. Ils ne sont pas
responsables à eux seuls de la résistance à la méticilline, mais peuvent augmenter le niveau de
résistance chez une souche SARM. Les protéines FemA, FemB et FemX sont impliquées dans
la synthèse du pont pentaglycine qui lie les chaînes glycanes. FemX catalyse l’incorporation
de la première glycine, FemA celle des glycines 2 et 3, et FemB ajoute les glycines 4 et 5
(Figure 2.9). FemA et FemB ne sont pas interchangeables. Par conséquent, l’inactivation des
gènes codant pour chacune de ces protéines conduit à l’obtention d’une paroi cellulaire
déstructurée contenant des ponts mono- ou triglycine respectivement (Ehlert et al., 1997).
L’inactivation de femA ou femB conduit à une large réduction de la résistance à la méticilline
et à une augmentation de la sensibilité à plusieurs antibiotiques (Ling et Berger-Bächi, 1998).
Mais la compensation de l’inactivation par mutations peut restaurer la viabilité cellulaire et la
résistance à la méticilline. Cependant la croissance est sévèrement affectée (Hübscher et al.,
2007).
Figure 2.9: Synthèse de l’interpeptide pentaglycine
D’après (Berger-Bächi et Tschierske, 1998)
2.1.3.2. Les glycopeptides
La vancomycine et la téicoplamine sont des antibiotiques utilisés dans le traitement des
infections à coques à Gram positif, essentiellement les staphylocoques, les streptocoques et
les entérocoques, en cas de multirésistance aux antibiotiques et d’intolérance aux β-
lactamines. Ces antibiotiques constituent le traitement de choix dans les infections à SARM.
30
Les glycopeptides présentent de nombreuses limitations: une bactéricidie lente, une
fluctuation de CMI, une faible pénétration intracellulaire, une toxicité potentielle, et enfin le
développement de la résistance souvent associée à un échec thérapeutique (Levine, 2006).
2.1.3.2.1. Mécanisme d’action
Les glycopeptides inhibent la synthèse du composant essentiel de la paroi cellulaire, le
peptidoglycane. L’inhibition est due à l’affinité de ces antibiotiques pour l’extrémité (D-
alanyl-D-alanine) des précurseurs du peptidoglycane. Ceux-ci, après avoir été synthétisés
dans le cytoplasme bactérien, sont transportés à travers la membrane cytoplasmique pour
finalement être branchés par des enzymes (transglycosylases et transpeptidases) au
peptidoglycane en cours d’élongation. La fixation du glycopeptide sur l’extrémité du
précurseur empêche, par encombrement stérique, son branchement au peptidoglycane (Daurel
et Leclercq, 2010) (Figure 2. 10).
2.1.3.2.2. Résistance de S. aureus aux glycopeptides
Suivant les recommandations du Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI,
anciennement NCCLS), une souche de S. aureus est dite sensible à la vancomycine si sa
concentration minimale inhibitrice (CMI) est ≤ 4 mg/L. Une souche de S. aureus de
sensibilité intermédiaire à la vancomycine (GISA ou VISA pour Glycopeptide ou Vancomycin
Intermediate-sensitive Staphylococcus aureus) se définit par une CMI comprise entre 8 et 16
mg/L. Les souches résistantes à la vancomycine (VRSA pour Vancomycin Resistant
Staphylococcus aureus) ont une CMI > 32 mg/L (Tiwari, 2009; Ng et al., 2011). Les
mécanismes d’action et de résistance sont repris dans la Figure 2.10.
Figure 2.10: Mécanismes d’action de la vancomycine et de résistance de S. aureus à la
vancomycine
D’après (Lowy, 2003)
31
2.1.3.2.2.1. SARM de sensibilité intermédiaire à la vancomycine (VISA)
Depuis la découverte de SARM de sensibilité diminuée à la vancomycine au Japon en 1996,
plusieurs rapports similaires font état de l’isolement de ces souches à travers plusieurs pays du
monde, y compris en Afrique (Gemmell, 2004; Mastouri et al., 2006).
La réduction de la sensibilité à la vancomycine est due aux changements affectant la
biosynthèse du peptidoglycane et à l’activité autolytique (Sieradzki et Tomasz, 1997; Reipert
et al., 2003). Les souches VISA synthétisent des quantités additionnelles du peptidoglycane
avec un accroissement du nombre de résidus D-ala-D-ala qui fixent la vancomycine. Ainsi, le
mécanisme de résistance à la vancomycine est lié à un épaississement de la paroi bactérienne
qui piège la vancomycine dans les couches superficielles du peptidoglycane l’empêchant ainsi
d’atteindre la membrane cytoplasmique où le peptidoglycane est synthétisé (Hiramatsu,
2001).
2.1.3.2.2.2. SARM résistant à la vancomycine (VRSA)
La résistance à la vancomycine fut rapportée pour la première fois chez les entérocoques en
1988 et les premières souches de SARM portant le gène vanA ont été isolées au Michigan en
2002. Depuis cette date, des souches VRSA ont été isolées dans d’autres pays du monde (Ng
et al., 2011). La résistance de VRSA est acquise par transposition du gène vanA de souches
d’Enterococcus faecalis résistantes à la vancomycine chez les patients coinfectés (Showsh et
al., 2001). L’opéron van code pour une déhydrogénase VanH, qui réduit le pyruvate en D-
lactate, et une VanA-ligase qui catalyse la formation d’une liaison ester entre la D-alanine et
le D-lactate. Le résultat de l’action de ces deux enzymes est la synthèse d’un nouveau
précurseur de synthèse du peptidoglycane se terminant par le depsipeptide D-alanyl-D-lactate
au lieu du dipeptide D-alanyl-D-alanine. Ainsi, il se forme une liaison ester terminale au lieu
d’une liaison amide nécessaire dans la formation des ponts hydrogènes avec la vancomycine,
ce qui entraîne une réduction de l’affinité de la vancomycine pour la chaine pentapeptide. La
synthèse de D-alanyl-D-lactate survient avec l’exposition à de faibles concentrations de
vancomycine (Ng et al, 2011).
32
2.1.3.3. La mupirocine
La mupirocine, anciennement connue sous le nom d’acide pseudomonique A, est un agent
antibactérien topique produit par Pseudomonas fluorescens. Elle est constituée d’une
molécule d’acide monique relié par une liaison ester à une courte chaine d’acide gras (l’acide
9-hydroxynonanoïque) (Gurney et Thomas, 2011). Cet antibiotique est utilisé pour
l’éradication du portage nasal de S. aureus, et dans la prévention de la transmission de SARM
dans les unités des soins intensifs. La mupirocine par voie intranasale est utilisée en
préopératoire pour prévenir les infections du site opératoire, contrôler la transmission des
SARM, et pour décoloniser le personnel et les patients colonisés par les SARM (Patel et al.,
2009). La mupirocine exerce son activité antimicrobienne par l’inhibition de la synthèse de
protéines en se fixant irréversiblement à l’isoleucyl-tRNA synthétase codée par le gène
chromosomique ileS.
On distingue deux phénotypes de résistance (Janssen et al., 1993; Gilbart et al., 1997; Patel et
al., 2009):
une résistance de bas niveau (CMI comprise entre 8 et 256 µg/mL) due à une mutation
chromosomique au niveau du gène ileS;
une résistance de haut niveau (CMI ≥ 512 µg/mL) causée par la présence d’un gène
plasmidique, mupR (ou ileS-2), codant pour une isoleucyl-tRNA synthétase additionnelle non
inhibée par la mupirocine.
2.1.3.4. Les autres antibiotiques utilisés contre S. aureus
Les mécanismes de résistance de S. aureus à d’autres antibiotiques sont résumés dans le
Tableau 2.1.
33
Tableau 2.1: Résistance de S. aureus à quelques antibiotiques
Antibiotiques Gènes de résistance Mécanismes de résistance Références
Fluoroquinolones
grlA Modification de la cible (mutations des gènes codant pour la
topoisomérase IV ou pour la gyrase)
Yoshida et al., 1990;
Hopper, 2000; Ruiz, 2003;
Jacoby, 2005 gyrA ou gyrB
norA Pompe à efflux
Rifampicine ropB Modification de la cible (réduction de l'affinité pour l'ARN
polymérase)
Wichelhaus et al., 2001
Triméthoprim-
sulfaméthoxazole
Sulfonamide: sulA Hyperproduction de l'acide para-aminobenzoique par l'enzyme DHPS Huovinen, 200; Lowy, 2003
TPM: dfrB Réduction de l'affinité pour la DHFR
Oxazolidinones rrn Modification de la cible (méthylation d’une adénosine à la position
2503 dans l’ARNr 23S conduit à la résistance au linézolide)
Lowy, 2003
Quinupristine-
dalfopristine
Q: ermA, ermB, ermC Réduction de la liaison à la sous-unité ribosomale 23S Lowy, 2003
D: vat, vatB Modification enzymatique de la dalfopristine
Macrolides ermA, ermB Modification de la cible (méthylation de l’ARNr 23S de la sous-unité
ribosomale 50S)
Quincampoix et Mainardi,
2001;
MacCallum et al., 2010
msrA, mrsB Pompe à efflux
Lincosamides ermA, ermB Modification de la cible (méthylation de l’ARNr 23S de la sous unité
ribosomale 50S)
Streptogramines ermA, ermB Modification de la cible (méthylation de l’ARNr 23S de la sous-unité
ribosomale 50S)
Acide fusidique fusA Modification de la cible (altération au niveau du facteur EF-G) O'Neil et al., 2007;
Chen et al., 2010
Tétracyclines tetK, tetL Pompe à efflux Chopora et Roberts, 2001
tetM, tetO Protection ribosomale
Chloramphénicol cat Acétylation de l'antibiotique avec production d’un dérivé diacétylé
inactif
Shaw et Brodwsky, 1968
Aminoglycosides aac, aph,... Inactivation de l’antibiotique (acétylation et/ou phosphorylation par les
enzymes modifiant les aminoglycosides)
Quincampoix et Mainardi,
2001
34
2.2. LE BIOFILM BACTERIEN
2.2.1. Introduction
L’idée que les bactéries croissent préférentiellement sur des surfaces a été avancée à
intervalles réguliers au cours des 150 dernières années (Costerton, 1999). Parallèlement,
certains microbiologistes ont constaté au microscope optique que les bactéries planctoniques
poussaient différemment après avoir adhéré à une surface et initié la formation d’un biofilm.
Les termes de bactéries sessiles et planctoniques décrivent des micro-organismes
respectivement adhérents à une surface et libres dans une suspension. La surface d’adhésion
des organismes sessiles peut être abiotique (les matériaux inertes) ou biotique (les tissus ou
les cellules vivantes) (Dune, 2002). Toute surface naturelle ou artificielle peut être le siège
d’une colonisation bactérienne avec formation d’un biofilm. C’est le cas des coques de
bateaux, des canalisations d’eau, des rochers dans les rivières, des lentilles de contact, et de
toutes les variétés d’implants biomédicaux. Toute surface du corps humain exposée à
l’environnement extérieur (peau, dents, épithéliums buccal, respiratoire, gastro-intestinal et
vésical, vagin) peut aussi faire l’objet d’une colonisation bactérienne avec formation d’un
biofilm (Cooper et Okhiria, 2006). Tenant compte de ces deux aspects (surface biotique ou
abiotique), Costerton et al. (1999) ont défini le biofilm comme une communauté structurée de
cellules bactériennes incluses dans une matrice polymérique autoproduite et adhérentes à une
surface inerte ou vivante. Dans ce contexte précis, la matrice du biofilm a comme seule
origine les cellules bactériennes.
Cette définition paraît cependant incomplète car la matrice du biofilm peut être aussi
constituée de matériaux non cellulaires tels que les cristaux minéraux, les particules de
corrosion ou d’argile. Le biofilm formé dans le système de canalisation d’eau est hautement
complexe du fait de la présence de bactéries filamenteuses et de certains éléments cités ci-
dessus (Donlan, 2002). Tout dépend de l’environnement dans lequel le biofilm s’est formé.
La définition précédente limite la formation du biofilm à l’interface solide/liquide alors qu’un
biofilm peut aussi se former à l’interface air/liquide ou liquide /liquide (Spencer et al., 2011).
Les agrégats de cellules bactériennes flottant dans le liquide ont les mêmes caractéristiques
que les agrégats formés à l’interface solide/liquide (Hall-Stoodley et al., 2012). Sur le plan
médical, la matrice du biofilm peut héberger des composants «extramicrobiens» provenant de
l’hôte. Les biofilms dentaires peuvent par exemple, utiliser les protéines de la salive à la
35
surface de la pellicule pour s’attacher aux dents. D’autres bactéries peuvent se lier à la
fibronectine à la surface d’un implant médical et, dans une endocardite infectieuse, les
populations bactériennes peuvent s’imbriquer dans une masse de plaquettes agrégées, de
fibrine et d’autres protéines de l’hôte. Restreindre la définition du biofilm à la seule origine
bactérienne pousse à faire abstraction des infections dans lesquelles les bactéries interagissent
avec les molécules et les récepteurs de l’hôte pour s’attacher, se multiplier et s’agréger. Tous
les facteurs cités ci-dessus permettent de donner une définition du biofilm plus complète et
pertinente cliniquement. Ainsi, le biofilm est défini comme un ensemble des cellules
microbiennes agrégées, entourées d’une matrice polymérique autoproduite et pouvant
contenir des composants de l’hôte (Hall-Stoodley et al., 2012).
2.2.2. Structure et organisation
Le biofilm est constitué essentiellement des microorganismes et de la matrice qu’ils
synthétisent. Les micro-organismes représentent 2 à 15% du matériel du biofilm selon
l’espèce impliquée alors que la matrice extracellulaire (EPS, extracellular polymeric
substances), représente 50 à 90% de la masse organique carbonée du biofilm. Mais l’eau
demeure le principal composant du biofilm (Costerton, 1999; Sutherland, 2001; Dolan, 2002).
Les propriétés physico-chimiques de l’EPS sont variables d’un biofilm à un autre, mais un
biofilm est initialement constitué de polysaccharides. La composition et la structure de
polysaccharides déterminent la conformation primaire du biofilm. La quantité des EPS
produits varie en fonction du micro-organisme, et elle augmente avec l’âge du biofilm. La
matrice du biofilm peut aussi être composée d’ions métalliques, de cations divalents, de
macromolécules (protéines, ADN, lipides, phospholipides) et de composants de l’hôte
(Sutherland, 2001; Donlan, 2002; Hall-Stoodley et al., 2012).
La matrice d’exopolysaccharides exerce différents rôles. Elle assure la protection et la
cohésion de chaque microcolonie bactérienne, absorbe l’eau et piège les petites particules
circulantes. L’EPS intervient aussi sur la relation des microorganismes entre eux et avec les
surfaces. Son important degré d’hydratation, due à sa capacité à fixer un grand nombre de
molécules d’eau par des liaisons hydrogène, permet de lutter contre la dessiccation de certains
biofilms dans le milieu naturel. Cette matrice contribue aussi aux propriétés
d’antibiorésistance des biofilms en se liant directement aux agents antimicrobiens et en les
36
empêchant de pénétrer au sein du biofilm (Wingender et al., 1999). Elle est aussi impliquée
dans le maintien d’un microenvironnement unique pour les bactéries (Costerton et al., 1994).
Figure 2.11: Biofilm de Staphylococcus spp à la surface d’un implant médical visualisé
par microscopie confocale
Photographie de J. Carr, Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA
De nombreux travaux de laboratoire ont étudié comment les bactéries coordonnent leur
activité et construisent les structures dans les biofilms matures. L’arrivée de nouvelles
techniques comme la CLSM (confocal laser scanning microscopy) et la SEM (Scanning
electron microscopy) ont permis de comprendre et de visualiser la structure complexe du
biofilm (Donlan et Costerton, 2002). Sur la photographie ci-dessus, on observe des structures
sphériques, ressemblant à des champignons et unis par des filaments (Figure 2. 11). Les
biofilms sont traversés par une multitude de pores et de canaux aqueux permettant d’une part
de maintenir une pression en oxygène et des concentrations de nutriments significatives dans
les régions profondes du biofilm, et d’autre part d’évacuer les déchets. Le matériel soluble
peut diffuser à travers la matrice d’exopolysaccharides et être utilisé par les bactéries.
2.2.3. Physiologie du biofilm
Les études menées sur le transport par diffusion des composants gazeux et liquides à travers la
matrice du biofilm ont montré que les cellules situées dans le biofilm reçoivent moins
d’oxygène et de nutriments que les cellules en suspension. On peut mettre en évidence un
gradient de nutriments et d’oxygène depuis le sommet du biofilm jusqu’à sa base où l’on a un
microenvironnement anaérobie. Les cellules de la périphérie d’une microcolonie sont mieux
desservies par les réseaux de canaux que celles situées au centre. L’état métabolique d’une
37
bactérie à l’intérieur d’un biofilm dépend de sa localisation au sein de la structure. Les
cellules situées dans les couches les plus profondes ont une activité métabolique réduite (Le
Magrex et al., 1994; McLandsborough et al., 2006). Les cellules bactériennes qui s’établissent
sur une surface et s’engagent dans la formation du biofilm adoptent ainsi un phénotype
profondément différent, l’expression de nombreux gènes change, ce qui conduit à des
modifications métaboliques (Becker et al., 2001; Beenken et al., 2004).
Les bactéries présentes au sein du biofilm sont actuellement considérées comme pouvant être
à l’origine d’infections chroniques. En effet, elles peuvent mieux résister aux défenses
naturelles (immunité cellulaire et humorale) (Hall-Stoodley et Stoodley, 2009). Les bactéries
d’un biofilm peuvent habituellement survivre à l’utilisation d’antiseptiques et/ou
d’antibiotiques à des concentrations 1000 à 1500 fois supérieures à celles qui tuent les
bactéries planctoniques des mêmes espèces bactériennes (Tenke et al., 2012). Ce mode de vie
offre un grand intérêt pour la bactérie puisqu’il lui confère également une résistance aux UV,
aux forces de cisaillement et aux variations de pH (Costerton et al, 1999).
2.2.4. Biofilms staphylococciques
2.2.4.1. Infections liées à la présence des biofilms de S. aureus
Les staphylocoques sont responsables de la grande majorité des infections causées par les
biofilms. Ceci est dû au fait que ces germes sont présents en grand nombre dans la flore
commensale de la peau et des muqueuses de l’homme et de l’animal (Otto, 2008). Les
biofilms à S. aureus sont à l’origine d’infections chroniques et nosocomiales, le plus souvent
en rapport avec l’utilisation des implants médicaux. Ces infections sont plus difficiles à traiter
et nécessitent un remplacement plus fréquent des implants médicaux (von Eiff et al., 2005).
Les principales infections liées à la présence de biofilm de S. aureus sont les suivantes
(Archer et al., 2011):
ostéomyélites,
endocardites,
infections associées aux implants médicaux,
infections des plaies chroniques (notamment chez les diabétiques),
38
rhinosinusites chroniques,
infections oculaires.
Les infections du tractus urinaire sont également dues au biofilm de S. aureus car le risque de
développer une infection urinaire augmente avec, par exemple, l’implantation d’un cathéter
urinaire (Ando et al., 2004; Tenke et al., 2012).
2.2.4.2. Base moléculaire de la formation du biofilm de S. aureus
La formation d’un biofilm de S. aureus est un processus qui se déroule en deux phases. La
première phase consiste en l’attachement initial des cellules sur une surface, et la seconde à la
multiplication et à la formation d’une communauté structurée, mature et multicouche des
cellules bactériennes. Ces deux phases sont physiologiquement différentes l’une de l’autre et
requièrent chacune des facteurs spécifiques. Le détachement de cellules du biofilm mature
permet la dissémination des bactéries et la colonisation de nouveaux sites d’infection chez
l’homme (Otto, 2008) (Figure 2.12).
Figure 2.12: Phases de développement d’un biofilm staphylococcique
Attachement initial, maturation et détachement de cellules (Otto, 2012).
39
2.2.4.2.1. Adhésion
2.2.4.2.1.1. Adhésion aux surfaces abiotiques
L’adhérence des microorganismes aux biomatériaux dépend de la nature de ces derniers et des
caractéristiques de la surface cellulaire. Les interactions initiales surviennent par
l’intermédiaire de forces physico-chimiques non spécifiques telles que les interactions
électrostatiques, les forces de van der Walls, les interactions hydrophobes et les interactions
acide-base (interactions de Lewis) (Speranza et al., 2004; Garret et al., 2008). La colonisation
des surfaces abiotiques par S. aureus dépend de la charge de ses acides teichoïques (Gross et
al, 2001). L’attachement initial sur une surface abiotique est aussi attribué aux protéines de
surface de S. aureus. C’est le cas de Bap (biofilm-associated protein) (Cucarella et al, 2001) et
de la protéine A (Henry-Stanley et al, 2011).
2.2.4.2.1.2. Attachement aux surfaces biotiques
Dans le corps humain, la formation du biofilm est initiée par l’attachement irreversible des
adhésines des cellules bactériennes aux protéines de la matrice extracellulaire. Chez S. aureus,
l’adhérence est médiée par les adhésines protéiques de surface de la famille de MSCRAMMs
qui ont la capacité de se fixer aux différentes protéines du plasma ou de la matrice
extracellulaire telles que le fibrinogène ou la fibronectine (Foster et Höök, 1998). Après leur
implantation, les biomatériaux (cathéters, prothèses orthopédiques, sondes urinaires, valves
cardiaques…) sont aussitôt couverts par les protéines de la matrice extracellulaire ou du
plasma. Les interactions spécifiques entre les protéines de l’hôte et les MSCRAMMs sont
alors très importantes pour l’établissement d’une colonisation bactérienne (Otto, 2008). Les
staphylocoques sont ainsi connus pour leur extraordinaire capacité d’adhésion à la surface des
implants médicaux.
2.2.4.2.2. Multiplication des bactéries et maturation du biofilm
Après l’attachement à la surface, les bactéries vont se multiplier et s’accumuler. Cette phase
est caractérisée par (i) l’agrégation intercellulaire pouvant s’accomplir par une variété de
molécules telles que les protéines d’adhésion ou le plus souvent par les exopolymères
polysaccharidiques, et (ii) la structuration conduisant à l’obtention d’une communauté mature,
multicouche sous forme de champignon, et contenant des canaux qui permettent le passage
des nutriments pour les bactéries présentes à l’intérieur du biofilm (Otto, 2008).
40
2.2.4.2.2.1. Adhésine polysaccharidique intercellulaire (PIA)
Chez les staphylocoques, la principale molécule responsable de l’adhésion intercellulaire est
la PIA (polysaccharide intercellular adhesin), aussi appelée poly-N-acétylglucosamine
(PGNA). C’est un polymère de résidus de N-acétylglucosamine partiellement déacétylés et
réunis pas une liaison β-1-6 (Figure 2.13). Ce polymère forme avec les autres polymères tels
que les acides teichoïques et les protéines, le slime, la matrice extracellulaire des
staphylocoques formant le biofilm. La déacétylation partielle de 15-20% des résidus N-
acétylglucosamine est d’une importance biologique majeure (Götz, 2000). Elle introduit une
charge positive dans le polysaccharide en libérant des fonctions amines libres chargées au pH
neutre ou acide, tel celui trouvé sur la peau de l’homme (Vuong et al., 2004). Comme la
surface bactérienne est chargée négativement, la PIA joue le rôle d’une «colle» qui attache les
bactéries entre elles par des interactions électrostatiques. Les acides teichoïques représentent
alors les molécules chargées négativement qui interagissent avec la PIA à la surface cellulaire.
Figure 2.13: Structure de l’adhésine polysaccharidique intercellulaire (PIA)
Un homoglycane linéaire composé de liaisons des résidus β-1,6- N-acétylglucosamine dont environ 20% sont
déacétylés et positivement chargés (Adapté de Mac et al., 1996).
2.2.4.2.2.2. Biosynthèse du PIA
Identifié pour la première fois chez Staphylococcus epidermidis, l’opéron ica est aussi présent
chez S. aureus et chez d’autres espèces de staphylocoques (Heilmann et al., 1996; Cramton et
al, 1999). La biosynthèse du PIA est effectuée par les produits de gènes codés par l’opéron
icaADBC qui comprend une N-acétylglucosamine transférase (icaA et icaD), une PIA
déacétylase (icaB) et un exportateur potentiel du PIA (icaC) (Vuong et al., 2004). Elle
s’effectue en trois étapes (Figure 2.14):
(i) IcaA ajoute à la chaîne de PIA en croissance, les résidus N-acétylglucosamine provenant
d’UDP-GlcNac. La transférase IcaA nécessite la présence d’IcaD pour une pleine activité.
41
L’activité N-acétylglucosamine transférase conduit à l’obtention d’oligomères de N-
acétylglucosamine d’environ 20 résidus.
(ii) La chaîne de PIA en croissance est ensuite exportée à travers la membrane par IcaC qui
est aussi nécessaire à l’allongement de la chaîne;
(iii) Après son exportation, la PIA est déacétylée par une protéine attachée à la surface, IcaB,
afin d’introduire des charges positives, cruciales pour son emplacement en surface et pour son
activité biologique.
Figure 2.14: Biosynthèse de la PIA en 3 étapes chez Staphylococcus spp.
D’après (Vuong et al., 2004)
2.2.4.2.2.3. Mécanismes indépendants de l’opéron ica
En dépit du rôle indéniablement important du locus icaADBC et des voies de régulation
contrôlant la production du PIA/PGNA dans le développement du biofilm staphylococcique,
des études récentes commencent à mettre en exergue l’existence chez S. aureus de
mécanismes de formation du biofilm indépendants de PIA/PGNA. Le premier mécanisme le
mieux caractérisé de formation de biofilm icaADBC - indépendant a été décrit par Penades et
Lassa qui ont montré que la protéine Bap (biofilm associated protein) est essentielle à la fois
dans l’adhérence, l’agrégation intercellulaire, et dans la formation du biofilm par la souche
V329 de S. aureus impliquée dans la mastite bovine (Cucarella et al., 2001). Le gène bap est
présent dans 5% des 350 souches bovines, et est absent dans les souches cliniques de S.
aureus d’origine humaine. Des études récentes ont décrit d’autres mécanismes icaADBC-
42
indépendants de formation du biofilm. C’est le cas de la protéine de surface SasG codée par le
gène sasG (Corrigan et al., 2007; Makoto Kuroda et al., 2008), des protéines de liaison à la
fibronectine, FnBPA et FnBPA (O’Neill et al., 2008; Vergara-Irigaray et al., 2009), de la
protéine de surface de S. aureus SasC codée par le gène sasC (Schroeder et al., (2009) et de la
protéine A (Merino et al., 2009).
La matrice du biofilm peut aussi contenir de l’ADN extracellulaire (ADNe). L’ADN étant une
molécule polyanionique, il peut interagir avec un polymère chargé positivement comme le
PIA/PGNA. Il a un rôle de structure en participant au développement du biofilm. (Mann et al.,
2009).
2.2.4.2.3. Détachement du biofilm
La dispersion du biofilm joue un rôle très important dans les infections associées aux
biofilms. C’est le cas des infections métastasiques telles que les ostéomyélites et les abcès, les
complications d’embolies d’une endocardite provoquées par le détachement d’un biofilm des
valves cardiaques ainsi que les infections aiguës sévères comme le sepsis (von Eiff et al.,
2005; Boles et Horswill, 2011).
Le principal mécanisme de détachement du biofilm utilisé par S. aureus est la production
d’enzymes extracellulaires ou des surfactants qui dégradent et solubilisent les différents
composants de la matrice du biofilm. Ainsi, les principaux facteurs de détachement sont les
protéases, les DNases et les surfactants PSM (Phenol-soluble modulins). A ceux-ci, il faut
ajouter le système de quorum sensing agr qui contrôle la production de ces enzymes et des
PSM dégradant la matrice du biofilm, et certaines conditions environnementales, telles que la
carence en glucose dans le milieu de culture (Boles et Horswill, 2011; McDougald et al.,
2012).
2.2.4.3. Facteurs favorisant la formation du biofilm
La formation du biofilm est un phénomène complexe, sous l’influence de nombreux facteurs
comme par exemple les caractéristiques du substrat sur lequel les bactéries vont se fixer, les
forces s’exerçant dans le milieu aqueux (hydrodynamique du fluide), les caractéristiques du
milieu et les propriétés de la surface des cellules (Donlan, 2002).
43
2.2.4.3.1. Caractéristiques de la surface du substrat
Une surface solide possède plusieurs caractéristiques essentielles au processus d’attachement.
2.2.4.3.1.1. Les propriétés physico-chimiques de la surface
Les interactions entre la paroi cellulaire bactérienne et les surfaces sont principalement
influencées par les forces électrostatiques interfaciales d’attraction ou de répulsion et par les
forces de van der Waals. Cependant, plusieurs interactions non spécifiques et forces
interfaciales influencent aussi l’attachement aux surfaces. C’est le cas de forces d’hydratation,
d’interactions hydrophobes et de forces stériques. Les cellules sont capables d’outrepasser les
forces répulsives que peut exercer sur elles le substrat, via l’action de liaisons hydrophobes.
Les interactions hydrophobes (l’énergie de surface faible) et les interactions électrostatiques
(la charge) sont les phénomènes les mieux étudiés (Renner et Weibel, 2011).
Les propriétés physico-chimiques peuvent exercer une influence sur le taux d’attachement et
sur son ampleur. Les micro-organismes se fixent plus facilement sur des surfaces
hydrophobes et non polarisées comme le téflon ou d’autres matières plastiques, que sur des
matériaux hydrophiles comme le verre ou les métaux (Hamadi et al., 2009).
Les interactions acide-base de Lewis (accepteur-donneur d’électrons) permettent la formation
de liaisons hydrogènes. Ce sont des interactions électrostatiques fortes, de courte distance,
possibles lorsqu’un atome d’hydrogène est en contact avec un atome électronégatif (Speranza
et al., 2004).
Les interactions de van der Waals correspondent aux forces de faible énergie qui s’établissent
entre les atomes des molécules de deux structures différentes lorsqu’elles se rapprochent. Ces
forces résultent de l’interaction entre les électrons d’une molécule et les charges d’une autre.
Les forces électrostatiques répulsives sont amoindries quand les bactéries entrent en contact
via les polymères extracellulaires ou le matériel capsulaire qui les maintiennent à une certaine
distance. D’après la théorie développée par Derjaguin, Landau, Verwey et Overbeek (théorie
DVLO), la résultante des interactions de van der Waals et des interactions électrostatiques
gouvernent l’adhésion bactérienne initiale (Garret et al., 2008). Elle est fonction de la distance
bactérie-support, ainsi que de la force ionique du milieu: à force ionique faible, les forces
électrostatiques sont très importantes et les conditions sont défavorables à l’adhésion
bactérienne due à la barrière du potentiel zêta; par contre, à force ionique élevée, les
44
interactions sont masquées par les nombreuses charges du milieu (suppression de la barrière
de solvatation et interactions électrostatiques répulsives négligeables), les conditions sont très
favorables à l’adhésion grâce aux forces de van der Waals (Katsikogiani et Missirlis, 2004).
La force consécutive aux interactions électrostatiques entre une bactérie et une surface est liée
aux structures de surface (protéines) et à la force ionique du milieu.
2.2.4.3.1.2. La rugosité de la surface
La rugosité d’une surface influence l’attachement des bactéries à celle-ci. En effet, plus une
surface est rugueuse, plus la colonisation de celle-ci par des microcolonies est importante
(Katsikogiani et Missirlis, 2004). Les surfaces rugueuses sont colonisées de façon
préférentielle, car les forces répulsives sont moindres et la surface de fixation est augmentée
grâce à la présence d’aspérités (Donlan, 2002).
2.2.4.3.2. La présence d’une couche protéique ou film conditionnant
La présence de polymères sur un matériau solide exposé dans un milieu aqueux modifie les
propriétés physico-chimiques de sa surface et a une influence directe sur l’attachement des
bactéries à cette dernière. En effet, la présence d’un film protéique sur des implants médicaux
en contact direct avec un fluide favorise la formation de biofilms. Par exemple, les implants
médicaux, en contact direct avec le sang, sont couverts de plaquettes, du plasma et de
protéines parmi lesquelles: albumine, fibrinogène, fibronectine, laminine, collagène, facteur
de von Willebrand (Katsikogiani et Missirlis 2004; von Eiff et al., 2005).
2.2.4.3.3. Les caractéristiques du milieu
Les caractéristiques du milieu aqueux, telles que le pH, la quantité de nutriments, la force
ionique, la température, peuvent jouer un rôle important dans l’adhésion de la bactérie à une
surface (Mahami et Adu-Gyamfi, 2011).
2.2.4.3.4. Les propriétés de la surface cellulaire
L’hydrophobicité de la surface de la cellule bactérienne influence l’attachement des bactéries
à une surface. L’hydrophobicité d’une surface est également importante dans l’adhésion des
microorganismes à celle-ci. Moins les matériaux sont polarisés, plus les liaisons hydrophobes
deviennent importantes. La plupart des bactéries sont chargées négativement et présentent à
leur surface des zones hydrophobes. Les éléments structuraux de S. aureus intervenant dans
45
son attachement à une surface sont ses adhésines, les MSCRAMMs. Une bactérie hydrophobe
aura plus de facilité pour enlever le film d’eau la séparant de la surface à coloniser et elle
établira plus facilement le contact avec cette surface qu’une bactérie hydrophile (Doyle, 2000;
Donlan, 2002).
2.2.4.4. Quorum sensing et biofilm de S. aureus
Chez S. aureus, la production des protéines de surface et des exoprotéines se fait en deux
phases. A une faible densité cellulaire (faible activité agr au début d’une infection), la
bactérie produit des facteurs protéiques, tels que les MSCRAMMs et d’autres adhésines
capables de promouvoir l’attachement et l’accumulation du biofilm. En revanche, à une forte
densité cellulaire (forte activité agr), la bactérie réprime les gènes codant pour les facteurs de
colonisation, et initie la sécrétion d’une variété de toxines (telles que α-toxine, δ-toxine, et
TTSS-1) et la sécrétion d’enzymes (telles que protéases, lipases, hyaluronidase, et nucléases)
qui sont impliquées dans la destruction des tissus et/ou dans le détachement du biofilm
(Heilmann et Götz, 2010). Les adhésines bactériennes sont spécialement importantes dans les
étapes initiales de la formation du biofilm et la δ-hémolysine exercerait une action négative
dans la maturation de la structure du biofilm du fait de ses propriétés détergentes. Les
protéases extracellulaires diminuent les biofilms en dégradant les protéines requises (Novick
et Geisinger, 2008; Martí et al., 2009). Ainsi, la répression du système agr est nécessaire à la
formation d’un biofilm et l’induction du système agr dans un biofilm établi favorise le
détachement du biofilm de son site de fixation (Boles et Horswill, 2008).
2.2.4.5. Résistance du biofilm
L’éradication d’un biofilm pose des problèmes cliniques, car l’antibiothérapie active
habituellement sur les bactéries à l’état planctonique se révèle bien souvent moins efficace sur
des structures organisées en biofilm (Stewart et Costerton, 2001). Quelques hypothèses sont
avancées pour tenter d’expliquer les mécanismes de résistance des biofilms aux antibiotiques.
La première repose sur la notion de barrière physique qui expliquerait la pénétration lente et
incomplète de certains antibiotiques. La seconde hypothèse est liée à l’environnement
spécifique du biofilm, dont les zones les plus profondes, riches en acides et pauvres en
oxygène et en nutriments, pourraient gêner l’action de l’antibiotique. Enfin, la dernière
hypothèse s’appuie sur les modifications phénotypiques observées dans certains biofilms. Les
bactéries à l’intérieur du biofilm activent plusieurs gènes qui altèrent l’enveloppe cellulaire,
46
les cibles moléculaires et la sensibilité aux antibiotiques (Steward et Costerton, 2001; Tenke
et al., 2012).
En dehors de la diminution de la sensibilité aux antibiotiques, les biofilms de S. aureus
montrent une résistance aux cellules phagocytaires de l’hôte (Hall-Stoodley et Stoodley,
2009; Thurlow et al., 2011).
2.2.4.6. Lutte contre les biofilms de S. aureus sur les implants médicaux
Les moyens de lutte contre les biofilms suivent trois axes de recherche: l’inhibition de
l’adhésion microbienne à une surface et de la colonisation, l’action sur le QS et le traitement
du biofilm préformé (Francolini et Donelli, 2010).
2.2.4.6.1. Inhibition de l’adhésion microbienne
Deux stratégies de traitement de surface sont généralement utilisées: la première consiste à
utiliser les solutions verrous pour lutter contre l’adhésion, la seconde, à éliminer ces
pathogènes par incorporation sur la surface, de molécules antimicrobiennes (von Eiff et al.,
2005, de Carvalho, 2012).
2.2.4.6.1.1. Les solutions verrous
La solution verrou traditionnelle contient de l’héparine, à raison de 5.000 à 10.000 UI/mL.
Mais des faibles concentrations d’héparine stimulent in vitro la formation du biofilm (Shanks
et al., 2005). Le citrate trisodique est utilisé comme solution verrou en raison de ses propriétés
antimicrobiennes puissantes, sans risque de résistance. Les concentrations supérieures à 0,5-
4% préviennent in vitro la formation du biofilm par S. aureus, mais ne détruisent pas un
biofilm préexistant (Shanks et al., 2006). Les propriétés antibactériennes du citrate peuvent
être accrues par l’adjonction d’autres substances, comme la gentamycine, la lepirudine,
l’acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) (Shanks et al., 2006) ou la taurolidine (Shah et
al., 2002).
2.2.4.6.1.2. Traitements par incorporation d’agents antimicrobiens
Pour empêcher l’adhésion des microorganismes sur les surfaces des implants médicaux, les
efforts de recherche se sont focalisés sur le traitement des surfaces par diverses molécules.
Parmi les systèmes les plus répandus, on peut citer: l’addition des métaux ou des enzymes sur
47
les surfaces et l’imprégnation aux antibiotiques et/ ou aux antiseptiques (de Carvalho, 2012).
Cependant, l’utilisation des antibiotiques ou des antiseptiques à des concentrations
subinhibitrices ou à titre prophylactique pour prévenir les infections des implants médicaux,
contribue à l’augmentation de la formation des biofilms et à la sélection des mutants résistants
(Campoccia et al., 2010).
2.2.4.6.2. Action sur le QS
Chez les staphylocoques, l’inhibiteur du QS, RIP (RNAIII-inhibiting peptide) qui interfère
avec le système agr, est efficace dans la prévention et le traitement des infections à S. aureus,
y compris celles associées aux implants médicaux (Otto, 2004).
Dans des nombreux modèles animaux, l’utilisation locale ou systémique de RIP prévient
l’infection et inhibe complètement la formation du biofilm par des souches résistantes de S.
aureus, et en même temps restaure la sensibilité aux antibiotiques (Dell’acqua et al., 2004;
Balaban et al., 2007). Balaban et al. (2003) avaient aussi préalablement démontré que RIP
inhibait l’adhésion de S. aureus aux cellules de l’hôte et réduisait in vitro l’adhérence et la
formation du biofilm sur les cathéters de dialyse en silicone ou en polyuréthane.
Dans les implants orthopédiques, les billes de polyméthylméthacrylate chargées de RIP et,
implantées chez les rats, étaient capables de prévenir in vivo la formation des biofilms par les
SARM (Anguita-Alonso et al., 2007).
2.2.4.6.3. Le traitement du biofilm staphylococcique préformé
Comme nous l’avons dit ci-dessus, les biofilms staphylococciques sont impliqués dans
différentes infections et contribuent aux difficultés rencontrées dans le traitement. La thérapie
possible des infections associées au biofilm pourrait être basée sur la combinaison des
molécules anti-biofilm avec différents antibiotiques conventionnels (Otto, 2008).
Raad et al. (2007) ont démontré que le linézolide et la vancomycine administrés séparément,
étaient moins efficaces sur le biofilm de S. aureus que la daptomycine, la minocycline et la
tigécycline. Cependant, la destruction du biofilm et la mort des bactéries planctoniques étaient
obtenues avec l’association rifampicine-linézolide ou vancomycine. Une autre étude a montré
que l’amikacine et la ciprofloxacine pénétraient les biofilms de S. aureus et S. epidermidis
48
contrairement à l’oxacilline, la cefotaxime et la vancomycine dont la pénétration était
significativement réduite (Singh et al., 2010).
L’utilisation des substances telles que les phages (Kelly et al., 2012), les enzymes (la
lysostaphine, la DNase I, la protéinase K, la protéase V8) (Kiedrowski et Horswill, 2011)
capables de détruire l’intégrité physique de la matrice du biofilm, constitue aussi une
approche antibiofilm attractive.
D’autres stratégies ont été étudiées dans le but de promouvoir la libération des cellules
bactériennes du biofilm de S. aureus, et augmenter ainsi leur sensibilité à la vancomycine. Il
s’agit notamment du traitement photodynamique (FTD) (Di Poto et al., 2009) et de la
vaccination contre des biofilms. (Brady et al., 2011).
49
3. BUT DU TRAVAIL
Les infections bactériennes sont la cause majeure de la morbidité et de la mortalité en milieu
hospitalier dont la majorité peut être due à S. aureus. L’importance médicale de cette espèce
bactérienne est sa capacité à provoquer de nombreux types d’infections chez l’homme et à
persister à la surface des implants médicaux. La présence d’un film protéique sur les implants
médicaux en contact direct avec un fluide favorise l’adhésion et la formation des biofilms par
S. aureus, avec comme corollaire la résistance aux défenses immunitaires de l’hôte et aux
antibiotiques.
Plusieurs travaux de recherche se focalisent actuellement sur l’élimination des bactéries
planctoniques avant qu’elles n’adhèrent à une surface et n’initient la formation d’un biofilm
ou sur la réduction de la colonisation des implants médicaux. L’une des approches exploitées
pour la prévention de l’adhésion et la formation du biofilm est l’utilisation des agents
chélateurs des cations divalents comme solutions verrous des implants médicaux. La méthode
in vitro la plus utilisée pour l’évaluation de l’adhésion et de la formation du biofilm et des
effets des antagonistes de ce processus est la méthode classique de coloration au cristal violet.
Bien qu’efficace, cette dernière présente cependant de nombreuses limitations, notamment la
longueur du temps d’incubation et plusieurs étapes de lavage des puits avant et après
coloration du biofilm formé avec le cristal violet. Une méthode efficace pour l’évaluation
rapide de l’adhésion à une surface abiotique est nécessaire.
Le but de ce travail était d’étudier l’interaction entre des souches cliniques de S. aureus
sensibles et résistantes à la méticilline (SASM et SARM) et des surfaces abiotiques et
d’évaluer l’activité de l’EGTA, chélateur des cations divalents dans le processus d’adhésion et
de formation du biofilm en comparant la méthode de coloration au cristal violet et celle du
Biofilm Ring Test®
récemment décrite.
50
4. MATERIEL ET METHODES
4.1. MATERIEL
4.1.1. Souches bactériennes
4.1.1.1. Souches testées et types de prélèvement
Au départ, 8 souches cliniques de S. aureus (4 souches sensibles à la méticilline [SASM1] et
4 souches résistantes à la méticilline [SARM]) ont été collectées à des fins diagnostiques par
le laboratoire de bactériologie de l’Hôpital Général Provincial de Référence de Kinshasa
(HGPRK) en République Démocratique du Congo en 2008. Une souche de référence de S.
aureus sensible à la méticilline et une souche de référence résistante à la méticilline
(respectivement, ATCC 25923 et ATCC 33591; American Type Culture Collection,
Manassas, VA, Etats-Unis d’Amérique) ont été également étudiées. Suite à un incident
survenu au laboratoire pendant la réalisation de nos travaux, toutes les souches cliniques de
SASM1 ont été remplacées en novembre 2011 par 4 nouvelles souches sensibles à la
méticilline (SASM2) collectées à Kinshasa dans le même laboratoire. Le Tableau 4.1 reprend
les caractéristiques de différentes souches étudiées.
Tableau 4.1. Caractéristiques de souches cliniques et de référence
Souches bactériennes Types de prélèvement Sensibilité à l'oxacilline
SARM
ATCC 33591 Référence Résistante
011/LP Liquide prostatique Résistante
027/U Urines Résistante
028/FV Frottis vaginal Résistante
007/FV Frottis vaginal Résistante
SASM1
ATCC 25923 Référence Sensible
020/LP Liquide prostatique Sensible
008/U Urines Sensible
022/U Urines Sensible
018/FV Frottis vaginal Sensible
SASM2
5668/S Sang Sensible
5741/S Sang Sensible
1532/P Pus plaie Sensible
1620/P Pus plaie Sensible
51
4.1.1.2. Identification, transport et conservation de souches
Les bactéries ont été cultivées et isolées dans le milieu Brain Heart Agar additionné de 5%
(v/v) de sang de mouton et dans le milieu Mannitol Salt Agar (Difco, BD Franklin Lakes, NJ,
Etats-Unis d’Amérique). L’identification des isolats a été faite par des méthodes
conventionnelles de microbiologie, à savoir: la coloration de Gram, les tests de la catalase, la
DNase, la coagulase et par le test d’agglutination au latex Pastorex Staph-plus (Biorad,
Marnes-la-Coquette, France). A Kinshasa, les souches ont été conservées à la température
ambiante dans le milieu Tryptone Soya Agar (TSA) (Oxoid, Basingstoke, Hampshire,
Angleterre), puis transportées en Belgique dans le même milieu. En Belgique, les souches ont
été repiquées sur la boîte de gélose TSA et incubées pendant 24 h à 37°C. Après incubation,
les morceaux de gélose TSA ont été placés dans les fioles de 5 mL contenant de la glycérine
stérile puis conservés au surgélateur à - 20°C. Les cultures de travail étaient obtenues après
étalement et 3 repiquages successifs de 24 h à 37°C sur une boîte de gélose TSA.
4.1.2. Milieu de culture pour la formation des biofilms
Le milieu de culture utilisé dans les études de formation du biofilm était le milieu BHI (Brain
Heart Infusion) dont la composition se trouve dans l’annexe n°4.
4.1.3. Substances antibiofilms
Acide éthylèneglycol tétraacétique (EGTA) de Sigma-Aldrich (France),
Protéinase K (PK) de Sigma- Aldrich (St Louis, MI, Etats-Unis d’Amérique),
Periodate de sodium (PI) de Merck (Darmstadt, Allemagne).
Le choix de l’EGTA était basé sur une étude suggérant que les cations, en particulier le
calcium, jouent un rôle dans la liaison des polymères et dans la cohésion du biofilm. Par
conséquent, l’absence de ces cations ou leur chélation par l’EGTA, peut conduire au
détachement du biofilm (Turakhia et al., 1983).
Pour explorer la composition de la matrice d’un biofilm staphylococcique, plusieurs études
préconisent l’utilisation d’une protéase comme la protéinase K ou du PI, un oxydant des
polysaccharides (Fitzpatrick et al., 2005; O’Neill et al, 2007).
52
La solution stock de l’EGTA de 100 mM (pH 7,0) était préparée extemporanément dans l’eau
déminéralisée puis stérilisée par filtration (Millipore 0,2 µm). Une solution stock de 200 mM
de PI (dans du tampon acétate de sodium 50 mM, pH 4.5) était également préparée dans les
mêmes conditions. La solution stock de la protéinase K (1 mg/mL) était préparée à l’aide de
tampon Tris-HCl 20 mM à pH 7, stérilisée par filtration (Millipore 0,2 µm), puis conservée à -
20°C.
4.1.4. Microplaques permettant la formation du biofilm
Les microplaques utilisées étaient en polystyrène comportant 96 puits, et sur lesquelles les
bactéries vont adhérer et former un biofilm. Il s’agissait des microplaques 96 Well Cell Plate
de marque Cellstar®, N° 655 180 (Greiner Bio-One).
4.1.5. Dispositif du Biofilm Ring Test® (BFRT
®)
Le kit du BFRT®
(Saint Beauzire, France) comprenait des microplaques de 96 puits
constituées de 12 barrettes à usage unique Strip Well (SW) de 8 puits stériles, du liquide de
contraste (LIC-001), du toner (TON-005) stérile contenant une suspension de particules
magnétisables, et un Block Test (BKT) pour aimantation. Les microplaques étaient lues au
scanner (lecteur BFC) et un logiciel BFC elements® a été utilisé pour calculer l’indice de
formation du biofilm (BFI) (Figure 4.1).
Figure 4.1: Dispositif et consommables du BFRT®
.
Image de BioFilm Control, Saint - Beauzire, France
Scanner
Logiciel BFC elements®
Block Test Microplaques
Strip Well
Liquide de
contraste
Solution de
Toner
53
4.1.6. Les amorces utilisées
Toutes les amorces utilisées dans les différentes réactions de PCR pour la détection du gène
gap, des gènes impliquées dans la résistance aux antibiotiques et dans la formation du biofilm
ont été fournies par Eurogentec (Liège, Belgique).
54
4.2. METHODES
4.2.1. Caractérisation des souches de S. aureus
4.2.1.1. Antibiogrammes
L’antibiogramme de chaque souche a été réalisé par la méthode de diffusion en milieu gélosé
de Mueller Hinton, décrite dans le document de NCCLS (1998) avec un inoculum contenant
environ 108
UFC/mL. Les disques d’antibiotiques (Liofichen, Roseto degli Abbruzi, Italie)
suivants ont été testés: amikacine, amoxicilline, cefazoline, ceftazidime, ciprofloxacine,
gentamicine, oxacilline et vancomycine. La détection de la méticillinorésistance a été
effectuée par la méthode de diffusion sur gélose de Mueller Hinton hypersalée par addition de
4% de NaCl (p/v), à l’aide de disques chargés de 1 µg d’oxacilline ou de céfoxitine. Les
résultats de l’antibiogramme ont été interprétés suivant les recommandations de NCCLS
(1998).
4.2.1.2. Caractérisation génomique des souches de S. aureus
4.2.1.2.1. Détection de gènes codant pour l’ARNr 16S, la résistance à la méticilline et
pour la thermonucléase de S. aureus par une PCR triplex
La détection de ces 3 gènes a été effectuée par une PCR multiplex qui permet l’amplification
simultanée de plusieurs séquences cibles dans un même tube d’amplification. Chaque
amplification doit être, dans le même tube, indépendante des autres, le résultat devant être
identique à celui obtenu isolément dans un tube avec un seul couple d’amorces. Dans le cas
d’espèce, la PCR multiplex utilisée permet la détection de gènes suivants:
- le gène mecA qui révèle un des mécanismes de résistance à l’oxacilline. L’expression
du gène mecA code pour la PBP2a, une protéine modifiée de liaison aux pénicillines,
possédant une faible affinité pour les bêta-lactamines,
- le gène nuc codant pour une thermonucléase spécifique de S. aureus et qui révèle la
présence d’un S. aureus,
- La détection du gène ARNr 16S, spécifique du genre Staphylococcus et qui sert de
contrôle de qualité interne.
55
4.2.1.2.1.1. Extraction de l’ADN
L’extraction de l’ADN a été réalisée selon le protocole décrit par Unal et al. (1992). Les
cellules bactériennes provenant d’une gélose Columbia additionnée de 5% de sang de mouton
ont été incubées pendant 10 min à 37°C avec 50 µL de lysostaphine 100 µg/mL. Une
deuxième incubation a été réalisée pendant 10 min à 37°C avec 150 µL de protéinase K 100
µg/mL préparée dans du tampon Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5). Les cellules ont été ensuite portées
à ébullition pendant 5 min à 95°C, puis centrifugées à 8000 g pendant 5 min. Le lysat
bactérien obtenu contenant de l’ADN a été utilisé pour la réaction d’amplification par PCR.
4.2.1.2.1.2. PCR triplex ARNr 16S, mecA et nuc
La PCR triplex a été réalisée selon le protocole décrit par Maes et al. (2002). La réaction de
PCR a été effectuée dans un mélange réactionnel de 50 µL contenant le tampon de PCR 1X
(Perkin-Elmer Applied Biosystem, Foster City, Californie), 2 mM de MgCl2, 0,6 µM de
chaque amorce sens et antisens spécifique à l’ARNr 16S, 0,4 µM de chaque amorce sens et
antisens spécifiques à mecA et nuc respectivement (Amersham Pharmacia Biotech,
Roosendaal, Hollande), 250 µM de chacun des 4 dNTPs, 2 U de Taq ADN polymérase et de 5
µL de lysat bactérien. Les conditions d’amplification comprenaient une dénaturation initiale à
95°C pendant 15 min suivie de 25 cycles de dénaturation (30 sec à 95°C), hydridation (90 sec
à 57°C), extension (90 sec à 72°C) et une extension finale à 72°C pendant 10 min. Les
fragments amplifiés ont été séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5% dans du TBE
1 X additionné de bromure d’éthidium. Les amorces utilisées sont reprises dans le Tableau
4.2.
Tableau 4.2: Les amorces utilisées dans la PCR multiplex
Gène GenBank Amorces Fragment
mecA X 52593
S 5'- AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-
533 pb AS 5'- AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-
nuc DQ 507381
S 5' GCGATTGATGGTGATACGGTT-
279 pb AS 5'- AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-
ARNr16S NR 037007
S 5’- GTTATTAGGGAAGAACATATGTG-
750 pb AS 5’- CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACC
S: Sens; AS: Antisens; pb: paires de base
56
4.2.1.2.2. Typage moléculaire des souches de S. aureus par spa typing
L’analyse des répétitions présentes dans la séquence codant pour la protéine A de S. aureus
(spa typing) a été effectuée suivant la méthode décrite par Hallin et al. (2007). Cette technique
consiste à séquencer une région contenant un nombre variable de séquences répétées en
tandem ou « repeat » de la région X de la protéine A (gène spa) (voir Figure 2.5). Le logiciel
Ridom StaphType (Ridom GmbH, Allemagne) permet l’analyse de ces séquences par la
détermination automatique de ces éléments répétés, l’analyse de ces éléments et, finalement
l’attribution d’un profil (spa type). Le principe de la méthode consiste à réaliser une PCR de
type end-point permettant d’amplifier la région spa et de séquencer l’amplicon spa obtenu.
4.2.1.2.2.1. Extraction de l’ADN
L’extraction de l’ADN a été effectuée selon le protocole décrit au paragraphe précédent.
4.2.1.2.2.2. PCR de la région X du gène spa
La réaction de PCR s’est réalisée dans un volume final de 25 µL contenant 12,5 µL de master
mix PCR multiplex Qiagen, 3 µL de lysat bactérien, 10 µM des amorces sens (spa-1113) et
antisens (spa-1514) (0,5 µL respectivement) et 8,5 µL d’eau apyrogène. Les amorces
classiques utilisées étaient les suivantes (voir Figure 2.5): amorce sens spa-1113 (5’-TAA
AGA CGA TCC TTC GGT GAG C - 3’) et amorce antisens spa-1514 (5’-CAG CAG TAG
TGC CGT TTG CTT- 3’) (Aires-de-Sousa et al., 2006).
Le protocole d’une PCR de type end-point a été utilisé. Les séquences ont été amplifiées en
deux phases: (1) les échantillons ont subi une dénaturation initiale à 94°C pendant 5 min
suivie de 3 cycles de dénaturation à 94°C pendant 1 min, hydridation à 55°C pendant 2 min et
extension des amorces à 72°C pendant 1 min, (2) puis 30 cycles de dénaturation à 94°C
pendant 20 sec, hydridation à 55°C pendant 1 min, extension des amorces à 72°C pendant 2
min, et enfin une extension finale à 72°C pendant 7 min. Les produits d’amplification ont été
révélés sur l’automate QIaxel (Qiagen).
57
4.2.1.2.2.3. Séquençage de l’ADN
La méthode de séquençage utilisée est celle décrite par Sanger et al. (1977). Le principe de
cette méthode consiste à initier la polymérisation de l’ADN à l'aide d'un oligonucléotide
(amorce) complémentaire à une partie du fragment d’ADN à séquencer. L’élongation de
l’amorce est réalisée par l’action enzymatique d’une polymérase thermostable comme celle
utilisée pour la PCR (Taq ADN polymérase). Les quatre désoxyribonucléotides (dATP,
dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés, ainsi qu’une faible concentration de quatre
didésoxyribonucléotides (ddNTP) (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). Chaque ddNTP est
marqué par une molécule fluorescente distincte. Ces didésoxyribonucléotides agissent comme
des terminateurs de chaîne: une fois incorporés dans le nouveau brin synthétisé, ils empêchent
la poursuite de l’élongation. Cette terminaison se fait spécifiquement au niveau des
nucléotides correspondant aux didésoxyribonucléotides marqués incorporés dans la réaction.
La terminaison se fait de manière statistique suivant que l'ADN polymérase utilise un dNTP
ou un ddNTP. Il en résulte un mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes, qui se
terminent tous au niveau d'un ddNTP. Ces fragments sont ensuite séparés sur le séquenceur
d’ADN qui permet de détecter automatiquement le traceur fluorescent incorporé dans l’ADN.
La séquence d’acide nucléique est déduite des mobilités électrophorétiques des différents
produits d’extension résultant de la réaction. La réaction de séquençage est réalisée dans un
thermocycleur de PCR de type end-point.
4.2.1.2.2.4. PCR de séquençage
La réaction de séquençage a été réalisée dans un volume final de 10 µL. Un mélange
réactionnel de 6 µL contenant 2,5 µL d’eau apyrogène, 2 µL de Big Dye Terminator DNA
sequencing kit V1.1 (Applied Biosystems, Darmstadt, Allemagne), 1 µL de tampon fourni par
le kit de séquençage et 10 µM de l’amorce de séquençage (0,5 µL) sont déposés sur une
microplaque préconisée pour la PCR. A ce mélange réactionnel sont ajoutés 4 µL de produit
PCR dilué au 1/10 dans de l’eau apyrogène. Les conditions d’amplification étaient les
suivantes: un cycle de dénaturation à 96°C pendant 2 min suivi de 25 cycles de dénaturation
(30 sec à 96°C), hybridation (15 sec à 50°C), extension (1 min à 60°C).
Les produits de séquençage ont été purifiés par le kit SOPACHEM. Les séquences ont été
obtenues en utilisant le séquenceur automatique d’ADN ABI 3100 Avant Genetic Analyser
(Applied Biosystems, Darmstadt, Allemagne). Les types spa ont été déterminés en utilisant le
58
logiciel Ridom StaphType qui détecte automatiquement les répétitions spa et attribue un type
spa selon Hallin et al. (2007).
Remarque: Les expériences portant sur la PCR triplex et le typage moléculaire par spa typing
ont été réalisées par le Centre national de référence Staphylococcus aureus du laboratoire de
microbiologie de l’Hôpital Erasme.
4.2.1.2.3. Détection du gène gap, et des gènes impliqués dans la résistance à la méticilline
et à la mupirocine
4.2.1.2.3.1. Extraction de l’ADN
L’extraction de l’ADN a été réalisée selon la méthode décrite par Martín-Lopez et al. (2004)
de la façon suivante: après culture pendant une nuit des différentes souches de SARM et
SASM sur une gélose TSA, une à deux colonies isolées ont été placées dans 20 mL d’eau
distillée stérile. La suspension obtenue a été chauffée à 100°C pendant 20 min. De cette
suspension, un aliquote de 5 µL a été utilisé directement pour la réaction d’amplification par
PCR.
4.2.1.2.3.2. PCR de fragments des gènes gap, mecA, femB, ileS-2 (mupR)
Les réactions de polymérisation en chaine ont été effectuées pour rechercher:
a. le gène gap codant pour la glycéraldéhyde - 3 - phosphate déshydrogénase,
b. le gène mecA codant pour la résistance à la méticilline,
c. le gène femB impliqué dans l’expression de la résistance à la méticilline,
d. le gène ileS-2 ou mupR impliqué dans la résistance à la mupirocine.
Les séquences des amorces sens et antisens correspondant aux 4 gènes sont reprises dans le
Tableau 4.3. Chaque réaction de PCR, en fonction du gène recherché, a été effectuée dans un
volume final de 50 µL contenant soit 0,8 µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène
gap, 0,1 µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène mecA, 3,6 µM de chaque amorce
sens et antisens pour le gène femB ou de 0,2 µM de chaque amorce sens et antisens pour le
gène ileS-2, 5 µL de solution contenant de l’ADN génomique, 0,2 mM de chacun des 4
dNTPs, 1,25 U de Taq ADN polymérase, du tampon réactionnel (16 mM de sulfate
59
d’ammonium, 67 mM de Tris-HCl pH 8,8), 3,5 mM de chlorure de magnésium et de l’eau
sans nucléase. Le protocole d’une PCR hot start a été utilisé. Les séquences ont été amplifiées
dans un thermocycler (Bio-Rad icycler) en utilisant le programme suivant: dénaturation
initiale à 94°C pendant 5 min, dénaturation, hybridation, extension des amorces selon les
protocoles repris dans le Tableau 4.4 et une extension finale de 10 min à 72°C.
Les produits d’amplification ont été séparés par électrophorèse soit sur gel d’agarose à 2%
pour les gènes femB, mupR et mecA, soit sur gel d’agarose à 1% pour le gène gap dans du
tampon TBE à 60 V pendant 60 min. Les gels ont ensuite été colorés avec du GelRed (VWR,
Leuven, Belgique), puis visualisés sous lumière UV dans le Chemidoc XRS+ (BioRad,
Nazareth, Belgique). La taille des fragments amplifiés a été estimée en comparaison avec un
marqueur de 100 pb (GeneRuler 100-bp DNA ladder plus, Fermentas, Hanover, MD, Etats-
Unis d’Amérique).
Tableau 4.3: Amorces utilisées dans les PCR
Gène
Gen
Bank
Amorces
Fragment
Références
gap 1123535 S
AS
5'-ATGGTTTTGGTAGAATTGGTCGTTTA
5'-GACATTTCGTTATCATACCAAGCTG 934 bp
Yugueros et al.,
2000
femB X17688 S
AS
5'-TTACAGAGTTAACTGTTACC
5'-ATACAAATCCAGCACGCTCT 651 pb
Martin-Lopez
et al., 2004
mupR X75439 S
AS
5'-TATATTATGCGATGGAAGGTTGG
5'-AATAAAATCAGCTGGAAAGTGTTG 458 pb
Martin-Lopez
et al., 2004
mecA Y00688 S
AS
5'-GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA
5'-CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA 310 pb
Martin-Lopez
et al., 2004
S: Sens; AS: Antisens; pb: paires de base
60
Tableau 4.4: Conditions des PCR
gap fembB + mupA + mecA
Dénaturation Temps (sec) 30 30 45 45
Temp. (°C) 94 94 94 94
Hybridation Temps (sec) 30 45 45 45
Temp. (°C) 55 66 64 50
Elongation Temps (sec) 45 60 60 60
Temp. (°C) 72 72 72 72
Nombre de cycles 35 10 5 25
4.2.1.3. Détermination du taux de croissance des cellules bactériennes
Les colonies de S. aureus cultivées sur une gélose TSA ont été inoculées dans le milieu BHI
et incubées à 37°C sous agitation orbitale à 100 tours/min pour obtenir une culture en phase
stationnaire. Deux cent cinquante µL de cellules en phase stationnaire ont été ensuite
inoculées dans 50 mL de BHI frais. Cent µL de cette suspension bactérienne ont été transférés
dans une microplaque stérile à 96 puits et incubés pendant 8 h sous agitation constante dans
un lecteur à microplaques (Synergy HT, BioTek, Winooski, VT, Etats-Unis d’Amérique). Les
puits ont été lus toutes les 5 min à une longueur d’onde de 600 nm. Les données collectées
entre 2 et 4 h ont été ajustées avec une équation exponentielle et le temps de doublement a été
calculé en utilisant le logiciel GraphPad.
4.2.1.4. Détermination des propriétés de surface des cellules bactériennes
4.2.1.4.1. La méthode MATS (Microbial Adhesion To Solvents)
Les propriétés des surfaces bactériennes ont été déterminées selon la méthode MATS décrite
par Bellon-Fontaine et al. (1996). La mesure de l’adhésion des cellules bactériennes à des
solvants permet de déterminer les propriétés des surfaces bactériennes intervenant dans le
phénomène d’adhérence en particulier les caractères acide/base de bactéries. Deux couples de
solvants ayant la même tension de surface liée au caractère Lifshitz-van der Waals ont été
61
choisis: le couple chloroforme (un solvant acide et accepteur d’électrons)/hexadecane (n-
alcane apolaire) et le couple acétate d’éthyle (un solvant basique et donneur
d’électrons)/hexane (n-alcane apolaire). Ces 4 solvants ont été fournis par la firme Sigma-
Aldrich (France). L’adhésion à l’hexadecane et à l’hexane permet de connaître le caractère
hydrophobe/hydrophile de la souche bactérienne. L’adhésion des cellules au chloroforme
(accepteur d’électrons) et à l’acétate d’éthyle (donneur d’électrons), par comparaison à
l’adhésion à l’hexadecane et à l’hexane permet de connaître respectivement les
caractéristiques basiques (donneur d’électrons) ou acides (accepteur d’électrons) de la souche
bactérienne.
Expérimentalement, les souches bactériennes ont été cultivées dans le milieu TSA additionné
de 5% de sang de mouton et incubées 24 h à 37°C. Deux à 3 colonies ont été ensuite inoculées
dans le milieu TSB et incubées 24 h à 37°C. Les bactéries récupérées après centrifugation à
5000 tours/min pendant 10 min et 2 lavages avec du tampon phosphate de sodium (PBS) 150
mM pH 7 ont été remises en suspension dans le même tampon. Chaque suspension ajustée à
une densité optique à 400 nm (D.O.400 nm) comprise entre 0,4-0,8 (soit environ 108
bactéries/mL) (A0) avec du PBS a été agitée vigoureusement sur vortex avec 0,4 mL de
chacun des 4 solvants pendant 2 min afin d’obtenir une émulsion. Après 15 min de repos pour
assurer une bonne séparation, la D.O.400 nm de la phase aqueuse (A) a été mesurée.
Le pourcentage (%) d’adhérence des cellules au solvant a été calculé par la formule suivante:
% adhérence = (1-A/A0) × 100
Parmi les 4 solvants considérés, l’hexadecane et l’hexane ont été utilisés comme solvants de
référence pour évaluer l’hydrophobicité de la souche bactérienne. Lorsque le pourcentage
d’adhérence dans ces solvants est supérieur à 50%, la bactérie est dite hydrophobe. Si ce
pourcentage est inférieur à 20%, la bactérie est dite hydrophile. Si le pourcentage est compris
entre ces deux valeurs, la bactérie est moyennement hydrophobe (Krepsky et al., 2003).
Lorsque le pourcentage d’adhérence à l’acétate d’éthyle est élevé par rapport à celui de
l’adhérence à l’hexane, la bactérie est dite acide, elle est acceptrice d’électrons. Lorsque le
pourcentage d’extraction par le chloroforme est élevé par rapport à celui de l’hexadecane, la
bactérie est dite basique, donneuse d’électrons.
62
4.2.1.4.2. La méthode SAT (Salt Aggregation Test)
L’hydrophobicité de la paroi bactérienne a été aussi évaluée par le test d’agrégation avec le
sulfate d’ammonium (SAT) décrit par Lindahl et al. (1981). Cette méthode est basée sur la
détermination de la plus faible concentration de sulfate d’ammonium qui induit une
agrégation de cellules bactériennes.
Ainsi, 2 à 3 colonies provenant d’une gélose TSA additionnée de 5% de sang de mouton ont
été repiquées dans le milieu TSB et incubées pendant 24 h à 37°C. Les cellules bactériennes
collectées après centrifugation pendant 10 min à 5000 tours/min ont été lavées 2 fois avec du
tampon sulfate de sodium 2 mM (pH 6,8) et mises en suspension dans le même tampon et
ajustées à une D.O.600 nm de 0,5. Un mL de cette suspension a été mélangé avec 1 mL de
solutions de concentrations croissantes de sulfate d’ammonium (pH 6,8) allant de 0,04 à 4 M
(préparées dans le tampon sulfate de sodium 2 mM à pH 6,8). L’agrégation a été observée par
une inspection visuelle du tube et la plus faible concentration de sulfate d’ammonium
provoquant l’agrégation a été considérée comme indice d’hydrophobicité. Un test était
considéré comme positif si la valeur du SAT était inférieure à 2 M. Si la valeur du SAT était
inférieure à 1 M, la souche était considéré comme très hydrophobe. Lorsque cette valeur était
comprise entre 1 et 2 M, la souche était hydrophobe, et si elle était supérieure à 2 M, la
souche était hydrophile (Krepsky et al., 2003).
4.2.1.5. Test de l’adhérence bactérienne sur tube de cathéter
Le protocole utilisé est celui décrit par Abraham et al. (2012). Les bactéries ont été cultivées
en milieu BHI et incubées toute la nuit à 37°C sous agitation orbitale à 120 tours/min afin
d’obtenir une culture bactérienne en phase stationnaire. Chaque culture a été ajustée à une
D.O.600 nm de 1,00 ± 0,05 et diluée au 1/250ème
dans du milieu BHI. Un morceau d’un tube de
cathéter intraveineux d’environ 2 cm a été introduit dans chaque tube et incubé à 37°C
pendant 18 h sans agitation. Après incubation, les tubes de cathéter ont été retirés puis lavés 2
fois avec de l’eau déminéralisée stérile avant ajout de 1 mL de 1× PBS (Gibco, Life
Technologies, Grande Bretagne) pH 7,2. Le décrochage de cellules a été réalisé après un
passage de tous les tubes dans un bain à ultrasons à 25°C pendant 5 min. Après une série de 4
dilutions successives avec du PBS de la suspension bactérienne obtenue, 1 mL de chacune de
ces dilutions a été déposé dans 2 boîtes de Pétri stériles contenant environ 15 mL de gélose
63
TSA fondue à 45°C. Les boîtes ont été incubées pendant 48 à 72 h à une température
comprise entre 30 et 35°C. Après dénombrement, les résultats ont été exprimés en UFC/mL.
4.2.2. Etudes sur la formation du biofilm
4.2.2.1. Etude de la formation du biofilm par la méthode in vitro de «Biofilm Ring Test®
»
La méthode du BFRT®
décrite par Chavant et al. (2007) permet de suivre de façon simple et
rapide l’immobilisation de billes magnétiques par les cellules bactériennes adhérant au fond
du puits. Plus les billes seront piégées, moins elles se déplaceront dans le champ magnétique
et moins elles se regrouperont au centre du puits. L’immobilisation des billes est secondaire
soit au fait qu’elles sont «piégées» par des bactéries qui adhèrent au fond du puits, soit au fait
que les propriétés rhéologiques du milieu sont modifiées.
D’une façon expérimentale, les souches de SASM et SARM ont été cultivées en milieu BHI
et incubées toute la nuit à 35°C sous agitation orbitale à 150 tours/min afin d’obtenir une
culture bactérienne en phase stationnaire. Cette culture a été ajustée à une D.O.600 nm de 1,00 ±
0,05 et diluée au 1/250ème
dans du BHI stérile pour obtenir une suspension bactérienne initiale
(SBI) contenant environ 107 UFC/mL. Cette SBI a été mélangée avec un volume adéquat
d’une solution de toner (billes magnétiques) puis placée dans les puits de la microplaque.
Chaque condition était étudiée en triplicat. Deux puits de la barrette ont servi de puits
contrôle. Après chaque temps d’incubation à 35°C en atmosphère humide (0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4
h), tous les puits ont été couverts avec quelques gouttes du liquide de contraste et scannés
avec un lecteur de microplaques pour avoir une image Io. La microplaque a été ensuite placée
pendant 1 min sur un aimant (Block Test) et scannée de nouveau pour avoir une image I1. La
capacité d’adhésion de chaque souche était exprimée par un indice de formation du biofilm
(BFI) calculé par le logiciel BFC elements®
et était basée sur la comparaison de ces deux
images. Lorsque le BFI était ≥ 7, un spot correspondant aux microbilles attirées par l’aimant
était visible et indiquait l’absence d’adhésion ou de biofilm (1). Lorsque le BFI était ≤ 2, il y
avait absence de spot après magnétisation, signifiant ainsi le blocage des billes (2). Un biofilm
en formation se traduisait par une immobilisation partielle de billes (2 ≤ BFI ≤ 7) (3) (Figure
4.2).
64
Figure 4.2: Critères d’interprétation du BFRT®
(1) (2) (3)
D’après (Badel et al., 2008)
4.2.2.2. Etude de la formation de biofilm par la méthode in vitro de coloration au cristal
violet (CV)
Cette méthode est adaptée des techniques décrites par Stepanovic et al. (2000) et par Chavant
et al. (2007). La méthode de coloration au CV est basée sur une mesure colorimétrique du
cristal violet incorporé à la fois par les cellules attachées sur les puits et par la matrice
organique formant le biofilm (Djordjevic et al., 2002). Toutes les souches étudiées avec le
BFRT® ont été également testées par la méthode de coloration au cristal violet. Pour chaque
souche de S. aureus étudiée, 200 µL d’une SBI calibrée (107 UFC/mL), préparée dans du
milieu BHI, ont été placés dans les puits d’une microplaque. Les plaques ont été incubées
dans des conditions similaires à celles du BFRT®
. Le milieu BHI stérile a servi de contrôle.
Après chaque temps d’incubation, le milieu de culture a été éliminé et les puits ont été rincés
3 fois avec 200 µL d’eau distillée stérile pour éliminer les cellules non adhérées, puis séchés
pendant 45 min sous la hotte. Ensuite, 100 µL de cristal violet (CV) ont été ajoutés dans les
puits. Après 45 min, l’excès du cristal violet a été éliminé par 5 lavages successifs des puits
avec 300 µL d’eau distillée stérile. Le colorant incorporé par les cellules ayant adhéré ou
ayant formé un biofilm et par la matrice organique a été solubilisé avec 200 µL d’acide
acétique glacial 33% (v/v). L’absorbance a été mesurée à 540 nm avec un lecteur de
microplaques (Synergy HT, BioTek, Winooski, VT, Etats-Unis d’Amérique) et corrigée par
l’absorbance des puits contrôles.
65
4.2.2.3. Exploration de la composition de la matrice du biofilm de SASM et de SARM
par BFRT®
et CV: Effet de la protéinase K et du periodate de sodium sur la formation
et la déstructuration du biofilm
4.2.2.3.1. Effet du periodate de sodium (PI)
Les monosaccharides et les polysaccharides sont très sensibles à l’oxydation par le PI.
L’activité du PI sur l’adhésion et la formation de biofilms par les souches SASM et SARM a
été évaluée en triplicat par la méthode de BFRT® et par celle de coloration au CV comme
décrit ci-haut.
4.2.2.3.1.1. La méthode du BFRT®
Les puits ont été ensemencés par les cellules bactériennes au contact de billes magnétisables.
Les bactéries ont été incubées pendant 4 h (temps correspondant au blocage significatif,
complet ou partiel, des billes) soit en présence de 50 mM de tampon acétate de sodium (pH
4,5), soit en présence du même tampon plus du PI (10 mM concentration finale dans les
puits). Si des polysaccharides contribuent à la structure du biofilm, leur oxydation par le PI
affecte l’intégrité du biofilm et les particules magnétisables restent libres. On observe donc
l’apparition du spot après magnétisation.
4.2.2.3.1.2. La méthode de coloration au CV
4.2.2.3.1.2.1. Test en préventif
L’efficacité du PI à prévenir la formation d’un biofilm a été mesurée pendant une incubation
de 4 h sur les biofilms de SASM et SARM en formation. Pour ce faire, 180 µL de SBI ont été
mis en contact soit avec du tampon acétate de sodium/BHI, soit avec du même tampon/BHI
plus du PI (10 mM concentration finale dans les puits). Après l’incubation, les puits ont été
soigneusement rincés, séchés et colorés au CV suivant la technique standard de coloration au
CV. La densité optique a été lue à 540 nm comme indiqué ci-haut. L’inhibition (prévention)
de la formation du biofilm par le PI suite à l’oxydation des polysaccharides se traduit par une
diminution de la densité optique.
66
4.2.2.3.1.2.2. Test en curatif
La capacité du PI à déstructurer un biofilm préformé a été évaluée sur des biofilms formés
pendant 24 h. Après ce délai, le milieu de culture a été soigneusement retiré et les puits ont été
lavés 3 fois avec 200 µL d’eau distillée stérile avant incubation pendant 2 h des puits
contrôles avec 200 µL de BHI-tampon acétate de sodium ou avec 200 µL de 10 mM
(concentration finale dans les puits) de PI dans du milieu BHI pour les puits essais. Après ce
temps d’incubation, les puits ont été vidés et rincés de nouveau 2 fois avec 200 µL d’eau
distillée stérile. L’expérience a été poursuivie suivant la méthode classique de coloration au
CV décrite ci-dessus. La déstructuration du biofilm préformé consécutive à l’oxydation des
polysaccharides de la matrice du biofilm par le PI se traduit par une diminution de
l’absorbance mesurée à 540 nm.
4.2.2.3.2. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm
La capacité de la protéinase K (isolée de Tritirachium album) à dégrader un biofilm préformé
a été évaluée respectivement par la méthode de BFRT® et par celle de coloration au CV.
4.2.2.3.2.1. La méthode de BFRT®
La protéinase K a été testée sur des biofilms formés en présence du milieu BHI pendant 6 h,
temps correspondant au blocage complet des billes. Le traitement a consisté en l’application
de 50 µL de la solution de protéinase K (100 µg/mL) dans les puits (par-dessus le surnageant)
durant 4 h à la température de 35°C avant de tester ces biofilms avec le BFRT®. Tous les tests
ont été effectués en triplicat. Des témoins positifs sans la protéinase K ont été réalisés à
chaque expérience.
Si des protéines sont des constituants majeurs des biofilms, la protéinase K les dégrade, le
biofilm est détruit (curatif), les particules magnétisables sont libérées et on observe
l’apparition d’un spot après magnétisation. Par contre, si des protéines ne contribuent pas à la
formation du biofilm, la protéinase K n’a aucun effet sur le biofilm, les particules
magnétisables restent prisonnières du biofilm et il n’y a pas de spot formé au cours de la
magnétisation.
67
4.2.2.3.2.2. La méthode de coloration au CV
La capacité de la protéinase K à déstructurer des biofilms préformés a été évaluée sur les
biofilms de 24 h. Après 3 lavages successifs des puits, les puits contrôles ont été incubés
pendant 4 h à 35°C avec 200 µL du milieu BHI-tampon Tris HCl (pH 7,0) et les puits essais
avec 200 µL d’une solution de protéinase K 100 µg/mL. Après rinçage des puits, les
microplaques ont été traitées suivant la technique classique de la méthode de coloration au
cristal violet. La déstructuration des biofilms préformés se traduit par une diminution de la
densité optique suite à la dégradation des protéines de la matrice du biofilm.
4.2.2.3.3. Etude de l’effet du periodate de sodium et de la protéinase K sur la mobilité
des billes
Cette étude avait pour but de vérifier comment 10 mM de PI ou 100 µg/mL de protéinase K
peuvent affecter la mobilité des billes magnétiques. Nous avons à cet effet incubé la
protéinase K ou le PI avec les billes magnétiques pendant une période de 4 h, temps
correspondant à la formation des biofilms jeunes par les deux méthodes. Les expériences ont
été réalisées et analysées suivant la technique standard de BFRT®. Des contrôles positifs
constitués de billes magnétiques/milieu de culture ont été réalisés à chaque expérience.
4.2.2.4. Etude de l’activité de l’EGTA sur les biofilms de SASM et de SARM
4.2.2.4.1. Evaluation de l’activité de l’EGTA sur les biofilms en formation et préformés
La capacité de l’EGTA à inhiber la formation des biofilms a été testée par les deux méthodes
décrites précédemment. Différentes concentrations d’EGTA ont été testées: 0,1, 0,3, 1, 3 et 10
mM. Deux concentrations d’EGTA, soit 1 et 10 mM, ont été testées sur les biofilms de 24 h
par la méthode de coloration au cristal violet décrite ci-dessus.
4.2.2.4.2. Evaluation de la toxicité de l’EGTA sur les cellules eucaryotes par le test MTT
4.2.2.4.2.1. Culture des cellules
Les macrophages murins de la lignée cellulaire J.774.2 nous ont été fournis par Melle M. EL
OUAALITI de notre laboratoire. Ils ont été cultivés dans des fioles de culture dans le milieu
DMEM/F-12 additionné de 10% de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur, 2 mM de L-
glutamine et 100 µg/mL de streptomycine (Gibco, Groningen, Hollande). Les fioles de culture
68
ont été incubées à 37°C en atmosphère de 5% de CO2. La croissance des cellules en
suspension a été évaluée par une observation microscopique. Les cellules formant une
monocouche ont été ensuite décrochées puis centrifugées à 3000 tours/min et le culot obtenu a
été remis en suspension dans 2 mL de milieu DMEM/F-12. Après comptage de cellules dans
une cellule hématimètre, un volume adéquat de milieu DMEM/F-12 a été de nouveau ajouté
pour diluer les cellules. Deux cents µL de cette suspension ont été placés dans les puits d’une
microplaque de 96 puits, puis incubés une nuit pour atteindre une densité d’environ 106
cellules par puits.
4.2.2.4.2.2. Viabilité cellulaire
L’effet de l’EGTA sur la viabilité de cellules eucaryotes a été évalué en mesurant la capacité
de macrophages murins à réduire le MTT. Le principe du test est basé sur la capacité de
cellules métaboliquement actives à réduire le sel de tétrazolium MTT (bromure de 3 (4,5
dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium) en un précipité formazan suite à l’action de
la succinate déshydrogénase mitochondriale (Berridge et Tan, 1993). La couleur du milieu
passe du jaune au violacé. L’intensité de la coloration est proportionnelle à l’activité de
l’enzyme mitochondriale et au nombre de cellules vivantes présentes lors du test.
Après l’incubation d’une nuit, le milieu de culture a été éliminé puis remplacé par le tampon
HEPES-NaOH 10 mM contenant 150 mM de NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1mM de
CaCl2, 13 mM de glucose et différentes concentrations d’EGTA (1, 5, 10, 20, 50 et 100 mM).
Les cellules ont été ensuite incubées pendant 20 min et le contenu des puits a été aspiré avant
l’ajout de 100 µL de MTT (1 mg/mL de milieu). Après 3-4 h d’incubation, la microplaque a
été centrifugée pendant 10 min à 1300 tours/min (25°C), puis 100 µL de dimethylsulfoxide
(DMSO) ont été ajoutés en vue de dissoudre le précipité formé. L’absorbance a été mesurée à
540 nm au lecteur de plaques. Chaque condition a été testée en triplicat.
69
4.2.2.5. Détection de gènes codant pour IcaA et pour les protéines de surface impliquées
dans la formation des biofilms
4.2.2.5.1. PCR de fragments des gènes sasC, sasG, fnbA, fnbB, clfA, clfB et icaA
Les réactions de PCR ont été effectuées en vue de détecter les gènes codant pour la protéine
IcaA et pour les protéines de surface des parois de différentes souches cliniques et de
référence SASM et SARM étudiées.
Les différents gènes ci-dessous ont été recherchés:
a. le gène sasC codant pour la protéine de surface C de S. aureus,
b. le gène sasG codant pour la protéine de surface G de S. aureus,
c. les gènes fnbA et fnbB codant pour les protéines de liaison à la fibronectine,
d. le gène clfA et clfB codant pour les protéines de liaison au fibrinogène,
e. Le gène icaA codant pour la protéine IcaA.
Après extraction de l’ADN par la technique rapportée par Martín-Lopez et al. (2004), les
réactions de PCR ont été réalisées avec les amorces sens et antisens reprises dans le Tableau
4.5. Chaque réaction de PCR, en fonction du gène recherché, a été effectuée dans un volume
final de 50 µL. Chaque mélange réactionnel comprenait soit 0,5 µM de chaque amorce sens et
antisens pour les gènes sasC, fnbA et fnbB, 2 µM de chaque amorce sens et antisens pour le
gène sasG, 0,4 µM de chaque amorce sens et antisens pour les gènes clfA ou clfB ou de 0,8
µM de chaque amorce sens et antisens pour le gène icaA. A ces amorces ont été ajoutés 5 µL
de l’extrait d’ADN génomique, 0,2 mM de chacun des 4 dNTPs, 1,25 U de Taq ADN
polymérase, 3,5 mM de chlorure de magnésium, du tampon réactionnel (67 mM Tris-HCl pH
8,8), 16 mM (NH4)2SO4) et de l’eau sans nucléase.
Les séquences ont été amplifiées dans un thermocycler (Bio-Rad icycler) en utilisant le
programme suivant: dénaturation initiale à 94°C pendant 3 min, 30 cycles de PCR selon le
protocole repris dans le Tableau 4.6 pour la dénaturation, l’hybridation, et l’extension des
amorces respectivement, et enfin une extension finale de 10 min à 72°C. Les produits
d’amplification ont été séparés par électrophorèse soit sur gel d’agarose à 1% pour icaA et
clfA, soit sur gel d’agarose à 2% pour fnbA, fnbB, sasC, sasG et clfB dans du tampon TBE à
70
60 V pendant 60 min. Les gels ont ensuite été traités et analysés selon le protocole décrit au
point 4.2.1.2.3.2.
Tableau 4.5: Les amorces utilisées dans les PCR
Gène Gen
Bank Amorces Fragment Références
sasC 2859120 S
AS
5'- GCAACGAATCAAGCATTGG-
5'- AGACAGCACTTCGTTAGG- 489 pb
Schroeder et al.,
2009
sasG 1193224 S
AS
5'- GGGAACTCAACAAGAGGCAG-
5'- CAGAACGAGCTTTTCTAACC- 311 pb Roche et al., 2003
fnbA 3913735 S
AS
5'- GATACAAACCCAGGTGGTGG-
5'- TGTGCTTGACCATGCTCTTC- 191 pb
Mongodin et al.,
2002
fnbB 3238062 S
AS
5'- GGAGCGGCCTCAGTATTCTT-
5'- AGTTGATGTCGCGCTGTATG- 201 pb
Mongodin et al.,
2002
clfA 5330438 S
AS
5- CCGGATCCGTAGCTGCAGATGCACC-3
5- GCTCTAGATCACTCATCAGGTTGTTCAGG- 1000 pb
Zmantar et al.,
2008
clfB 5331889
S
AS
5- ACATCAGTAAATAGTAGGGGGCAAC-
5-TTCGCACTGTTTGTGTGTTTGCAC- 205 pb
Tristan et al.,
2003
icaA
NC
017340
S
AS
5'-ACACTTGCTGGCGCAGTCAA
5'-TCTGGAACCAACATCCAACA 188 pb Zmantar et al.,
2008
icaA AF
086783
S
AS
5’-AAACTTGGTGCGGTTACAGG
5’-TCTGGGCTTGACCATGTTG 752 pb
Martin-Lopez et
al, 2004
S: sens; AS: antisens; pb: paire de bases
Tableau 4.6: Conditions des PCR
sasC sasG fnbA fnbB clfA clfB icaA
Dénaturation
Temps (sec) 60 60 30 30 60 60 30
Temp. (°C) 94 94 94 94 94 94 94
Hybridation
Temps (sec) 30 30 30 30 60 60 30
Temp. (°C) 50 50 55 55 55 55 55
Elongation
Temps (sec) 60 60 30 30 60 60 45
Temp. (°C) 72 72 72 72 72 72 72
Nombre de cycles 30 30 30 30 30 30 30
71
5. RESULTATS
5.1. Sensibilité aux antibiotiques
Un antibiogramme a été réalisé par la méthode de diffusion en milieu gélosé de Mueller
Hinton sur toutes les souches de S. aureus collectées à Kinshasa. Les résultats de la sensibilité
aux antibiotiques des souches cliniques et de référence sont présentés dans le Tableau 5.1
Tableau 5.1: Sensibilité des souches de S. aureus aux antibiotiques
Souches Charges des disques et diamètres mesurés
AK
30 µg
AML
30 µg
KZ
30 µg
CIP
5 µg
CAZ
30 µg
CN
10 µg
OX
1 µg
VA
30 µg
SARM
011/LP 15:R 14:R 14:R 25:S 14:R 12:R 10:R 20:S
027/U 16:R 14:R 14:R 25:S 14:R 12:R 10:R 20:S
028/FV 14:R 14:R 15:R 25:S 14:R 12:R 10:R 18:S
007/FV 14:R 14:R 14:R 12:R 14:R 12:R 10:R 19:S
ATCC 33591 14:R 14:R 14:R 25:S 14:R 26:S 10:R 20:S
SASM1
020/LP 28: S 20:R 28:S 30:S 20:S 29:S 25:S 21:S
008/U 25:S 18:R 30:S 30:S 23:S 29:S 23:S 20:S
022/U 26:S 20:R 28:S 30:S 20:S 29:S 24:S 20:S
018/FV 22:S 14:R 36:S 33:S 20:S 35:S 24:S 22:S
ATCC 25923 28:S 30:S 34:S 30:S 24:S 30:S 30:S 20:S
SASM2
5668/S 26: S 18: R 26: S 30: S 26: S 30: S 24: S 20: S
5741/S 24: S 14: R 30: S 28: S 24: S 28: S 26: S 22: S
1532/P 30: S 14: R 36: S 34: S 22: S 36: S 26: S 24: S
1620/P 28: S 14: R 30: S 29: S 25: S 34: S 28: S 22: S
AK: Amikacine; AML: Amoxicilline; KZ: Céfazoline; CIP: Ciprofloxacine; CAZ: Ceftazidime; CN:
Gentamicine; OX: Oxacilline; VA: Vancomycine; S: Sensible; R: Résistant.
La sensibilité des souches cliniques de S. aureus pour la méticilline était la suivante: des 12
souches de S. aureus, 8 étaient sensibles et 4 étaient résistantes à la méticilline. Les données
de souches SARM montrent que toutes les souches étaient résistantes à l’amikacine,
l’amoxicilline, la céfazoline, la ceftazidime et la gentamicine et sensibles à la vancomycine.
Trois souches sur 4 étaient sensibles à la ciprofloxacine.
Chez les souches sensibles à la méticilline, les résultats montrent que toutes les souches
étaient sensibles à l’amikacine, la gentamicine, la cefazoline, la ciprofloxacine, la ceftazidime
et la vancomycine et résistantes à l’amoxicilline.
La souche de référence SASM ATCC 25923 était sensible à tous les antibiotiques étudiés. Par
contre, la souche de référence SARM ATCC 33591 était sensible à la vancomycine, la
72
ciprofloxacine et la gentamicine et résistante à l’amikacine, l’amoxicilline, la cefazoline et la
ceftazidime.
5.2. Gènes codant pour la résistance à la méticilline et à la mupirocine
L’ADN de chaque souche de S. aureus étudiée a été analysé par PCR pour la mise en
évidence de 3 gènes sélectionnés codant pour la résistance aux antibiotiques. Le gène gap a
servi de référence dans la réaction PCR. Les résultats de cette étude sont présentés dans le
Tableau 5 .2 et dans les Figures 5. 1 à 5.3.
Tableau 5.2: Gènes codant pour la résistance aux antibiotiques
Souches Gènes
mecA femB ileS-2 gap
SARM
007/FV + + + +
011/LP + + - +
027/U + + - +
028/FV + + - +
ATCC 33591 + + - +
SASM1
020/LP - - - ND
008/LP - - - ND
022/U - - - ND
018/FV - - - ND
SASM2
5668/S - + - +
5741/S - + - +
1532/P - + - +
1620/P - + - +
ATCC 25923 - + - +
ND: non déterminé
La technique de PCR a confirmé dans le génome de toutes les souches de SARM et non dans
les souches SASM, la présence d’un fragment du gène mecA (310 pb) qui confère la
résistance à la méticilline. Un fragment du gène femB (651 pb), un gène codant pour la
protéine qui influence le niveau de résistance de S. aureus à la méticilline, a été amplifié dans
l’ADN provenant de toutes les souches cliniques et de référence de SARM et de SASM2, à
l’exception des souches SASM1. Un fragment du gène ileS-2 (458 pb) codant pour la
résistance à la mupirocine n’a été détecté que dans la souche de SARM 007/FV.
73
Figure 5.1: Amplification par PCR de fragments de gènes mecA et femB
1. Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène femB dans les souches SARM ou les
souches SASM2. SARM: Ligne 1: 007/FV; 2: 011/LP; 3: 027/U; 4: 028/FV; 5: ST de 100 pb DNA ladder plus.
SASM2: Ligne 6: 5668/S; 7: 5741/S; 8: 1532/P; 9: 1620/P.
2. Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène mecA dans les souches SARM ou les
souches SASM2.SARM: Ligne 11: 007/FV; 12: 011/LP; 13: 027/U; 14: 028/FV; 15: ST de 100 pb DNA ladder
plus. SASM2: Ligne 16: 5668/S; 17: 5741/S; 18: 1532/P; 19: 1620/P.
74
Figure 5. 2: Amplification par PCR d’un fragment du gène mupR
Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène mupR dans les souches SARM ou dans les
souches SASM2. SARM: Ligne 1: 007/FV; 2: 011/LP; 3: 027/U; 4: 028/FV; SASM2: Ligne 6: 5668/S; 7:
5741/S; 8: 1532/P; 9: 1620/P; 10: ST de 100 pb DNA ladder plus.
Figure 5. 3: Amplification par PCR d’un fragment du gène gap
Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène gap dans les souches SARM ou dans les
souches SASM2. SARM: Ligne 1: 007/FV; 2: 011/LP; 3: 027/U; 4: 028/FV; 5: ST de 100 pb DNA ladder plus.
SASM2: Ligne 6: 5668/S; 7: 5741/S; 8: 1532/P; 9: 1620/P.
75
5.3. spa typing
Le tableau 5.3 ci-dessous reprend les résultats de l’analyse par PCR des répétitions présentes
dans la séquence codant pour la protéine A de S. aureus dans lequel sont également introduits
les résultats de PCR des fragments de gènes codant pour une nucléase et l’ARN 16S de S.
aureus, ainsi que les résultats de la sensibilité des souches à la céfoxitine.
Tableau 5.3: Types spa des souches SARM et SASM2
Souches Gènes spa typing
Céfoxitine mecA nuc ARNr
16S
Profil spa
Type spa
SARM
007/FV R + + + 26-23-17-34-17-20-17-12-17-16 t002
011/LP R + + + 07-23-12-34-34-33-34 t044
027/U R + + + 11-19-21-12-21-17-34-24-34-22-25 t051
028/FV S + + + 08-39-34-17-34-16-34 t2265
SASM
5668/S S - + + 07-56-12-17-16-16-33-31-57-12 t355
5741/S S - + + 04-16-34-12-34-12 t939
1532/P - - + + - NT
1620/P S - + + 15-12-17-17-16-02-16-02-25-17 t10715
NT: Non typable
Les résultats présentés dans ce tableau montrent 7 types spa différents, dont 4 pour les
souches SARM et 3 pour les souches SASM2. La souche 1532/P était non typable. Le profil
spa t10715 n’a jamais été rencontré à travers le monde contrairement aux autres types spa
identifiés dans cette étude.
La souche 028/FV positive pour le gène mecA est hétéro-résistante à la méticilline. Le gène
ARNr 16S a été amplifié chez toutes les souches confirmant ainsi l’appartenance de ces
dernières au genre Staphylococcus. Toutes les souches sont positives pour nuc confirmant leur
appartenance à l’espèce S. aureus.
76
5.4. Croissance bactérienne
La vitesse de croissance des bactéries a été évaluée en mesurant le temps de doublement des
différentes souches de S. aureus (Tableau 5.4). Les Figures 5.4 et 5.5 reprennent à titre
illustratif les courbes de croissance des souches SARM.
Tableau 5.4: Temps de doublement (TD) et hydrophobicité des souches de S. aureus
Souches TD (min) SAT
(Sulfate d’ammonium)
SARM
007/FV 33,2 ± 1,9 0,2 M
011/LP 35,8 ± 1,7 1,2 M
027/U 33,6 ± 0,7 1-1,2 M
028/FV 38,2 ± 1,9 1,0 M
ATCC 33591 42,1 ± 1,1 0,8 M
SASM1
020/LP 32,1 ± 1,0 1,0 M
008/U 32,0 ± 0,2 1,0 M
022/U 33,6 ± 0,1 1,2 M
018/FV 67,3 ± 7,8 1,6 M
SASM2
5668/S 38,3± 0,5 ND
5741/S 40,2 ± 0,6 ND
1532/P 42,5 ± 0,7 ND
1620/P 40,5 ± 0,7 ND
ATCC 25923 28,8 ± 0,5 1,2 M
ND: Non déterminé
Pour chaque analyse, le coefficient de corrélation était supérieur à 0,98. L’analyse de ces
résultats montre que le nombre des cellules bactériennes a doublé dans un intervalle de temps
compris entre 30-45 min pour toutes les souches, à l’exception de la souche MSSA 018/FV
dont le temps de doublement était significativement plus élevé (environ 60 min).
77
Figure 5.4: Courbe de croissance des souches SASM2
0 2 4 6 80.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.05668/S
5741/S
1620/P
1532/P
ATCC 25923
Temps (heures)
Un
ités
d'
ab
sorb
an
ce
60
0 n
m
Les cellules en phase stationnaire ont été inoculées dans 50 mL de BHI frais. Cent µL de cette suspension
bactérienne ont été transférés dans une microplaque stérile à 96 puits et incubés pendant 8 h sous agitation
constante dans un lecteur à microplaques. Les puits ont été lus toutes les 5 min à une longueur d’onde de 600
nm. Les données collectées entre 2 et 4 h ont été ajustées avec une équation exponentielle et le temps de
doublement a été calculé en utilisant le logiciel GraphPad.
Figure 5.5: Courbe de croissance des souches SARM
0 2 4 6 80.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0007/FV
011/LP
028/U
027/FV
ATCC 33591
Temps (heures)
Un
ités
d'
ab
sorb
an
ce
60
0 n
m
Les cellules en phase stationnaire ont été inoculées dans 50 mL de BHI frais. Cent µL de cette suspension
bactérienne ont été transférés dans une microplaque stérile à 96 puits et incubés pendant 8 h sous agitation
constante dans un lecteur à microplaques. Les puits ont été lus toutes les 5 min à une longueur d’onde de 600
nm. Les données collectées entre 2 et 4 h ont été ajustées avec une équation exponentielle et le temps de
doublement a été calculé en utilisant le logiciel GraphPad.
78
5.5. Caractérisation des propriétés de surface des souches bactériennes
L’hydrophobicité des souches cliniques et de référence de S. aureus a été dans un premier
temps évaluée en déterminant la plus faible concentration de sulfate d’ammonium capable
d’induire une agrégation des cellules bactériennes (SAT test). Les résultats repris dans le
Tableau 5.4 ci-dessus montrent que toutes les souches ont agrégé avec des concentrations en
sel allant de 0,8 à 1,2 M, à l’exception de la souche SASM 018/FV et de la souche SARM
007/FV qui paraissaient respectivement moins hydrophobe (1,6 M sulfate d’ammonium) et
plus hydrophobe (0,2 M sulfate d’ammonium) selon les critères définis par Krepsky et al.
(2003).
Le test MATS a été ensuite utilisé pour déterminer à la fois l’hydrophobicité des bactéries et
les propriétés acide-base de Lewis de leur membrane. Les résultats obtenus sont présentés
dans les Figures 5.6 à 5.8 et dans le Tableau 5.5.
Figure 5.6: Affinité des souches SARM pour les solvants
011/LP 027/U 028/FV 007/FV ATCC 335910
25
50
75
100
125
Chloroforme
Hexadecane Hexane
Acétate d'éthyle
n = 3
Souches
%
de b
acté
ries
extr
ait
es
pa
r le
so
lva
nt
L’affinité des souches SARM pour le chloroforme, l’hexadecane, l’acétate d’éthyle ou pour l’hexane. Les
résultats sont exprimés en pourcentage des bactéries transférées de la phase aqueuse à la phase organique. Les
valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 3 expériences.
79
Figure 5.7: Affinité des souches SASM1 pour les solvants
020/LP 008/U 022/U 018/FV ATCC 259230
25
50
75
100
125
Chloroforme
Hexadecane
Acétate d'éthyle
Hexane
n = 3
Souches
% d
e b
act
érie
s ex
trait
es p
ar
le s
olv
an
t
L’affinité des souches SASM1 pour le chloroforme, l’hexadecane, l’acétate d’éthyle ou pour l’hexane. Les
résultats sont exprimés en pourcentage des bactéries transférées de la phase aqueuse à la phase organique. Les
valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 3 expériences.
Figure 5.8: Affinité des souches SASM2 pour les solvants
ATCC 25923 5668/S 5741/S 1532/P 1620/P0
25
50
75
100
125
Chloroforme
Hexadecane
Acétate d'éthyle
Hexane
n = 3
Souches
%
de b
acté
rie
s ex
tra
ites
pa
r l
e s
olv
an
t
L’affinité des souches SASM2 pour le chloroforme, l’hexadecane, l’acétate d’éthyle ou pour l’hexane. Les
résultats sont exprimés en pourcentage des bactéries transférées de la phase aqueuse à la phase organique. Les
valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 3 expériences.
80
Tableau 5.5: Pourcentage d’adhésion aux solvants
SASM SARM
% HEXADECANE 90,1 ± 2,0 82,07 ± 0,9
% CHLOROFORME 90,01 ± 2,3 82,1 ± 2,2
% HEXANE 69,6 ± 6,1 16,2 ± 0,5
% ACETATE D'ETHYLE 51,4 ± 9,7 47,6 ± 0,3
Comme le montrent les Figures 5.6 à 5.8 et le Tableau 5.5, la valeur moyenne d’adhésion de
toutes les souches SASM à l’hexadecane est de 90%, alors que celle de souches SARM est
d’environ 80%. Toutes les souches ont une surface très hydrophobe selon les critères définis
par Krepsky et al. (2003), mais par rapport à l’adhésion à l’hexane, les souches SARM sont
moins hydrophobes que les souches SASM.
Concernant le caractère acide-base de Lewis des membranes, nous avons noté une meilleure
extraction de toutes les souches SASM de la phase aqueuse par le chloroforme que les
souches SARM. Mais l’indice de polarité est égal à l’indice d’hydrophobicité. Par contre, le
pourcentage d’extraction des souches SARM de la phase aqueuse par l’acétate d’éthyle est
plus élevé que celui observé avec son contrôle, le n-hexane. Au regard des résultats obtenus,
les membranes de souches SASM sont complètement dépourvues du caractère accepteur
d’électrons, alors que celles de SARM ont un léger caractère acide, accepteur d’électrons.
81
5.6. Formation du biofilm
Dans les premières expériences, 5 souches de S. aureus résistantes et 5 souches sensibles à la
méticilline (SARM et SASM1 respectivement) ont été étudiées par le BFRT® et par le CV en
vue d’évaluer leur capacité à adhérer sur une surface et à former le biofilm.
5.6.1. Adhérence bactérienne sur une surface par le BFRT®
La méthode BFRT® est basée sur l’immobilisation des billes magnétiques par les bactéries
adhérentes au fond des puits. Les résultats de l’adhésion de souches SARM et SASM1 sont
présentés dans les Figures 5.9 et 5.10.
Figure 5.9: Adhérence à une surface par les souches SASM1
0 1 2 3 40
4
8
12
16
022/U
018/FV
020/LP
ATCC 25923
008/U
Temps (heures)
BF
I (u
nit
és
arb
itra
ires)
Les souches SASM1 mélangées aux billes magnétiques ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les
puits d’une microplaque à 96 puits. L’immobilisation des billes a été mesurée après 1, 2, 3, ou 4 h avec le
Biofilm Ring Test® et les résultats ont été exprimés en BFI. Les résultats sont les moyennes ± s.e.m de 6 à 18
expériences.
82
Figure 5.10: Adhérence à une surface par les souches SARM
0 1 2 3 40
5
10
15
20
007/FV
011/LP
028/FV
ATCC 33591
027/U
Temps (heures)
BF
I (u
nit
és
arb
itra
ires)
Les souches SARM mélangées aux billes magnétiques ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les
puits d’une microplaque à 96 puits. L’immobilisation des billes a été mesurée après 1, 2, 3, ou 4 h avec le
Biofilm Ring Test® et les résultats ont été exprimés en BFI. Les résultats sont les moyennes ± s.e.m de 6 à 15
expériences.
Comme le montrent les Figures 5.9 et 5.10, l’adhésion des souches au fond des puits de la
microplaque était variable. Huit souches avaient complètement immobilisé les billes
magnétiques après 3 h d’incubation. Pour l’ensemble de ces 8 souches nous avons observé
une chute de l’indice de formation du biofilm (BFI) de 15 ± 0,4 (n = 63) à 2,3 ± 0,1 (n = 72).
L’adhésion de la souche SASM1 018/FV et celle de la souche SARM 007/FV étaient très
lentes. Après 4 h d’incubation, leur BFI respectif était de 5 ± 0,6 (Figure 5.9) et 8 ± 1 (n = 15)
(Figure 5.10).
83
5.6.2. Etude de la formation du biofilm par la méthode de coloration au cristal violet
La méthode in vitro de coloration au cristal violet a été utilisée pour évaluer la capacité des
souches à former un biofilm. Les résultats de SARM et SASM1 sont présentés dans les
Figures 5.11 et 5.12 ci-dessous.
Figure 5.11: Formation des biofilms par les souches SASM1
0 1 2 3 40.00
0.05
0.10
0.15
0.20
018/FV
22/U
008/U
ATCC 25923
020/LP
Temps (heures)
Ab
sorb
an
ce5
40
nm
Les souches SASM1 ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits.
La formation du biofilm a été mesurée après 1, 2, 3 ou 4 h en utilisant la méthode de coloration au cristal violet.
Les résultats ont été exprimés en absorbance mesurée à 540 nm du colorant incorporé par les cellules formant un
biofilm et par les composants de la matrice. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 6 à 9 expériences.
84
Figure 5.12: Formation des biofilms par les souches SARM
0 1 2 3 40.00
0.05
0.10
0.15
0.20
007/FV
011/LP
028/FV
ATCC33591
027/U
Temps (heures)
Ab
sorb
an
ce
54
0 n
m
Les souches SARM ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits.
La formation du biofilm a été mesurée après 1, 2, 3 ou 4 h en utilisant la méthode de coloration au cristal violet.
Les résultats ont été exprimés en absorbance mesurée à 540 nm du colorant incorporé par les cellules formant un
biofilm et par les composants de la matrice. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 6 à 9 expériences.
Une augmentation significative de l’absorbance a été observée après 3 h d’incubation pour
toutes les souches, à l’exception de la souche de référence ATCC 25923. En accord avec les
résultats obtenus par le BFRT®, la souche SARM 007/FV n’a formé un biofilm significatif
qu’après 4 h d’incubation (Figure 5.11).
Dans une seconde étude, la capacité d’adhésion à une surface et de formation de biofilm de 4
nouvelles souches cliniques de S. aureus sensibles à la méticilline (SASM2) a été explorée par
BFRT®
et par CV (Figures 5.13 et 5.14).
85
Figure 5. 13: Adhérence à une surface par les souches SASM2
0 1 2 3 40
5
10
15
20
5668/S
1532/P
1620/P
5741/S
ATCC 25923
Temps (Heures)
BF
I (u
nit
és
arb
itrair
es)
Les souches SASM2 mélangées aux billes magnétiques ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les
puits d’une microplaque à 96 puits. L’immobilisation des billes a été mesurée après 1, 2, 3, ou 4 h avec le
Biofilm Ring Test® et les résultats ont été exprimés en BFI. Les résultats sont les moyennes ± s.e.m de 5 à 7
expériences.
Figure 5.14: Formation des biofilms par les souches SASM2
0 1 2 3 40.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
1620/P
5741/S
ATCC 25923
5668/S
1532/P
Temps (heures)
Ab
sorb
an
ce540 n
m
Les souches SASM2 ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits.
La formation du biofilm a été mesurée après 1, 2, 3 ou 4 h en utilisant la méthode de coloration au cristal violet.
Les résultats ont été exprimés en absorbance mesurée à 540 nm du colorant incorporé par les cellules formant un
biofilm et par les composants de la matrice. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 8 expériences.
86
Les résultats présentés dans la Figure 5.13 montrent que 2 souches cliniques isolées des plaies
cutanées (1532/P et 1620/P) immobilisent les billes magnétiques au bout de 2 h d’incubation à
l’instar de la souche de référence ATCC 25923. Leur BFI est passé rapidement de 17,01 ± 0,1
à 2,4 ± 0,3. Par contre, la cinétique d’immobilisation des billes magnétiques par les souches
5668/S et 5741/S isolées des échantillons de sang était lente (BFI de 17,6 ± 0,2 à 9,3 ± 1 après
2 h d’incubation). Au bout de 4 h, leur BFI était de 1,4 ± 0,1 (Figure 5.13).
Par la méthode de coloration au CV, un biofilm significatif n’a été formé qu’au bout de 4 h
d’incubation pour toutes les souches (Figure 5.14).
5.6.3. Composition de la matrice du biofilm
5.6.3.1. Recherche par PCR d’un fragment de icaA
La molécule principalement responsable de l’adhésion intercellulaire chez la majorité de
staphylocoques est le PIA (polysaccharide intercellular adhesion), aussi appelé poly-N-
acétylglucosamine (PGNA). Cette molécule est synthétisée par les enzymes codées par
l’opéron icaADBC. Nous avons recherché la présence du gène icaA, un gène qui code pour
une N-acétylglucosamine transférase indispensable à la synthèse de PIA.
Figure 5.15: Amplification par PCR d’un fragment du gène icaA
Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène icaA dans les souches SARM ou les
souches SASM2. SARM: Ligne 1: 007/FV; 2: 011/LP; 3: 027/U; 4: 028/FV; 5: ATCC 33591; 6: ST de 100 pb
DNA ladder plus. SASM2: Ligne 7: 5668/S; 8: 5741/S; 9: 1532/P; 10: 1620/P; 11: ATCC 25923.
Ces résultats ont été repris dans le Tableau 5.6 dans lequel nous avons introduit les résultats
obtenus avec les souches SASM1. Comme indiqué dans ce tableau, les souches de référence
87
ainsi que toutes les souches SARM et SASM2 possédaient le produit d’amplification d’un
fragment du gène icaA (752 pb). Par contre, toutes les souches cliniques SASM1 étaient
négatives pour icaA (voir annexe n°1).
Tableau 5.6: Fragment du gène icaA de l’opéron icaADBC
Souches Gènes
icaA gap
SARM
007/FV + +
011/LP + +
027/U + +
028/FV + +
ATCC 33591 + +
SASM1
020/LP - ND
008/U - ND
022/U - ND
018/FV - ND
SASM2
5668/S + +
5741/S + +
1532/P + +
1620/P + + ND: Non déterminé
88
5.6.3.2. Effet du periodate de sodium (PI) sur l’adhésion, la formation et sur la
déstructuration du biofilm
Les différentes expériences ont été menées sur 10 souches de S. aureus dont 5 SARM et 5
SASM1.
5.6.3.2.1. Effet du PI sur l’adhésion par le BFRT®
Nous avons commencé par évaluer l’influence du PI à la concentration de 10 mM sur
l’immobilisation des billes magnétiques en l’absence des bactéries.
Tableau 5.7: Influence du PI sur l’immobilisation de billes magnétiques
BHI + Billes PI 10 mM + Billes
BFI 16,28 ± 0,07 14,15 ± 0,5
Les résultats présentés dans le Tableau 5.7 montrent que le PI n’a pas entraîné une chute
significative de BFI. Ce dernier est passé respectivement de 16,2 ± 0,07 à 14,1 ± 0,5 (n = 4)
en l’absence et en présence du PI après 4 h d’incubation.
Après ce contrôle, l’activité du PI a été testée sur l’adhésion telle que l’illustrent les Figures
5.16 et 5.17.
89
Figure 5.16: Effet de PI sur l’adhésion de souches SASM1 à une surface
020/LP 008/U 022/U 018/FV ATCC 259330
5
10
15Contrôle
Periodate
n=
5 5 5 5
66 6
6
****
**
**
7
4**
Souches
BF
I (u
nit
és a
rbit
rair
es)
Les souches SASM1 mélangées aux billes magnétiques en milieu BHI ont été incubées pendant 4 h en
atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque soit en présence de 50 mM de tampon acétate de
sodium (pH 4,5), soit en présence de 50 mM de tampon acétate de sodium plus 10 mM de PI (concentration
finale). Après incubation, la migration de billes dans un champ magnétique a été évaluée et les résultats sont
exprimés en BFI. Les résultats sont les moyennes ± s.e.m de 4 à 7 expériences. Les résultats ont été analysés par
le test non-paramétrique de Mann-Whitney. ** P < 0,01.
Pour les 4 souches cliniques SASM1, nous avons noté une augmentation significative de BFI
qui est passé en moyenne de 1,4 ± 0,03 (n = 20) en absence du PI à 9,2 ± 0,2 (n = 24) en
présence de 10 mM de PI. Une exception a été cependant observée pour la souche ATCC
25923 qui était moins sensible au PI (BFI: 3,2 ± 0,3, n = 4, P < 0,005) en comparaison aux
souches cliniques (Figure 5.16).
Le PI a également bloqué l’immobilisation des billes par les 4 souches SARM dans les puits
de la microplaque (Figure 5.17).
90
Figure 5.17: Effet du PI sur l’adhésion de souches SARM à une surface
011/LP 027/U 028/FV 007/FV ATCC 335910.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Contrôle
Periodate
n=
5 55
5
6 6
64
** **
* **
6
6
**
Souches
BF
I (u
nit
és
arb
itra
ires)
Les souches SARM mélangées aux billes magnétiques en milieu BHI ont été incubées pendant 4 h en
atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque soit en présence de 50 mM de tampon acétate de
sodium (pH 4,5), soit en présence de 50 mM de tampon acétate de sodium plus 10 mM de PI (concentration
finale). Après incubation, la migration de billes dans un champ magnétique a été évaluée et les résultats ont été
exprimés en BFI. Les résultats sont les moyennes ± s.e.m de 4 à 6 expériences. Les résultats ont été analysés par
le test non-paramétrique de Mann-Whitney. ** P < 0,01; * P < 0.05
Comme le montre la Figure 5.17, le BFI est passé en moyenne de 1,8 ± 0,1 (n = 20) en
absence du PI à 5,5 ± 0,2 (n = 22) en présence de 10 mM de PI. La souche de référence
ATCC 33591 était plus sensible au PI par rapport aux souches cliniques (BFI: 8,9 ± 0,7, n = 6,
P < 0,001). Par comparaison aux souches SASM1, les souches SARM étaient moins sensibles
au PI (P < 0,0001).
91
5.6.3.2.2. Effet du PI sur la formation du biofilm par la méthode de coloration au cristal
violet
Les résultats de l’activité du PI sur la formation du biofilm sont présentés dans les Figures
5.18 et 5.19.
Figure 5.18: Effet du PI sur la formation des biofilms par les souches SASM1
020/LP 008/U 022/U 018/FV ATCC 259230.0
0.5
1.0
1.5
Contrôle
Periodate
n=
99
9
9
15 15 15 15
*** *** *** ***
6
6
**
Souches
Un
ités
d'a
bso
rb
an
ce
54
0 n
m
Les souches SASM1 ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits.
La formation du biofilm a été mesurée pendant 4 h dans le milieu BHI-tampon acétate de sodium ou en présence
de BHI-tampon acétate de sodium plus 10 mM de PI (concentration finale) en utilisant la méthode de coloration
au cristal violet. Les résultats sont exprimés en absorbance mesurée à 540 nm du colorant incorporé par les
cellules formant un biofilm et par les composants de la matrice. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 6 à 15
expériences. Les résultats ont été analysés par le test non-paramétrique de Mann-Whitney. *** P < 0,005; ** P <
0,01.
92
Figure 5.19: Effet du PI sur la formation des biofilms par les souches SARM
011/LP 027/U 028/FV 007/FV ATCC 335910.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Contrôle
Periodate
n=
99
9
9
15 15 15 15
*** *** *** ***
6
6
***
Souches
Un
ités
d'a
bso
rb
an
ce
54
0 n
m
Les souches SARM ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits.
La formation du biofilm a été mesurée pendant 4 h dans le milieu BHI-tampon acétate de sodium ou en présence
de BHI-tampon acétate de sodium plus 10 mM de PI (concentration finale) en utilisant la méthode de coloration
au cristal violet. Les résultats sont exprimés en absorbance mesurée à 540 nm du colorant incorporé par les
cellules formant un biofilm et par les composants de la matrice. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 6 à 15
expériences. Les résultats ont été analysés par le test non-paramétrique de Mann-Whitney. *** P < 0,005.
Toutes les souches de SASM1 étaient très sensibles au PI. Cette sensibilité s’est traduite par
une chute de l’absorbance mesurée en l’absence du PI (0,54 ± 0,007, n = 36) comme l’illustre
la Figure 5.18. A la concentration de 10 mM, le PI avait également une activité inhibitrice sur
la formation des biofilms de SARM (Figure 5.19). L’absorbance du colorant incorporé par les
cellules formant un biofilm et de la matrice polymérique extracellulaire a chuté en moyenne
de 0,21 ± 0,009 (n = 42) à 0,07 ± 0,002 (n = 66).
93
5.6.3.2.3. Etude par la méthode de coloration au CV de l’effet du PI sur la
déstructuration du biofilm préformé de 24 heures
La capacité du PI à déstructurer les biofilms de SASM1 et SASM2 a été évaluée pendant 4 h
sur les biofilms formés pendant 24 h tel que décrit dans la méthodologie. Les résultats sont
présentés dans les Figures 5.20 et 5.21
Figure 5.20: Déstructuration des biofilms de SASM1 par le PI
020/LP 008/U 022/U 018/FV ATCC 25923
0
1
2
3
4
5
Contrôle
Periodate
n = 3
*
Souches
Un
ités
d'a
bso
rban
ce54
0 n
m
Les souches SASM1 ont été incubées pendant 24 h dans les puits d’une microplaque à 96 puits. Après
incubation, le milieu de culture (BHI) a été éliminé puis remplacé par du milieu BHI-50 mM de tampon acétate
(contrôle) ou contenant 10 mM de PI (essai). Les bactéries ayant formé un biofilm ont été de nouveau incubées
pendant 4 h à 35°C avant la quantification de la biomasse par la méthode de coloration au cristal violet. Les
résultats sont exprimés en unités d’absorbance et sont les moyennes ± s.e.m de 3 expériences. Les résultats ont
été analysés par le test non-paramétrique de Mann-Whitney. * P < 0,05.
Comme le montre la Figure 5.20, le PI n’a pas affecté la matrice de biofilm de toutes les
souches cliniques SASM1. Il a par contre affecté le biofilm de la souche de référence ATCC
25923 dont la matrice était fortement dégradée par 10 mM de PI (chute de l’absorbance de 0,6
± 0,04 à 0,15 ± 0,01; n = 3). Les biofilms de toutes les souches SASM2 ont été dégradés par
le PI. L’absorbance moyenne de ces biofilms est passée respectivement de 0,9 ± 0,09 (n= 16)
en absence du PI à 0.3 ± 0.03 (n= 16) en présence du PI (Figure 5.21).
94
Figure 5.21. Déstructuration des biofilms de SASM2 par le PI
5668/S 5471/S 1620/P 1532/P0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5Contrôle
Periodate
n= 4
souches
Un
ités
d'a
bso
rban
ce5
40
nm
*
* **
Les souches SASM2 ont été incubées pendant 24 h dans les puits d’une microplaque à 96 puits. Après
incubation, le milieu de culture (BHI) a été éliminé puis remplacé par du milieu BHI-50 mM de tampon acétate
(contrôle) ou contenant 10 mM de PI (essai). Les bactéries ayant formé un biofilm ont été de nouveau incubées
pendant 4 h à 35°C avant la quantification de la biomasse par la méthode de coloration au cristal violet. Les
résultats sont exprimés en unités d’absorbance et sont les moyennes ± s.e.m de 4 expériences. Les résultats ont
été analysés par le test non-paramétrique de Mann-Whitney. * P < 0,05.
95
5.6.3.3. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm
Comme pour le PI, la capacité de 100 µg/mL de PK à immobiliser les billes magnétiques
chargées négativement a été également évaluée en absence des cellules bactériennes.
Tableau 5.8: Influence de la protéinase K sur l’immobilisation des billes magnétiques
BHI + Billes
Protéinase K
100 µg/mL + Billes
BFI 16,9 ± 0,05 1,6 ± 0,04
Les résultats présentés dans le Tableau 5.8 montrent que la protéinase K a provoqué une chute
très importante du BFI allant en moyenne de 16,9 ± 0,05 en l’absence de protéinase K à 1,6 ±
0,04 en présence de 100 µg/mL de protéinase K après 4 h d’incubation. En dépit de ce fait,
l’activité de la protéinase K a néanmoins été testée sur la déstructuration des biofilms de
SASM1 et SARM par BFRT® et par la méthode de coloration au CV.
5.6.3.3.1. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm de 6 heures par
BFRT®
Les résultats de ces expériences sont présentés dans les Figures 5.22 et 5.23. L’analyse des
données montre une nette augmentation du BFI pour les dix souches testées.
96
Figure 5.22: Déstructuration des biofilms de SASM1 par la protéinase K
020/LP 008/U 022/U 018/FV ATCC 259230.0
2.5
5.0
7.5
10.0Contrôle
Proteinase K
n=*
*
* *
4
4
4
4
4
4
4
4
6
4
**
Souches
BF
I (u
nit
és
arb
itrair
es)
Les souches SASM1 mélangées aux billes magnétiques ont été incubées pendant 6 h en atmosphère humide à
35°C dans les puits d’une microplaque. Après incubation, les biofilms préformés ont été traités soit avec du
milieu BHI- 20 mM de tampon Tris-HCl (pH 7), soit avec 100 µg/mL de protéinase K, puis de nouveau incubés
pendant 4 h. La migration de billes dans un champ magnétique a été évaluée et les résultats sont exprimés en
BFI. Les résultats sont les moyennes ± s.e.m de 4 à 6 expériences. Les résultats ont été analysés par le test non-
paramétrique de Mann-Whitney. ** P < 0.01; * P < 0,05.
97
Figure 5.23: Déstructuration des biofilms de SARM par la protéinase K
011/LP 027/U 028/FV 007/FV ATCC 335910.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
Contrôle
Proteinase K
n=
**
**
4
4
4
4
4
4
4
4
6
6
**
Souches
BF
I (u
nit
és
arb
itrair
es)
Les souches SARM mélangées aux billes magnétiques ont été incubées pendant 6 h en atmosphère humide à
35°C dans les puits d’une microplaque. Après incubation, les biofilms préformés ont été traités soit avec du
milieu BHI- 20 mM de tampon Tris HCl (pH 7), soit avec 100 µg/mL de protéinase K, puis de nouveau incubés
pendant 4 h. La migration de billes dans un champ magnétique a été évaluée et les résultats ont été exprimés en
BFI. Les résultats sont les moyennes ± s.e.m de 4 à 6 expériences. Les résultats ont été analysés par le test non-
paramétrique de Mann-Whitney. ** P < 0.01; * P < 0,05.
Le BFI est passé de 1,5 ± 0,01 (n = 32) en absence de la protéinase K à 4,6 ± 0,3 (n = 32) en
présence de 100 µg/mL de protéinase K pour toutes les 8 souches cliniques. Chez les SASM1
(Figure 5.22), les biofilms préformés des souches 008/U et 020/LP étaient plus affectés par
100 µg/mL de protéinase K que ceux de souches 018/FV et 022/U.
98
5.6.3.3.2. Effet de la protéinase K sur la déstructuration du biofilm préformé de 24
heures par la méthode de coloration au cristal violet
Considérant l’interaction de billes magnétiques avec la protéinase K dans le BFRT®, nous
avons également évalué la capacité de l’enzyme à déstructurer les biofilm préformés pendant
24 h par la méthode de coloration au cristal violet. Les résultats obtenus sont présentés dans
les Figures 5.24 à 5.26 ci- dessous.
Figure 5.24: Déstructuration des biofilms de SASM1 par la protéinase K
020/LP 008/U 022/U 018/FV ATCC 259230.0
0.1
0.2
Proteinase K
n=6
** ****
** **
6
6
66
6 6
6
6
6
6
*
Contrôle
2.0
3.0
4.0
5.0
Souches
Un
ités
d'a
bso
rb
an
ce
54
0 n
m
Les souches de S. aureus sensibles à la méticilline ont été incubées pendant 24 h dans les puits d’une
microplaque à 96 puits. Après incubation, le milieu de culture (BHI) a été éliminé puis remplacé par du milieu
BHI-tampon Tris HCl (pH 7) (contrôle) ou contenant 100 µg/mL de protéinase K (essai). Les bactéries ayant
formé un biofilm ont été de nouveau incubées pendant 4 h à 35°C avant la quantification de la biomasse par la
méthode de coloration au cristal violet. Les résultats sont exprimés en unités d’absorbance et sont les moyennes
± s.e.m de 6 expériences. Les résultats ont été analysés par le test non-paramétrique de Mann-Whitney. *** P <
0,005; ** P < 0,01.
99
Figure 5.25: Déstructuration des biofilms de SARM par la protéinase K
011/LP 027/U 028/FV 007/FV ATCC 335910.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Proteinase K
Contrôle
n=
** ****
**
**6
6 6
66
66
6
6
6
Souches
Un
ités
d'a
bso
rb
an
ce
54
0 n
m
Les souches de S. aureus résistantes à la méticilline ont été incubées pendant 24 h dans les puits d’une
microplaque à 96 puits. Après incubation, le milieu de culture (BHI) a été éliminé puis remplacé par du milieu
BHI-tampon Tris HCl (pH 7) (contrôle) ou avec 100 µg/mL de protéinase K (essai). Les bactéries ayant formé
un biofilm ont été de nouveau incubées pendant 4 h à 35°C avant la quantification de la biomasse par la méthode
de coloration au cristal violet. Les résultats sont exprimés en unités d’absorbance et sont les moyennes ± s.e.m de
6 expériences. Les résultats ont été analysés par le test non-paramétrique de Mann-Whitney. ** P < 0,01.
Cette seconde méthode a également confirmé la dégradation des biofilms de SASM1 et
SASM2 par une solution contenant 100 µg/mL de protéinase K. L’absorbance moyenne est
passée de 0,8 ± 0,2 (n = 40) en absence de la protéinase K à 0,09 ± 0,003 (n = 30) après
incubation avec 100 µg/mL de protéinase K pour les souches SASM1 (Figure 5. 24) et de 0.9
± 0.06 (n= 16) en absence de la protéinase K à 0.5 ± 0.04 (n= 16) en présence de la protéinase
K pour les souches SASM2 (Figure 5.26). La souche 018/FV a été particulièrement sensible à
la protéinase K. Le biofilm de 24 h de cette souche était pratiquement indétectable après 4 h
de contact avec l’enzyme. Nous avons observé une diminution très importante de
l’absorbance, de 3,3 ± 0,2 en l’absence de la protéinase K à 0,08 ± 0,009 (n = 6) en présence
de la protéinase K (Figure 5.24). Les biofilms de toutes les souches résistantes à la méticilline
ont été également dégradés par la protéinase K. L’absorbance moyenne de ces souches est
100
passée de 0,18 ± 0,004 (n = 30) en absence de la protéinase K à 0,12 ± 0,003 (n = 30) en
présence de 100 µg/mL de protéinase K (Figure 5.25).
Figure 5.26. Déstructuration des biofilms de SASM2 par la protéinase K
5668/S 5741/S 1620/P 1532/P0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Contrôle
Protéinase K
n= 4
* * *
souches
Un
ités d
'ab
so
rb
an
ce
54
0 n
m
Les souches de S. aureus résistantes à la méticilline ont été incubées pendant 24 h dans les puits d’une
microplaque à 96 puits. Après incubation, le milieu de culture (BHI) a été éliminé puis remplacé par du milieu
BHI-tampon Tris HCl (pH 7) (contrôle) ou avec 100 µg/mL de protéinase K (essai). Les bactéries ayant formé
un biofilm ont été de nouveau incubées pendant 4 h à 35°C avant la quantification de la biomasse par la méthode
de coloration au cristal violet. Les résultats sont exprimés en unités d’absorbance et sont les moyennes ± s.e.m de
4 expériences. Les résultats ont été analysés par le test non-paramétrique de Mann-Whitney. * P < 0,05.
101
5.7. Effet de l’EGTA sur les biofilms
5.7.1. Effet de l’EGTA sur l’immobilisation des billes magnétiques par les souches
bactériennes dans le BFRT®
Dans une première expérience, l’influence de l’EGTA 10 mM sur l’immobilisation de billes
magnétiques a été évaluée pendant 4 h d’incubation en l’absence des bactéries.
Tableau 5.9: Influence de l’EGTA sur l’immobilisation des billes magnétiques
BHI + Billes EGTA 10 mM + Billes
BFI 16,8 ± 0,3 17,8 ± 0,9
Les résultats présentés dans le Tableau 5.9 montrent que l’EGTA n’affecte pas la mobilité des
billes magnétiques.
Après ce constat, l’activité de l’EGTA sur l’immobilisation des billes magnétiques par les 10
souches de S. aureus a été mesurée sur une période de 6 h. Les Figure 5.27 et 5. 28 illustrent
les différents résultats obtenus.
102
Figure 5.27: Effet de l’EGTA sur l’adhésion de souches SASM2 à une surface
0
1
2
3
4
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
5668/S
5741/S
1532/P
1620/P
ATCC 25923
[EGTA] (Log µM)
BF
I (u
nit
és a
rb
itra
ires)
Les souches SASM2 ont été incubées à 35°C avec les billes magnétiques pendant 6 h dans les puits d’une
microplaque à 96 puits en absence ou en présence des différentes concentrations d’EGTA. Après l’incubation, la
migration des billes magnétiques dans un champ magnétique a été évaluée et les résultats ont été exprimés en
BFI. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 4 à 6 expériences.
Les 4 souches cliniques de SASM2 et la souche de référence ATCC 25923 étaient totalement
insensibles aux concentrations d’EGTA allant de 100 µM à 10 mM (Figure 5.27).
103
Figure 5. 28: Effet de l’EGTA sur l’adhésion de souches SARM à une surface
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
011/LP
027/U
028/FV
007/FV
ATCC 33591
[EGTA] (Log µM)
BF
I (u
nit
és a
rbit
rair
es)
Les souches SARM ont été incubées à 35°C avec les billes magnétiques pendant 6 h dans les puits d’une
microplaque à 96 puits en absence ou en présence des différentes concentrations d’EGTA. Après incubation, la
migration des billes magnétiques dans un champ magnétique a été évaluée et les résultats ont été exprimés en
BFI. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 4 à 6 expériences.
Par contre, nous avons constaté une inhibition par l’EGTA de l’adhésion de 4 souches
cliniques de SARM (Figure 5.28). Un mM d’EGTA inhibait l’immobilisation des billes
magnétiques par la souche 011/LP (BFI de 3,6 ± 0,9 à 7,5 ± 1,0), la souche 027/U (BFI de 2,8
± 0,3 à 7,2 ± 0,7) et la souche 028/FV (BFI de 2,4 ± 0,1 à 4,6 ± 0,6). L’inhibition de
l’immobilisation des billes par la souche 007/FV n’a été observé qu’à une concentration de 10
mM d’EGTA (BFI de 2,1 ± 0,6 à 6,1 ± 0,6). La souche de référence SARM n’était pas
affectée par les différentes concentrations d’EGTA testées.
104
5.7.2. Effet de l’EGTA sur l’adhérence bactérienne sur des tubes de cathéter
Les résultats de l’adhérence bactérienne sur des tubes de cathéter sont présentés dans les
Figures 5.29 et 5.30.
Figure 5.29: Adhésion de souches SASM2 sur des tubes de cathéter
5668/S 1620/P 1532/P 5741/S0
2
4
6
8
10Contrôle EGTA 1 mM
souches
Lo
g U
FC
/mL
Les souches SASM2 ont été incubées pendant 18 h en présence d’un morceau de tube de cathéter avec ou sans
EGTA 1 mM. Après rinçage, les bactéries ont été détachées par passage des tubes dans un bain à ultrasons et
différentes dilutions de la suspension bactérienne ont été placées dans les boites de gélose TSA, puis incubées
pendant 48 h. Après dénombrement, les résultats ont été exprimés en UFC/mL.
105
Figure 5.30: Adhésion de souches SARM sur des tubes de cathéter
011/LP 007/U 027/FV 028/FV0
2
4
6
8
10
Contrôle EGTA 1 mM
* *
souches
Lo
g U
FC
/mL
Les souches SARM ont été incubées pendant 18 h en présence d’un morceau de tube de cathéter avec ou sans
EGTA 1 mM. Après rinçage, les bactéries ont été détachées par passage des tubes dans un bain à ultrasons et
différentes dilutions de la suspension bactérienne ont été placées dans les boites de gélose TSA puis incubées
pendant 48 h. Après dénombrement, les résultats ont été exprimés en UFC/mL. Les résultats ont été analysés par
Two-way ANOVA suivie du post test de Bonferroni. * P < 0,05.
Comme l’illustrent les Figures 5.29 et 5.30, les souches SASM2 ont plus adhéré sur le tube de
cathéter (1,1 x 107 ± 5 x 10
6 UFC/mL) que les souches SARM (2,4 x 10
5 ± 7 x 10
4 UFC/mL).
L’ajout de l’EGTA dans le milieu de culture a provoqué une augmentation de l’adhésion de
souches SASM2 (1,1 x 108 ± 1 x 10
7 UFC/mL) et une diminution de l’adhésion de souches
SARM (7,7 x 104 ± 2 x 10
4 UFC/mL). Au vu de la grande variation des mesures entre les
souches, les résultats de chaque souche ont été analysés individuellement. Les 4 souches de
SASM2 étaient comparables et n’étaient aucunement affectées par l’EGTA. Deux souches de
SARM (007/U et 028/FV) n’étaient pas non plus affectées par l’EGTA. Par contre, l’EGTA a
inhibé l’adhésion des 2 autres souches SARM (011/LP et 027/FV).
106
5.7.3. Effet de l’EGTA sur la formation du biofilm par la méthode de coloration au
cristal violet
La densité optique de la biomasse (colorant incorporé par les cellules formant un biofilm et
par les composants de la matrice du biofilm) a été mesurée après 6 h d’incubation. Les
résultats de ces expériences sont présentés dans les Figures 5.31 et 5.32.
Figure 5.31: Effet de l’EGTA sur la formation des biofilms de SASM
1.000.00
0.25
0.50
0.75
2 3 4
5668/B
5741/B
1620/SW
ATCC 25923
1532/SW
[EGTA] (Log µM)
Ab
sorb
an
ce
Les souches SASM2 ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits.
La formation du biofilm a été mesurée pendant 6 h dans le milieu BHI ou en présence de différentes
concentrations d’EGTA en utilisant la méthode de coloration au cristal violet. Les résultats sont exprimés en
absorbance mesurée à 540 nm du colorant incorporé par les cellules formant un biofilm et par les composants de
la matrice. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 4 à 6 expériences.
107
Figure 5.32: Effet de l’EGTA sur la formation des biofilms de SARM
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
007/FV
027/U
028/FV
011/FV
[EGTA] (Log µM)
Ab
sorb
an
ce
54
0 n
m
Les souches SARM ont été incubées en atmosphère humide à 35°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits.
La formation du biofilm a été mesurée pendant 6 h dans le milieu BHI ou en présence de différentes
concentrations d’EGTA en utilisant la méthode de coloration au cristal violet. Les résultats sont exprimés en
absorbance mesurée à 540 nm du colorant incorporé par les cellules formant un biofilm et par les composants de
la matrice. Les valeurs sont les moyennes ± s.e.m de 4 à 6 expériences.
Comme le montrent les Figures 5.31 et 5. 32, les densités optiques moyennes de souches
SASM et SARM en l’absence de l’EGTA étaient respectivement de 0,3 ± 0,02 (n = 52) et de
0,16 ± 0,01 (n = 36) (P < 0,001). Après addition de l’EGTA (100 µM- 10 mM) dans le milieu
de culture, on a observé une diminution dose-dépendante de la densité optique pour toutes les
souches.
La concentration efficace à 50% (EC50) de l’EGTA avoisinait 48 µM pour les 5 souches
SASM2 et 26 µM pour les 4 souches cliniques de SARM testées. Mais la différence n’était
pas significative.
108
5.7.4. Effet de l’EGTA sur les biofilms préformés de 24 heures par la méthode de
coloration au cristal violet
Les résultats de cette étude sont illustrés dans les Figures 5.33 et 5.34.
Figure 5.33: Effet de l’EGTA sur la déstructuration des biofilms de SARM
011/FV 027/U 028/FV 007/FV ATCC 335910.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Contrôle
EGTA 1 mM
EGTA 10 mMn= 6
Souches
Ab
sorb
an
ce
54
0 n
m
Les souches SARM ont été incubées pendant 24 h dans les puits d’une microplaque à 96 puits. Après incubation,
le milieu de culture (BHI) a été éliminé puis remplacé par du milieu frais sans EGTA ou contenant 1 ou 10 mM
d’EGTA. Les bactéries ayant formé un biofilm ont été de nouveau incubées pendant 4 h à 35°C avant la
quantification de la biomasse par la méthode de coloration au cristal violet. Les résultats sont exprimés en unités
d’absorbance et sont les moyennes ± s.e.m de 6 expériences.
109
Figure 5.34: Effet de l’EGTA sur la déstructuration des biofilms de SASM2
5668/S 5741/S 1532/P 1620/P ATCC 259230.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
EGTA 10 mM
Controln= 6 EGTA 1 mM
Souches
Ab
sorb
an
ce
54
0 n
m
Les souches SASM2 ont été incubées pendant 24 h dans les puits d’une microplaque à 96 puits. Après
incubation, le milieu de culture (BHI) a été éliminé puis remplacé par du milieu frais sans EGTA ou contenant 1
ou 10 mM d’EGTA. Les bactéries ayant formé un biofilm ont été de nouveau incubées pendant 4 h à 35°C avant
la quantification de la biomasse par la méthode de coloration au cristal violet. Les résultats sont exprimés en
unités d’absorbance et sont les moyennes ± s.e.m de 6 expériences.
Cette étude avait pour objet d’évaluer la capacité de l’EGTA à déstructurer les biofilms
préformés. Pour cela, les biofilms ont été formés pendant 24 h dans les puits d’une
microplaque stérile de 96 puits. Après l’élimination du milieu de culture, les bactéries ayant
formé un biofilm ont été de nouveau incubées pendant 4 h dans les conditions contrôle (milieu
BHI) ou en présence de 1 ou 10 mM d’EGTA. Comme l’illustrent les Figures 5.33 et 5.34,
l’EGTA n’a pas provoqué la déstructuration des biofilms de 24 h après mesure de la densité
optique.
Les différents résultats de l’activité de l’EGTA sur l’adhésion, la formation et sur la
déstructuration du biofilm ont été modélisés dans la Figure 5.35
110
Figure 5.35: Résumé de l’effet de l’EGTA sur les biofilms de souches SARM et SASM2
Les souches SASM2 (en rouge) et les souches SARM (en bleu) ont été incubées dans les puits de la
microplaque. L’adhésion bactérienne a été évaluée par BFRT®
(A). L’EGTA a inhibé l’adhesion de souches
SARM (+) et non celle de souches SASM2 (-). Le développement de la biomasse (surface verte, B) et la
déstructuration du biofilm (C) ont été estimés par la méthode de coloration au cristal violet. L’EGTA a inhibé la
formation du biofilm (+), mais n’a pas provoqué sa déstructuration (-).
111
5.7.5. Effet de l’EGTA sur la croissance bactérienne
Pour vérifier si l’inhibition de la formation des biofilms par l’EGTA était consécutive à une
inhibition de la croissance bactérienne, les bactéries planctoniques ont été incubées pendant
6h en absence et en présence de différentes concentrations d’EGTA (100 µM - 10 mM). Les
temps de doublement de cellules en présence de l’EGTA sont présentés dans les Figures 5.36
et 5.37.
Figure 5.36: Temps de doublement de souches SASM2 en présence de l’EGTA
5668/S 5741/S 1532/P 1620/P ATCC 259230
20
40
60
80 EGTA 1 mM
EGTA 10 mM
CONT
n=
1111
11 11
11
44
4 4 4
4
4 4
4
4
**
** EGTA 100 µM
EGTA 3 mM
4
4
4 4 4
44
4
4
4
Souches
Tem
ps
de d
ou
ble
men
t (m
inu
tes)
Les souches SASM2 ont été incubées à 37°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits en absence ou en
présence de concentrations croissantes d’EGTA. L’absorbance à 600 nm a été mesurée toutes les 5 min pendant
6h. Le temps de doublement a été estimé après ajustement des données avec une équation exponentielle. Les
résultats sont les moyennes ± s.e.m de n expériences. ** P < 0,01 tel que déterminé par Two-way ANOVA
suivie du post-test de Bonferroni.
112
Figure 5.37: Temps de doublement de souches SARM en présence de l’EGTA
028/FV 011/FV 027/U 007/FV ATCC 335910
10
20
30
40
50
60
70
80
EGTA 1 mM EGTA 10 mM
CONT
n=
88
8
128
1212
1212
12
12
12
6
6 6
***
**
EGTA 3 mM EGTA 100 µM
66
6
6
6
6
6
64
4
Souches
Tem
ps
de d
ou
ble
men
t (m
inu
tes)
Les souches SARM ont été incubées à 37°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits en absence ou en
présence de concentrations croissantes d’EGTA. L’absorbance à 600 nm a été mesurée toutes les min pendant
6h. Le temps de doublement a été estimé après ajustement des données avec une équation exponentielle. Les
résultats sont les moyennes ± s.e.m de n expériences. ** P < 0,01; *** P < 0,001 tel que déterminé par Two-way
ANOVA suivie du post-test de Bonferroni.
Le temps de doublement de SASM2 était d’environ 39 ± 1 min. Les différentes concentrations
testées n’avaient aucun effet sur la croissance bactérienne en général. Mais à la concentration
d’EGTA de 10 mM, le temps de doublement a augmenté de 25% pour la souche 1532/P et de
120% pour la souche ATCC 25623 (Figure 5.36). Le temps de doublement des souches
SARM était d’environ 36 ± 1 min. La croissance de ces souches était partiellement affectée
par l’EGTA. Les effets les plus significatifs ont été observés à 3 mM où le temps de
doublement a augmenté respectivement de 50% pour la souche 007/FV et de 30% pour la
souche ATCC 33591(Figure 5.37).
113
5.7.6. Effets des cations sur l’adhésion et la formation des biofilms
Les expériences préliminaires concernaient l’évaluation de l’influence des cations (calcium,
magnésium et manganèse) sur l’immobilisation de billes magnétiques. Les cations ont été
incubés en absence des bactéries pendant 4 h. Les résultats obtenus sont présentés dans la
Figure 5.38.
Figure 5.38: Effet des cations sur le BFRT®
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000
5
10
15
20
Calcium
Magnésium
Manganèse
EGTA
Concentration (mM)
BF
I (u
nit
és
arb
itrair
es)
Les billes magnétiques ont été incubées à 35°C pendant 4 h en présence de concentrations croissantes d’EGTA,
de calcium, de magnésium ou de manganèse et en absence des bactéries. A la fin de l’incubation, le BFI a été
mesuré et les résultats sont les moyennes ± s.e.m de 3 expériences.
Comme l’illustre la Figure 5.38, les 3 cations ont immobilisé les billes magnétiques avec une
forte diminution du BFI. Compte tenu de l’interaction des ions avec les billes magnétiques,
les effets des ions sur l’inhibition de l’adhésion et de la formation du biofilm par l’EGTA ont
été étudiés uniquement par la méthode de coloration au CV. Les résultats obtenus sont
présentés dans le Tableau 5.10.
114
Tableau 5.10: Effet des cations sur les biofilms
Souches SARM Souches SASM2
O.D.540 nm N O.D.540 nm n
CONT 0,124 ± 0,003 12 0,530 ± 0,040 12
EGTA 0,076 ± 0,004###
8 0,278 ± 0,013###
12
+ Ca 0,139 ± 0,005***
7 0,340 ± 0,020 11
+ Mg 0,137 ± 0,003***
8 0,353 ± 0,013 11
+ Mn 0,150 ± 0,006***
8 0,447 ± 0,025***
12
Les 4 souches SARM et SASM2 ont été incubées à 35°C dans les puits d’une microplaque à 96 puits soit en
absence ou en présence de 1 mM d’EGTA, soit en présence de 1 mM de calcium, magnésium ou manganèse plus
1 mM d’EGTA. La formation du biofilm a été mesurée après 24h par la méthode de coloration au cristal violet.
Les résultats sont exprimés en absorbance mesurée à 540 nm. Les données sont les moyennes ± s.e.m de n
expériences. ###
, P < 0,001 en l’absence des ions, ***
P < 0,001 en présence des ions selon le test non-
paramétrique de Mann-Whitney.
Les résultats obtenus montrent que les 3 cations utilisés ont levé l’inhibition provoquée par
l’EGTA. Dans les souches SASM2, seul le manganèse avait un effet très significatif.
115
5.7.7. Toxicité de l’EGTA sur les cellules eucaryotes
La toxicité de l’EGTA sur les cellules eucaryotes a été évaluée par le test MTT. Ce test
explore la capacité de cellules à transférer les électrons et à réduire le colorant. Pour y
parvenir, les macrophages murins ont été incubés avec différentes concentrations d’EGTA (1-
50 mM).
Figure 5.39: Test MTT sur les macrophages
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
0.2
0.3
0.4
[EGTA] (Log mM)
Ab
sorb
an
ce
54
0 n
m
Les macrophages ont été incubés toute la nuit dans les puits d’une microplaque à 96 puits. Le jour suivant, le
milieu a été éliminé et remplacé par du milieu frais contenant différentes concentrations d’EGTA. Les cellules
ont été incubées en présence de l’EGTA pendant 20 min. Après l’élimination du milieu, la capacité de cellules à
réduire le MTT a été testée. Les résultats sont exprimés en unités d’absorbance mesurée à 540 nm et sont les
moyennes ± s.e.m de 4 expériences.
Comme le montre la figure 5.39 ci-dessus, les concentrations d’EGTA allant de 1 à 5 mM
n’avaient aucun effet sur la densité optique. A des fortes concentrations, l’EGTA a provoqué
une diminution dose- dépendante de la densité optique (de 0, 348 à 5 mM à 0,219 à 50 mM.
Ces différents résultats ont montré que les faibles concentrations d’EGTA n’avaient aucun
effet toxique sur les macrophages.
116
5.8. Détection des gènes codant pour les protéines de surface de S. aureus
Différents gènes codant pour les protéines de surface impliquées dans l’adhésion, l’agrégation
cellulaire et dans la formation des biofilms ont été recherchés par PCR. Le gène gap a servi de
référence dans la réaction PCR. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 5.11.
Tableau 5.11: Gènes amplifiés dans les souches de S. aureus
Souches Gènes
SARM fnbA fnbB sasC sasG gap clfA clfB
007/FV + + + - + + +
011/LP + + + + + + +
027/U + + + + + + +
028/FV + + + + + + +
ATCC 33591 + + + + + + +
SASM2
5668/S + + - - + + +
5741/S + + + + + + +
1532/P + + - - + + +
1620/P + + + - + + +
ATCC 25923 + + + - + + +
Comme le montre le Tableau 5.11 ci-dessus, toutes les souches sensibles et résistantes
possédaient le produit d’amplification des gènes fnbA (191 pb), fnbB (201 pb), clfA (1000 pb)
et clfB (205 pb). Toutes les souches de SARM étaient positives pour les gènes sasC (489 pb).
Le gène sasG (311 pb) a été détecté dans le génome de 4 souches de SARM, à l’exception de
la souche 007/FV. Des petites variations ont été cependant observées chez les souches
SASM2: le gène sasC n’était pas détecté dans le génome des souches 5668/S et 1532/P; sasG
était absent dans toutes les souches SASM2 excepté la souche 5741/S (sasG). Les différents
fragments des gènes amplifiés par PCR sont repris dans les Figures 5.40 à 5.43 ci-dessous.
117
Figure 5.40: Amplification par PCR de fragments des gènes fnbA et fnbB
1) Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène fnbA chez les SARM ou les
SASM 2. SARM: Ligne 1: 007/FV; 2: 011/LP; 3: 027/U; 4: 028/FV; 5: ST de 100 pb DNA ladder plus.
SASM2: Ligne 6: 5668/S; 7: 5741/S; 8: 1532/P; 9: 1620/P.
2) Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène fnbB chez les MRSA ou les
MSSA. SARM: Ligne 11: 007/FV; 12: 011/LP; 13: 027/U; 14: 028/FV; 15: ST de 100 pb DNA ladder
plus. SASM2: Ligne 16: 5668/S; 17: 5741/S; 18: 1532/P; 19: 1620/P.
Figure 5.41: Amplification par PCR de fragments des gènes sasC et sasG
1) Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène sasC chez les SARM ou les
SASM2. SARM: Ligne 1: 007/FV; 2: 011/LP; 3: 027/U; 4: 028/FV; 5: ST de 100 pb DNA ladder plus.
SASM2: Ligne 6: 5668/S; 7: 5741/S; 8: 1532/P; 9: 1620/P.
2) Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène sasG chez les SARM ou les
SASM2. SARM: Ligne 11: 007/FV; 12: 011/LP; 13: 027/U; 14: 028/FV; 15: ST de 100 pb DNA ladder
plus.
SASM2: Ligne 16: 5668/S; 17: 5741/S; 18: 1532/P; 19: 1620/P.
118
Figure 5.42: Amplification par PCR d’un fragment du gène clfA
Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène clfA chez les SARM ou les SASM2.
SARM: Ligne 1: 007/FV; 2: 011/LP; 3: 027/U; 4: 028/FV; 5: ATCC 33591; 6: ST de 100 pb DNA ladder plus.
SASM2: Ligne 7: 5668/S; 8: 5741/S; 9: 1532/P; 10: 1620/P; 11: ATCC 25923.
Figure 5. 43: Amplification par PCR d’un fragment du gène clfB
Electrophorèse sur gel d’agarose des produits d’amplification du gène clfB chez les SARM ou les SASM2.
SARM: Ligne 1: 007/FV; 2: 011/LP; 3: 027/U; 4: 028/FV; 5: ATCC 33591; 6: ST de 100 pb DNA ladder plus.
SASM2: Ligne 7: 5668/S; 8: 5741/S; 9: 1532/P; 10: 1620/P; 11: ATCC 25923.
119
6. DISCUSSION GENERALE
Quatre points constitueront la charpente de la présente discussion. Dans un premier temps,
nous aborderons la caractérisation des souches cliniques et de référence des SARM et SASM.
Nous parlerons ensuite de deux méthodes (Biofilm Ring Test® et la méthode de coloration au
cristal violet) utilisées pour étudier l’adhésion de différentes souches de S. aureus sur une
surface inerte, la formation du biofilm et pour explorer la composition de la matrice des
biofilms. Dans un troisième temps, nous aborderons l’application de ces deux méthodes dans
la recherche de nouveaux traitements antibiofilms. Nous prendrons comme molécule l’EGTA
dont nous discuterons l’activité sur l’adhésion et la formation des biofilms de SARM et
SASM. Enfin, nous terminerons cette discussion par une analyse des résultats de la PCR.
6.1. Caractérisation des souches cliniques et de référence de S. aureus.
La caractérisation des souches étudiées a été principalement faite par la détermination de la
sensibilité aux antibiotiques (antibiogramme et recherche de gènes impliqués dans la
résistance), le génotypage (spa typing) et par la détermination des propriétés de surface des
cellules bactériennes.
La méthode de diffusion en milieu gélosé de Mueller Hinton a été utilisée en routine pour la
sélection de souches sensibles et résistantes à la méticilline. Les résultats obtenus ont montré
que 4 souches étaient résistantes et 8 sensibles à la méticilline. A cause du faible pouvoir
discriminant de cette méthode, nous avons utilisé la technique de PCR pour la recherche du
gène mecA codant pour la résistance à la méticilline et du gène femB qui influence le niveau
de résistance à la méticilline. Les 4 souches résistantes à la méticilline ont été confirmées
comme étant des SARM du fait de la présence du gène mecA. La présence du gène femB
codant pour l’enzyme impliqué dans l’incorporation des glycines 4 et 5 dans le pont
pentaglycine et dans l’augmentation de la résistance à la méticilline a été non seulement
confirmée dans toutes les souches SARM, mais aussi dans les 4 souches cliniques de SASM2
et dans la souche de référence ATCC 25923. Le gène femB n’était pas amplifié dans l’ADN
extrait de souches SASM1. Ces résultats corroborent ceux obtenus par Kaboyashi et al. (1994)
et par Mohanasoundaram et Lalitha, (2008).
Nous avons également recherché le gène ileS-2 impliqué dans la résistance à la mupirocine.
En effet, la résistance à cet antibiotique topique utilisé dans la prévention, la décolonisation
120
nasale des MRSA et dans les infections post-opératoires a été rapportée dans plusieurs études
à travers le monde (Pérez-Roth et al., 2002; Simor et al., 2007; Shin-Moo et al., 2011). En
Afrique, cette résistance a déjà été mentionnée dans les souches SARM isolées au Nigéria et
en République Sud Africaine (Shittu et al., 2009; Marais et al., 2009). Des 4 souches SARM
isolées à Kinshasa, le gène ileS-2 n’a été détecté que dans la souche 007/FV. Ce cas constitue
la première description d’une souche résistante à la mupirocine en République Démocratique
du Congo.
Les résultats du typage moléculaire par spa typing ont montré que les 4 souches SARM et 3
souches SASM2 avaient des types spa différents (Tableau 5.3). La souche sensible à la
méticilline 1532/P était spa non typable. Ces résultats nous ont donc confirmé que les 8
souches cliniques étudiées étaient génomiquement distinctes. Chez les souches sensibles à la
méticilline, le type spa t355 a déjà été rencontré dans les souches provenant de plusieurs pays
d’Afrique, notamment le Mali (Ruimy et al., 2008), le Gabon (Schaumburg et al., 2011; Ateba
Ngoa et al., 2012), et le Nigeria (Shittu et al., 2011). Le type spa t939 a été récemment
identifié au Gabon (Schaumburg et al., 2011; Ateba Ngoa et al., 2012). L’analyse du gène spa
a aussi révélé l’existence d’un nouveau type spa t10715 d’une souche de SASM. N’ayant
trouvé aucune donnée rapportée sur le type t10715 dans la littérature, c’est pour la première
fois que ce génotype a été observé chez S. aureus isolé d’un produit pathologique non
seulement en Afrique mais aussi dans le monde. Il serait alors intéressant d’étudier les
relations de ce nouveau type avec d’autres types déjà décrits. En effet, ce type (15-12-17-17-
16-02-16-02-25-17) appartient au complexe clonal spa 012 (15-12-16-02-25-17-24-24) et
provient probablement après des insertions, délétions et des duplications successives
conduisant aux sous-types t021 (15-12-16-02-25-17-24), t421 (15-12-16-02-25-17), t342 (15-
12-16-02-16-02-25-17) et t1848 (15-12-17-16-02-16-02-25-17). L’absence d’un type spa pour
la souche 1532/P pourrait être due à l’absence ou la mutation de ce gène. Chez les souches
résistantes à la méticilline, le type spa t002 est rencontré dans les souches isolées en Europe
(Fenner et al. 2008), et dans certains pays d’Afrique tels que le Nigeria et le Gabon (Shittu et
al., 2011; Schaumburg et al., 2011, Ateba Ngoa et al., 2012). Les types spa t044 et t051 sont
majoritairement rencontrés dans les souches isolées en Europe (Denis et al., 2005; Fenner et
al., 2008). Mais le type spa t044 a été récemment identifié en Tunisie (Kechrid et al., 2010).
Ces résultats suggèrent un échange intercontinental de plusieurs clones. En effet, les
121
voyageurs et les migrants sont maintenant considérés comme des vecteurs majeurs des
infections à S. aureus parmi les populations (Tappe et al., 2010).
Plusieurs facteurs énumérés dans la partie introductive de ce travail influencent l’adhésion de
S. aureus sur une surface. L’hydrophobicité de la surface cellulaire est l’un des facteurs les
mieux étudiés. A cet effet, les tests d’agrégation cellulaire par le sulfate d’ammonium (SAT)
et MATS (microbial adhesion to solvents) ont été utilisés pour étudier les propriétés de
surface de différentes souches de S. aureus.
Les résultats obtenus par le test SAT avaient montré une divergence de l’hydrophobicité de la
souche 007/FV par rapport aux autres souches. En effet, la concentration en sulfate
d’ammonium provoquant une agrégation de cellules était plus faible (0,2 M) que celle des
autres souches, suggérant que cette souche était plus hydrophobe. Cette différence n’était
pourtant pas observée dans le test MAT. Le test MAT compare l’affinité des bactéries pour un
solvant non- polaire et pour les solvants à caractère acide ou basique ayant des propriétés de
Lifshitz - Van der Waals similaires. Le pourcentage d’extraction de toutes les souches SASM
de la phase aqueuse par l’hexadecane, un n- alcane très hydrophobe, était plus élevé (autour
de 90%) que celui de SARM (environ 80%). Selon les critères définis par Krepsy et al.
(2003), toutes les souches étudiées avaient une paroi très hydrophobe, mais les SASM étaient
légèrement plus hydrophobes que les SARM (très faible adhésion à l’hexane). Une étude
récente menée par Bekir et al. (2012) a montré que les souches SARM possédaient un
caractère hydrophile. En dépit de la similitude des indices de polarité et d’hydrophobicité des
souches SASM, cette étude a aussi montré que ces bactéries présentaient des propriétés
basiques ou donneuses d’électrons à divers degrés et en fonction de la souche. Le caractère
basique résulterait de la présence des groupes chimiques carboxylate, hydroxyle, phosphate
ou amine à la surface cellulaire (Zeraik et Nitschke, 2010; Renner et Weibel, 2011). Pour la
majorité de souches cliniques de SARM, le pourcentage d’extraction par l’acétate d’éthyle
était plus élevé que le pourcentage d’extraction par le solvant contrôle, le n-hexane. Ces
résultats attestent que les souches cliniques de SARM ont une membrane légèrement acide,
avec un caractère accepteur d’électrons. Par contre, les souches SASM ont une paroi
complètement dépourvue du caractère acide, accepteur d’électrons. La différence des résultats
obtenus par les tests SAT et MATS n’est pas sans rappeler les résultats publiés par Vanhaecke
et al. (1990). En effet, ces auteurs ont rapporté que l’évaluation de l’hydrophobicité
membranaire n’était pas aussi aisée et dépendait de la méthode d’évaluation de celle-ci.
122
6.2. Adhésion et formation du biofilm par BFRT® et méthode basée sur la coloration au
CV
Différentes méthodes ont été développées pour évaluer in vitro l’adhésion bactérienne à une
surface. L’adhésion et les étapes initiales de formation des biofilms peuvent donc être
étudiées dans des réacteurs spécifiques conçus pour la culture de biofilms. Nous pouvons citer
à titre d’exemples les cellules d’écoulement (Caldwell et Lawrence, 1988; Lawrence et al.,
1991), le réacteur annulaire rotatif (Escher et Characklis, 1990), le réacteur tubulaire
(l’appareil de Robbins) (Vorachit et al., 1993), le réacteur à biofilm CDC (Murga et al., 2001;
Nagant et al., 2012) dans lesquels les biofilms peuvent se former et être continuellement
approvisionnés en nutriments. Ces réacteurs présentent plusieurs désavantages, notamment
leur petite surface rendant le prélèvement direct du biofilm impossible, l’obtention d’une
faible quantité du biofilm fixé à la surface par rapport au volume initial. Les biofilms formés
dans ces réacteurs et sur les implants médicaux peuvent être facilement observés par des
techniques microscopiques (Surman et al., 1996; Burnet et al., 2000; Kodjikian et al., 2003;
Senechal et al., 2004). Mais ces techniques restent purement qualitatives et descriptives et ne
peuvent mesurer l’adhésion bactérienne (Xavier et al., 2003). Les méthodes de dénombrement
de cellules sont également utilisées (Anwar et al., 1992; Oulahal et al., 2004), mais elles ne
donnent qu’une indication sur le nombre de cellules se trouvant à l’intérieur du biofilm. La
méthode de culture en microplaques après coloration au cristal violet est actuellement la plus
utilisée pour évaluer l’adhésion bactérienne et la formation du biofilm (Christensen et al.,
1985).
Dans ce travail, nous avons utilisé deux méthodes basées sur la culture de bactéries en
microplaque pour étudier la capacité de souches de S. aureus à adhérer à une surface inerte et
à former les biofilms. Il s’agit du BFRT® et de la méthode de coloration au cristal violet.
Le BFRT® évalue la capacité de cellules bactériennes à immobiliser les billes magnétiques.
Cette méthode, de mise en œuvre simple et rapide, nécessite peu de manipulations et sa
procédure n’inclut pas les différentes étapes de lavage de puits. Elle a été utilisée avec succès
par Chavant et al. (2007) dans l’étude de formation d’un biofilm par les bactéries et les
microalgues (Badel et al., 2008). Les résultats de nos expériences ont montré que cette
méthode était la plus efficiente et la mieux indiquée pour une évaluation rapide de l’adhésion
bactérienne sur une surface en dehors de toute influence de la croissance bactérienne.
123
Le BFRT® nous a également permis de démontrer que les souches SASM adhéraient plus
rapidement sur une surface que les souches SARM. Grinholc et al. (2007) et Atshan et al.
(2012) ont montré que les souches SASM étaient plus susceptibles à adhérer à une surface et à
former les biofilms que les souches SARM. Nos résultats corroborent également ceux obtenus
par O’Neill et al. (2007). Ces auteurs ont rapporté que la capacité des souches cliniques de S.
aureus à former un biofilm dans un milieu de culture contenant du NaCl était plus importante
chez les SASM que chez les SARM. Leurs résultats suggéraient aussi que différents
mécanismes intervenaient dans la formation des biofilms des SASM et des SARM. La forte
adhérence des SASM à la surface pourrait également être attribuée à la forte hydrophobicité
de leur membrane telle que mis en évidence par le test MATS. Il convient cependant de
souligner que des opinions divergentes existent à ce sujet. En effet, les travaux d’Amaral et al.
(2005) ont montré que l’adhésion de souches SARM aux cellules épithéliales bronchiques
était plus importante que celle de souches SASM. Plus récemment, Pozzi et al. (2012) ont
montré que l’expression du gène de résistance à la méticilline était associée avec une forte
adhésion sur un cathéter. A l’opposé, Aathithan et al. (2001) ont rapporté la similarité
d’adhésion de SARM et SASM sur les cellules épithéliales du foie. Par contre, l’adhésion de
SARM sur les cellules épithéliales respiratoires était inférieure à celle de SASM d’après les
travaux de Karauzum et al. (2008).
La méthode de coloration au CV est basée sur une mesure colorimétrique du cristal violet
incorporé à la fois par les cellules attachées sur les puits et par la matrice organique formant le
biofilm. Elle a été modifiée pour augmenter sa précision et sa reproductibilité (Stepanovic et
al., 2000; Peeters et al., 2008). Les résultats de nos travaux ont montré qu’elle était de faible
sensibilité et nécessitait des temps d’incubation plus longs pour observer une augmentation
significative de l’absorbance. Malheureusement, le manque de standardisation de différentes
étapes de lavage de puits rend souvent difficile la comparaison des résultats de différents
laboratoires (Chavant et al., 2007).
En utilisant ces deux méthodes, Nagant et al. (2010) avaient montré la cohérence des résultats
obtenus lorsqu’on étudie l’étape initiale de formation du biofilm par les souches cliniques et
de référence de Pseudomonas aeruginosa, mais à condition que la mesure de la formation du
biofilm se fasse en peu de temps. Ceci a été également observé dans nos travaux (Figures 5.9
à 14).
124
Le BFRT® est une méthode facile et reproductible pour examiner rapidement l’adhésion et la
formation d’un biofilm, mais les résultats de nos études montrent aussi que cette méthode est
rapidement saturable et ne peut donner une estimation de la quantité du biofilm formé à des
temps dépassant 4 à 6 h. En effet, la formation d’un biofilm plus important ne peut être
détectée que par la méthode de coloration au CV. C’était le cas du biofilm formé dans notre
étude par la souche 018/FV après 24 h d’incubation (Figure 5.20). Cette souche de croissance
lente (temps de doublement plus long) avait formé un biofilm plus important que ceux de
toutes les autres souches.
La matrice des biofilms de staphylocoques est constituée en grande partie du PIA/PGNA et
des protéines (Götz, 2002). Nous avons utilisé le PI et la protéinase K pour explorer
respectivement la contribution des polysaccharides et des protéines dans la matrice du biofilm
par le BFRT® et par la méthode de coloration au CV.
Avec le BFRT®, les expériences préliminaires consistaient à examiner l’influence de ces deux
traitements sur l’immobilisation des billes magnétiques. Les résultats obtenus avaient montré
que le PI n’avait pas un effet significatif sur l’immobilisation de billes, tandis que la
protéinase K provoquait une chute massive du BFI suggérant ainsi une immobilisation
complète des billes magnétiques. Les forces électrostatiques entre les billes chargées
négativement et la protéine ne sembleraient pas être responsables de cette interaction. Des
interactions inattendues entre un composant du milieu de culture avec les billes avaient déjà
été observées par Badel et al. (2008; 2011). Ces auteurs avaient rapporté que certains milieux
de culture ayant une force ionique élevée pouvaient diminuer la mobilité de billes. En dépit de
cette interaction, les résultats obtenus par le BFRT avaient montré que les biofilms préformés
étaient déstructurés par la protéinase K suite à la disparition de l’interaction et à une
augmentation du BFI. Cette déstructuration avait également été confirmée par la méthode de
coloration au CV. Ces résultats corroboraient ceux obtenus par Cucarella et al. (2001) sur les
mécanismes de formation des biofilms dépendant de protéines.
La contribution de sucres dans le mécanisme de formation du biofilm a été testée en incubant
les bactéries avec le PI. Ce dernier oxyde les liaisons covalentes entre deux carbones
adjacents portant les groupes hydroxyles et clive les liaisons C3-C4 des résidus N-
acétylglucosamine. Les résultats obtenus par le BFRT et par la méthode de coloration au CV
ont montré une inhibition de la formation des biofilms pour toutes les souches testées.
125
En vue de confirmer la présence des polysaccharides dans la matrice des biofilms de S.
aureus, un des gènes codant pour l’opéron ica a été recherché par PCR. Le gène icaA était
détecté dans toutes les 5 souches SARM, dans les 4 souches de SASM2 et dans la souche de
référence ATCC 25923. Toutes les souches SASM1étaient négatives pour le gène icaA.
Les études de dégradation des biofilms de SARM, SASM1 et de SASM2 par le PI avaient
également confirmé les résultats de PCR. Les biofilms de souches icaA+ étaient déstructurés
par 10 mM de PI contrairement aux souches icaA-. La souche de référence ATCC 25923 était
plus sensible à l’action du PI (P < 0.001). L’insensibilité des souches SASM1 au PI pourrait
s’expliquer par l’absence du gène icaA dans la structure de leur biofilm. Il est bien établi que
l’expression de l’opéron ica se traduit par une augmentation de la formation des biofilms dans
la majorité (Gad et al., 2009), mais pas dans toutes les souches de S. aureus (O’Gara et al.,
2007). Des mécanismes de formation des biofilms indépendants de l’opéron ica par les
souches cliniques de S. aureus sensibles à la méticilline avaient été mis en évidence par
Fitzpatrick et al. (2005) et O’Neill et al. (2007). Nos résultats sont en contradiction avec ceux
rapportés par ces auteurs en ce qui concerne les souches SASM1, mais conformes à ceux
obtenus par Petrelli et al. (2008) dans lesquels une souche clinique de SASM était négative
pour l’opéron icaA. En effet, la présence du gène icaA n’est pas toujours corrélée avec la
formation d’un biofilm in vitro (Nasr et al., 2012).
6.3. Activité de l’EGTA sur l’adhésion et la formation du biofilm
L’importance médicale des biofilms à S. aureus a été évoquée dans plusieurs travaux de
recherche. Cette bactérie est responsable de plusieurs types d’infections dont la majorité est
due à son habileté à adhérer sur les implants médicaux et à former les biofilms (Archer et al.,
2011). Le traitement des implants médicaux avec des substances antimicrobiennes ou avec
des solutions verrous à base de ces substances constituent sans doute les moyens les plus
utilisés soit pour prévenir la formation d’un biofilm soit pour éliminer un biofilm mature
préformé.
Un des composés ayant ces propriétés est l’EGTA, un agent complexant de cations divalents
(calcium, magnésium, manganèse,…). En effet, les cations divalents contribuent à
l’interaction entre bactéries, se lient aux groupes chimiques négativement chargés de la
surface cellulaire et interagissent avec les composants de la matrice extracellulaire du biofilm
(Özerdem Akpolat et al., 2003). Ils augmentent l’attachement d’une bactérie à une surface en
126
réduisant les répulsions électrostatiques et en stabilisant les interactions entre la surface
bactérienne chargée négativement et les substrats anioniques (Renner et Weib, 2011).
Il a été démontré par Turakhia et al. (1983) que la séquestration par l’EGTA d’un cation tel
que le Ca2+
pouvait conduire au détachement du biofilm de son site de fixation. Ces
observations suggéraient que les cations divalents jouaient un rôle important dans le maintien
de la structure du biofilm.
Les techniques du BFRT® et de coloration au CV ont été utilisées pour évaluer la capacité de
l’EGTA à prévenir l’adhésion cellulaire et la formation d’un biofilm ainsi qu’à déstructurer un
biofilm préformé. Les résultats obtenus ont montré que l’adhésion et la formation d’un
biofilm par les 10 souches de S. aureus étaient différemment affectées par l’EGTA.
L’adhésion de toutes les souches SASM étudiées n’était affectée par aucune concentration de
l’EGTA présent dans le milieu. A la concentration de 1 mM, l’agent complexant n’avait
aucun effet sur l’adhésion d’une souche clinique (007/FV) et de référence (ATCC 33591) de
SARM, mais inhibait significativement l’adhésion des 2 autres souches cliniques de SARM.
Ces observations ont été confirmées par les tests d’adhésion sur des tubes de cathéter
intraveineux. En effet, 1mM d’EGTA inhibe l’adhérence de 2 souches cliniques de SARM sur
le tube de cathéter.
Par contre, l’inhibition de la formation du biofilm était observée à cette concentration pour
toutes les souches SASM et SARM. Il convient de souligner que cette concentration
inhibitrice de l’adhésion et de la formation du biofilm n’était pas toxique sur les cellules
eucaryotes.
Les biofilms préformés par toutes les souches n’étaient pas affectés par l’EGTA. Nos résultats
sont en accord avec ceux obtenus par Shanks et al. (2006) qui avaient montré que le citrate
qui fixe le calcium extracellulaire inhibait la formation d’un biofilm mais n’entraînait pas la
déstructuration d’un biofilm établi. Oulahal et al. (2004) avaient observé que l’EGTA
potentialisait l’effet des ultrasons sur l’élimination du biofilm d’E. coli formé à la surface de
l’acier inoxydable et non celui de S. aureus.
La concentration de 1mM n’avait aucun effet sur le temps de doublement de toutes les
souches confirmant que ces inhibitions n’étaient pas liées à une inhibition de la croissance
bactérienne.
127
Les résultats divergents obtenus avec l’EGTA sur l’adhésion et la formation du biofilm
confirment que ces deux propriétés sont distinctes et sont différemment régulées par les
cations, probablement le calcium. En présence d’ions magnésium et calcium, les
polysaccharides extracellulaires polymérisent et forment un gel (Gristina et al., 1987). Dune et
Burd (1992) avaient également observé que les cations divalents augmentaient in vitro et dans
des conditions statiques l’adhésion de S. epidemidis sur le plastique. En accord avec
Taweechaisupapong et Doyle (2000), les agents complexants sont des inhibiteurs de plusieurs
adhésines bactériennes. Nos résultats suggèrent aussi que certaines souches cliniques ont
acquis la résistance non seulement aux agents antimicrobiens, mais ont aussi modifié les
propriétés de leur surface. Les résultats de l’adhésion des bactéries à une surface et du test
MATS étaient éloquents à ce sujet. En outre, Jansson et Wadström (1984) avaient montré que
certaines souches cliniques de S. aureus pouvaient exprimer une capsule polysaccharidique
contribuant aux propriétés invasives et à la résistance à la phagocytose. Ceci a été mieux
illustré par les résultats de Tachi et Hibaraschi (2004). En utilisant un modèle animal, ils ont
démontré que les souches cliniques de S. aureus pénétraient plus dans la plaie que la souche
de référence. Molina-Manso et al. (2010) ont également démontré qu’une collection de
souches cliniques et de référence de S. aureus adhéraient différemment sur le polyéthylène de
haut poids moléculaire traité avec la vitamine E. Ils conclurent que les études d’adhésion
devaient toujours inclure à la fois les souches cliniques et de référence.
Nous avons également étudié l’influence de cations (calcium, magnésium et manganèse) sur
l’inhibition causée par 1 mM d’EGTA. Les expériences préliminaires portant sur l’influence
des cations sur l’immobilisation des billes magnétiques avaient montré que les ions
interféraient avec les billes et diminuaient le BFI. Ces interactions (déjà abordées au point 6.2
de cette discussion) avaient été aussi observées avec les peptides cationiques dérivés de la
cathélicidine qui portent plusieurs charges positives au pH neutre (C. Nagant, communication
personnelle). Pareilles interactions seraient dues aux interactions électrostatiques entre les
billes négativement chargées et les cations ou entre certains composants du milieu de culture.
Ces résultats ont montré aussi que la mobilité des billes magnétiques pouvait être affectée non
seulement par les bactéries qui adhèrent à une surface, mais aussi par la modification des
propriétés rhéologiques du milieu. Pendant la réalisation de nos expériences, nous avions
constaté que l’ajout des ions dans les puits contenant de l’EGTA se traduisait par une chute
brutale du BFI au lieu de son augmentation.
128
Compte tenu de cette forte interaction avec les billes, les expériences des effets des cations sur
l’inhibition de l’adhésion provoquée par l’EGTA ont été réalisées uniquement par la méthode
de coloration au CV. Les résultats obtenus ont montré que ces 3 ions n’affectaient pas la
formation des biofilms, mais levaient plutôt l’inhibition provoquée par l’EGTA. Seul le
manganèse était très efficace sur les souches SASM. En effet, l’affinité du manganèse pour
l’EGTA (pKa 12,12) est meilleure que celle du calcium (pKa 10,9) et de loin supérieure à
celle du magnésium (pKa 5,3). Ainsi, la concentration d’EGTA libre devrait être plus faible
en présence de 1 mM de manganèse qu’en présence des 2 autres cations (Smith et al., 2001).
L’explication la plus probable serait qu’en l’absence de l’ajout de tout cation divalent,
l’EGTA se lierait sans doute à un autre cation, le fer (Lin et al., 2012) ou le zinc (Conrady et
al., 2008) qui contribuerait à la formation du biofilm. Il a été récemment démontré que le zinc
contribuait à la dimérisation de la structure de SasG, une protéine impliquée dans la formation
des biofilms de S. aureus (Gruszka et al., 2012).
6.4. Les protéines de surface de S. aureus
Dans une étude très récente, Abraham et al. (2012) ont démontré que l’effet du citrate et de
l’EGTA sur la formation du biofilm variait énormément parmi les souches de S. aureus. Ces
produits inhibaient la formation d’un biofilm dans une souche de S. aureus, comme la souche
Newman, et favorisaient la formation du biofilm par la souche 10833. La délétion du gène
codant pour la protéine de liaison au fibrinogène B abolissait complètement les propriétés
stimulatrices du biofilm de ces deux agents complexants dans la souche 10833. Dans le but de
déterminer les gènes qui pouvaient nous donner une indication sur la différence de sensibilité
de l’adhésion à l’EGTA, des gènes codant pour les principales protéines de surface
impliquées dans l’adhésion ou la formation d’un biofilm ont été étudiés par PCR.
Les résultats de la PCR ont montré de très légères différences entre les 10 souches. Le gène
sasC était détecté dans toutes les souches, à l’exception de souches 5668/S et 1532/P. La
protéine SasC est impliquée dans l’agrégation et l’accumulation du biofilm (Schroeder et al.,
2009). L’absence de l’amplicon pour sasG et la présence de l’amplicon pour mupR
constituaient les seules différences entre la souche 007/FV et les autres souches SARM. La
protéine SasG est une protéine qui participe à l’adhérence et à la formation d’un biofilm par S.
aureus (Corrigan et al., 2007). Il a été aussi démontré par les mêmes auteurs que les souches
129
qui exprimaient ces protéines pouvaient former un biofilm même à l’absence du PIA
(Corrigan et al., 2007).
Les résultats de PCR ont montré qu’aucune des différences entre les gènes amplifiés ne
pourrait expliquer les différents profils de souches de S. aureus en l’absence du calcium.
L’EGTA inhiberait probablement une protéase exprimée par les souches résistantes à la
méticilline et qui serait indispensable dans la formation du biofilm.
130
7. CONCLUSION GENERALE
Ce travail avait pour objet d’étudier l’interaction des souches cliniques de S. aureus sensibles
et résistantes à la méticilline avec des surfaces abiotiques en vue de trouver un moyen de lutte
contre l’adhésion bactérienne, étape essentielle conduisant à la colonisation des surfaces
biotiques ou abiotiques et à la formation d’un biofilm.
Le mécanisme d’adhésion bactérienne à une surface dépendant entre autres des propriétés de
la surface cellulaire, nous avons caractérisé les souches SASM et SARM par la détermination
des propriétés de membranes dans le but de cerner leur influence sur le processus d’adhésion
et de formation du biofilm. Comme déjà décrit dans la littérature, les souches SASM étaient
plus hydrophobes que les souches SARM.
Les études d’adhésion bactérienne et de formation du biofilm réalisées par la méthode du
BFRT®et celle de coloration au cristal violet ont mis en évidence l’efficience de ces deux
méthodes pour étudier la formation du biofilm et les effets des antagonistes dans ce processus.
Différentes cinétiques d’adhésion et de formation du biofilm ont été observées entre les
souches. Nos études ont clairement montré que les souches SASM dont l’hydrophobicité était
supérieure à celle de SARM adhéraient plus vite à une surface et formaient un biofilm
beaucoup plus important.
La méthode BFRT® utilisée pour évaluer l’interaction entre la bactérie et une surface
abiotique nous a permis de démontrer que cette dernière était efficace pour étudier l’adhésion
cellulaire sur une surface en dehors de toute influence de la croissance bactérienne. Elle
pourrait ainsi contribuer dans la recherche des nouvelles solutions de lavage pour prévenir la
contamination des implants médicaux à base de polystyrène ou de silicone. En effet, nous
avons démontré en utilisant BFRT® que l’EGTA inhibait l’adhésion des souches SARM à une
surface abiotique. Ces données ont été confirmées par le test d’adhésion sur tube de cathéter
en silicone. La recherche des protéines de surface de la paroi bactérienne impliquées dans la
formation du biofilm ne nous a pas permis de tirer une conclusion sur la différence de
sensibilité des souches de S. aureus à l’EGTA. L’utilisation d’une méthode quantitative telle
que la qRT-PCR couplée à une approche protéomique permetrait dans l’avenir, de mener des
investigations envue de détecter les gènes qui seraient sur ou sous régulés chez les bactéries
exposées à l’EGTA.
131
Puisque nous avons observé une modification des propriétés rhéologiques du milieu par le
produit à tester (immobilisation des billes en l’absence des bactéries), nous pensons que la
firme qui a développé le BFRT® devrait mener des études sur la réduction des interférences
avec les billes magnétiques. Ces nouveaux développements permettraient d’utiliser dans le
futur ce test afin de prédire la capacité à adhérer sur les surfaces biotiques telles que les plaies,
de souches cliniques de S. aureus.
132
8. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Aathithan, S., R. Dybowski et G. L. French. 2001. Highly epidemic strains of methicillin-
resistant Staphylococcus aureus not distinguished by capsule formation, protein A content or
adherence to HEp-2 cells. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20: 27-32.
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159
ANNEXES
160
ANNEXE N° 1: Study of the formation of a biofilm by clinical strains of Staphylococcus
aureus
161
162
163
164
165
166
167
168
169
170
171
172
173
ANNEXE 2: Study of the adhesion of clinical strains of Staphylococcus aureus on an
abiotic surface using the Biofilm Ring Test®
(article accepté)
174
175
176
177
178
179
180
181
182
183
184
ANNEXE N° 3: Inhibition by EGTA of the formation of a biofilm by clinical strains of
Staphylococcus aureus (article soumis pour publication)
185
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
197
198
199
200
201
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204
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207
208
209
210
211
212
213
214
215
216
217
218
219
220
221
222
223
224
225
ANNEXE N° 4: Composition du milieu Brain Heart Infusion (BHI) (Becton, Dickison,
Etats-Unis d’Amérique)
Formule approximative par litre
Cervelle de veau, infusion de 200 g………………………… 7,7 g
Cœur de bœuf, infusion de 200 g…………………………… 9,8 g
Peptone de protéose………………………………………... 10,0 g
Dextrose…………………………………………………….. 2,0 g
Chlorure de sodium………………………………………… 5,0 g
Phosphate disodique………………………………………. 2,5 g
pH 7,4 ± 0,2
226
ANNEXE N° 5: Structures chimiques
Periodate de sodium
