FLUOROQUINOLONES : MODE D’ACTION ET MECANISMES DE

Cécile Bébéar, UER Microbiologie générale 2-Bactériologie, 2021 1

FLUOROQUINOLONES : MODE D’ACTION ET MECANISMES DE

RESISTANCE DEVELOPPES PAR LES BACTERIES Famille des quinolones : • Une des familles les + développées actuellement • Dérivée de l’acide nalidixique (Nal) - 1962 Produit intermédiaire de synthèse de la chloroquine • Antibiotiques (ATB) synthétiques • ATB à large spectre, bactéricides, à bonne diffusion tissulaire

• ATB très utilisés…..-> apparition de nombreuses résistances

I- STRUCTURE-CLASSIFICATION

A- Structure de base Bicyclique ® activité antibactérienne : •cycle A : cycle pyridone •cycle B : cycle aromatique (benzène, pyridine, pyrimidine) • +/- 3ème cycle


COOH

B- Classification • avant 1980 : 1ères quinolones NAL, ac. pipémidique...etc.

• depuis 1980 : Fluoroquinolones (FQ)

® 2 modifications clés : atome de fluor (F) en 6 hétérocycle azoté en 7 (pipérazine) ® Activité antibactérienne spectre élargi meilleure tolérance

Pénétration à travers la paroi bactérienne

Spectre antibactérien

R1

R7

F

R5 O Site de fixation

X8 N 1

2

3

4 5

6

7

8

A B


® Autres substituants en différentes positions :

FQ de nouvelle génération

LEVOFLOXACINE MOXIFLOXACINE


II- SPECTRE D’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE

A- Ac. nalidixique et dérivés spectre étroit • S : Certaines bactéries à Gram négatif (-) Entérobactéries, Haemophilus, Vibrio Neisseria • R : Pseudomonas Bactéries à Gram positif (+) Mycobactéries, chlamydiae, mycoplasmes Anaérobies

B- Fluoroquinolones spectre très élargi • activité sur entérobactéries (x100, 1000) • Extension aux Pseudomonas à certains Gram+ (Staphylococcus aureus) aux chlamydiae, mycoplasmes

à Mycobacterium tuberculosis • Activité insuffisante sur les cocci Gram + type streptocoques (Streptococcus pneumoniae) et anaérobies pour les FQ les plus anciennes


• Nouvelles FQ commercialisées ou en développement : actives sur toutes ces bactéries Þ Classification des FQ par "génération"

Première

Deuxième

Troisième

Ac. nalidixique Ac. pipémidique

Norfloxacine Péfloxacine Ofloxacine Ciprofloxacine

Lévofloxacine Moxifloxacine Délafloxacine

Entérobacteries Entérobacteries P. aeruginosa Cocci Gram+ (Staphylocoque) Atypiques

Entérobacteries P. aeruginosa Atypiques Cocci Gram+ (Pneumocoque) Anaérobies

Urines Urines Inf. systémiques

Inf. systémiques +/- urines


III- MECANISMES D’ACTION

A- Pénétration intrabactérienne

FQ : hydrophobicité et type ionique variables ® interactions variables avec enveloppes bactériennes (paroi, membranes)

1- Bactéries à Gram+

ü Pas de membrane externe, paroi constituée par un

peptidoglycane épais ü Pénétration des FQ par diffusion passive

2- Bactéries à Gram-

Phospholipides

Lipopolysaccharides

Porine

Antibiotique hydrophobe

Antibiotique hydrophile

Cations (Ca++, Mg++)

Charges électriques


ü Voie des porines (Outer Membrane Protein) canaux hydrophiles, ex : porines Omp chez Escherichia coli, impliqués dans la pénétration ¹ ATB

® FQ hydrophiles et de petite taille (< 400 da) ® pas les FQ les + hydrophobes ü Voie du LPS FQ chélatent Mg2+ associés au LPS ® désorganisation du LPS découverte de zones hydrophobes d’où pénétration des FQ hydrophobes

3- Passage de la membrane cytoplasmique (diffusion passive)

B- Cibles moléculaires: topoisomérases (TP)

bactériennes de type II

1- Notions générales


1-1 TP: enzymes modifiant la topologie de l’ADN (nombre d'enlacements)

ü enzymes essentielles pour réplication ADN et transcription, présentes dans toutes cellules, eucaryotes et eubactéries.

1-2. 4 classes de TP chez E. coli

ü TP de type I : cassure d’1 seul brin de la molécule d'ADN

double brin relâchent l’ADN, pas besoin d’ATP

ü TP de type II : coupent les 2 brins ATP-dépendantes, essentielles

- ADN gyrase ou topoisomérase II ® surenroulement de la double hélice ++

Gyrase et TP I régulent le niveau de surenroulement de l'ADN Þ réplication, transcription, expression des gènes.


DNA plasmidiques relachés ou surenroulés (m.électronique)

- Topoisomérase IV ® décaténation des copies d’ADN circulaires après la réplication

ü Structure oligomérique : tétramères chez les eubactéries

2- ADN gyrase (études cristallographiques)

2-1. Structure protéique

2-1.1. Tétramère A2B2 : 2 SU GyrA + 2 SU Gyr B

ü GyrA 875 acides aminés (E. coli), codée par gyrA GyrB 804 aa, codée par gyrB


2-1.2. Plusieurs domaines avec sites d’activité ¹

ü GyrA, 2 domaines : - N-terminal, fonctionnel

site actif de la gyrase (tyrosine 122) = lieu de coupure-resoudure de l'ADN très conservé, site de mutations («Quinolone Resistance Determining Region” ou QRDR) ® Résistance aux FQ

- C-terminal, structural

ü GyrB - N terminal, fonctionnel : interaction avec ATP - C terminal, structural : interaction avec GyrA et ADN


2-2. Activité inhibitrice des FQ

ü GyrA : cible préférentielle des FQ


ü Formation d’un complexe tertiaire ADN-ADN gyrase-FQ Þ blocage irréversible de la réaction au stade de complexe ADN-ADN gyrase ouvert ou complexe de clivage Þ blocage de la réplication avec arrêt de la fourche Þ induction de la réponse SOS chez la bactérie Þ évènements mal définis (facteurs protéiques) Þ mort bactérienne

3- Topoisomérase IV 3-1. Structure protéique

Tétramère : 2 SU ParC (parC) + 2 SU ParE (parE), homologues à GyrA et GyrB

3-2. Fonctions

ü Décaténation, ATP dépendante ® ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire

Effet bactéricide : mort cellulaire

Effet bactériostatique : inhibition de la synthèse d’ADN et de la croissance

ADN gyrase ADN

+

Quinolone Mutations de l’ADN gyrase


IV- MECANISMES DE RESISTANCE ü Très étudiés chez E. coli, P. aeruginosa, S. aureus et

S. pneumoniae Majoritairement mutations chromosomiques Résistance plasmidique décrite plus récemment

ü 3 mécanismes :

ATB Modification de la cible ¯ accumulation intrabactérienne

Inactivation enzymatique

Mutations Modification enzymatique

Protection (efflux)

FQ +++ - + ++ (+)


A- Altérations des cibles Mutations chromosomiques au niveau des domaines conservés appelés "QRDR" touchant les gènes codant pour les sous-unités des topoisomérases II :

- gyrA et gyrB (ADN gyrase) - parC et parE (topoisomérase IV)

Þ Résistance de haut niveau, croisée à toutes les FQ

1- Moyens d'étude moléculaire, exemple des altérations GyrA

GyrA, cible préférentielle des FQ ® rôle prépondérant dans la R acquise Altérations responsables de la mauvaise affinité de la gyrase pour FQ

1-1 Etudes génétiques • AMPLIFICATION PAR PCR ET SEQUENÇAGE DE LA QRDR

GYRA Choix d’amorces encadrant la QRDR gyrA, amplification et séquençage. • TEST DE DOMINANCE

Allèle gyrA sauvage dominant sur allèle gyrAR muté ® expce de complémentation en trans : introduction d’1 plasmide porteur du gène gyrA S dans bactérie R (gyrA muté) : R devient S Preuve que allèle gyrA R= mécanisme de Rce


• ECHANGES ALLELIQUES (S. PNEUMONIAE, S. AUREUS)

Transformation d'une souche de pneumocoque sensible aux FQ avec des fragments d'ADN comprenant la QRDR gyrA ou parC de différents mutants caractérisés Þ recombinaison homologue Þ apparition d'une résistance aux FQ avec CMI

1-2 Etudes biochimiques

ü Purification enzymatique des sous-unités protéiques GyrA et GyrB

ü Etude inhibit° ADN gyrase par FQ pour souches S et R

(Concentration Inhibitrice 50) In vitro :GyrA (R) + GyrB (S) ® gyrase R ( CI50 FQ)

2- Altérations GyrA et ParC

- Prédominantes, QRDR localisées près du site actif des sous-unités, à l'extrémité N-terminale au niveau du site de fixation des FQ - Observées chez de très nombreuses bactéries Gram+ et -, mycobactéries, chlamydiae et mycoplasmes substitutions et positions » E. coli

2-1 QRDR GyrA

ü Acidez aminés 67-106 (numérotation E. coli)

ü Mutations ponctuelles isolées ou associées Niveau de Rce fonction du type et nb de mutations

ü Mutations les + fréquentes : positions 83 et 87


2-2 QRDR ParC

Région homologue E. coli GyrA S83 D87 ParC S80 D84

3- Altérations GyrB et ParE ü Plus rares, moindre retentissement sur niveau de résistance ü QRDR définies également pour GyrB et ParE B- Protection de la cible ü Protéines constituées de répétitions de pentapeptides ü Chez les bactéries à Gram négatif (E. coli, Klebsiella, etc…) et

chez Mycobacterium tuberculosis 1. Exemple des BGN

ü Support plasmidique, transférable par conjugaison à d'autres

bactéries à Gram négatif. 1ère description en 1998 de la protéine Qnr chez K. pneumoniae. Identification du gène qnr au sein d'un intégron, dans le plasmide Þ code pour une protéine Qnr qui protège l'ADN gyrase de E. coli contre l'action inhibitrice de la ciprofloxacine.

ü Phénotype : résistance à l’acide nalidixique, faible niveau de R

aux FQ mais effet additionnel mutations chromosomiques + protection plasmidique Þ haut niveau de R


ü Implication clinique ? Oui (Asie –Chine-, Inde, USA, Europe).

C- Défaut d’accumulation de l’ATB

Diminution de la quantité d’ATB atteignant la cible par défaut de pénétration efflux actif

1. Défaut de pénétration ou imperméabilité

• Chez des BGN : E. coli, P. aeruginosa • Diminution ou disparition des porines • Le plus souvent associée à l’efflux actif

2. Efflux actif

• Systèmes de protéines transmembranaires +/- complexes exportant les ATB en dehors de la bactérie

• Efflux actif ® énergie-dépendant (2 classes suivant la source d’énergie)


• Résistance acquise de type MDR (« Multidrug Resistance ») à plusieurs familles d'ATB différentes

• Chez les BGN (E. coli, P. aeruginosa) et BGP (S. aureus, S. pneumoniae)

• Exemple : pompe NorA de S. aureus qui entraîne une résistance à plusieurs ATB, quinolones, blactamines, chloramphénicol, et autres composés divers

• Efflux actif impliqué dans la résistance naturelle et acquise aux FQ

Différentes pompes MDR bactériennes: 2 classes

ATB

ADP+Pi

S. aureus

NorA

H+

ATP

ATB

LmrA

L. lactis

H+

MbexterneOprM

MexB

MexA

ATB

P. aeruginosa

Mbinterne

Transporteur « ATP Binding Cassette »

Transporteurs utilisant la Force Proton Motrice


IV- Impact clinique de la résistance aux FQ ü Apparition précoce, espèces pathogènes touchées : S. aureus et P. aeruginosa, entérobactéries (E. coli +++)

CHU de Bordeaux, 2019 : ³ 90%% des S. aureus et ³ 87% des entérobactéries sensibles à la lévofloxacine et ³ 82% des P. aeruginosa sensibles à la ciprofloxacine.

ü Autres espèces concernées :

- Campylobacter, salmonelle etc… Lien avec l'utilisation des FQ chez l'animal

- Gonocoque, IST bactérienne, 65% de résistance aux FQ en 2020 (CNR IST bactériennes)

V- CONCLUSION ü Résistance aux FQ décrite maintenant pour de nombreuses

espèces bactériennes ü Altération des cibles bien connue mais émergence de

nouveaux mécanismes (protection de la cible, efflux actif, inactivation enzymatique)

ü Association de plusieurs mécanismes de R en clinique Þ haut niveau de résistance ü Surveillance épidémiologique +++

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