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Autoradiographie quantitative Autoradiographie quantitative d‘animaux entiers (QWBA)d‘animaux entiers (QWBA)

Alain A. Schweitzer, PhDAlain A. Schweitzer, PhDPCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 BâlePCS, Novartis Pharma AG, CH-4057 Bâle

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SommaireSommaire• Définitions• Historique• La méthode d’Ullberg• Détection de la radioactivité• Quantification des autoradiogrammes• Interprétation des résultats • Principales applications• Conclusions

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DéfinitionsDéfinitions• Ensemble de méthodes “photographiques” permettant

la détection et la localisation spatiale/géographique d’éléments radioactifs présents dans un échantillon solide• Macro- vs. Microautoradiographie• QWBAR, QWBAL et DNC

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Historique Historique (autoradiographie)(autoradiographie)

1897 (Niepce de St Victor): 1er “autoradiogramme” (sels d’uranium)

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Historique Historique (autoradiographie, suite)(autoradiographie, suite)

1904 (London) : 1ère application

biologique de l’autoradiographie

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Historique Historique (autoradiographie, suite)(autoradiographie, suite) • 1953: 1ère utilisation des particules β- (Dziewiatkovski)• 1954: WBAR des substances diffusibles (Ullberg)• 1963: 1ère tentative de quantification WBAR (Kutzim)• 1975: Brévet (USA) des écrans-phosphore (Luckey)• 1983: Comptage Nucléaire Direct (Jeavons)• 1989: Autoradioluminographie (Miyahara)

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Historique Historique (coupes d‘animaux entiers)(coupes d‘animaux entiers)

• 1947 (Libby) : scie à ruban, 2-3 mm, souris• 1954 (Ullberg) : microtome, 100 µm, en chambre froide

• 1959 (Cohen et al.) : microtome à congélation (CO2)

• 1961 (Pellerin) : rape/fraise d’atelier, seulement 1 WBA• 1962 (Martin et al.) : disque abrasif/perceuse, souris• 1966 (Kalberer) : scie circulaire, 2-4 mm, chat, singe• 1977 (Ullberg) : cryomicrotome, méthode actuelle

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Historique Historique (méthode de Kalberer, 1966)(méthode de Kalberer, 1966)

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La méthodeLa méthoded‘Ullbergd‘Ullberg

• Congélation• Enrobage• “Trimming”• Obtention des coupes• Cryodessication

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Congélation des animauxCongélation des animaux

• Azote liquide ?? • Hexane-CO2 solide

– Souris 15-30 min (<pour males and fng <25 g)– Rat 30-60 min (<pour males and fng <180 g)– Lapin 2-4 h (<pour males and fng <2 kg)– Singe 2-4 h (<pour males and fng <1.5 kg)

• Congélation rapide = pas de diffusion

Curtis et al., 1981. Whole-Body Autoradiography. Academic Press, Inc., London)

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EnrobageEnrobage

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Le Leica CM3600 PLCLe Leica CM3600 PLC

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Le Leica CM3600 PLCLe Leica CM3600 PLC

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Atteinte du niveau de coupe (Atteinte du niveau de coupe (“trimming”)“trimming”)

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Obtention des coupesObtention des coupes

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La coupeLa coupe

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Détection de la radioactivitéDétection de la radioactivité

• Autoradiographie, à l‘aide de films (QWBAR)• Autoradioluminographie/imagerie phosphore,

à l‘aide d‘écrans-phosphore (QWBAL)• Comptage nucléaire direct, dans le compteur

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QWBA / Principe QWBARQWBA / Principe QWBAR

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QWBA / Principe QWBALQWBA / Principe QWBAL

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QWBAL / exemple de balayageQWBAL / exemple de balayage

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QWBAL / exemple de balayage /CycloneQWBAL / exemple de balayage /Cyclone

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QWBAL / exemple de balayage /BAS5000QWBAL / exemple de balayage /BAS5000

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QWBA / principe DNC / MICADQWBA / principe DNC / MICAD

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QWBA / principe DNC /BetaImager 2000QWBA / principe DNC /BetaImager 2000

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QWBA / comparaison QWBAL et DNCQWBA / comparaison QWBAL et DNC

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QWBA / durées QWBAR, QWBAL et QWBA / durées QWBAR, QWBAL et

DNCDNC

Durée (sem.) QWBAR QWBAL DNC n = 2 n = 30 n = 2 n = 20 n = 2 n = 40 Exposition 3.00 3.00 0.20 0.20 0.05 2.70 Analyse 0.15 2.20 0.10 1.00 0.10 1.00 In-life 0.20 1.00 0.20 1.00 0.20 1.00 Coupes 0.20 2.00 0.20 2.00 0.20 2.00 Durée totale 3.50 8.20 0.70 4.20 0.55 6.70

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QWBA / analyse en temps réel DNCQWBA / analyse en temps réel DNC

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QWBA / analyse en temps réel DNCQWBA / analyse en temps réel DNC

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QWBA / comparaison QWBAL et DNCQWBA / comparaison QWBAL et DNC

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QWBA : Résolution “QWBA : Résolution “film”film”

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QWBA : Résolution QWBA : Résolution PhosphorImagerPhosphorImager

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QWBA : Résolution QWBA : Résolution BetaImagerBetaImager (3H, 14C)

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QWBA / DNC (résolution QWBA / DNC (résolution µ-Imager®)µ-Imager®)

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QWBA : QuantificationQWBA : Quantification

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QuantificationQuantification

HistoriqueHistorique

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QuantificationQuantification

HistoriqueHistorique

Kutzim (1963)

1ère quantification desWBA par densitometrie

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QuantificationQuantification

• auto-absorption tissulaire ?• caractéristiques des coupes ?• conditions d‘exposition ?

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Quantification : Quantification : auto-absorption tissulaireauto-absorption tissulaire

Détecteur

Source radioactive homogène

Coupe (40 µm) d‘un rat non traité

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QuantificationQuantificationTissus Absorbance moyenne ± SDFoie 91.0

1.9Moelle osseuse 91.2

2.2Cerveau 91.6

1.9Rate 92.0

1.6Coeur 92.4

1.1Rein 92.8

1.5Glande salivaire 93.0

1.2Vesicule séminale 93.0

1.2Poumon 93.0

2.3Surrénale 93.4

1.1SANG 93.6

1.5Muscle 94.0

1.6Testicule/epididyme 94.0

1.5

Os minéral 38.40.9

Tissue adipeux 60.01.2

Globe oculaire 109.8 0.4

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Quantification : “efficacité relative” DNCQuantification : “efficacité relative” DNC

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Quantification : épaisseur des coupes Quantification : épaisseur des coupes

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Quantification : conditions d’exposition Quantification : conditions d’exposition

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Quantification : conclusions Quantification : conclusions

Standardisation de toutes les étapes (coupe, exposition, balayage etc) nécessaire

▼

Utilisation systématique indispensable des standards de calibration

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Quantification : DNC vs. LSCQuantification : DNC vs. LSC

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Quantification : QWBAL vs. DNCQuantification : QWBAL vs. DNC

100

1000

10000

100 1000 10000

Activity Phosphor-imager - 4 days (dpm/mg)

Ac

tiv

ity

Be

ta-i

ma

ge

r (d

pm

/mg

)

200x250 - 4 heures

200x250 - 12 heures

120x160 - 24 heures

75x100 - 24 heures

Beta-Imager acquisition :

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Interprétation des résultatsInterprétation des résultats

• vue d‘ensemble de la distribution de la radioactivité (substance + métabolites) dans tout le corps• distribution régionale dans les tissus et structures • contrôle visuel de l‘absence de contamination• archivage permettant une re-lecture/contre-expertise• analyses complémentaires possibles

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Interprétation des résultats Interprétation des résultats

• macro-, pas micro-autoradiographie (récepteurs!)• radioactivité totale, pas une structure chimique

donnée• pharmacocinétique!• importance des conditions expérimentales

– purité radiochimique de la substance testée– LOD, LOQ– doses nominales, doses radioactives – métabolites volatiles, 3H20

• „ouvrir les yeux, voir large“

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Principales applicationsPrincipales applications

• contribution à la sélection de molécules (PD,Tox)• contribution à la sélection de formulations (Galénique)• études ADME (PK)• safety assessment (ex: passage transplacentaire)

(Tox)• estimation de la radio-exposition (hADME)• dossiers d‘enregistrement• études spécifiques (BBB, affinité à la mélanine,

résidus, „mottled pattern“ etc)

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Exemples d’application Exemples d’application

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Exemples d’application Exemples d’application

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Exemples d’application Exemples d’application

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Exemples d’application Exemples d’application

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Exemples d’application Exemples d’application

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Exemples d’application Exemples d’application

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ConclusionsConclusions informations spécifiques, importantes nombreuses applications en recherche &

développement (universités, industries pharmaceutiques et agro-alimentaires etc)

difficultés techniques expertise nécessaire coût élevé des équipements radioactivité totale, macroscopie, animal

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RemerciementsRemerciementsH.Harlemann, G.Gross, O.KretzA.Wach, P.Schnider

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MerciMercipour votrepour votreattention !attention !