45ème Congrès du Groupe Français des PesticidesVersailles, 27-29 mai 2015

Sana Romdhane, Marion Devers-Lamrani, Fabrice Martin-Laurent , Christophe Calvayrac , Emilie

Rocaboy-Faquet , David Riboul, Jean-François Cooper & Lise Barthelmebs

Biocapteurs Analyse Environnement, F-66860, Perpignan, France

Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l’Environnement – CRIOBE – USR 3278 CNRS EPHE, F-66860, Perpignan, France

INRA, UMR 1347 Agroécologie, Pole Ecoldur, 17 rue Sully, BP 86510, 21065 Dijon Cedex, France

INPT, ENSIACET, Université de Toulouse, 31432 Toulouse, France

Laboratoire de Génie Chimique (LGC UMR 5503), CNRS, 4 allée Emile Monso, BP 84234, 31432 Toulouse, France

Isolement et caractérisation de Bradyrhizobium sp. SR1 dégradant deux

herbicides β-tricétones

ANR Projet TRICETOX

• Recommandés pour les traitements de pré et post-levée en

maïsiculture.

Herbicides β-tricétones : utilisation et mode d’action

Sulcotrione Mesotrione

Tembotrione

Leptospermone

• Mode d’action : inhibition de p-hydroxyphénylpyruvate dioxygénase (HPPD)

Perturbation de la photosynthèse + blanchissement

• Dérivé de la leptospermone

• Remplacement de l’atrazine

a b

Devenir des herbicides dans l’environnement : processus impliqués

•Adaptation par acquisition des capacités de dégradation des pesticides

• Rôle important de la dégradation microbienne dans l’atténuation des pesticides

Herbicide

volatilisation

Lixiviation

ruissellement

SolAdsorption

Désorption

EauDégradation microbienne

Dégradationabiotique

Hydrolyse

Photolyse

Biodégradation des herbicides β-tricétones : état des lieux

Mésotrione

Sulcotrione1,3-cyclohexanedione (CHD)

+ acide 2-chloro-4-méthyl sulfonylbenzoïque (CMBA)

Pseudomonas sp. 1OP

Calvayrac et al. 2012

Chaabane et al. 2008

Biodégradation Métabolites

Bacillus sp. MES11

Bacillus sp. 3B6

Biodégradation Métabolites

Durand et al. 2006 ; 2010

Batisson et al. 2009

AMBAMNBAM2, M3, M4

Comportement

Comportement

DT50 : entre 16 et 122 jours

DT50 : entre 6 et 34 jours

Durand et al. 2006 ; 2010

Batisson et al. 2009

Prélèvement au champ

Cultures d’enrichissement

Dilution et Étalement

Analyse chromatographique

CLHP/UV et CLHP/ SM

Objectif : isolement d’une souche dégradant la sulcotrione

Prélèvement au champ

Cultures d’enrichissement

Dilution et Étalement

Analyse chromatographique

CLHP/UV et CLHP/ SM

Bradyrhizobium sp. SR1

Séquençage ARNr 16S

Isolement de Bradyrhizobium sp. SR1

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 8 12 20 24 32 38 48 72Temps (heures)

Concentr

ation (

µM

)

Dégradation de la sulcotrione par Bradyrhizobium sp. SR1

Sulcotrione CMBA

Temps de demi- vie : 13 h

Accumulation du CMBA

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 8 12 20 24 32 38 48 72Temps (heures)

Concentr

ation (

µM

)

Dégradation de la sulcotrione par Bradyrhizobium sp. SR1

Sulcotrione CMBA

0

10

20

30

40

50

60

0 24 48 72

Co

nce

ntr

atio

n (

Arb

itra

ryU

nit

)

LC-MS/MS HR

Sulcotrione Hydroxy-sulcotrione CMBA

Temps de demi- vie : 13 h

Accumulation du CMBA

Identification d’un nouveau métabolite :

hydroxy-sulcotrione

UV:254nm

CMBA Sulcotrione

??

Formule brute retenue (ion) :

C14H12O6ClS

Temps (heures)

• Tembotrione ?

• Leptospermone ?

• Mésotrione ?

Biodégradation d’autres herbicides tricétones

• Tembotrione ?

• Leptospermone ?

• Mésotrione

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Temps (jours)

Co

nce

ntr

atio

n (

µM

)

AMBAMésotrione MNBA

Biodégradation d’autres herbicides tricétones

Accumulation des métabolites connus:

MNBA et AMBA

Temps de demi- vie : 3 jours

Hypothèse: affinité plus importante des enzymes pour la sulcotrione

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

% in

hib

itio

n d

e l’H

PP

D

Toxicité microbienne des herbicides tricétones et de leurs métabolites

Inhibition de l’HPPD ?

Temps (heures)

Concentr

ation (

µM

)

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 4 6 8 10 12 20 24 32 38 48 72 96

Culture de Bradyrhizobium sp. SR1

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

% in

hib

itio

n d

e l’H

PP

D

Toxicité microbienne des herbicides tricétones et de leurs métabolites

Toxicité microbienne liée à l’inhibition de l’HPPD est due aux molécules mères (mésotrione et sulcotrione) et non pas à leurs métabolites

Toxicité importante du CMBA mesuré par Microtox (V. fischeri ) (Bonnet et al. 2008)

Mesure de l’inhibition de l’HPPD par la sulcotrione et ses métabolites par un bioessai colorimétrique

(Rocaboy et al. 2014)

Temps (heures)

Concentr

ation (

µM

)

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 4 6 8 10 12 20 24 32 38 48 72 96

Culture de Bradyrhizobium sp. SR1

Stratégie 2 : recherche des gènes dans le génome complet (chromosome et plasmide)

Stratégie 1 : recherche des gènes sur le plasmide

Dégradation de la sulcotrione chez Bradyrhizobium sp. SR1 : Localisation du système génétique impliqué

Curage du plasmide

Plasmide non curé / phénotype de

dégradation stable

Transfert du plasmide

1- Marquage / transfert vers E.

coli par électroporation

2- Transfert vers Bradyrhizobium sp. G49

électroporatoion / conjugaison

Transfert non réussi Gènes essentiels à la survie de la souche Absence de dégradation chez E. coli

Dégradation de la sulcotrione chez Bradyrhizobium sp. SR1 : Localisation du système génétique impliqué

Stratégie 1 : recherche des gènes sur le plasmide

Profil plasmidique de SR1 (>48kb)

48 kb

1 2 3 4

2- Criblage d’une banque de 14 000 mutants Tn5 de la souche Bradyrhizobium sp. SR1 sur la perte de capacité de dégradation de la sulcotrione

1- Insertion aléatoire d’un Tn5 dans le génome de la souche à l’aide d’un plasmide suicide

Stratégie 2 : recherche des gènes dans le génome complet

(chromosome et plasmide)

Absence de sulcotrione HPPD non inhibé

Dégradation de la sulcotrione chez Bradyrhizobium sp. SR1 : Localisation du système génétique impliqué

Méthode de criblage : suivie de la dégradation

de la sulcotrione par les clones en utilisant un

test colorimétrique basé sur l’inhibition de

l’HPPDPrésence de sulcotrione HPPD inhibé

Conclusions

Identification des gènes impliqués dans la dégradation de la sulcotrione (en cours)

Perspectives

Isolement de Bradyrhizobium sp. SR1 qui dégrade la sulcotrione et la mésotrione

Identification d’autres métabolites de la voie de dégradation de la sulcotrione

Mise en évidence de l’adaptation à la biodégradation de deux β-tricétones

micro-organismes sensibles à l’inhibition de l’HPPD

micro-organismes sensibles au CMBA

Isolement d’une souche dégradant le CMBA

Nathalie BontempsLaboratoire de Chimie des Biomolécules et de l’Environnement – CRIOBE – USR 3278 CNRS EPHE, Perpignan, France Franck E. DayanNatural Products Utilization Research Unit, USDA

Merci de votre attention

45e congrès du Groupe Français des Pesticides, 27-29 mai 2015, Versailles