ﺔﯿﺒﻌﺸﻟاﺔﯿطاﺮﻘﻤﯾﺪﻟاﺔﯾﺮﺋاﺰﺠﻟاﺔﯾرﻮ ...dspace.univ-km.dz/jspui/bitstream/123456789/2386/1/pdf.pdf · 2018. 7. 9. · 11 Protocole

الشعبیةالدیمقراطیةالجزائریةالجمھوریةRépublique Algérienne Démocratique et Populaire

و البحث العلمي التعلیم العاليةوزارMinistère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique

ةخمیس ملیانةجیلالي بونعامجامعة Université Djilali BOUNAAMA Khemis Miliana

Faculté des sciences de la nature et de la vie et des sciences de la terre.Département de: Biologie

Mémoire de fin d’étudeEn vue de l’obtention du diplôme de Master en

Domaine : Sciences de la Nature et de la Vie.Filière : Biologie.

Spécialité: Microbiologie Appliquée.

Présenté par :AICHOUBA AminaHENNINE FatimaSoutenu le 26/06/2018, Devant le jury :Présidante : Mme BENOUAKLIL. M.A.A U.K.MPromotrice : Mme OUAZIB M. M.A.B U.K.MExaminatrice : Mme HALFAOUI. M.A U.K.M

Année universitaire : 2017/2018

Remerciements

Au terme de ce travail, je remercie Dieu tout puissant de m’avoirdonné la force, le courage et la volonté d’entamer ce projet et de le finir.

Nous tenons à remercier tout particulièrement notre encadreur Mme.OUAZIB Meriem pour le temps et l’attention qu’elle nous a consacrée

pour le bon déroulement de ce travail.

Nos sincères remerciements vont également aux membres de juryMme. BENOUAKLIL de nous avoir honorés en présidante le jury,

Mme. HALFAOUI pour avoir accepté d’examiner notre travail.

Nos remerciements vont à tous les enseignants du département debiologie et les ingénieurs de laboratoire de biochimie et microbiologie de

l’université de Khemis Miliana qui ont contribué à notre formation.

Nos remerciements et gratitude s’adressent à Mme. ABADDENIAicha de nous avoir accueilli au sein de son laboratoire d’analyses

médicales où une partie de nos travaux ont été effectué.

Un remerciement particulier s’adresse au Directeur de l’ITGC (BirOuald Khelifa à Ain Defla) de nous avoir procuré les échantillons de

lentilles.

Grand Merci A tous

DédicacesJE DEDIE CE TRAVAIL,

A mes très chère parents : Abd Alkhader et Djouher à quije dois le mérite d’en être arrivée là, qu’ils trouvent icil’expression de ma profonde gratitude et mon affection.

A mes sœurs que j’aime beaucoup.A mes très chère frères

A mes nieces: Aridj et Khossay.Aux autres membres de la famille.

A ma binôme, ma copine, Amina et sa famille.A ma promotrice Mme. Ouazib M.

Une spéciale dédicace à mon Fiancé M ,et à tous mes amis.

FATIMA

Dédicaces

JE DEDIE CE TRAVAIL,

A mes très chère parents : Abdallah et Khadoma à qui jedois le mérite d’en être arrivée là, qu’ils trouvent icil’expression de ma profonde gratitude et mon affection.

A mes sœurs que j’aime beaucoup.A mes très chère frères.

A mes nieces: Rahaf ,Malak ,Maram ,Riham ,Adam Amir.Aux autres membres de la famille.

A ma binôme, ma copine, Fatima et sa famille.A ma promotrice Mme. Ouazib M.

Une dédicaces spéciale également à tous mes amis.

Amina

sommaire

Liste des abréviationsListe des figuresListe des tableauxIntroduction………………………………………………………………………1

Chapitre I : Généralités sur les légumineuses.

I.1. Classification botanique.................................................................................... 3I.2. Structure de la graine de légumineuses ............................................................ 3I.3. Principales caractéristiques des légumineuses ........................................... 4I.3.1. Valeur nutritive ......................................................................................... 4I.3.2. Profil des acides aminés ............................................................................... 5I.3.3. Vitamines et les sels minéraux ................................................................ 6I.3.4. Fixation de l’azote atmosphérique ................................................................ 7I.4. Production et consommation de légumineuses............................................ 8I.4.1. Production................................................................................................. 8I.4.2. Consommation mondiale ............................................................................... 9I.4.3. Légumineuses en Algérie ......................................................................... 10I.5. Présentation des légumineuses étudiées ........................................................... 10I.5.1. Lentille........................................................................................................... 10I.5.1.1.Systématique ............................................................................................... 11I.5.1.2. Composition biochimique de Lentille (Lens culinaris) .............................. 11I.5.1.3. Culture ....................................................................................................... 12I.5.1.4. Types de lentille ................................................................................... 12I.5.1.5. Facteurs antinutritionnels de Lens culinaris ............................................... 13

Chapitre II :Les Composés phénoliques et les activités antibactériennes

I.1. Généralités sur les composés phénoliques........................................................ 14I.2. Classification des polyphénols ......................................................................... 14I.1.2.1. Acide phénolique ........................................................................................ 15I.1.2.2. Flavonoïdes ................................................................................................ 15I.1.2.3. Tanins ......................................................................................................... 16I.1.2.4.Anthocyanes ................................................................................................ 17I.1.3. Propriétés biologiques des polyphénols ........................................................ 17I.3.1. Activité antioxydante..................................................................................... 18

sommaireI.3.2. Activité antimicrobienne ............................................................................... 18I.3.3. Activité anticancéreuse.................................................................................. 18I.3.4. Autres effets biologiques ............................................................................... 19I.4. Biodisponibilité des polyphénols...................................................................... 19II.1. Méthodes d’étude de l’activité antibactérienne............................................... 20II.1.1.Méthode de disques....................................................................................... 20II.1.2. Méthode de diffusion en puits...................................................................... 20II.1.3. Méthodes de détermination de l’effet bactériostatique ou bactéricide......... 20II.2. Facteurs influençant l’effet antibactérien ....................................................... 21II.2.1. Facteurs liés aux composés phénoliques...................................................... 21II.2.2. Facteurs liés aux microorganismes .............................................................. 22II.3. Bactéries étudiées ..................................................................................... 22II.3.1. Enterobactériaceae ....................................................................................... 22II.3.1.1. Escherichia coli......................................................................................... 23II.3.1.2.Klebsiella pneumonia……………………………………….……….……23II.3.1.3. Proteus mirabilis ....................................................................................... 23II.3.2.Staphylocoque ............................................................................................... 25II.3.3.Pseudomonas ................................................................................................ 25

Chapitre I : Matériel et Méthodes

I. Matériel et méthodes.............................................................................................. 27

I.1. Objectif ............................................................................................................... 27

I.1.1. Matériel végétal................................................................................................ 27

I.1.1. Origine des échantillons................................................................................... 27

I.1.3. Broyage ........................................................................................................... 28

I.2. Dosage des composés phénoliques .................................................................... 29

I.2.1. Extraction......................................................................................................... 29

I.2.2. Dosage des phénols totaux solubles................................................................ 30

I.2.3. Dosage des flavonoïdes ................................................................................... 30

I.3. Activité antibactérienne ..................................................................................... 31

I.3.1. Matériel biologique .......................................................................................... 31

I.3.2. Origine des souches bactériennes testées ......................................................... 31

I.3.3. Conservation des souches ................................................................................ 31

sommaireI.3.4. Repiquage des espèces bactériennes ............................................................... 32

I.3.5. Identification bactériennes ............................................................................... 32

I.3.6. Préparation des suspensions bactériennes ....................................................... 32

I.3.7. Ensemencement des boites ............................................................................. 33

I.3.8. Méthode de diffusion sur milieu solide ........................................................... 33

I.3.8.1. Méthode de diffusion en puits....................................................................... 33

I.3.8.2. Méthode de l'aromatogramme ...................................................................... 33

II. Analyse statistique................................................................................................ 35

Chapitre II : Résultats et discussion.

II. Dosage en composés phénoliques ....................................................................... 36II.1. Dosage des phénols totaux solubles .................................................................. 36II.2. Dosage des flavonoïdes ..................................................................................... 38II.3. Activité antibactériennes des extraits éthanoliques et aqueux bruts ............... 40

Conclusion..............................................................................................50Perspectives............................................................................................51Références bibliographiques ................................................................52Annexes.Résumé.

Liste des abréviation

AA : Acide aminé ADH : arginine dihydrolase AG : Acide galique

AlCl3 : chlorure d’aluminium AND : Acide désoxyribonucléique

Aq : Extrait aqueux ARN : Acide ribonucléique

CMB : concentration minimale bactérienne CMI : concentration minimale inhibitrice D : Déterminé

DSA : Direction de Service Agricole E : Equivalent.

Eth : Extrait éthanolique ITGC : Institut Technique des Grandes Cultures LDH : lysine décarboxylase

LL : Lentille large LP : Lentille petite

LR : Lentille rouge MS : Matiere sèche

ND : non déterminé ODC : Ornithine décarboxylase. ONPG: Ortho-Nitrophenyl-β-Galactosides.

Q : Quercétine . q : quantité

Qx : unité de production (quintaux) R : résistance Rdt : Rendement

S : sensible TS : Très sensible

UFC : Unité Formant Colonie Z. inh : zone d’inhibitions en mm

Liste des figures

N° Titre Page1 Cycle de fixation d’azote. 7

2 La production mondiale de quelques légumineuses. 8

3 La production mondiale de lentille. 9

4 Les parties de la plante de Lentille (graine, fleur, fleur etfruit).

11

5 Les principales structures des acides hydroxybenzoiques ethydroxycinnamiques.

15

6 Squelette de base des flavonoïdes. 15

7 Structure de l’acide gallique et l’acide éllagique. 16

8 Exemple de structure d’un tanin condensé. 17

9 Les trois variétés de lentilles. 27

10 Poudres de lentilles. 28

11 Protocole d’extraction des composés phénoliques. 29

12 Protocole de dosage des polyphénols totaux solubles. 30

13 Protocole de dosage des flavonoïdes. 31

14 Ensemencement par l’écouvillonnage. 33

15 Schéma du principe de la méthode d’aromatogramme 34

16 Protocole de l’activité antibactérienne des extraits. 34

17 Teneur en phénols totaux solubles. 3618 Teneur en flavonoïdes. 3819 Traduction de l’activité antibactérienne sur Staphylococcus

aureus sous forme de zones d’inhibition par méthode dedisque et de diffusion en puits.

44

20 Traduction de l’activité antibactérienne sur Pseudomonasaeruginosa sous forme de zones d’inhibition par méthode de

disque et de diffusion en puits.

45

21 Traduction de l’activité antibactérienne sur Escherichia colisous forme de zones d’inhibition par méthode de disque et

de diffusion en puits.

46

22 Traduction de l’activité antibactérienne sur Klebsiellapneumonia sous forme de zones d’inhibition par méthode

de disque et de diffusion en puits.

47

23 Traduction de l’activité antibactérienne sur Proteus mirabilissous forme de zones d’inhibition par méthode de disque et

de diffusion en puits.

48

24 Courbes d’étalonnage Annexe1

25 Identification de Staphylococcus aureus. Annexe 2

Liste des figures

26 Identification de Pseudomonas aeruginosa. Annexe 2

27 Identification de Klebsiella pneumonia. Annexe 2

28 Identification d’Escherichia coli. Annexe 2

29 Identification de Proteus mirabilus. Annexe 2

30 Les souches bactériennes isolées. Annexe 3

Liste des tableauxN° Titre Page

I Nom scientifique de quelques légumineuses 3

II Composition chimique globale de quelques légumineuses 5

III Composition en acides aminés (AA) essentiels des protéines dequelques légumineuses alimentaires (mg/g de protéine)

5

IV Les vitamines et les sels minéraux de quelques légumineuses 6

V Evolution de la consommation des légumineuses (kg/an/personne) 9

VI La production de légumineuses dans la willaya d’Ain Defla 10

VII Distribution des constituants chimiques des différentes partiesanatomiques de la lentille

12

VIII Teneur en facteur antinutritionnels des lentilles 13

IX Principales classes de composés phénoliques rencontrés chez lesplantes

14

X Sources principales de polyphénols dans l’alimentation et leur teneuren polyphénols en mg/kg)

19

XI Quelques genres de la famille des Entérobatériaceae 22

XII Quelques caractéristiques des genres sélectionnés parmi lesEntérobatériaceae

24

XIII Différenciation des espèces et sous-espèces de staphylocoques àcoagulase positive et ou à clumping factor –positif

25

XIV Caractères d’identification des principales espèces de Pseudomonas(P)

26

XV Résultats de l’activité antibactérienne d’extraits éthanolique etaqueux contre Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus

par la méthode de disque

40

XVI Résultats de l’activité antibactérienne d’extraits éthanolique etaqueux contre Escherichia coli, Klebsiella pneumonia et Proteus

mirabilis par la méthode de disque.

41

XVII Résultats de l’activité antibactérienne d’extraits éthanolique etaqueux contre Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus

par la méthode de puits

42

XVIII Résultats de l’activité antibactérienne d’extraits éthanolique etaqueux contre Escherichia coli, Klebsiella pneumonia et Proteus

mirabilis par la méthode de puits.

43

XIX Dénombrement des bactéries . Annexe 3

Introduction

Introduction

1

Les légumineuses (pois, lentilles, haricots, soja et pois chiches) sont l'une des cultures

les plus importantes en raison non seulement de leur qualité nutritionnelle mais également

pour leurs divers avantages agro-environnementaux. Les graines et poudres de légumineuses

sont des sources importantes de protéines, glucides, vitamines, minéraux et fibres alimentaires

(Baljeet et al., 2014 ; Rachwa- Rosiak et al., 2015).

Des études épidémiologiques ont révélé que la consommation de légumineuses est

inversement associée au risque de maladies coronariennes, de maladies cardiaques, de diabète

de type II et l'obésité. Pour ces raisons, les légumineuses sont considérées comme un

complément idéal aux céréales dans les régimes végétariens et ils gagnent une attention dans

le contexte de l'adoption d’une alimentation plus saine (Troszynska et al., 2001).

En Algérie, les légumineuses alimentaires sont essentiellement cultivées pour leurs

rôles en alimentation humaine et dans l’amélioration de la fertilité des sols dans le système de

culture dominant à base de céréales. La production de légumineuses alimentaires en Algérie,

demeure largement un secteur traditionnel où la majorité des producteurs sont de petits

exploitants agricoles disposant d'une main d'œuvre familiale abondante. Avec l’augmentation

de la demande intérieure en légumineuses alimentaires (croissance démographique) et la

stagnation des rendements (nature traditionnelle du secteur); la production ne satisfait plus la

demande locale ; l’Algérie est devenue un net importateur depuis 1979. Les principales

légumineuses alimentaires cultivées en Algérie sont la fève, le pois chiche, le pois sec et la

lentille.

La lentille est une plante annuelle, largement cultivée pour ses graines comestibles

riches en protéines. Les fruits sont des gousses renfermant deux graines rondes et aplaties

dont la couleur varie selon la variété : verte, blonde, brune, corail et rouge (Therascience,

2007).

Les polyphénols représentent l’un des groupes hydroxyles sur les groupes

phénoliques sont supposés être reliés à leur relative toxicité envers les microorganismes, avec

l’évidence que le taux d’hydroxylation est directement proportionnel à la toxicité (Cowan,

1999). Il a été aussi rapporté que plus les composés phénoliques sont inhibiteurs des

microorganismes (Scalbert, 1991).Ils entrainent notamment des lésions irréversibles sur les

Introduction

2

membranes et sont utiles dans les infections bactériennes, quelle que soit leur localisation

(Dugo et al., 1998; Dorman, 2000; Chaumont et al., 2001)

C’est dans ce cadre que s’inscrit le présent travail. Trois graines de Lens culinaris

(Lentille jaune large et petite, et Lentille rouge ) couramment utilisées en Algérie ont retenus

notre attention. Nous nous sommes intéressés à l’activité antibactérienne de leurs extraits

phénoliques bruts sur quelques bactéries pathogènes.

Partiebibliographique

Chapitre I :Généralités surleslégumineuses.

CHAPITRE I: Généralités sur les légumineuses .

3

1. Classification botanique

Les plantes de la superfamille des légumineuses ou leguminosae sont très

nombreuses , jusqu’à 1900 espèces (Baba-Aissa,2000). Les légumineuses, ordre de plantes

dicotylédones dont le fruit est une gousse, ou légume, et comprenant trois familles :

Césalpiniacées (exemple: Arbre de Judée) ,mimosacées (des légumineuses à fleurs

actinomorphes) et Papilionacées (Ex : pois , pois chiche ,fève et lentille), illustré en

Tableau I (Bruneton,2005 et Claude,2010) .

la plupart des légumineuses cultivées appartiennent à une des sous-familles (les

Fabiodeae ou Papilionoideae) et plus précisément aux tribus des Fabeae ,des Phaseoleae et

des Trifolieae. (Schneider et al.,2015).

Tableau N° I : Le Nom scientifique de quelques légumineuses (Siegel et Fawcett, 1978).

2. Structure de la graine de légumineuses

Les légumes secs sont des graines comestibles déshydratées des légumineuses qui

produisent entre un et douze grains de différentes tailles, formes et couleurs au sein d’un

même groupe. Leurs graines peuvent être utilisées pour la consommation humaine ou pour

l’alimentation du bétail.

Elles peuvent pousser dans des sols arides nécessitant très peu d’eau. Les plantes

légumineuses ont la capacité de fixer l’azote, un processus naturel qui a été et continue

Nom scientifique Nom(s) commun(s) Endroits où on les consomme

Vicia faba Fève des marais

Grosse fève

Pays des zones tempérées. Proche-Orient, Afrique

du Nord, Amérique Centrale et Amérique du sud.

Lens esculenta Lentille Proche-Orient, Afrique du Nord, Inde, Amérique

Centrale et Amérique du sud.

Cicer arietinum Pois chiche ,

Pois cornu

Inde, Pakistan .

Pisum sativum Pois vert, petit pois Surtout les pays tempérés, Inde, Afrique.


4

d’être important pour l’enrichissement des sols. Contrairement aux autres plantes, les

légumineuses possèdent des propriétés qui améliorent le sol dans lequel elles sont cultivé

tout en aidant les autres plantes à fleurir. Bien que petites en taille, elles renferment une

véritable force nutritive (FAO, 2016).

3. Principales caractéristiques des Légumineuses 3.1.

Valeur nutritive

Les légumineuses contiennent naturellement beaucoup de fibres et de protéines,

et sont pauvres en matières grasses illustré en Tableau II (FAO, 2016) . Elles sont d’abord

caractérises par leur richesse en protéine (sources d’éléments constitutifs) exemple : fève,

haricot, lentille, soja, féverole (Mazoyar, 2002) .Ce sont également des sources importante

de glucides environ 60% du poids sec (Huiganrd et al., 2014).

Elles comportent des fibres solubles et insolubles. Les fibres solubles sont utiles

pour faire baisser le taux de cholestérol sanguin et pour contrôler le taux de sucre dans le

sang, et les fibres insolubles aident à la digestion et contribuent à la régularité du transit

(FAO ,2016). Elles ont des teneurs naturellement faibles en acides gras saturés, et parce

qu'elles sont des aliments végétaux, elles sont également exemptes de cholestérol

(Rémond et Walrand, 2017) .


5

Tableau N° II : Compositions chimiques globales de quelques légumineuses (FAO, 2016)

47,20

,23.2. Profil des acides aminés

Les graines de légumineuses présentent un intérêt sur le plan de la richesse en

protéines et de l’équilibre en acides aminés essentiel (Tableau N° III).

Elles ont un déficil relatif en méthionine , acide aminé soufré , qui en donc le facteur

limitant réduisant la valeur biologique et donc l’efficacité biologique des légumineuses

(Huiganrd et al.,2014).

Tableau N° III : Composition en acide aminé( AA )essentiels des protéines de quelques

légumineuses alimentaire (g/16gN) (Yadav et al., 2007 et Jezierny et al., 2010 ).

47,1

NOM

COMMUN

NOM SCIENTIFIQUE Energie

(kcal)kJ

Protéine

(g)

Matière

Grasse

(g)

FIBRE

(g)

Glucide

(g)

Fève, sèche ,cru.

Niébé, sec ,cru.

Lentille.

Haricot noir.

Haricot blanc.

Pois chiche.

Pois vert sec.

Vicia faba

Vigna unguiculata

Lens culinaris

Phaseolus vulgaris

Phaseolus vulgaris

Cicer arietinum

Pisum sativum

(300)1260

(316)1330

(336) 1420

(288)1210

(315)1330

(340)1430

(308)1290

26,1

21,2

25,4

21,3

22,3

21,2

18,44

1,8

1,3

1,8

1,2

1,5

5,4

1,4

26,3

15,3

10,7

21,8

15,3

12,4

26

31,7

47,2

49,3

37

45,5

45,5

42,4

Acide amine Pisumsativumg/16gN

Fèveminorg/16gN

Lensculinarisg/16gN

Arginine 21,04 26,4 3,9-11,8

Histidine 6,1 7,8 1,3-3,36

Lysine 17,3 28,4 4,27-8,2

Méthionine 2,2 2,2 0,22-4,2

Valine 14,1 13,3 3,04-6,1


6

3.3. Vitamines et sels minéraux33

Sur le plan nutritionnel, les légumes secs sont également une sources intéressante de

vitamines du groupe B, y compris de vitamine B9 , et des sels minéraux, magnésium,

potassium et cuivre illustré en Tableau IV( Louis-Schlienger, 2014) .

Les légumineuses contribue également à la santé du système nerveux car elles

contient du folate, aussi connu sous le nom d’acide folique ou vitamine B9 , qui contribue

au métabolisme énergétique et dont nous avons besoin pour synthétiser l’AND, l’ARN et

les globules rouges . Le folate permet également de faire baissais le risque d’anomalie du

tube neural chez l’embryon et le nouveau née. Il est donc très important pour les femmes

enceintes , qui peuvent trouver du folate dans les lentilles rouges.

Les vitamine et les sels minéraux sont d’excellents antioxydants qui ralentissent le

vieillissement naturel (FAO, 2016).

Tableau IV :Les vitamines et les sels minéraux de quelques légumineuses (FAO, 2016)

3.4. Fixation de l’azote atmosphériqueL’azote est essentiel à la croissance des végétaux, notamment pour la synthèse des acides

nucléiques et des protéines. L’azote est abondant sur terre et représente 78% de l’atmosphère

NOM COMMUN FE(mg)Fer

MG(mg)Magnesium

P(mg)Phosphore

K(mg)Potassium

ZN(mg)Zinc

CU(mg)Cuivre

VIT B9/FOLATE(mg/100g)

Fève, sèche ,cru.

Niébé, sec ,cru.

Lentille.

Haricot noir.

Haricot blanc .

Pois chiche.

Pois vert sec.

6,1

7,3

7

6,5

5,49

5,4

3,5

191

187

103

188

175

146

116

506

387

391

471

407

342

295

1080

1210

855

1416

1185

1116

1010

3,1

4,61

3,9

2,9

3,65

3,2

2,39

0,82

0,68

0,74

0,83

0,834

0,67

n.a

423

417

295

444

364

557

138


7

terrestre, mais toutes les formes ne sont pas utilisables par les végétaux (Nemecek et al ., 2008).

Les légumineuses hébergent dans les nodules développés sur leurs racines, des bactéries du

genre Rhizobium qui assurent la fixation de l’azote de l’air (Duc et al., 2010).et s’active et

augmente considérablement la fertilité du sol illustré en Figure01 (FAO, 2016).

L’azote fixé par les légumineuses contribue à enrichir le sol en azote, en augmentant la

nutrition azotée et les rendements des cultures succédant aux légumineuses.

Ainsi les légumineuses influencent à long terme les propriétés physico-chimiques et

biologiques des sols (Bado, 2002).

Figure 01 :Cycle de fixation d’azote (Anonyme 1).

4. Production et Consommation de Légumineuses

4.1. Production

Les légumineuses sont cultivées partout dans le monde, mais plus particulièrement

dans des pays en développement (Inde, Chine, Canada, en Australie, au Brésil, Nigeria,)

illustré en Figure 02 (Gordon, 2002).


8

Figure 02 : La production mondiale de quelques légumineuses (FAO, 2016).

Cette production mondiale des légumineuses à graines représente 12,5% de la

production mondiale des céréales en 2012. Les légumineuses à graines hors soja ont connu

plus de 50% d’augmentation en 30 ans (entre 1980 et 2010). Le pois représente 10,5Mt et

la féverole 6Mt en 2010 ( Schneider et al., 2015).

Jusque aux années 2000, l’Inde produisait les deux tiers de la production mondiale de

lentille (Figure03) qui était de l’ordre de 8 Mt dans les années 1990. Le canada est ensuite

devenu le deuxième acteur majeur. De nos jours, ces deux pays produisent 60% de la

production mondiale de lentille (près de 5Mt) tous types confondus. Les autres producteurs

sont la Turquie, les Etats-Unis, l’Australie, l’Ethiopie et le Népal, l’UE produit moins du

tiers de ses besoins avec 60 000t -produites principalement en Espagne (près de 50% en

moyenne mais avec de fortes fluctuations interannuelles liées aux variations de rendement)

et en France - et importait près de 190 000 t de lentilles dans les années 2010 (Schneider

et al., 2015).

0

5

10

15

20

25

prod

uctio

n (m

illio

ns d

e to

nnes

)

pays

la production mondaile de quelques légumineuses


9

9 116

Figure 03 : La production mondiale de lentille ( FAO, 2016).

4.2. Consommation Mondiale

Les légumineuses sont consommées dans tous les pays du Moyen-Orient, de l’Afrique

du Nord, de l’Amérique latine et du sous-continent Indien afin de satisfaire les besoins

alimentaires de leurs populations. Elles sont aussi consommées dans les pays développés

mais à de moindres mesures (Gordan, 2002).

La consommation mondiale est d’environ 6kg/an/ personne en 2002 (Roudaut et

Lefrancq, 2005). Le Tableau V représente l’évolution de la consommation mondiale des

légumineuses en kg/an/personne, on constate une baisse de consommation dans les années

80 puis une légère remontée dans les années 90.

Tableau N° V : Evolution de la consommation des légumineuses (kg/an/personne).

(Roudaut et Lefrancq, 2005)

4.3. Légumineuses en Algérie

Les légumineuses alimentaires ont toujours été présentes dans les systèmes de

production agricole en Algérie .Sur le plan géographique, les espèces de légumineuses

alimentaires les plus cultivées sont la lentille le pois chiche, le pois , la fève et le haricot

(Abdelguerfi, 2003).

Asia60,4%Amérique

31,4%

Océanie3,9%

Afrique 3% Europe 1,3%

la production mondiale de lentille

1880 1937 1960 1985 1996 2002

10 5 ,5 3,7 1,4 1,7 2


10

La production nationale de légumes secs ne satisfait pas tous les besoins de la

population algérienne. Malgré une augmentation des surfaces réservées à cet effet ; le

rendement reste assez faible de 0,4 à 1,4 tonnes/ha (Amir et al., 2006).

La production de légumineuse dans la wilaya de Ain Defla est représenté dans le Tableau

VI.

Tableau VI : La production de légumineuses dans la willaya de Ain Defla (DSA, 2018).

5.Présentation des légumineuses étudiées

5.1.Lentille

Lens culinaris ou Lens esculenta plante annuelle, de 45 cm de hauteur, porte

des feuilles composés de six paires de folioles oblongues, les folioles supérieures étant

transformées en vrilles, ses fleurs de pois bleu pâle sont suivies de gousses renflées

contenant deux graines. Ce genre compte six espèces de légumineuses annuelles,

originaires de la méditerranée, de l’ouest de l’Inde et d’Afrique (Geoff Burnie et al.,

2006)

La lentille est l’une de nos plus anciennes plantes alimentaires cultivées .Ses

feuilles, à stipules lancéolées, terminées par une longue vrille simple, présentent 5 à 7

paires de folioles. les fleurs, petites et de couleur bleuâtre, sont groupées par 2 ou 3 à

l’aisselle des feuilles. Les gousses, courtes, planes et tronquées, contiennent 2 graines

aplaties riches en protéines (25% de matière fraiche) illustré en Figure 04 ( Mazoyar,

2002).

Evolution des Légumes Secs par Espèces wilaya de Ain Defla 2012-2016

Com

pagn

es

Fèves- féveroles Pois secs Lentilles

Superficie Production Rdt Superficie Production Rdt Superficie Production Rdt

Ha Qx qx/ha Ha Qx qx/ha Ha Qx qx/ha

2012 1963 27883 14,2 428 6034 14,1 0 0 0,0

2013 2282 24845 10,9 370 4050 10,9 0 0 0,0

2014 1971 22446 11,4 299 2345 7,8 4 60 15,0

2015 2300 23000 10,0 236 4527 19,2 0 0 0

2016 2 025 23 340 249,5 250 2 483 221,0 23 221


11

Figure 04 : Les partie de la plante de Lentille (graine, fleur et fruit) (Baba Aissa, 2000).

5.1.1. Systématique

Règne: Plantae

Division: Magnoliophyta

Classe: Magnoliopsida

Ordre: Fabales

Famille: Fabaceae

Genre: Lens culinaris

5.1.2. Composition biochimique de lentille ( Lens culinaris)

La teneur en matière grasse des lentilles est faible (0,7 -3,6%) est présenté dans le

Tableau VII. Les acides gras insaturés (linoléique, oléique et linoléique) dominent le

profil de lentilles avec de petites quantités d'acides gras saturés, principalement l'acide

palmitique (Kumar et al ., 2006).

La concentration des glucides dans les lentilles entières varie de 43 à 70%. La

fraction glucidique comprend des sucres individuels solubles tels que le fructose, glucose

et le saccharose (de 1 à 2,5%), des polysaccharides et l'amidon (35 à 63%) avec une teneur

en amylose de 20 à 45,5% (Yadav et al., 2007).


12

Tableau N° VII : Distribution des constituants chimiques des différentes parties

anatomiques de la lentille par 100 g de poids sec (Adsule et al., 1989 et Cuadrado et al.,

2002).

5.1.3.Culture

La lentille présente un bon comportement sous le climat méditerranéen , ou

l’alternance thermique jour-nuit est marquée. Son zéro végétatif (température minimale de

développement) se situe à 6°C environ. Elle affectionne les sols plutôt légers, sablo-

limoneux. l’implantation de la culture se fait par semis direct au champ du 20 mars au 15

mai, à une densité de 250 à 350 semences/m2 (espacement de 15 à 20 cm entre les rangs),

soit 85 à 200 Kg de semences/ha (Marcel, 2002)

5.1.4. Types de lentille

Il existe différentes variétés de lentille qui sont répertoriées selon leur couleur :

*Lentille du Puy

Cette petite lentille, d’un bleu-vert foncé, semblable à une perle ,provient de la

région Auvergne, dans le centre de la France. Considérée comme la plus savoureuse de

toutes les variétés, elle conserve sa forme pendant la cuisson (FAO, 2016) .

*Lentille rouge

Riche en couleur et en goût, cette lentille cassée de couleur orange foncé, aussi

appelée lentille égyptienne ou masoor daal est la variété la plus répandue. Bien que la

lentille soit assez dure même lorsqu’elle est fraîche, contrairement aux autres légumes secs

(FAO, 2016)

*Lentille jaune

Même si moins connue que la lentille rouge, la variété jaune vif est semblable en

goût et se cuit de la même manière (FAO, 2016) lentilles jaunes. Aucune de ces variétés

n’est utilisée fraîche; elles sont séchées dès qu'elles sont mûres (Yadav et al., 2007).

Composés Téguments Cotylédons Graine entière

Protéine 14,3 26,5–30,1 29,6Matieres grasses 0,6 3,0 3,1Fibres 29,4 1,0 3,2Cendres 1.94 2.45 2.40Azote libre 53.7 63.4 61.7


13

* Lentille verte et brune

Contrairement aux variétés rouges et jaunes, cette lentille commune en forme de

disque, connue également sous le nom de lentille continentale. Bien qu’elle se ramollisse,

elle conserve sa forme (FAO, 2016).

*Lentille d’Ombrie

L’Italie et la cuisine méditerranéenne sont traditionnellement connues pour leurs

savoureuses lentilles. Cette lentille italienne brune et dorée est souvent cuisinée avec des

oignons, de l’ail et des fines herbes. Les Italiens marquent la nouvelle année en mangeant

des lentilles peu après minuit (FAO, 2016).

5.1.5. Facteurs antinutritionnel de Lens culinaris

En étant très nutritives, les graines de lentilles contiennent également des facteurs

antinutritionnels (Yadav et al ., 2007) tels que les inhibiteurs de protéase, les lectines ou

phytohémagglutines qui causent des flatulences et qui peuvent même traverser la barrière

gastro-intestinale ; elles peuvent atteindre les liquides organiques et les tissus où elles

pourraient exercer plusieurs fonctions physiopathologiques. Ces Facteurs antinutritionnel

peuvent être minimisés selon (Jumbunathan et al ., 1994) par certain traitements tels que

le chauffage, l'eau de trempage et la germination (Tableau VIII).

Tableau N° VIII : Teneurs en facteurs antinutritionnels des lentilles (Yadav et al ., 2007).

Facteurs antinutritionnels Teneurs

Inhibiteurs de trypsine et de chymotrypsine 2.7 - 6.1 U/mg

Inhibiteurs d’α-amylase 2 - 18 U/mg

Lectines 0.2 - 7.7 U/mg

Tannins <0.5 - 10.9 mg/g

Acide phytique 0.15 - 2.34 g/100g

α-galactosides 1.8 - 7.5 g/100g

Chapitre II : Composés phénoliques et les activités antibactériens.

Chapitre II : Les composées phénolique et les activités antibactériennes

14

I. Composés phénolique

I.1. Généralités sur les composés phénoliques

Les polyphénols sont des métabolites secondaires, d'un poids moléculaire élevé. Ils

sont largement distribués dans le règne végétal (Haslam, 1988). La structure de base qui

les caractérise est la présence d'un ou plusieurs noyaux aromatiques auquel sont

directement liés un ou plusieurs groupements hydroxyle libres ou engagés dans une autre

fonction éther et ester (Harborne, 1994).

I.2. Classification des polyphénols

Les composés phénoliques sont synthétisés par plusieurs voies réactionnelles, les

plus importantes sont les voies du shikimate, acétate-malonate et acétate-mévalonate. Plus

de 8000structures sont identifiées et réparties en différentes classes(Tableau IX) selon

leurs structures chimiques de base (Castelluccio et al., 1995 ; Lee et al., 2004 et

Soobrattee et al., 2005).

Tableau N° IX : principales classes de composés phénoliques rencontrés chez les plantes

(Baba-Aissa, 2000)

Nombre d’atomesde carbone

Structure Classe Exemple

6 C6 Phénols simples Arbutine, catéchol7 C6-C1 Acides phénoliques Acides gallique,

sallicylique9 C6-C3 Acides

hydroxycinnamiquesAcides caféique,coumarique

Coumarines Ombelliférone,khelline10 C6-C4 Naphtoquinones Jugloneplombagone13 C6-C1-C6 Xanthones Mangiférine14 C6-C2-C6 Stilbénes,

AnthraquinonesAcidelunularique,Emodine,hypéricine

15 C6-C3-C6 Flavonoides,Isoflafonoides

Quercétine,Génistéine

18 (c6-c3)2 Lignanes Podophyllotoxine30 (C6-C2-C6)2 Biflavonoides AmentoflavoneN (C6-C3) n Lignines


15

I.2.1. Acide phénolique

Les acides phénoliques sont largement distribués dans les fruits ,les tiges et les

feuilles des légumes (Morton et al., 2000).Les acides phénoliques, ont une fonction acide

et plusieurs fonctions phénols. Ils regroupent deux classes, les acides hydroxybenzoiques

(Figure 05) et les acides hydroxycinnamiques (Skerget et al ., 2005;Macheix et al.,

2006).

Figure 05 : Les principales structures des acides hydroxybenzoiques et

hydroxycinnamiques (Chira et al., 2008).

I.2.2. Flavonoïdes

Les flavonoïdes (plus de 4000) ont une origine biosynthétique commune et de ce

fait, ils possèdent la même structure de base (Figure 06) composée de 15 atomes de

carbone formant une structure C6-C3-C6 (2 noyaux aromatiques A et B et un hétérocycle

oxygéné C) (Macheix et al., 2006;Bruneton, 2008). Ils donnent des couleurs allant du

jaune clair au jaune or. Selon les détails structuraux, les flavonoïdes se divisent en 6

groupes : flavones, flavonols, flavonones, isoflavones, chalconesetaurones. Ces composés

existent sous forme libre dite aglycone ou sous forme d’hétérosides, c'est à-dire liée à des

oses et autres substances (Heller et Forkmann, 1993).

Figure 06 : Squelette de base des flavonoïdes (Macheix et al., 2006).


16

I2.3. Tanins

Ce sont des formes phénoliques condensées ayant une masse moléculaire élevée

allant de 500 à 3000 Dalton (Guignard, 2000), en plus des propriétés classiques des

polyphénols les tanins sont capables de précipiter les alcaloïdes et les protéines solubles

(Bruneton, 2008). On distingue deux grands groupes de tanins, différents à la fois par leur

réactivité chimique et par leur composition: les tanins hydrolysables et les tanins condensés

(Macheix et al., 2006).

* Tannins hydrolysables

Sont des esters d’acide gallique (Figure 07) qui se lient aux molécules de glucose

(Sarni-Manchado et Cheynier, 2006). Les gallotannins et les ellagitannins sont appelés

tannins hydrolysables. Comme leur nom l’indique, ces composés peuvent être dégradés en

fragments simples (acides phénols et sucres). (Naczk et Shahidi, 2004).

Figure 07 : Structure de l’acide gallique et l’acide éllagique (Naczk et Shahidi, 2004).

* Tannins condensés

Proanthocyanidines : ce sont des composés phénoliqueshétérogènes. Ils se trouvent

sous forme d’oligomères ou polymères de flavanes, flavan-3-ols,5 desoxy-3-flavonols et

flavan-3,4-diols (Figure 08). Les polymères donnent une structure hérissée d’OH

phénoliques capable de former des liaisons stables avec les protéines (Montenegro de

Matta et al,.1976, Sarni-Manchado et Cheynier, 2006).


17

Figure 08 : La structure d’un tanin condensé (Macheix et al., 2006).

I.2.4. Anthocyanes

Les anthocyanes donnent des couleurs très variées : bleu, rouge, mauve, rose ou

rouge. Ces molécules ont, comme les flavonoïdes, un squelette de base en C15 formé de

deux cycles A et B, et d’un hétérocycle (cycle C).Leurcaractéristique principale est que ce

dernier est chargé positivement. Cette charge est due à leur structure de base commune : le

cation flavylium ou 2 phenyl 1-benzopyrilium (Heller et Forkmann, 1993).

I.3. Propriétés biologiques des polyphénols

Chez les plantes, les composés phénoliques sont impliqués dans différentsprocessus

comme la germination des graines et la croissance des plantes (Marcheix et al., 2005).

Ces dernières années les recherches sur les composés phénoliquesse sont

accentuées en raison de leurs activités antibactériennes, antifongiques et antioxydant et

même anticancéreuse (Montoro et al., 2005).

I.3.1. Activité antioxydants

Il est connu que certaines propriétés pharmacologiques des polyphénols sont dues à

leur activité antioxydant (Morton et al., 2000). Un antioxydant est une substance qui

inhibe ou retarde significativement l’oxydation d’un substrat par chélation de radicaux

libres qui sont à l'origine de diverses maladies. (Berger et Que 2009).

I.3.2. Activité antimicrobiennes

Les composés phénoliques ont une activité antibactérienne très vaste et très

diversifiée. En effet, ils s’attaquent à un grand nombre de bactéries avec une intensité


18

différente selon le microorganisme et l’écosystème dans lequel il se trouve. Les

flavonoïdes sont capables d’inhiber la croissance de différents types de bactéries :

Staphylococcus aureus et Escherichia coli (Babayi et al., 2004).

Les polyphénols ont une activité antifongique très puissante. Batawita et ses

collaborateurs, (2002), dans leur étude sur les flavonoïdes de Conyzaaegyptica L., ont

démontré que ces molécules avaient une action fongicide etfongistatique sur différents

agents de mycoses Microsporumcanis,Microsporumgypseum,Trichophytonmentagrophytes

et Candida zeylanoïdes. D’autres flavonoïdes extraits de Tibouchinagrandifolia ont montré

une forte activité antifongique contre différents types de moisissures (Kuster et al., 2009).

I.3.3. Activité anticancéreuse

Les substances polyphénoliques sont capables d’activerles mécanismes naturels de

ladéfense anticancéreuse. En effet, les premiers stades de la phased’initiation cancéreuse

peuvent être bloqués par la capacité des tissus cibles à intercepter et àmétaboliser les

agents mutagènes. Des cellules impliquées, comme les hépatocytes, synthétisent des

enzymes dites de phase I (notamment des monooxygénases, telle que les cytochromes P-

450) qui peuvent oxyder les substances mutagènes hydrophobes en produitsconstituant le

substrat des enzymes de phase II (glucoronyl transférases, sulfotransférases...).

Ces dernières convertissent leurs substrats en espèces hydrolysables facilement

excrétées hors des cellules. Les enzymes de phase I et II agissent également dans la

muqueuse intestinale. Elles sont synthétisées sous l’action des substances polyphénoliques

trouvées dans leslégumes, et aussi sous l’action des isothiocyanates qui sont dérivés des

glucosinolates (Ames et al., 1995).

I.3.4. Autres effets biologiquesLes polyphénols peuvent aussi empêcher le diabète ou du moins le réduire en

inhibant l’enzyme aldose réductase. Il a été constaté que la myricétine possède un effet

hypoglycémiant chez des animaux diabétiques. Certains flavonoïdes peuvent entraver

l’athérosclérose et par conséquent réduisent le risque des maladies cardiovasculaires (Cook

et Sammam, 2006).

4. Biodisponibilités des polyphénols

L’organisme humain ne synthétise pas de polyphénols, mais de manière générale

ils sont largement dans répandus dans le règne végétal (Tableau X) En effet, les

polyphénols se retrouvent dans notre alimentation quotidienne, ainsi les fruits et légumes


19

et toutes les parties des plantes sont pour l’homme des sources considérables de composés

phénolique (Sagols et Priymenko, 2010).

Tableau N° X: Sources principales de polyphénols dans l’alimentation et leur Teneur en

polyphénols en mg/kg) (Sagols et Priymenko, 2010)

Aliment Teneur en polyphénols

Thé 100-800

Raisin noir 300-7500

Pomme de terre 100-190

Soja 200-900

Farine de soja 800-1800

Farine de mais 310

Farine de blé 70-90

Pomme 50-600

Haricot 350-550

Chapitre II : Les Composés phénoliques et les activités antibactériennes

20

II. Activité antibactérienne des polyphénols

Les polyphénols considérés comme étant les principaux composés antimicrobiens

des plantes. Ils peuvent affecter la croissance et le métabolisme des microorganismes

(Vaquero et al., 2007 et Viswanath et al., 2009).

II.1. Méthodes d’étude de l’activité antibactérienne

L’examen des données bibliographiques fait apparaitre la diversité des

méthodologies utilisées pour mettre en évidence l’activité antibactérienne des extraits de

lentille, le choix de la méthode dépend de la nature des substances testées. (Guerrin-

Fauble et Carret, 1999).

II.1.2. Antibiogramme

Appelée aussi méthode des disques ou méthode par diffusion en milieu gélose;

cette Technique consiste à utiliser des disques imprégnés de différents extraits à tester,

puisles déposés à la surface d’une gélose uniformément ensemencée avec la suspension

de la bactérie à étudier. Après incubation,les colonies se développent à la surface de la

géloseenlaissant des zones vierges autour des disques appelées «zone d’inhibition».

Le diamètre de ces zones d’inhibition est proportionnel àl’activité de la substance sur le

germe testé, plus le diamètre de la zone d’inhibition est grand plus la souche est sensible

à la substance testée et plus le diamètre est plus petit, plus la bactérie est résistante

(Guerrin-Fauble et Carret, 1999).

II.1.3. Méthode de diffusion en puits

Selon Shan, (2007) cette méthode assure une diffusion radiale des substances

testées à partir d’un puit en donnant une zone d’inhibition claire facilement mesurable.

Elleconsiste à découper un trou circulaire dans la gélose et y verser une solution de la

substance à une concentration connue.Lasubstance diffuse radialement en donnant une

zone d’inhibition circulaire à la surface de la gélose préalablement ensemencée avecla

suspension bactérienne.

II.1.4. Méthode de détermination de l’effet bactériostatique ou bactéricide

La détermination de l’effet bactériostatique ou bactéricide est réalisée par un

repiquage en procédant à un prélèvement à partir des zones d’inhibition formées et ne

présentant aucune croissance bactérienne visible à l’œil nu sur milieu de culture. S’il y a


21

croissance bactérienne, la substance testée a un effet bactériostatique sur la souche

étudiée. S’il y a absence de croissance bactérienne, l’extrait testé a un effet bactéricide

vis-à-vis de cette souche.

Lors de la détermination de l’effet bactériostatique ou bactéricide des composés

phénoliques deux paramètres doivent être pris en compte :

CMI : concentration minimale inhibitrice: plus petite concentration d'antibiotique qui

inhibe toute culture visible d'une souche bactérienne après 18 heures de culture à 37°C.

Cette valeur caractérise l'effet bactériostatique d’une substance testée.

CMB : plus petite concentration d'antibiotique laissant 0,01% ou moins de survivants de

l'inoculum initial après 18 heures de culture à 37°C. Cette valeur caractérise l'effet

bactéricide d’une substance testée. Différentes techniques dérivent de ces deux mesures;

le laboratoire de bactériologie effectuera ces techniques en fonction des différentes étapes

de l'analyse bactériologique (Archambaud, 2000).

II.2. Facteur influençant l’effet antibactérien

II.2.1. Facteur liés aux composés phénoliques

L’activité antibactérienne des polyphénols est directement liée à leur structure

chimique. L’efficacité d’un composé phénolique dépend de son poids moléculaire et de

son hétérogénéité (Hagerman et Bulter, 1981). La toxicité microbienne des polyphénols

semble être relative à la position et au nombre de groupements hydroxyles du cycle

phénolique ; une augmentation de l’hydroxylation augmente la toxicité et l’activité

antimicrobienne (Cowan, 1999).

De plus, il a été démontré que l’activité antibactérienne ne dépend pas d’un seul

composé phénolique, plutôt, elle peut être résultante d’effet synergique de deux ou de

plusieurs composés. Le p-cymene associé au carvacrol exerce un effet synergique contre

certain bacille et cela en augmentant la perméabilité de la membrane cytoplasmique et

facilitant la pénétration du carvacrol (Ultree et al ., 2000).

II.2.2. Facteur liés aux microorganismes

Les microorganismes présentent sensibilités variables vis-à-vis des composés

phénolique (Jeon et al., 2009). L’état physiologique influe énormément sur cette


22

sensibilité. Les germes en phase exponentielle de croissance sont résistants que âgés de

24 heures ou plus (Meyer et al., 1995).

La structure de la paroi des microorganismes intervient dans la résistance

naturelle, ainsi, l’activité antibactérienne varie selon que la bactérie en question soit

Gram +ou Gram-. D’une manière générale, les polyphénols sont plus actif sur les

bactéries Gram+ que les bactéries Gram -. Cela revient au fait que la paroi des bactéries

Gram-limite la diffusion des composés hydrophobe par sa couche de lipopolysacharides

(Lambert et al., 2001 ; Tian et al .,2009).

La concentration de l’inoculum est considéré comme le facteur le plus important

dans l’activité antibactérienne (Ozaki et al., 1991), ont montré que L‘activité

antimicrobienne dépend de la nature du composé phénolique.

II.3. Bactéries étudiées

II.3.1. Entérobatériaceae

Selon Brenner (1992) la famille comprendrait actuellement 29 genres, 107

espèces nommés et au moins 50 espèces en attente de classification. La liste de quelques

genres actuellement définis est donnée dans ce tableau (Leeler et al., 1995)

Tableau N° XI : Quelques genres de famille des Entérobatériaceae ( Leeler et al .,

1995)

Enterobacter

Erwinia

Escherichia

Klebsiella

Morganella

Proteus

Salmonella

Shigilla

Yersinia

II.3.1.1. Escherichia coli

Est l’un des résidents les plus communs de l’intestin des humain, et c’est

probablement l’organisme le mieux connu en microbiologie. La présence d’E. coli dans


23

l’eau ou les aliments est un indice de contamination fécale, il cause parfois des infection

des vois urinaires (Martin, 2012).

II.3.1.2. Klebsiella pneumonie

Sont des bactérie à Gram négatif , bâtonnet tantôt court , tantôt long (0,4µ à 3µ ) ,

assez large (0,5 µ à 0,8µ ) souvent groupé en deux élément , parfois en courtes chainettes,

immobile, non sporule et est une bactérie pathogène opportuniste (Fasquelle et al.,

1999).

II.3.1.3. Proteus mirabilis

Les genres des Proteus sont des bacilles de 0,4-0,8 × 1-3 µm de diamètre (Don. J

et al., 2007 ), à Gram négatifs, mobiles et aérobie ( Bergan, 1984).

Il contient 5 espèces : Proteus vulgaris est le type espèce, Proteus mirabilis,

Proteus penneri, Proteus myxofaciens et Proteus hauseri. Proteus mirabilis sont des

pathogènes opportunistes qui sont une couse importante d’infection des voies urinaires

chez l’homme (Eyquem, 2000)

Les caractères de ces genres représentent dans le tableau ci-dessus :


24

Tableau N° XII: Quelques caractéristiques de genres sélectionnés parmi les

Entérobatériaceae (Lansing et al., 2003)

Caractéristiques Escherichia Shigilla Salmonella Proteus Klebsiella

Voges-

Proskauer

- - - + ou - +

Production

d’indole+ + ou - - + ou - + ou -

Utilisation de

citrate

- - + + ou - +

Production

d’H2S - - + + -

Uréase - - - + +

Gaz à partir de

glucose + - + + +

Phénylalanine

désaminase - - + + -

Lysine

décarboxylase + - + - +

Ornithine

décarboxylase + + ou - + + ou - -

Mobilité + ou - - - + -

%CG 48-52 49-53 50-53 38-41 53-58

(+) : Présence ;(-) : Absence


25

II.2. Staphylocoque

Bactérie à Gram positif, arrondie, de 0,8 à 1µm de diamètre, dont les individus

sont, aérobie-anaérobies facultatives, immobiles (Tableau XIII) et généralement groupés

en amas plans irréguliers ( Mazoyer, 2002) .

Une espèce Staphylococcus aureus (staphylocoque doré), tient une place très

importante dans les infections communautaires et nosocomiales (Chambers, 1997).

Tableau N° XIII : Différenciation des espèces et sous-espèces de staphylocoques à

coagulase positive et ou à clumping factor –positif ( Yves et Michel, 2009).

Caractères S. aureus S.delphini S.hyicus

Taille de la colonie

±6mm + - +

Pigmentation de la

colonie + - -

Staphylocoagulase + - +

Clumping factor + - -

Hémolyse + + +

Catalase + - +

Uréase D ND +

(+) Concerne 90%ou plus des souches sont positives ;(-) :90%ou plus des souches sont négative ; ND, non

déterminé ; D : 11à89%des souches sont positive.

II.3. Pseudomonas

Les bactéries du genre Pseudomonas sont des bacilles à Gram négatif, mobile,

rarement immobiles, non sporulés, ils sont oxydase positif, ils se présentent se forme de

bâtonnets droits et fins 0,5 à 1,3µm (Tableau XIV). Le genre Pseudomonas était un

genre pléthorique avec 160 espèces répertoriées en 1957. L’édition 1974 de Bergey’s

Manual retenait 29 espèces dont 13 d’intérêt médical ; en 1984, il gardait 30 espèces

principales (Eyquem, 2000).


26

Tableau N° XIV : Caractères d’identification des principales espèces de

Pseudomonas(P) (Eyquem, 2000)

Caractères P. aeruginosa P. fluorescens P.putida

Oxydase + + +

Flagelles 1 >1 >1

King A + - -

King B + + +

ADH + + +

Caractères

complémentaires

Culture 41°C

+

Culture 41°C

-

Culture 41°C

-

(+) : positive, (-) : négative.

Partieexpérimentale

Matérielet méthodes

Partie pratique Matériel et méthodes

27

I. Matériel et méthodes

I.1. Objectif

La partie pratique est réalisée au niveau du laboratoire de biochimie et de

microbiologie à l’université Djilali Bounaama Khemis Miliana, ainsi qu’au niveau du

laboratoire d’analyses médicales privé Abaddeni Aicha à Ain Defla pour une période de 2

mois.

I.1. Matériel végétal

I.1.1. Origine des échantillons

Cette étude à été réalisée sur trois variétés de lentille (Lens culinaris), produites localement et

récoltées en 2016 (Figure 09) provenant de l’Institut Technique des Grandes Culture (ITGC),

Bir Oueld Khelifa à Ain Defla :

La variété Petite blonde de Dahra (LP), avec des cotylédons jaunes.

La variété Large blond de Dahra (LL), avec des cotylédons jaunes.

La variété Idleb roux, lentille corail(LR), avec des cotylédons rouge.

Figure 09: Les trois variétés de lentilles.


28

I.1.2. Broyage

Les échantillon sont nettoyés, puis concassés grossièrement à l’aide d’un mortier

et pilon, ensuite broyés au moyen d’un broyeur électrique. Les poudres sont tamisées (Tamis

agitateur AS 200; Retsch GmbH, Haan, Germany), afin d’obtenir des poudres dont la taille des

particules est ≤ 0,5 mm (Figure 10), pui s sont conservées s dans l'abri de la lumière pour éviter

toute détérioration de l’échantillon. Annexe 1

Figure 10 : Poudres de lentilles

I.2. Dosage des composés phénoliques

I.2.1. Extraction

L'extraction est une étape très importante dans l’isolation, l'identification et l'utilisation

des composés phénoliques (Bucić-Kojić et al., 2007). L’extraction des composés phénoliques

effectuées par macération selon la méthode décrite par Oomah et al ., (2010) schématisé

dans la figure 11. L’éthanol à 80% et l’eau distillée stérile ont été utilisés comme solvant.

L’extraction utilisée dans cette étude est de type solide-liquide (contact direct entre le solide

est le solvant). Son principe consiste à la séparation des composés phénoliques solubles par

diffusion à partir d’une matrice solide (poudre) en utilisant une matrice liquide


29

(solvant).Quand une matrice solide est en contact avec un solvant, les composants solubles

dans le matériel migrent vers le solvant ; ainsi l'extraction est due au transfert de matière du

principe actif de la matrice vers le solvant (Kamaliroosta et al., 2012).

Figure 11 : Protocole d’extraction des composés phénoliques (Oomah et al ., 2010).

I.2.2. Dosage des phénols totaux solubles

Le dosage des polyphénols totaux solubles a été réalisées par la méthode au Folin-

Ciocalteu (Figure 12) décrite dès 1965 par Singleton et Rossi modifiée par Skerget et al.,

(2005).

Le réactif de Folin-Ciocalteu est un acide de couleur jaune constitué par un mélange

d’acide phosphotungstique (H3PW12O40) et d’acide phosphomolybdique (H3PMo12O40).

L’oxydation des composés phénoliques par le réactif de Folin- Ciocalteu résulte de la

réaction entre l’acide phosphotungstique (H3PW12O40) et l’acide phosphomolybdique

(H3PMo12O40) en milieu alcalin. Cette réduction se traduit par l’apparition d’une coloration

80 ml de solvant

Agitation pendant 2 h, puisfiltration sous vide.

Centrifugation 5000tr/min.

Récupération des surnageants etles stocker à 4°C.

2g de poudre de lentille


30

bleue formée d’un mélange d’oxyde bleu de tungstène (W8O23) et de molybdène (M8 O23) qui

sont proportionnels à la concentration en polyphénols dans le mélange (Ribérau-Gayon,

1982).

Figure 12 : Protocole de dosage des polyphénols totaux solubles (Ribérau-Gayon, 1982)

L’acide gallique (0 – 1 mg/ml), est utilisé comme standard (Annexe 4).Les résultats sont exprimés en mg équivalent d’acide gallique par g d’échantillon (mg Eq.

AG/ g).

I.2.3. Dosage des flavonoïdes

La teneur en flavonoïdes est déterminée par la méthode colorimétrique décrite par

Bahorum et al ., (1997). Cette méthode est basée sur la formation de complexes jaunâtre

suite à la chélation de métaux Al+3, utilisés sous forme de chlorure d’aluminium (AlCl3), par

les groupements OH (Figure 13). La coloration ainsi formée est proportionnelle au taux de

flavonoïdes dans le mélange (Ribereau-Gayon, 1982).

200µl d’extraits 1ml de réactif Folin-Ciocalteu(1N dilué à 0,1N).

Mesure d’absorbanceà 760 nm

Incubation à 50°Cpendant 5 min

0,8ml desolution carbonatede sodium de 75g/l.

Incubation pendant5 min


31

Figure 13 : Protocole de dosage des flavonoïdes (Bahorum , 1997)

La quercétine (0 – 0,02 mg/ml), a été utilisée comme standard (Annexe 4). Les résultats sont exprimés en mg équivalent quercétine par g d’échantillon (mg Eq. Q/ g).

I.3. L’activité antibactérienne

I.3.1. Matériel biologique

I.3.2. Origine des souches bactériennes testées

L’activité antibactérienne a été testée sur cinq souches isolées dans le laboratoire

médical privé Abaddeni Aicha à Ain Defla (Annexe 2). Quatre d’entre elles hoviennent de

patients souffrants d’infections urinaires (Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli, Proteus

mirabilis et Klebsiella pneumonie) et la cinquième (Staphylococcus aureus) à partir d’un pus

d’abcès. Annexe 1

I.3.3. Conservation des souches

Les souches ont été conservées à 6°C dans des tubes stériles contenant 09 ml de

milieu de culture incliné gélose nutritive.

I.3.4. Repiquage des espèces bactériennes

1ml de chlorured’Aluminium (AlCl3) à 2%

1ml d’extrait

Homogénéisations

Incubation à l’abri de lalumière pendant 15 min

Mesure d’absorbance à450nm


32

Les différentes espèces bactériennes ont été repiquées par la méthode des stries, puis

incubées à 37 °C afin d'obtenir des colonies isolées qui vont servir à la préparation de

l’inoculum.

I.3.5. Identification bactérienne

Les bactéries Entérobatériaceae Staphylococcus

aureus

Pseudomonas

aeruginosa

Les tests

Coloration de Gram,

TSI, Urée -Indole,

mannitol, citrate de

simmons, ONPG,

ADH, LDH, ODC et

Clark et Lubs.

Coloration de Gram,

Coagulase et catalase

Coloration de Gram,

King A, King B et

mannitol

Les résultants de l’identifications sont résumés en Annexe 3.

I.3.6. Préparation des suspensions bactériennes

Des colonies bien isolées ont été prélevées à l'aide d'une anse de platine stérile puis

ont été préparées dans 09 ml d’eau distille stérile, pour obtenir des dilutions décimales

de 10-1à 10-3.

Un volume de 0,1ml est prélevé de la dilution 10-3 et est ensemencé en surface sur gélose

nutritive (2 boites), après incubation à 37°C pendant 24h, un dénombrement est réalisé. La

concentration bactérienne (en UFC/ml) est obtenue par l’application de la loi suivante := ∑C(vx1,1d)∑ Somme des colonies comptées sur les deux retenues.

V Volume de l’inoculum (1ml en masse/ 0,1 ml en surface).

d Dilution correspondant à la première boite retenue, avec l’inoculum

le moins dilué.

Les calculs et résultats de la concentration bactérienne (en UFC/ml) se trouvent en Annexe3.


33

I.3.7. Ensemencement des boites

La gélose de Muller Hinton stérile prête à l’usage a été coulée dans des boites Pétri

stériles de 90 mm de diamètre. L’épaisseur de la gélose est de 3mm répartie uniformément

dans les boites. Ces dernières doivent être solidifiées à une température ambiante (30 min)

avant leur emploi.

Des boites Pétri préalablement coulées, sont ensemencées par écouvillonnage (Figure

14) à partir de la dilution 10-3. Cette méthode permet une distribution homogène des bactéries.

Quatre boites ont été ensemencées pour chaque bactéries(deux pour l’extrait éthanolique et

deux pour l’extrait aqueux).

Figure 14 : Ensemencement par écouvillonnage.

I.3.8. Méthode de diffusion sur milieu solide

I.3.8.1. Méthode de diffusion en puits

Pour chaque boite de Pétri préalablement ensemencée, 3 puits ont été réalisées à l’aide

d’une pipette Pasteur, aux quels attaché sont injectés 30 µl et 40 µl, respectivement.

L'activité antibactérienne est déterminée en termes de diamètre de la zone d'inhibition

produite autour des puits après 24 h d'incubation à 37° C.

I.3.8.2. Méthode de l'aromatogrammeL’évaluation de l’activité antibactérienne des extraits a été réalisée par la méthode

d’aromatogramme selon (Vincent, 1991; Kavbouche et al., 2005 et Ormeno et al.,2007).

Le principe de l’aromatogramme est inspiré de l’antibiogramme, il consiste à tester la

sensibilité des souches bactériennes par la diffusion de l’extrait sur un milieu solide dans une

boite de Pétri. L’apparition et l’importance du diamètre de la zone d’inhibition (Figure 15)


34

reflète l’impact des extraits éthanoliques et aqueux sur les souches bactériennes. Ainsi, ces

dernières seront qualifiées de sensibles, très sensibles, ou résistantes (Ouibrahim, 2015).

Disque imprégné croissances bactériennesd’extraits

Zone d’inhibition

Figure 15 : Schéma du principe de la méthode d’aromatogramme (Ouibrahim, 2015).

Des disques (patchs) de 5 mm de diamètre ont été découpés sur du papier Wattman

n°1 puis stérilisées au four Pasteur à 120°C pendant 20 min.

Les bactéries ont été ensemencés par étalement sur des boites de Pétri contenant la gélose

Muller-Hinton Les disques ont été ensuite imprégnés chacun par 10 µl et 20 μl de principe

actif extrait et déposés sur la surface des géloses (Figure 16).

Pour les bactéries, l’incubation s’est faite à 37°C pendant 24 H (Osato, 2009).

.Figure 16 : Protocole de l’activité antibactérienne des extraits.

La lecture des résultats se fait par la mesure des diamètres d'inhibition qui sont

représentés par une auréole claire formée autour de chaque disque. Les résultats sont exprimés

selon les niveaux d'activité.


35

Niveaud’activité

Résistant Sensible Très sensible Extrêmement

sensible

Diamètre (D < 8) (8 >D >14) (15 >D >19) (D >20)

Les bactéries montrant une sensibilité aux extraits sont sélectionnées pour déterminer

la concentration minimale inhibitrice (Derwich et al., 2010). Plus la zone d’inhibition

mesurée est grande, plus le germe est sensible.

II. Analyse statistique

Toutes les déterminations ont été réalisées en triple. Les résultats sont exprimés par la

moyenne ± écart type. Les résultats ont fait l’objet d’une analyse multifactorielle (Facteur 1 :

échantillon et Facteur 2 : solvant), suivie d’une comparaison multiple des moyennes (Test

LSD) au moyen du logiciel Statgraphics plus Centurion XVI (Statpoint Technologies

,Warrenton , USA ). Les différences sont considérées comme significatives à p<0,05.

Résultats d’analyses statistique illustré en annexe 05.

Résultats

et discussion

Partie pratique Résultats et discussion

36

II. Dosage en composés phénoliques

L’expérimentation a mis en jeu le facteur solvant d’extraction (éthanol 80%, eau distillée

stérile) et l’échantillon (LL, LP, LR)

II.1. Dosages en phénols totaux solubles

Les résultats de dosage des phénols totaux solubles obtenus (Figure 17) révèlent

une variabilité de teneur entre les différents extraits des différentes variétés de lentille

.L’analyse de la variance montre un effet significatif (p<0,05) du facteur solvant

(P1 :0,5613) et échantillon (P2 :0,0184) sur la concentration en polyphénols.

Il est difficile de comparer nos résultats aux données de la littérature .selon Zia UI-

Haq et al.,(2007) de nombreux facteurs peuvent être à l’origine de cette variation de

composition (période de culture ,stade de maturité ,condition et environnement

,conservation et traitement ).

Les valeurs suivies de lettres différents sont significativement différentes (p<0,05).

Figure 17 :Teneur en phénols totaux solubles.

Extrait éthanolique: différence significative (p<0,05) entre les trois extraits, avec

l'extrait de LP qui affiche la teneur la plus élevée en polyphénols et l'extrait de LL la plus

faible.(LL : 4,26 ;LP : 7,40 ;LR : 5,36 mg E AG/ g échantillon)

a

cb

ab

c

0

2

4

6

8

10

12

14

LL LP LR

En

mg

EA

G/g

échantillons

Ext éth

Ext aque


37

Extrait aqueux: différence significative (p<0,05) entre les trois extraits, l'extrait de

LR est significativement (p<0,05) plus riche en polyphénols et l'extrait de LL, le moins

riche.(LL : 9,94 ;LP :11,48 ;LR :12,39 mg E AG/ g échantillon ).

Différence significative (p<0,05) entre l’extrait éthanolique et aqueux, la (LL) est

moins riche en polyphénols concernant les deux extraits, L’extrait éthanolique de (LP) est

plus riche en polyphénols par apport à l’extrait aqueux, et l’extrait aqueux de (LR) est plus

riche en polyphénols comparé à l’extrait éthanolique.

Les valeurs observées pour les lentilles (Lens culinaris) s’accordent avec celles

rapportées par Han et Baik ,(2008); Campos-Vega et al., (2010); et Boudjou ,(2015)

,pour la lentille en général (12, 6,56 et 5,96mg Eq AG/ g de échantillon

respectivement) ,Oomah et al., (2011) et Zhang et al.,(2015) pour les lentilles rouges et

vertes (5,04 à 6,64 mg EqAG/g MS); elles sont inférieures aux valeurs observées par

Amarowicz et al.,(2009)et Amarowicz et al.,(2010).

La teneur en phénols totaux solubles notée pour l’extrait de lentille est plus élevés

que les données rapportées par Boudjou et al., (2013) sur les fèverole (fève,

fèverole)(6.27, 6.75 mg Eq AG/ g de échantillon respectivement). Amarowicz et

al.,(2004) et Chaieb et al.,(2011) ont rapporté des valeurs nettement plus élevés que les

nôtres (55,9 à 151mg EqAG/g MS).

Les résultats de la présente étude pour les phénols totaux des extraits de Lens

culinaris algériennes sont plus élevés que les données rapportées par Oomah et al., (2008)

et Campos-Vega et al., (2010)sur une autre légumineuses (Phaseolus vulgaris L et Cicer

arietinum L , respectivement ).

Le facteur solvant et échantillon influe sur la teneur en phénols totaux solubles de

nos échantillons. l’extrait aqueux (12,39 mg E AG/ g échantillon) est élevée celle de

comparée aux résultats trouvés par Boudjou, et al.,2013 sur l’extrait acétonique (11,42mg

EAG/ g échantillon) .

L’extrait éthanolique est moins riche en phénols totaux solubles (4,26mg EAG/ g

échantillon) contrairement aux teneurs rapportées par Boudjou et al., 2013 ou la

concentration en polyphénols de l’extrait éthanolique atteint 57.1mg EAG/ g échantillon.


38

II.2. Dosage en flavonoïdes

Les résultats des teneurs en flavonoïdes obtenus (Figure 18) montre une variabilité

entre les différents extraits, en fonction du solvant d’extraction et d’échantillon

Les valeurs suivies de lettres différents sont significativement différentes (p<0,05).

Figure 18 : Teneur en flavonoïdes.

La figure 18 montre que l’extrait aqueux de lentille est plus riches (p<0,05) en

flavonoïdes que l’extrait éthanolique de la lentille (0,46 à 3,76 contre 1,22 à 1,74 mg Eq

Q/g échantillon respectivement ).

Pour les extraits éthanoliques : pas de différence significative (p>0,05) pour les

échantillons LL et LP, alors que l'extrait éthanolique de LR est significativement (p<0,05)

plus riche en flavonoïdes (LR : 1,74 mg EQ/g).

Pour les extraits aqueux: celui de LL est significativement (p<0,05) plus riche en

flavonoïdes, tandis que l'extrait de LP est significativement (p<0,05) le moins concentré en

flavonoïdes (LP : 0,46 mg EQ/g ).

a a

b

c

ab

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

LL LP LR

En

mg

EQ

/g

échantillan

Ext éth

Ext aque


39

Différence significative (p<0,05) entre l’extrait de LR qui est plus riche en

flavonoïdes par rapport à celui de LP, concernant les deux solvant .et l’extrait aqueux de

LL est plus riche en flavonoïdes par rapport à l’extrait éthanolique.

Nos substrats expérimentaux s’avèrent riches en flavonoïdes comparés aux données

rapportées par Boudjou, (2015), Chaib et al.,(2011), Oomah et al., (2011) et Gutie’rrez-

Uribe et al.,(2011).

L’extrait éthanolique de lentille est riche en flavonoïde (1,74 mg Eq. Quercétine/g

d’échantillon) comparé aux résultats de Boudjou et al., (2013) (0,07 mg EQ/g).


40

II.3. Activité antibactérienne des extraits éthanolique et aqueux bruts

L’activité antibactérienne s’est manifestée par l’apparition de zones d’inhibition

auteur des disques imprégnés et de puits remplis d’extraits phénoliques .D’après les

résultats obtenus, il s’est avéré que les extraits éthanoliques ont une activité plus

importante sur les bactérie testées comparée aux extraits aqueux .(Tableau XV-XVIII) .

Ces résultats varient selon les différentes variétés de lentille (LP ,LR et LL), les

bactéries étudiées (Pseudomonas aeruginosa ;Staphylococcus aureus ;Escherichia coli ;

Klebsiella pneumonia et Proteus mirabilus ), et les deux méthodes utilisées

La lecture de résultats se fait par la mesure des diamètres selon Derwich et al.,(2010)

Tableau N° XV : Résultats de l’activité antibactérienne des extraits éthanolique et

aqueux (en µl) contre Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus (diamètre en

mm) par la méthode de disque.

E: Extrait éthanolique ; A : Extrait aqueux ; LL : lentille large ;LP : lentille petite ;LR : lentille rouge ;(-):

pas d’inhibition ;S : sensible ; R : résistance ;TS :Très sensible ;ES :Extrêmement sensible ;Z. inh : zone

d’inhibitions ; Q :Quantité.

Bactéries E Q

(µl)

Z. inh

(mm)

Lecture A Q

(µl)

Z. inh

(mm)

Lecture

Stap

hylo

cocc

us a

ureu

s

LL

10 8 R

LL

10 -

R20 12 S 20 8

LP

10 10 S

LP

10 - R

20 13 S 20 10 S

LR

10 12 S

LR

10 - R

20 14 S 20 10 S

Pse

udom

onas

aeru

gino

sa

LL

10 8 R

LL

10 -

R20 14 S 20 -

LP

10 12 S

LP

10 -

R20 16 TS 20 -

LR

10 10 S

LR

10 -

R20 15 TS 20 -


41

Tableau XVI : Résultats de l’activité antibactérienne des extraits éthanolique et aqueux

(en µl) contre Escherichia coli, Klebsiella pneumonia et Proteus mirabilus (diamètre en

mm) par la méthode de disque.

E : Extrait éthanolique ; A : Extrait aqueux ; LL : lentille large ; LP : lentille petite ;LR : lentille rouge ;

(-) : pas d’inhibition ; S : sensible ; R : résistance ;TS :Très sensible;ES :Extrêmement sensible ;Z. inh :

zone d’inhibitions en mm ; Q :Quantité en ml.

Bactéries E Q

(µl)

Z. inh

(mm)

Lecture A Q

(µl)

Z. inh

(mm)

Lecture

Esc

heri

chia

col

i

LL

10 14 S

LL

10 8

R20 15 TS 20 -

LP

10 12 S

LP

10 - R

20 16 TS 20 - R

LR

10 - R

LR

10 8 R

20 10 S 20 9 S

Kle

bsie

lla

pneu

mon

ia. LL

10 8 R

LL

10 -

R20 15 TS 20 -

LP

10 12 S

LP

10 -

R20 14 S 20 -

LR

10 12 S

LR

10 - R

20 16 TS 20 9 S

Pro

teus

mir

abilu

s.

LL

10 - R

LL

10 - R

20 11 S 20 12 S

LP

10 8 R

LP

10 - R

20 12 S 20 8 R

LR

10 10 S

LR

10 - R

20 20 TS 20 - R


42

Tableau XVII: Résultats de l’activité antibactérienne des extraits éthanolique et aqueux

(en µl) contre Pseudomonasaeruginosa et Staphylococcus aureus (diamètre en mm) par

la méthode de diffusion en puits.

E : Extrait éthanolique ; A : Extrait aqueux ; LL : lentille large ; LP : lentille petite ; LR :

lentille rouge ;- : pas d’inhibition ; S : sensible ; R : résistance ;TS :Très sensible;ES :Extrêmement

sensible ; Z. inh : zone d’inhibitions en mm ;Q :Quantité en µl.

Bactéries E Q

(µl)

Z.inh

(mm)

Lecture A Q

(µl)

Z.inh

(mm)

LectureSt

aphy

loco

ccus

aur

eus

LL

30 14 S

LL

30 -

R40 18 TS 40 -

LP

30 12 S

LP

30 -

R40 20 TS 40 -

LR

30 10 S

LR

30 -

R40 16 TS 40 -

Pse

udom

onas

aeru

gino

sa

LL

30 - R

LL

30 -

R40 18 TS 40 -

LP

30 - R

LP

30 -

R40 16 TS 40 -

LR

30 - R

LR

30 -

R40 18 TS 40 -


43

Tableau XVIII: Résultats de l’activité antibactérienne des extraits éthanolique et aqueux

(en µl) contre Escherichia coli ,Klebsiella pneumonia et Proteus mirabilus (diamètre en

mm) par la méthode de diffusion en puits .

E : Extrait éthanolique ; A : Extrait aqueux ;LL : lentille large ;LP : lentille petite ;LR : lentille rouge ;

(-): pas d’inhibition ;S : sensible ;R : résistance ;TS :Très sensible; ES :Extrêmement sensible ;Z. inh :

zone d’inhibitions en mm ; Q :Quantité en µl .

Bactéries E Q

(µl)

Z. inh

(mm)

Lecture A Q

(µl)

Z.inh

(mm)

Lecture

Esc

heri

chia

col

i

LL

30 19 TS

LL

30 - R

40 20 TS 40 12 S

LP

30 16 TS

LP

30 - R

40 18 TS 40 - R

LR

30 16 TS

LR

30 8 R

40 17 TS 40 9 S

Kle

bsie

lla

pneu

mon

ia . LL

30 20 TS

LL

30 -

R40 21 ES 40 -

LP

30 16 TS

LP

30 -

R40 23 ES 40 -

LR

30 - R

LR

30 -

R40 12 S 40 -

Pro

teus

mir

abilu

s.

LL

30 22 ES

LL

30 -

R40 24 ES 40 -

LP

30 16 TS

LP

30 - R

40 18 TS 40 15 TS

LR

30 20 TS

LR

30 -

R40 24 ES 40 -


44

A : Extrait aqueux. ; B : Extrait éthanolique. ; 1 :Méthode des puits ;2 : Méthode des disques

A1 B1

A2 B2

Figure 19 : Traduction de l’activité antibactérienne sur Staphylococcus aureus

sous forme de zones d’inhibition par méthode de disque et de diffusion en puits.


45

A : Extrait aqueux. ; B : Extrait éthanolique. ; 1 : Méthode des puits ;2 : Méthode des disques.

A1

B2A1

B2

Figure 20 : Traduction de l’activité antibactérienne sur Pseudomonas aeruginosa

sous forme de zones d’inhibition par méthode de disque et de diffusion en puits.


46

A : Extrait aqueux. ; B : Extrait éthanolique. ; 1 : Méthode des puits. ; 2 : Méthode des disques.

A1 B1

A2 B2

Figure 21: Traduction de l’activité antibactérienne sur Escherichia coli sous

forme de zones d’inhibition par méthode de disqueet de diffusion en puits .


47


A : Extrait aqueux. ;B : Extrait éthanolique. ;1 : Méthode des puits. ;2 : Méthode des disques.

Figure 22 : Traduction de l’activité antibactérienne sur Klebsiella pneumonia sous

forme de zones d’inhibition par méthode de disqueet de diffusion en puits.

A1

A2 B2

B1


48


Les résultats obtenus diffèrent selon la variété des graines de lentille (LP , LR etLL ), les solvants utilisés (éthanol et eau), les bactéries testées ( Escherichia coli,Proteus mirabilus , Klebsiella pneumonia , Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcusaureus) et selon les méthodes évaluées (Aromatogrammes, et méthode de diffusion enpuits) .

D’après les résultats de l’évaluation de l’activité antibactérienne, on peut constaterce qui suit :

Les différents échantillons de Lens culinaris de l’extrait éthanolique ont montrés uneaction inhibitrice sur les souches bactériennes : Les diamètres d’inhibition varient de 8 à24 mm (Resistance ; Sensible ; Très Sensible ; Extrêmement Sensible), comparés à ceux

LRLL

LP

LLLR LP

Figure 23 : Traduction de l’activité antibactérienne sur Proteus mirabilus sous

forme de zones d’inhibition par méthode de disque et de diffusion en puits.

A1B1

A2 B2


49

de l’extrait aqueux qui varient de 8 à 15 mm de diamètre, affichant une très faible, voireabsence de zones d’inhibition. Ces résultats sont similaires à ceux obtenus parPugalenthi et al., (2010) pour l’extrait méthanolique ( 13 à 23 mm de diamètre) etaqueux (9à 15mm de diamètre) de Canavalia ensiformis L.

Les diamètres des zones d’inhibition par nos extraits sont supérieurs à ceuxtrouvés par Neelam et al ., (2011) qui ont étudié les extraits de méthanol et d’éthyleacétate de Cassia fistula sur Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia (aucuneactivité inhibitrice) et E. coli (9-11 mm de diamètre ). Par contre, les extraits aqueux dupois cajan possède une bonne activité antibactérienne contre Bacillus cereus selonKanatt, (2011).Les résultats de Yaw-Ee et al ., (2018) sur l’extrait aqueux de pois chiche (absenced’une zone d’inhibition) s’accordent avec nos résultats trouvés pour l’extrait aqueux.

Conclusion

Conclusion

50

La présente travail porte sur la valorisation des différents extraits phénoliques issus

de Lens culinaris. A travers cette étude nous avons d’une part doser les flavonoïdes et

phénols totaux solubles à partir d’ extraits bruts, d’autre part la mise en évidence de l’effet

antibactérien de ces derniers.

La préparation des extraits aqueux et éthanolique de trois variétés de lentille (LL, LP

et LR) en est réalisée par une macération. Les extraits obtenus se caractérisent par des teneurs

variables en phénols totaux solubles et en flavonoïdes.

Les teneurs en phénols totaux soluble différence significative (p<0,05) entre l’extrait

éthanolique et aqueux. La LL affiche les teneurs les plus faibles en phénols totaux solubles

comparés aux autres variétés de lentilles ( 4,26 et 9,94 mg EAG /g pour l’extrait éthanolique

et aqueux , respectivement ).concernant la LP et LR , l’extrait éthanolique est moins riche en

polyphénols (7,40 et 5,36 mg EAG/g, respectivement ) comparé à l’extrait aqueux ( 11,48 et

5,36 mg EAG/g, respectivement ) .une variabilité des teneurs en flavonoïdes a été notée pour

les différentes extraits des différentes variétés de lentille ,avec l’extrait aqueux de LL qui est

plus riche avec une teneur atteignant 3,76 mg EQ/g ,et celui de LP qui affiche la concentration

la plus faible (0,46 mg EQ/g ).

Les extraits bruts de Lens culinaris ont été testés in vitro pour leur activité

antibactériennes, par la méthode d’aromatogramme et de diffusion en puits est contre un

ensemble de bactéries pathogènes. L’extrait éthanolique plus actif que l’extrait aqueux

contre les bactéries étudiées. L’extrait éthanolique a révélé des activités antibactériennes

variables contre les différentes souches microbiennes testées : (Staphylococcus aureus est très

sensibles de 20 mm de diamètre pour LP ; Klebsiella pneumonie et Proteus mirabilus sont

extrêmement sensible. de 23 pour LR et 24 mm de diamètre pour LP respectivement, et

Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli sont très sensibles de 18 et 20 mm de diamètre

pour LL, respectivement).

Conclusion

51

Il est souhaitable d’approfondir de lyophilise des extraits afin de prépare différentes

doses à concentration connues pour calcul des concentration minimal d’inhibitions CMI.

Il est souhaitable d’approfondir utilisé d’autre solvants à savoir le méthanol ,l’acétone

Il est souhaitable d’approfondir les tests réalisés , a fin de recherche les substances

bioactives responsables de ce potentiel antibactérien et dès les caractériser.

Il est souhaitable d’approfondir d’étude de l’activité antioxydant.

Il est souhaitable d’approfondir détermination de la composition biochimiques des

poudres, et dosées d’autres composes phénoliques.

Il est souhaitable d’approfondir recherche les substances bioactives responsables de

potentiel antibactérien et dès les caractériser.

.

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Annexes

AnnexeAnnexe 4 : courbes d’étalonnage

Figure 24 : Courbes d’étalonnage

y = 1,207xR² = 0,996

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Abs

(76

0nm

)

concontration(mg/ml)

courbe d'étalonnage des phénols totatuxsolubles

y = 21,28xR² = 0,9906

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 0,014

Abs

(43

0 nm

)

Concentration (mg/ml)

Courbe d'étalonnage des flavonoïdes

AnnexeAnnexe 3 : Les cinq souches testées

Figure 30 : les souches bactériennes isolées.

Tableau XIX : Dénombrements des bactéries étudiées

Les bactéries Unité formant des colonies (UFC/ml)Staphylococcus aureus 1136.03

Pseudomonas aeruginosa 836. 103

Klebsiella pneumonia 1090. 103

Escherichia coli 909.103

Proteus mirabilis 581. 103

AnnexeAnnexe 2 : Identification des bactéries testées.

Figure 25 : Identification de Staphylococcus aureus.

Figure 26 : Identification de Pseudomonas aeruginosa

Figure 27 : Identification de Klebsiella pneumonia.

Annexe

Figure 28 : Identification d’Escherichia coli.

Figure 29 : Identification de Proteus mirabilis.

AnnexeAnnexe 4 : Préparation de milieu de culture.

Milieu pour la conservation des souches :

constituants : Ingrédient en grammes pour un litre d’eau distillé.

pH final à 25°C :7,3± 0,2

Peptone 10 ,00Extrait de viande 5,00Chlorure de sodium 5,00Agar 10, 00

AnnexeAnnexe 1: Matériel

Produits chimiques

Éthanol 80%.

L’eau distillée stérile.

Chlorure d’aluminium (AlCl3) 2%.

Folin-Ciocalteu (1N dilué à 0,1N).

Carbonate de sodium(Na2CO3) 75g/l

Les colorants de coloration de Gram

Eau physiologique stériles

Disque Antibiotique, disque vide

Milieu de cultureGélose nutritive (milieu de dénombrement).

Milieu de conservation.

Gélose Mueller Hinton (milieu de l’activité antibactérienne.

Appareillage

Broyeur électrique, moulin et tamis de 0,5mm.

Bain marine.

Agitateur.

Centrifugeuse.

Spectrophotomètre.

Réfrigérateur.

AnnexeAnnexe 5 : Résultats de l’analyse statistique

Phénols totaux solubles

Analysis of Variance for Phénols totaux solubles - Type III Sums of Squares

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:Solvant 136,69 1 136,69 269,60 0,0000

B:Variété 15,2883 2 7,64415 15,08 0,0004

RESIDUAL 6,59106 13 0,507004

TOTAL (CORRECTED) 164,966 16

All F-ratios are based on the residual mean square error.

The Stat Advisor

The ANOVA table decomposes the variability of Phénols totaux solubles intocontributions due to various factors. Since Type III sums of squares (the default) have beenchosen, the contribution of each factor is measured having removed the effects of all otherfactors. The P-values test the statistical significance of each of the factors. Since 2 P-valuesare less than 0,05, these factors have a statistically significant effect on Phénols totauxsolubles at the 95,0% confidence level.

1- Extrait aqueux

Multiple Range Tests for POLY EXT AQUEUX by échantillon

Method: 95,0 percent LSD

échantillon Count Mean Homogeneous Groups

LL 3 9,94437 X

LP 3 11,4821 X

LR 3 12,3874 X

Contrast Sig. Difference +/- Limits

LL - LP * -1,53773 0,732615

LL - LR * -2,44306 0,732615

LP - LR * -0,905327 0,732615

* denotes a statistically significant difference.

AnnexeThe StatAdvisor

This table applies a multiple comparison procedure to determine which means aresignificantly different from which others. The bottom half of the output shows the estimateddifference between each pair of means. An asterisk has been placed next to 3 pairs, indicatingthat these pairs show statistically significant differences at the 95,0% confidence level. At thetop of the page, 3 homogenous groups are identified using columns of X's. Within eachcolumn, the levels containing X's form a group of means within which there are nostatistically significant differences. The method currently being used to discriminate amongthe means is Fisher's least significant difference (LSD) procedure. With this method, there isa 5,0% risk of calling each pair of means significantly different when the actual differenceequals 0.

1- Extrait éthanolique

Multiple Range Tests for POLY EXT ETH by échantillon


Echantillon Count Mean Homogeneous Groups

LL 3 4,25749 X

LR 3 5,3646 X

LP 2 7,40233 X


LL - LP * -3,14484 0,100319

LL - LR * -1,10711 0,0897278

LP - LR * 2,03773 0,100319


The Stat Advisor


AnnexeFlavonoide

Analysis of Variance for flavonoides - Type III Sums of Squares

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

MAIN EFFECTS

A:Solvant 0,294914 1 0,294914 0,35 0,5613

B:Variété 8,97361 2 4,48681 5,39 0,0184

RESIDUAL 11,6609 14 0,83292

TOTAL (CORRECTED) 20,9294 17

All F-ratios are based on the residual mean square error.

The Stat Advisor

The ANOVA table decomposes the variability of flavonoides into contributions due tovarious factors. Since Type III sums of squares (the default) have been chosen, thecontribution of each factor is measured having removed the effects of all other factors. The P-values test the statistical significance of each of the factors. Since one P-value is less than0,05, this factor has a statistically significant effect on flavonoides at the 95,0% confidencelevel.

1- Extrait aqueux

Multiple Range Tests for FLAV EXT AQUEUX by échantillon



LP 3 0,457979 X

LR 3 0,744495 X

LL 3 3,7594 X


LL - LP * 3,30142 0,00310416

LL - LR * 3,0149 0,00310416

LP - LR * -0,286517 0,00310416


AnnexeThe StatAdvisor


1- Extrait éthanolique

Multiple Range Tests for FLAV EXT ETH by échantillon



LP 3 1,2186 X

LL 3 1,2342 X

LR 3 1,74107 X


LL - LP 0,0155935 0,148694

LL - LR * -0,506878 0,148694

LP - LR * -0,522472 0,148694


The Stat Advisor


Annexe

Résumé :Lens culinaris, plante annuelle cultivée, appartenant à la famille des Fabacées. Elle contient naturellementbeaucoup de fibres alimentaires, de protéines, de glucides complexes, de vitamines et de minéraux. L’objectif dece travail est l’étude de l’activité d’extraits phénoliques de différentes variétés de lentilles (lentille jaune petiteLP, large LL et rouge LR) sur quelques bactéries pathogènes. Les extraits phénoliques ont été obtenus parextraction à l’éthanol (80%) et par l’eau distillée stérile de la poudre de lentille ; le dosage de flavonoïdes a étébasé sur une méthode utilisant l’AlCl3 (2%), et le Folin-Ciocalteu (1N) a été utilisé pour le dosage despolyphénols totaux. Les résultats obtenus montrent que les extraits aqueux sont nettement plus riches en phénolstotaux comparés aux extraits éthanoliques, et la teneur la plus élevée est en faveur de la LR (12,39 mg EAG/g).L’extrait aqueux de la LL affiche la teneur la plus élevée en flavonoïdes (3,76mg EQ/g) contre 0,46 mg EQ/gpour l’extrait aqueux de la LP. Les tests antibactériens des différents extraits obtenus ont été testés sur dessouches pathogènes suivant deux méthodes de diffusion sur milieu solide : méthode de diffusion en puits etméthode des disques (aromatogramme). Selon ces deux méthodes, l’extrait éthanolique a eu une forte activitéantibactérienne (Staphylococcus aureus est très sensible : 20 mm de diamètre pour LP ; Klebsiella pneumonie etProteus mirabilus sont extrêmement sensibles : 23 pour LR et 24 mm de diamètre pour LP respectivement, etPseudomonas aeruginosa et Escherichia coli sont très sensibles : 18 et 20 mm de diamètre pour la LL,respectivement) par rapport à l’extrait aqueux.

Mots clés : Lens culinaris, composés phénoliques, activité antibactérienne.

Abstract:Lens culinaris, an annual cultivated plant belonging to the Fabaceae family. The objective of this work is tostudy the activity of phenolic extracts of different varieties of lentils (small yellow lens LP, wide LL and red LR)on some pathogenic bacteria. Phenolic extracts were obtained by extraction with ethanol (80%) and steriledistilled water from the lens powder; the flavonoid assay was based on a method using (2%) AlCl3, and Folin-Ciocalteu (1N) was used for the determination of total polyphenols. The results obtained show that the aqueousextracts are significantly richer in total phenols compared to the ethanolic extracts, and the highest content is infavor of the LR (12,39 mg EAG/ g). The aqueous extract of the LL displays the highest content of flavonoids(3,76 mg EQ/ g) against 0,46 mg EQ/ g for the aqueous extract of the LP. The antibacterial tests of the variousextracts obtained were tested on pathogenic strains according to two solid medium diffusion methods: holediffusion method and disc method (aromatogram). According to these two methods, the ethanolic extracts had astronger antibacterial activity (Staphylococcus aureus is very sensitive: 20 mm diameter for LP, Klebsiellapneumonia and Proteus mirabilus are extremly sensitive: 23 for LR and 24 mmdiameter for LP respectively,Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli are very sensitive: 18 and 20 mm diameter for LL, respectively)comparing with the aqueous extract.

Keywords: Lens culinaris, phenolic compounds, antibacterial activity.

:ملخصمزروع ات سنو ات .،العدس هو ن قول ةینتمي الى عائلة ال اف الغذائ على الكثیر من الال حتو ،الكروهیدرات المعقدة،بروتینات،هذا الاخیر

المستخلص الفینولي لمختلف الفیتامینات و المعادن . و الهدف من هذا العمل و LPالأصفر لعدس الصغیر والكبیر االعدس(أنواعهو دراسة نشاLL، و الاحمرLR عض تیرا) على ة ال الایثانول للأمراضالمسب ة عن طر اه المقطرة 80.تم الحصول على المستخلصات الفینول ٪، الم

د لورور الالمنیومالمعقمة من مسحوق العدس.و استند فحص الفلافونو فینولو،)٪2(استخدام و ꞉Folin-Ciocalte(1N)بالإجماليالبولفینول الاجمالي ة في العدس الاحمربما اظهرت النتائج المتحصل علیها ان مستخلص الماء للبول اكثر ثراء من مستخلص الایثانول،و اعلى نس

mg EAG/ g12.39دالمستخلص المائي الاصفر حتو ة للفلافونو mg EQ/ g(0.46(مقابل)mg EQ/ g3.76(الكبیر اعلى نس

ار المستخلصللمستخلص المائي للعدس الاصفر ة الصغیر .تم اخت تیرة المسب طرقتینالمدروس على مختلف السلالات ال النشر ꞉للأمراض القرص الصلب ووفقا لهاتین الطرقتین الثقوب و النشر صلب معلى وس مضاد للجراث نشا ه اقو (نستنتج ان مستخلص الایثانول لد

Staphylococcus aureusقطر حساسة هما حساستان Proteus mirabilisو LP;Klebsiella pneumoniaلأجلمم 20جدا هما حساستان Eschrichia coliو Pseudomonas aeruginosa، على التواليLPمم لاجل 24وLRمم لأجل 23قطر جدا جدا

قطر مقارنة مع المستخلص المائي. على التوالي )LLمم لاجل 20و 18جدا

النشاط المضاد للبكتیریا.،المركبات الفینولیة،العدس꞉الدالةالكلمات

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