Tissus sanguins et systèmes immunitaire. Bases générales – Immunoanalyse

20/11/2014LEBLANC Romane L2 Relecture : Brassier JuliaTSSIBPr S.Desplat-Jego6 pages

Immunoanalyse

A. Immunoanalyse

C'est l'ensemble des techniques biologiques utilisant la mise en evidence de complexes immuns Ag-Ac pour la detection d'un antigene ou d'un anticorps (techniques servant à la biologie clinique et la recherche fondamentale).

I. Critères de choix

Sensibilite : c'est la capacite de la technique à detecter plus ou moins une petite quantite de la molecule à doser

Praticabilite : Certaines techniques sont envisageables en routine et d'autres non. Il faut aussi prendre en compte la duree de la technique (certaines sont tres longues et durent des heures ou des jours), les techniques peuvent être différentes de celles que l'on va utiliser en recherche.

Méthodes qualitatives ou quantitatives : une technique peut donner des infos simples comme savoir si la molécule est présente ou non (qualitative), d'autres peuvent donner des infos supplémentaires comme savoir si la molécule est là et le nombre de molécule (quantitatif)Ces techniques peuvent être manuelles ou automatisees

Techniques Maison : fabriquées directement par les laboratoires, elles sont plutôt contraignantes mais sont conservées car peu chères ou car il n'existe pas de techniques commerciales (standardisees, comparables)Elles peuvent être en phase liquide ou solide (ELISA)

II. Caractéristiques communes

Ces méthodes ont des caractéristiques communes• Necessite d'une source d'antigene (nature et qualite de l'antigene+++) ou d'anticorps. • Mise en contact de cette source avec l'echantillon à tester (on dilue les echantillons car ils sont tres

riches en proteines donnant un «bruit de fond») : serum, LCR ou liquides articulaires

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Plan

A. Immunoanalyse I. Critères de choix II. Caractéristiques communes

B. Exemple de techniques I. Immunoprécipitation en phase liquide : immunonéphélémétrie II. Immunoprécipitation en milieu gélifié III. Agglutination IV. Western blot V. Elisa

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• Formation de complexes Antigene-Anticorps → complexes immuns• Revelation/visualisation des complexes Antigene/Anticorps : par des enzymes comme dans la technique

ELISA, par fluorochrome ou à l’œil nu• +/- Quantification nécessitant des standards de calibration c'est à dire des réactifs

Ces méthodes peuvent servir pour :– Diagnostic et suivi serologiques (infections, maladies autoimmunes)– Dosages d'hormones ou de medicaments (ELISA) – Groupage sanguin – Depistage d'une Ig monoclonale....

Ces techniques d'immunoanalyse peuvent se faire avec ou sans marqueurs

Immunodosage sans marqueur : visible quasiment à l'oeil nu, méthode plutôt ancienne– Agglutination– Precipitation – (Neutralisation)– (Immunochromatographie)

Immunodosage avec marqueur : les plus utilisés en routine – ELISA– Immunofluorescence – Western Blot – (Radio Immunologie)– (Cytometrie en flux, Technologie Luminex)

Les chiffres ci-dessous sont donnes a titre indicatif.

Techniques Sensibilité (μg/ml ou g/L)

ELISA ou radio-immunologie 0,00001-0,001

Agglutination 0,01-0,1

Immunofluorescence 0,1

Immunonéphélémétrie laser 0,5

Précipitation (Ouchterlony, Mancini) 01/03/20

B. Exemples de techniques

I. Immunoprécipitation en phase liquide : immunonéphélémétrie

C'est une technique automatisee utilisant un faisceau laser et une colonne de liquide dans laquelle on va mettre en contact l'anticorps et l'antigene => reaction en phase liquide. Le rayon laser applique sur la solution indique la quantite de complexes car il a la propriete de se diffracter differemment en presence des complexes Ag-Ac. Il faut des conditions optimales de mesure des complexes Ag/Ac, et donc bien adapter la methode avant de l'utiliser (equivalence Ag/Ac..)

Quand on arrive dans la zone d'équivalence où il y a autant d'Ag et d'Ac, au delà si on rajoute encore des Ag, il y a saturation, tous les Ac ont fixé les Ag. Il faut donc utiliser des doses optimales

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2 pièges :– dispersion non immunologique de la lumiere du fait de la presence de particules, lipides..– exces d'Ag, d'ou l'interet de la phase pre-analytique.

Cette technique permet notamment de doser les Ig dans le serum,ou le LCR.

II. Immunoprécipitation en milieu gélifié

– Immunodiffusion radiale : technique de Mancini

1) La gelose coulee dans une boite, avec un Ac d’interet melange en concentration connue2) Depot des Ag (serums) à doser dans les puits. 3) Diffusion sur plusieurs jours dans la gelose pendant lequel l'Ag va rencontrer l'Ac et former des anneaux4) On mesure le diametre de l'anneau de precipitation² (au carre) qui est proportionnel à la quantite d'Ag

(zone d'équivalence)

– Immunodiffusion double : technique d'Ouchterlony

Presence de gelose => depot au centre d'une solution de l'antigene de reference, ensuite dans les puits autour on depose le serum des differents patients. C'est une methode qualitative et comparative. On observe une diffusion de l'Ag (puits) et de l'Ac (serum dans le puits) pendant 24h.

2 situations :

• Si il y a rencontre entre l'Ag et l'Ac (= il y a identite) → Precipitation sous forme d'un arc (zone d'équivalence)

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• Si l'Ag et l'Ac ne correspondent pas il n'y a pas d'identite, les arcs se coupent. On fait migrer ici l'anticorps et l'antigene = diffusion double

– Immunofluorescence indirecte

C'est une technique automatisee sauf la lecture qui se fait au microscope. On utilise des lames de microscopies (par exemple à 8 puits) portant des tissus ou cellules dans chaque puits : l'Ag est donc sur la lame sous sa conformation in situ . On introduit donc le serum de malade dilue, on effectue un lavage => Revelation des complexes immuns par un anticorps anti-immunoglobulines humaines lie à un fluorochrome, on effectue de nouveau un lavage => Revelation de la fluorescence par une lumiere UV (via un microscope à fluorescence).

Il s'agit d'une methode qualitative qui peut etre semi-quantitative en manipulant le degre de dilution d'un serum positif.

Exemple : Recherche d'auto anticorps detectes par immunofluorescence indirecte : Anticorps anti-nucleaires : 2 patients positifs => 2 aspects differents : homogene, et mouchete indiquant des antigenes differents donc des maladies differentes.

III. Agglutination

C'est une technique d'immunoanalyse encore beaucoup utilisee pour les groupes sanguins ou dans la detection de facteurs rhumatoides par exemple. C'est une technique sans marqueur car les agglutinats sont visibles à l'oeil nu

L'agglutination ne marche qu'avec des anticorps qui agglutinent :

– IgM (pentamères) forme des réseaux

– anti-Fc des IgG : facteur rhumatoide : utilisation de globules rouges ou de billes de latex recouvertes d'anticorps Fc des IgG => si presence des anticorps IgM anti-Fc des IgG dans le serum du patient → agglutination

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IV. Western blot

C'est une technique tres manuelle donc de moins en moins utilise

• Cellules entieres en culture ou tissu (en suspension) : presence de multiples proteines (Ag) • Extraction des proteines par migration, electrophorese sur gel en polyacrylamide • Transfert des proteines sur une membrane de nitrocellulose • Decoupage de bandelettes • Saturation • Incubation des Serums (Anticorps ?) • Revelation des complexes Ag/Ac sur la membrane (par un systeme enzymatique le plus souvent).

V. ELISA

C'est une methode tres utilisee, automatisable entierement, haut debit (micro-plaques de 96 puits) :

1) L'antigene purifie ou recombinant est combine au serum du malade (Anticorps ??)2) On effectue ensuite des lavages3) On rajoute des Ac anti-Ig humaines lie à une enzyme 4) On effectue ensuite de nouveau des lavages 5) On rajoute un substrat de l'enzyme qui interagit avec l'enzyme6) Lavages 7) Reaction coloree du à l'interaction entre l'enzyme et son substrat8) Spectrophotometre avec lequel on evalue la reaction coloree ce qui donne la densite optique

En immunoanalyse medicale, plus un test biologique est sensible, moins il est specifique et inversement. On ne peut pas avoir de test ideal.

Applications en routine: – Dosage de proteines non Ig : hormonologie, proteines de l'inflammation– Dosage d'Ig : Ig monoclonales, deficits immunitaires, maladies auto-immunes

(auto-Ac), serologies infectieuses et post-vaccinales.

Causes d'erreurs en immunoanalyse : les erreurs peuvent etre pre-analytiques (lie à la preparation des echantillons ...), analytiques (lie à la realisation du test comme la dilution ...), post analytiques (interpretation du test ...).

Nombreuses techniques possibles : • Pieges (role du biologiste+++), • Limites (sensibilite..)• Avantages/inconvenients• Prix de revient.

Dédicace à Anissa pour s'être levée 2 jours d'affilés juste pour m'accompagner (Merci pour tes photos!!)Et dédicace à tous les lapins cartins !:)

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