Induction de photoproduits de l’ADNpar les UV : données récentes

Thierry Douki

Laboratoire « Lésions des Acides Nucléiques »INAC/SCIB UMR E3 CEA/UJF

CEA-Grenoble

ADN

Conséquences des dommages de l’ADN

mutations

dommage

Agents génotoxiques

Radiationsionisantes

RadiationUV

Stressoxydant

Produitschimiques

Réparation

Mortcellulaire

vieillissementcancer

UV solaire

L’ADN, cible majeure du rayonnement UVC et UVB

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

220 240 260 280 300 320 340 360 380 400

UVC UVB UVA

Longueur d’onde (nm)

abso

rptio

nAbsorption ADN

Pyrimidinesadjacentes

(TT)

Les dimères de pyrimidinesDimère cyclobutane (CPD)

UVC, UVB

NH

NO

O

O

O

O

P

O-O

N

N

O

OH

O

O

O

Oxetane

Photoproduitpyrimidine (6-4)

pyrimidone

UVC, UVB

Mêmes réaction aux sites TC, CT et CC !!

Mutations induites par le rayonnement UVB

autres substitutions

autres mutations

Substitutions à des sites TC etCC

Un effet mutagène principalement des dimères cyclobutane, les photoproduits (6-4)étant rapidement réparés (You et al J. Biol. Chem. 2001; Jans et al. Current Biol. 2005)

plasmide

transfection

réplication

gènes de cellulesen cultures

gènes mutés dans lestumeurs de la peau

(Brash et al. (1991) PNAS 88, 10124)

UVA et dommages de l’ADN

Théories admises :1) les UVA endommagent l’ADN par la production d’espèces

oxydantes dues à des photosensibilisateurs intracellulaires.2) L’ADN n’absorbe pas les UVA (donc pas de dimères)

300 350 400250

Longueur d’onde (nm)

Act

ion

rela

tive

par

quan

tum

1

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6Mutagénèse

létalité

Absorptionde l’ADN

d‘après Coohill(1987)

Le rayonnement UVA, un autre agent génotoxique

En UVB (et UVC) (280 < l < 320 nm) :- Effet direct- Formation des dimères de pyrimidines

En UVA (320 < l < 400 nm) :- Effet indirect- Photosensibilisateurs endo- ou exogènes- Stress oxydant intense

Cellules en cultures

+ dimères cyclobutane par absorptiondirecte (beaucoup plus faible qu’avecUVB)

Induction du stress oxydant par les UVA :des mécanismes indirects (photosensibilisation)

PS PS*UVA

(PS: photosensibilisateur)

O2

O2°-

H2O2

°OH

UVAFe2+/Fe3+

Chimie type Fenton

mitochondries

ferritine

O2

1O2

Production d’oxygènesingulet

type II

majoritaire

NH

N N

N

NH2

O

dR

O

H

8-oxoGuanine

R+ + PS- Production de radicaux libres

type I

Coupuresde chaine

Pyrimidinesoxydées

HN

N

O

O

CH3

OH

OH

Dimères de pyrimidine et UVA

CPDs induits par les UVA dans la peauYoung et al. 1998, J. Invest. Dermatol, 111, 936-940

keratinocytes

melanocytes

340 nm 360 nm

melanocyteskeratinocytes

(aussi Freeman, 1989, Burren et al. 1998,Mouret et al. 2006)

Formation dans des cellules en cultureDouki et al. (2003) Biochemistry 42, 9221-9226

(aussi Tyrrell 1974, Freeman 1990, Kielbassa 1997, Zhang1997, Perdiz 2000, Rochette 2003, Courdavault 2004)

6-4 TCTC CPD

CC CPDCT CPD

6-4 TTTT CPD

UVB

UVA

UVB (0.2 J/cm2)

0

10

20

30

40

50

60

70

0.5 1 1.5 2 2.5 3

DEM (J/cm2)

TT

CP

Dper

10

6base

s

phototype II

phototype IV

UVA (200 J/cm2)

0

10

20

30

40

50

60

70

TT

CP

Dper

10

6base

s

phototype II

phototype IV

0.5 1 1.5 2 2.5 3

DEM (J/cm2)

Phototype et CPDs chez des volontaires

Le phototype reflète la protection contre les dimères induits par les UVB et les UVA

Irradiations ex-vivo

Mouret et al. (2011) J. Invest. Dermatol. 131, 1539

Un mécanisme direct du à une faible absorption des UVA par l’ADN

l cut-off(nm)

ADN isolé Kératinocytes

322 0.188 0.197

351 0.168 0.205

374 0.151 0.204

390 0.246 0.233

Mouret et al. (2010) Org. Biomol. Chem., 8, 1706–1711

Même rendement entre ADN isolé et cellulaire :pas de rôle majeur de photosensibilisateursendogènesObservation à toutes les longueurs d’onde UVA :pas un problème de contamination UVB

Comparaison ADN isolé / cellules

(en lesions/106 bases per J cm-2)

Les doubles brins d’ADNabsorbent (un peu !) les UVA

Wavelength (nm)

250 275 300 325 350 375 400

1

10

100

1000

10000

250 275 300 325 350 375 400

Mola

re

xtin

ctio

nco

effic

ient(M

-1cm

-1)

1

10

100

1000

10000

Wavelength (nm)

250 275 300 325 350 375 400

1

10

100

1000

10000

250 275 300 325 350 375 400

Mola

re

xtin

ctio

nco

effic

ient(M

-1cm

-1)

1

10

100

1000

10000dA20:dT20

dT + dA

Données en accord avec ADNbactérien (Sutherland 1981)

Les CPDs en UVA :un mécanisme direct

Plus de dimères que d’oxydation après irradiation UVA

Douki et al. (2003) Biochemistry 42, 9221 Courdavault et al. (2004) Mutat. Res. 556, 135Mouret et al. (2006) PNAS 103, 13765 Mouret et al. (2012) Photochem. Photobiol. Sci. 11, 155

TT-CPD

HN

NO ON

NH

O O

CHO kératinocytes fibroblastes Peau(6 donneurs)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

lési

ons/

10

6base

sper

J/cm

2

8-oxoGua

HNN

N

O

H2N

O

H

mélanocytes

Plus grandesensibilité des

mélanocytes austress oxydant

Mélanocytes de souris(quantification par anticorps)

Mélanocytes de souris avec ou sans mélanine(détection HPLC-spectrométrie de masse)

Le plusmutagène

La formation retardées de dimères après l’exposition aux UVAPremi et al. (2015) Science 347

Sans lumière

mélanine

polymérisation

Réactionsbiochimiques

normales

Précurseursde mélanine Transfert

d’énergie

Un mécanisme complexe

Absorptiondes UVA

oxydantsON

NH

O

HN

NO

O

ON

NH

O

HN

NO

O

HN

NO

OO

NH

N O

Absorptiondirecte des

UV parl’ADN

Dimères dans l’ADN

In the nucleus

Bilan sur la nature des dommages de l’ADN après exposition aux UV

0

25

50

75

100

Rendem

entre

latif(%

)

Dimèrescyclobutane

NH

N N

NH

O O

O O

dR dR

HN

N

O

O

dR N

N

O

OH

dR

Photoproduits(6-4)

UVB

NH

N N

NH

O O

O O

dR dR

0

25

50

75

100

Rendem

entre

latif(%

)

Dimèrescyclobutane

Guanineoxydée

cassures Pyrimidinesoxydées

PontagesADN-Protéines

HN

N

N

N

O

O H

H2N

HN

N

O

O

CH3

OH

OH

UVAX 100 à 1000

La réparation des dimères de pyrimidines

- Mécanisme de Réparation par Excision de Nucléotides (NER)- Présente dans tous les types cellulaires- Différentes protéines entre prokaryotes et eukaryotes mais les mêmes fonctions

Détection des dommages :• par arrêt de l’ARN polymérase dans les gènes transcrits• Par des protéines spécifiques dans le reste du génome

Reconnaissancedu dommage

Déroulementde l’ADN

Synthèsed’ADN intact

Excision du brinendommagé

Le syndrome Xeroderma Pigmentosum

Déficience en réparation de dimères = grande fréquence de cancer de la peau

Maladie génétique; décrite pour la première fois en 1870

Prévalence: 1 à 105 - 106

Associé avec des mutations de gènes de la réparation par excision de nucléotides

1000 fois plus de cancer de la peau que dans le population normale

Mort prématurée

Un effet des UVA sur la réparation des dimères

0

0

1

2

3

4

5

6

20 40 60Temps (h)

TT-C

PD

rest

ant

po

ur

10

6b

ases

UVB 25 J/m2

UVA 60 J/cm2

40%

15%

Cinétique après UVA ou UVB

TT-64PP TT-CPD TC-64PP TC-CPD

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Dim

ère

sre

sta

nt

à24

h(%

) UVB

UVA + UVB

p<0.01

p<0.05

p<0.05p<0.1

Effet d’une pré-irradiation UVA

Dans les kératinocytes humains en culture Courdavault et al. (2005) DNA Repair 4, 836

0

25

50

75

100

0 12 24 36 48

temps (h)

Dim

ère

sre

sta

nt

(%)

TT CPD UVB TT (6-4) UVB TT CPD UVA

72 vs 55 %p<0.05

UVB: 0.1 J/cm2; UVA 100 J/cm2

Cinétique de réparationdans la peau humainesMouret et al. (2006) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 103

L’oxydation des protéines de réparation par les UVA

Pontage de PCNA

UVA UVA + 6-thioguanine

Montaner et al. EMBO reports 8 2008

Oxydation de RPA

UVA + fluoroquinolones

Guven et al. J. Invest. Dermatol. 135 2015

Conclusions

- Un rôle majeur des dimères de pyrimidines dans le déclenchement desprocessus de cancérisation dus aux UV

- Les UVB, la portion la plus délétères du spectre solaire

- Les UVA comme agents génotoxiques et mutagènes : lésions oxydatives,formation de dimères directe et retardée; quelques % des dommages induitspar la lumière solaire

- Un impact négatif des UVA sur la réparation de l’ADN (importance dela combinaison des effets UVA et UVB)

- Une nécessaire réévaluation à la hausse des effets des UVA :photoprotection adaptée, risques associés aux bronzage artificiel, …

- Autres effets délétères des UV solaires : modifications épigénétiques,immunosupression, vieillissement cutané, effets oculaires …

Remerciements

Au laboratoire LAN

• Jean-Luc Ravanat• Sylvie Sauvaigo

+ les doctorants et les post-docs

Financements

Les collaborations

• Evelyne SageInstitut Curie d’Orsay

• Jean-Claude Béani et Marie-Thérèse LecciaDermatologie CHU-Grenoble

• Dimitra Markovitsi et Akos BanyaszIRAMIS, CEA-Saclay

• Douglas BrashYale School of Medecine

Merci de votre attention !