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I N F L U E N C E DU C A D M I U M ( C d " ) SUR L'ACTIVITÉ B I O L O G I Q U E D U R É C E P T E U R D E S O E S T R O G È N E S DE LA T R U I T E ARC-EN-C IEL

(ONCORHYNCHUS MYKISS).

R. LE GUEVEL, F. PETIT, P. LE GOFF, Y. VALOTAIRE et F. PAKDEL

Équipe d'Endocrinologie Moléculaire de la Reproduction, UPRES-A 6026, Université de Rennes I, 35042 Rennes Cedex, France.

RÉSUMÉ

De nombreuses publications font l'état de l'action négative du cadmium (Cd**) sur la vitellogenèse chez les poissons. Le mécanisme d'action de ce métal n'étant pas clairement établi, une étude a été entreprise afin de déterminer si l'effet du cadmium passait par une action sur l'activité biologique du récepteur des oestrogènes de la truite arc-en-ciel (rtER). Cette étude a été réalisée dans un système de levures recombinantes, exprimant de manière stable rtER, et dans des hepatocytes de truite en culture primaire. Dans la levure, rtER activé par l'oestradiol (E2) contrôle spécifiquement l'expression d'un gène rapporteur codant pour l'enzyme B-Galactosidase. Une concentration en C d " de 10 pM diminue de 45 % l'expression stimulée par l'oestradiol du gène rapporteur dans les levures recombinantes. De même, dans les hepatocytes, l'expression du gène de la vitellogénine (VTG), gène sous le contrôle positif de E2, est diminuée de 65 %. Le cadmium n'affecte pas la liaison de E2 à son récepteur et seule l'activité hormono-dépendante est affectée par ce métal. Les résultats de cette étude montrent que l'effet négatif du cadmium sur l'action de l'oestradiol passe vraisemblablement par une action directe de ce métal sur la fonction de transactivation hormono-dépendante de rtER.

EFFECT OF CADMIUM (Cd") ON RAINBOW TROUT {ONCORHYNCHUS MYKISS) ESTROGEN RECEPTOR BIOLOGICAL ACTIVITY.

ABSTRACT

Numerous publications have related the negative action of cadmium (Cd") on vitellogenesis in fishes. This action is not clearly established. The aim of the present study was to determine if the cadmium-mediated decrease of vitellogenesis was a process interfering with the rainbow trout estrogen receptor (rtER) activity. The effect of cadmium rtER activity was studied in a recombinant yeast system expressing highly and stably rtER and in trout hépatocyte cultures. In yeast system, rtER activated by estradiol (E2) regulates specifically the expression of the B-Galactosidase reporter gene. The E2-stimulation of the reporter gene expression was reduced by 45 % under 10 uM C d " treatment. In rainbow trout hepatocytes cell culture, the vitellogenin (VTG) gene expression, positively regulated by E2, was also reduced by 65 % after C d " treatment. Cadmium does not affect the estradiol binding capacity of the receptor and only the hormone-dependent activity of rtER was affected by this metal. This study shows that the negative effect of C d " on estradiol action was probably mediated by a direct effect on the hormono-dependent transactivation function of rtER.

Article available at http://www.kmae-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/kmae:1998027

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INTRODUCTION

Le cadmium, métal n'ayant pas de rôle biologique est, sous la forme Cd " , un pol luant insidieux du milieu terrestre comme du milieu aquatique (JENSEN et BRO-RASMUSSEN, 1992) du fait de son accumulation progressive chez de nombreuses espèces animales et de son temps de demi-élimination de plusieurs dizaines d'années dans les organismes. Contrairement aux molécules organiques, il n'existe pas de systèmes enzymatiques de dégradation des métaux lourds. Le mécanisme cellulaire de l'élimination de ces ions passe par un cryptage par fixation des métaux sur des résidus cysteines de protéines de faible masse moléculaire : les métalothionéines, protéines induites par les métaux lourds (BRUCE JACOBSON et TURNER, 1980 ; BROWN et al., 1994 ; GEORGE et al., 1996). L'action toxique du cadmium s'exerce tant au niveau de l'inhibition de l'activité de nombreuses enzymes (GILL et al., 1991 ; KUDO et WAKU, 1996) qu'au niveau de l'homéostasie de certains ions essentiels comme le cuivre, le fer, le calcium et le zinc (CHMIELNICKA et BOGUSLAW, 1996 ; SOUZA et al., 1996) par compétit ion directe du cadmium sur les sites de fixation de ces ions sur certaines protéines (BRUCE JACOBSON et TURNER, 1980 ; OLSSON et al., 1995). Le cadmium peut interagir avec l'ADN et dans certains cas, il est capable de provoquer des altérations de l'ADN et interférer dans les processus de réparation de l'ADN (BRUCE JACOBSON et TURNER, 1980 ; WAALKES et al., 1992a, 1992b ; BEYERSMANN et HECHTENBERG, 1997). De nombreuses études ont démontré l'action néfaste du cadmium sur les fonctions de reproduction chez les mammifères et chez les poissons [i.e. altérations de la synthèse des hormones stéroïdiennes (KIME, 1984 ; PIASEK et LASKEY, 1994), apoptose du tissu interstitiel testiculaire (XU et al., 1996), diminution de la vitellogénèse chez les poissons (OLSSON et al., 1995 ; PEREIRA et al., 1992, 1993)]. Ainsi, chez la truite fario soumise à un traitement chronique par le cadmium, l'ovogenèse est retardée tandis que chez la truite arc-en-ciel le même traitement provoque un blocage du développement de l'oeuf (BROWN et al., 1994). L'injection de cadmium chez la truite arc-en-ciel provoque une inhibition de l'expression stimulée par l'oestradiol du messager de la vitellogénine (OLSSON et al., 1995). La vitellogénèse est une étape fondamentale de la reproduction des espèces animales ovipares. En effet, la vitellogénine est une protéine synthétisée dans le foie, sous le contrôle de l'oestradiol, et libérée dans la circulation sanguine pour être finalement incorporée dans les ovocytes comme protéine de réserve. Il est évident que tous les facteurs environnementaux (comme les polluants), affectant la production de vitellogénine au niveau hépatique, seront des facteurs limitants de la reproduction chez les espèces sensibles comme la truite arc-en-ciel et les salmonidés en général (BUHL et HAMILTON, 1991). Dans l'étude que nous avons entrepris, nous nous sommes attachés à déterminer si les effets négatifs du cadmium sur les fonctions de la reproduction chez la truite passaient par une action directe ou indirecte au niveau de la régulation de gènes par l'oestradiol, hormone clef de la reproduction. Pour cela, nous avons réalisé l'étude de l'action du cadmium sur l'activité de transactivation hormono-dépendante du récepteur des oestrogènes exprimé dans un système de levures recombinantes. Le récepteur des oestrogènes exprimé dans la levure présente toutes les caractéristiques fonctionnelles du récepteur dans son contexte cellulaire normal (PAKDEL et al., 1997) et possède le double avantage de permettre un criblage rapide d'un grand nombre de molécules et de mettre en évidence des effets directs des molécules étudiées sur la protéine d'intérêt, en l'occurrence le récepteur des oestrogènes. Dans ce système, l'induction hormono-dépendante de l'activité 13-Galactosidase est strictement sous le contrôle de l'oestradiol (PETIT et al., 1995). L'action du cadmium sur l'activité transactivatrice de rtER a été testée dans ce système ainsi que celle du zinc, du cobalt, du nickel, du manganèse et du cuivre. Cette étude a été réalisée en parallèle sur des cellules d'hépatocytes de truite en culture primaire afin de vérifier si les résultats observés dans le système de levure étaient transposables à un système cellulaire plus complexe et plus proche des conditions physiologiques. Dans le système d'hépatocytes en culture en agrégats, les

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caractéristiques fonctionnelles du tissu hépatique sont exprimées pendant au moins un mois (FLOURIOT et al., 1993), en particulier, l'expression oestrogéno-dépendante des gènes du récepteur de l'oestradiol et de la vitellogénine est maintenue. La forte induction du messager vitellogénine par les oestrogènes fait de cette molécule un excellent témoin de l'activité oestrogénique dans ce système cellulaire.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Souche de levure

La souche utilisée dans cette étude est : BJ-ECZ (a \eu2 trp1 ura3-52 prbl-1122pep4-3prc1-407gal2:URA3-2ERE-CYC1-lacZ) (WRENN et KATZENELLENBOGEN, 1993). Cette souche contient, intégré dans son génome, un gène rapporteur constitué de deux éléments de réponse aux oestrogènes (ERE), du promoteur du gène de la cytochrome C1 et du gène lacZ codant pour la B-Galactosidase de E. coll. Ce gène rapporteur est sous le contrôle strict du récepteur aux oestrogènes et en l'absence de ce dernier, aucune activité transcriptionnelle du gène rapporteur n'est observée, que ce soit en présence ou en l'absence d'oestradiol. Les levures sont transformées par le plasmide YEprtER (vecteur d'expression du récepteur des oestrogènes de la truite arc-en-ciel qui permet la transcription et traduction constitutive de rtER) en utilisant la méthode à l'acétate de lithium. Les levures recombinantes sont sélectionnées sur milieu CM (complete minimal medium) sans uracil et tryptophane (PETIT et al., 1995). Dans ces levures, rtER est activé par E2, l'effet maximal étant obtenu pour une concentration d'oestradiol de 10 nM, ce qui permet l'induction du gène rapporteur et l'expression de l'enzyme B-Galactosidase dont l'activité enzymatique peut être mesurée par colorimétrie. En l'absence d'hormone, une activité de base dépendante de la présence de rtER est observée et représente 10 à 15 % de l'activité maximale induite par E2.

Détermination de l'activité B-Galactosidase

Le test B-Galactosidase est effectué, comme décrit par PETIT et al. (1995), sur plusieurs clones indépendants, la B-Galactosidase est induite spécifiquement pendant 4 heures par 10 nM de 17B-oestradiol en présence ou non de C d " ou d'autres métaux lourds (Zn " , C u " , N i " , C o " , Mn" ) . L'activité B-Galactosidase est déterminée par l'hydrolyse du substrat NpGal (o-nitrophenyl B-D-galactopyranoside), la formation du produit coloré est quantifiée par spectrophotométrie à 420 nM. L'activité B-Galactosidase est exprimée en unité de MILLER qui corrige l'activité enzymatique par le nombre de cellules et par le temps de réaction enzymatique (MILLER, 1972).

Extrait protéique

Les levures sont cultivées dans 50 ml de milieu sélectif à 30°C sous agitation vigoureuse à 300 r.p.m. jusqu'à l'obtention d'une absorbance de 1,5-2 à 600 nm. Les cellules sont récupérées et après digestion de la paroi par la lyticase (Sigma), les sphéroplastes sont lysés selon McDONNELL et al. (1991). L'extrait cellulaire brut contenant la protéine rtER sera utilisé pour les expériences de liaison avec l'oestradiol.

Compétition du cadmium sur la liaison de E2 à son récepteur

Quatre-vingt-dix pg de protéines de l'extrait cellulaire sont incubés 16 heures à 4°C avec 20 nM de [ 3H]oestradiol en l'absence ou en présence de concentrations croissantes de CdCI 2 La liaison spécifique avec le [ 3H]oestradiol est déterminée après traitement au charbon dextran (PAKDEL et KATZENELLENBOGEN, 1992).

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Culture d'agrégats d'hépatocytes et traitement

Des truites arc-en-ciel mâles (Oncorhynchus mykiss) de 250-750 g sont fournies par l'élevage du Drennec, France. Le foie est dissocié par perfusion à la collagénase A (Boehringer), comme décrit par SEGLEN (1973), et adapté à la truite (MAITRE et al., 1986). Les hépatocytes (1-2 x 10 7 cellules/5 ml de milieu par boîte) sont incubés à 18°C dans des boîtes de Pétri non traitées de 60 mm (Falcon) dans le milieu DMEM/Ham's F12 (1:1) sans rouge de phénol, avec L-glutamine, 15 mM Hepes, 15 mM TES, 12 mM N a H C 0 3 , 1 % antibiotiques (pénicilline, streptomycine et amphotéricine B ; Sigma) et 2 % (V/V) ultroser SF (Biosepra). Les agrégats sont obtenus par agitation orbitale à 55 r.p.m. pendant 7 jours. Après formation, les agrégats sont traités par 1 pM de 17(3-oestradiol en présence ou non de CdCI 2 (10 pM) ou CuCI 2 (100 uM). Bien que ce système permette des études sur 1 mois, le cadmium pouvant avoir des effets toxiques à long terme, le traitement n'est appliqué que pendant 48 heures, pour éviter de masquer un effet spécifique sur rtER par un effet toxique à long terme. De plus, les gènes de rtER et de la vitellogénine étant rapidement induits par E2, ce temps de traitement est largement suffisant pour obtenir une forte expression de ces deux gènes oestrogéno-dépendants.

Analyse des ARNm par slot blot

Les ARN totaux sont préparés par la méthode LiCI-urée (AUFFRAY et ROUGEON, 1980) modifiée par VAILLANT et al. (1988). Quatre pg d'ARN sont déposés en double sur une membrane de Nylon Biodyne A (Pali) en utilisant un appareil à slot blot Bio-Rad. La membrane est préhybridée à 42°C pendant 6 heures et hybridée en conditions stringeantes avec une sonde ADNc radioactive du récepteur des oestrogènes (rtER), de la vitellogénine (VTG) ou de l'actine (Ac) de truite arc-en-ciel marquée au 3 2 P (PAKDEL et al., 1989). Après lavage, la membrane est mise en autoradiographie pendant 48 heures à -70°C. La quantité relative d'ARN est déterminée par densitométrie des spots, les taux d'ARN rtER et VTG sont corrigés par rapport au messager actine pour chaque dépôt.

RÉSULTATS

Effet du cadmium sur l'activité biologique du récepteur des oestrogènes exprimé dans un système de levure

Le système de levures recombinantes, contenant un gène rapporteur sous le contrôle du récepteur des oestrogènes de truite arc-en-ciel exprimé de manière constitutive, a été utilisé pour tester l'action de C d " s u r l'activité biologique du récepteur. Comme illustré par la Figure 1, dans ce système, en l'absence d'hormone rtER est capable d'activer le gène rapporteur faiblement mais de manière significative par rapport aux cellules n'exprimant pas le récepteur. Cette activité basale est associée à la fonction de transactivation hormono-indépendante du récepteur. En présence d'E2, la transcription du gène rapporteur est multipliée par un facteur d'environ 6 à 7 (Figure 1, contrôle), ce qui reflète l'activité hormono-dépendante du rtER dans la levure. Un traitement par C d " à une concentration de 1 uM et 10 pM provoque une diminution de l'induction du gène rapporteur de 20 et 45 % respectivement. En revanche, l'expression basale n'est pas affectée par le cadmium. Les autres métaux lourds testés à la concentration de 10 pM, contrairement au cadmium à la même concentration, sont sans effet sur l'activité transcriptionnelle de rtER.

Figure 1 Effet de divers métaux lourds sur l'activité transcriptionnelle de rtER exprimé dans un système de levures recombinantes. Les métaux sont ajoutés au milieu de culture en présence ou non d'oestradiol 10 nM. Les résultats sont exprimés en pourcentage de l'induction maximale par l'oestradiol en l'absence de métal et représentent la moyenne +/- SEM de clones indépendants : n = 16 pour les contrôles, n = 3 pour Cd 0,1 pM, n = 7 pour Cd 1 uM, n = 11 pour Cd 10 pM, n = 5 pour Cu, Co, Ni et Mn.

Figure 1 Effect of several heavy metals on the transcriptional activity of rtER expressed in a yeast system. Heavy metals are added in culture medium with or without estradiol 10 nM. Results are expressed in percentage of maximal estradiol induction without metal and represent the mean +/- SEM of independent clones, n = 16 for controls, n = 3 for Cd 0.1 pM, n = 7 for Cd 1 pM, n = 11 for Cd 10 uM, n = 5 for Cu, Co, Ni and Mn.

Effet du cadmium sur l'induction du gène de la vitellogénine dans les hepatocytes en culture en agrégats

La diminution d'activité transactivatrice du récepteur observée dans les levures recombinantes cultivées en présence de cadmium ne présume en rien de l'action du cadmium dans des systèmes plus élaborés et plus proches des conditions physiologiques. Il était donc nécessaire de vérifier si le même phénomène était observé dans des hepatocytes de truite, cellules cibles de l'oestradiol in vivo.

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L a potentialité anti-oestrogénique. révélée d a n s le système d e l e v u r e , es t retrouvée d a n s l e s hépatocytes e n c u l t u r e c o m m e le m o n t r e la F i g u r e 2 . D a n s c e t t e expérience, l ' e x p r e s s i o n d e d e u x gènes c i b l e s d e l ' oes t rad io l a été analysée : le gène d e r t E R e t d e la V T G . E n l ' a b s e n c e d ' o e s t r a d i o l , l e s A R N m e s s a g e r s d e r t E R et d e la V T G s o n t indétectables t a n d i s q u e s o u s s t i m u l a t i o n oestrogénique c e s m e s s a g e r s s o n t f o r t e m e n t i n d u i t s . L e s résultats, o b t e n u s e n présence d e c a d m i u m , m o n t r e n t u n e différence d e sensibilité d e c e s d e u x gènes oestrogéno-dépendants vis-à-vis d e c e métal. U n e c o n c e n t r a t i o n d e 1 0 u M p r o v o q u e u n e d i m i n u t i o n d e 6 5 % d e l ' i n d u c t i o n d u m e s s a g e r V T G t a n d i s qu'à la même c o n c e n t r a t i o n , le m e s s a g e r r t E R n 'es t p a s s i g n i f i c a t i v e m e n t affecté. P a r c o n t r e à u n e c o n c e n t r a t i o n d e 1 0 0 u M , l ' e x p r e s s i o n d e c e s d e u x m e s s a g e r s es t complètement inhibée et d e v i e n t indétectable. L e c u i v r e à u n e c o n c e n t r a t i o n d e 1 0 0 u M n 'a a u c u n e f fe t i n h i b i t e u r s u r l ' i n d u c t i o n d e l ' e x p r e s s i o n d u gène vitellogénine p a r E 2 ( F i g u r e 2 B ) . L e c a d m i u m e s t d o n c c a p a b l e d e b l o q u e r l ' a c t i on d e l ' o e s t r a d i o l s u r les gènes c i b l e s étudiés d a n s d e s hépatocytes e n cu l t u re .

Figure 2 Effet du cadmium 10 uM et 100 uM (n = 3) sur l'induction par l'oestradiol 1 uM des gènes de la vitellogénine (VTG) et du récepteur des oestrogènes (rtER) (Figure 2A) ainsi que l'effet du cuivre 100 uM (n = 4) sur l'induction du gène de la vitellogénine (Figure 2B) dans des hépatocytes de truite en culture en agrégats. Le taux d 'ARNm est corrigé par l 'ARNm actine. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle stimulé par l'oestradiol seul +/- SEM, n = 3 (n.d. : non dosable).

Figure 2 Effect of cadmium 10 uM and 100 uM (n = 3) on the induction by 1 uM estradiol of vitellogenin (VTG) and estradiol receptor (rtER) gènes expression (Figure 2A) and effect of copper 100 uM (n = 4) on the induction of vitellogenin gene expression (Figure 2B) in trout hepatocyte aggregate cultures.The level of mRNA is corrected by actin mRNA. Results are expressed in percentage of estradiol-stimulated control +/- SEM, n = 3 (n.d. : non dosable).

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Effet du cadmium sur la liaison de E2 à son récepteur

C e r t a i n s a u t e u r s o n t montré q u e C d " a i n s i q u e d ' a u t r e s i o n s , c o m m e l ' ion arsénite, p o u v a i e n t i n h i b e r la l i a i s o n d e s h o r m o n e s glucocorticoïdes à l e u r récepteur p a r i n t e r a c t i o n d i r e c t e d e C d * * a v e c d e s g r o u p e m e n t s « t h i o l » ( S H ) d e cystéines v i c i n a l e s a u n i v e a u d u s i t e d e l i a i s o n h o r m o n a l e ( S I M O N S et al., 1 9 9 0 ) . A f i n d e vérifier s i le même mécanisme était m i s e n j e u d a n s le c a s d u récepteur d e s oestrogènes d e la t r u i t e a r c - e n - c i e l , n o u s a v o n s effectué u n e expérience d e compétition e n t r e le [ 3 H ] o e s t r a d i o l e t C d * * . L e s résultats s o n t rassemblés à la F i g u r e 3 e t m o n t r e n t q u e , c o n t r a i r e m e n t a u récepteur d e s h o r m o n e s glucocorticoïdes, le c a d m i u m n ' i n h i b e p a s la l i a i s o n d e l ' o e s t r a d i o l à s o n récepteur même à u n e c o n c e n t r a t i o n e n C d * * 1 0 0 0 0 fo i s supérieure à l ' o e s t r a d i o l tritié.

Figure 3 Effet in vitro du cadmium sur la liaison du [ 3H]oestradiol à son récepteur. Quatre-vingt-dix ug de protéines sont incubés 16 heures à 4°C avec 20 nM de [ 3H]oestradiol en l'absence ou en présence de concentrations croissantes de CdCI 2 .

Figure 3 In vitro effect of cadmium on [ 3H]estradiol binding to its receptor. Ninety ug of proteins were incubated at 4°C for 16 hours with 20 nM of [ 3H]estradiol in the absence or présence of increasing concentrations of CdCI 2 .

DISCUSSION

L e s résultats présentés d a n s c e t t e étude m o n t r e n t q u e , d a n s n o s c o n d i t i o n s expérimentales e n système d e l e v u r e s r e c o m b i n a n t e s , l ' i on C d * * i n h i b e l 'ac t ion d u récepteur a u x oestrogènes e t c e l a s e u l e m e n t après a c t i v a t i o n p a r E 2 ; l e s a u t r e s métaux testés à la c o n c e n t r a t i o n d e 1 0 u M n ' a f f e c t e n t p a s l ' i n d u c t i o n d u gène r a p p o r t e u r par E 2 . L'effet d u c a d m i u m s e m a n i f e s t e p a r u n e d i m i n u t i o n d e l ' e x p r e s s i o n i n d u i t e p a r l ' oes t rad io l d u gène r a p p o r t e u r c o d a n t p o u r la B - G a l a c t o s i d a s e . L e s résultats o b t e n u s d a n s le système

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d e l e v u r e m o n t r e n t qu ' i l s ' a g i t d ' u n e a c t i o n d i r e c t e d u c a d m i u m s u r le récepteur. E n e f fe t , d a n s c e système d ' e x p r e s s i o n simplifié, le gène r a p p o r t e u r e s t s o u s le contrôle s t r i c t d u récepteur d e s oestrogènes e t d e l ' o e s t r a d i o l , il n 'y a d o n c p a s d ' i n t e r v e n t i o n d ' a u t r e s f a c t e u r s c o n t r a i r e m e n t a u x systèmes c e l l u l a i r e s p l u s c o m p l e x e s où l ' a c t i o n d ' u n xénobiotique p e u t s e m a n i f e s t e r à différents n i v e a u x . L a b s e n c e d ' a c t i o n d u c a d m i u m s u r l'activité b a s a l e d u gène r a p p o r t e u r d a n s le système d e l e v u r e (activité dépendante d e la présence d e r t E R et q u i p e u t d o n c s e r v i r d e contrôle i n t e r n e ) témoigne d ' u n e f fe t spécifique s u r l a f o n c t i o n t r a n s a c t i v a t r i c e hormono-dépendante. E n e f fe t , l'activité b a s a l e e n l ' a b s e n c e d ' o e s t r a d i o l d a n s la l e v u r e reflète la capacité d e r t E R à s e f i xe r spontanément s u r l e s éléments d e réponse d e s oestrogènes d u gène r a p p o r t e u r . C e t t e f i x a t i o n f a i b l e p e u t f o r t e m e n t a u g m e n t e r u n e f o i s le récepteur activé p a r l ' h o r m o n e , d u fa i t d e la dimérisation i n d u i t e p a r E 2 . L e fa i t q u e le c a d m i u m n e m o d i f i e p a s l'activité b a s a l e démontre d ' a u t r e p a r t l ' a b s e n c e d ' e f f e t su r d e s systèmes e n z y m a t i q u e s e t s u r l es mécanismes t r a n s c r i p t i o n n e l e t t r a d u c t t o n n e l de b a s e d e la c e l l u l e . E n e f fe t , s i l ' ac t i on d u c a d m i u m , d a n s n o s c o n d i t i o n s expérimentales, p a s s a i t p a r l ' i n h i b i t i o n d ' e n z y m e s nécessaires a u b o n f o n c t i o n n e m e n t d e la ce l l u le e t / o u p a r u n e p e r t u r b a t i o n générale d e la m a c h i n e r i e c e l l u l a i r e e t d o n c d e l'activité d e synthèse d e la c e l l u l e , l'activité b a s a l e d e r t E R d e v r a i t a u s s i d i m i n u e r d u fa i t d e la b a i s s e du t a u x i n t r a c e l l u l a i r e d e c e t t e protéine e t d e l ' e n z y m e B - G a l a c t o s i d a s e . D e même, u n effet génotoxique e s t à e x c l u r e c a r c e l a s e m a n i f e s t e r a i t a u s s i p a r u n e d i m i n u t i o n d e l'activité t r a n s c r i p t i o n n e l l e b a s a l e d e r t E R a i n s i q u ' u n e d i m i n u t i o n d u n o m b r e d e c e l l u l e s mesuré p a r la D O 6 0 0 a u t e r m e d e l'expérience ( la D O 6 0 0 d o u b l e p e n d a n t l e s q u a t r e h e u r e s d ' i n c u b a t i o n ) , c e t t e d i m i n u t i o n n 'a j a m a i s été observée d a n s n o s c o n d i t i o n s expérimentales (résultats n o n montrés). L e fa i t q u e l'activité b a s a l e , hormono-indépendante, n e s o i t pas affectée p a r c e métal démontre q u e le mécanisme d ' a c t i o n d u c a d m i u m p a s s e p a r une a c t i o n e n a v a l d e l ' a c t i va t i on d u récepteur p a r l ' o e s t r a d i o l e t s e m b l e spécifique a u récepteur d e l ' o e s t r a d i o l .

L 'effet observé d a n s l e s l e v u r e s e s t retrouvé d a n s l e s hépatocytes e n c u l t u r e p r i m a i r e c o m m e le témoigne l a d i m i n u t i o n (65 % ) d e l ' i nduc t i on p a r l ' o e s t r a d i o l d u gène d e la vitellogénine p o u r u n e c o n c e n t r a t i o n d e 10 u M e t u n e i n h i b i t i o n t o t a l e à 1 0 0 u M . Pa r c o n t r e , il n ' e s t p a s observé d 'e f f e t d u c a d m i u m s u r l ' e x p r e s s i o n d u gène r t E R à la c o n c e n t r a t i o n d e 10 u M . C e résultat différentiel p o u r r a i t être expliqué p a r u n e différence d e sensibilité d e c e s d e u x gènes à l ' a c t i on d e r tER (activés p a r E 2 e t traités p a r le c a d m i u m ) e n f o n c t i o n d e l ' e n v i r o n n e m e n t p r o m o t e u r des gènes. A u n e c o n c e n t r a t i o n d e 1 0 u M , r t E R s e r a i t f a i b l e m e n t affecté p a r le c a d m i u m et le p r o m o t e u r d u gène d e r t E R se ra i t p e u s e n s i b l e à la m o d i f i c a t i o n d e r t E R t a n d i s que le p r o m o t e u r d u gène d e la V T G s e r a i t lu i p l u s s e n s i b l e à c e t t e m o d i f i c a t i o n d e l a protéine r t E R p a r le c a d m i u m . A la c o n c e n t r a t i o n e n c a d m i u m d e 1 0 0 u M r t E R p o u r r a i t être f o r t e m e n t affecté, c e q u i p r o v o q u e r a i t u n e t o t a l e i n a c t i v a t i o n d e s o n a c t i o n t r a n s a c t i v a t r i c e . C e p e n d a n t , à c e t t e c o n c e n t r a t i o n , u n e f fe t t o x i q u e s u r l a c e l l u l e n 'es t p a s à e x c l u r e .

A u v u d e s résultats o b t e n u s d a n s l e s l e v u r e s , il e s t légitime d e p e n s e r q u e d a n s l es hépatocytes le c a d m i u m a g i r a i t p a r a c t i o n d i r ec te s u r le récepteur. C e p e n d a n t , il n ' es t p a s à e x c l u r e q u e d a n s c e s c e l l u l e s , l ' a c t i on d u c a d m i u m p o u r r a i t a u s s i être d u e à u n e interférence a v e c l'homéostasie d e c e r t a i n s i ons d i v a l e n t s c o m m e le c a l c i u m .

S' i l apparaît c l a i r e m e n t q u e le c a d m i u m a f f e c t e la t r a n s a c t i v a t i o n h o r m o n o -dépendante d u gène r a p p o r t e u r d a n s les l e v u r e s et l ' e x p r e s s i o n d u gène d e la vitellogénine d a n s l es hépatocytes, le mécanisme d ' a c t i o n d e c e métal e s t q u a n t à lu i b e a u c o u p m o i n s c la i r . A u c u n e a c t i o n d u c a d m i u m s u r la l i a i s o n d e l ' o e s t r a d i o l à s o n récepteur n ' a été m i s e e n évidence c e qui suggère, c o n t r a i r e m e n t a u récepteur d e s glucocorticoïdes ( S I M O N S et al., 1 9 9 0 ) , qu' i l n 'y a p a s d e cystéines v i c i n a l e s impliquées d a n s l a l i a i s o n d e l ' h o r m o n e .

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L e s récepteurs d e s h o r m o n e s stéroïdiennes, c o m m e d e n o m b r e u x f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n , s o n t caractérisés p a r u n e s t r u c t u r e d i t e e n « d o i g t s d e z i n c » constituée p a r hu i t cystéines f o r m a n t u n c o m p l e x e organo-métall ique a v e c d e u x i o n s Z n " . C e t t e s t r u c t u r e , i n d i s p e n s a b l e a u f o n c t i o n n e m e n t d u récepteur, p e r m e t d ' u n e p a r t d e s t a b i l i s e r le récepteur d a n s u n e c o n f o r m a t i o n dimérique e t d ' a u t r e p a r t , p e r m e t u n e i n t e r a c t i o n d u récepteur a v e c l ' A D N a u n i v e a u d e s éléments régulateurs d e s gènes c i b l e s . C e r t a i n s t r a v a u x o n t montré q u e le z i n c p o u v a i t être remplacé p a r d ' a u t r e s métaux a u se in d e l a s t r u c t u r e e n d o i g t s d e z i n c d e s récepteurs stéroïdiens ( P R E D K Y e t S A R K A R , 1 9 9 4 ) . A i n s i , si l e z i n c e s t substitué p a r d u n i c k e l , le récepteur e s t i n c a p a b l e d e s e f i x e r a u x éléments d e réponse d u récepteur d e l ' o e s t r a d i o l ( E R E ) , la même s u b s t i t u t i o n p a r d u c o b a l t p e r m e t a u récepteur d e s e f i x e r m a i s a v e c u n e affinité 1 0 f o i s m o i n s f o r t e . P a r c o n t r e , u n e s u b s t i t u t i o n p a r le c a d m i u m n e m o d i f i e p a s l'affinité d u récepteur p o u r l ' A D N . L a s u b s t i t u t i o n d e métaux, o b t e n u e in vitro, n e s e m b l e p a s être le mécanisme m i s e n j e u d a n s l e s systèmes c e l l u l a i r e s in vivo. E n e f f e t , d e u x a r g u m e n t s p l a i d e n t p o u r l ' a b s e n c e d ' u n te l mécanisme : (1) le r e m p l a c e m e n t d u z i n c p a r le c a d m i u m n e m o d i f i e p a s la l i a i s o n d u récepteur à l ' A D N d a n s l e s expériences in vitro décrites p a r S A R K A R e t al. O r , n o s résultats m o n t r e n t q u e le c a d m i u m a f f e c t e l ' a c t i on b i o l o g i q u e d u récepteur a u x oestrogènes, t a n d i s q u e le c o b a l t e t le n i c k e l s o n t s a n s e f fe t , c o n t r a i r e m e n t a u x expériences d e s u b s t i t u t i o n décrites pa r c e s a u t e u r s ; (2) l 'e f fet d u c a d m i u m n e s e m a n i f e s t e p a s s u r l'activité b a s a l e q u i représente l a capacité d u récepteur à s e f i x e r s u r l ' A D N e n l ' a b s e n c e d ' h o r m o n e . S i le mécanisme i m p l i q u a i t u n e s u b s t i t u t i o n d u z i n c , c e t e f f e t s e r a i t a u s s i o b s e r v a b l e s u r c e t t e activité d e b a s e . P o u r l e s mêmes r a i s o n s , il e s t p e u p r o b a b l e q u e le c a d m i u m a g i s s e p a r a c t i o n d i r e c t e s u r l ' A D N a u n i v e a u d e s p r o m o t e u r s d e s gènes c i b l e s e n gênant l ' i n t e rac t i on d u récepteur a v e c A D N .

L'hypothèse la p l u s p r o b a b l e s e r a i t q u e le c a d m i u m b l o q u e r a i t l e c h a n g e m e n t d e c o n f o r m a t i o n d u récepteur i n d u i t p a r E 2 ( c h a n g e m e n t i n d i s p e n s a b l e à l ' ac t i on d u récepteur), c e q u i empêcherait d e la t r a n s a c t i v a t i o n hormono-dépendante. C e phénomène p o u r r a i t s ' e x e r c e r s e l o n p l u s i e u r s mécanismes p o s s i b l e s : (1) l e c a d m i u m empêcherait l a dimérisation hormono-dépendante s a n s a f f e c t e r c e t t e dernière, c e q u i e x p l i q u e r a i t l ' a b s e n c e d ' e f f e t d u c a d m i u m s u r l'activité d e b a s e ; (2) le c a d m i u m d i m i n u e r a i t l ' i n t e r a c t i o n d u récepteur activé a v e c l ' A D N ; (3) le c a d m i u m d i m i n u e r a i t l ' i n t e r a c t i o n e n t r e le récepteur activé e t la m a c h i n e r i e t r a n s c r i p t i o n n e l l e d e b a s e e t / o u d e s c o - a c t i v a t e u r s d e la t r a n s c r i p t i o n .

CONCLUSION

L e s résultats d e c e t t e étude t e n d e n t à m o n t r e r q u e l e s o b s e r v a t i o n s relatées d a n s la littérature c o n c e r n a n t l ' i m p a c t négatif d u c a d m i u m s u r l e s f o n c t i o n s d e la r e p r o d u c t i o n c h e z les salmonidés p o u r r a i e n t p a s s e r e n p a r t i e p a r u n e i n h i b i t i o n d e l ' a c t i o n d e l ' o e s t r a d i o l d i r e c t e m e n t a u n i v e a u d e s o n récepteur et e n conséquence, p a r u n e a c t i o n d i r e c t e sur l e s gènes c i b l e s d e l ' o e s t r a d i o l , c o m m e p a r e x e m p l e s u r le gène d e la vitellogénine. A u n i v e a u p h y s i o l o g i q u e , l e s p o l l u t i o n s p a r le c a d m i u m p o u r r a i e n t être u n f a c t e u r l im i t an t le succès d e la r e p r o d u c t i o n d e s salmonidés, n o t a m m e n t p e n d a n t la vitellogenèse.

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