Introductionxavierbataille.free.fr/ana/1_clhp2.pdfX. Bataille – ENCPB - 2008 Temps mort (tmou t0) Temps que met un produit pour traverser la colonne sans être retenu. Se calcule

Chromatographie

Liquide de Haute

Performance

(CLHP-HPLC)

Introduction

X. Bataille – ENCPB - 2008

Principe de la CLHP

Séparation de constituants dans un mélange complexeMise en solution dans un solvant ou un mélange de solvant (éluant)Analyse qualitativeAnalyse quantitative



Principe


Schéma


CLHPApparition : années 1950

Chromatographie : séparation et quantificationLiquide : travail en solutionHaute performance : Grande efficacité de la séparation


Comparaison CPG-CLHP

CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse : � composés volatils,

� faibles masses molaires

CLHP : � toutes molécules trouvent un solvant pour y

être dissoutes : méthode universelle


Exemple de chromatogramme

Rétention différée


Performance - Efficacité

Nombre de plateaux théoriques

N > 2000

2 2

0 1/ 2

16 5,54r rth

t tN

ω ω

= =


Résolution

R ~ 1,5

0 0 1/ 2 1/ 2

2 1,18A B A B

A B A B

r r r rt t t tR

ω ω ω ω− −

= =+ +


Asymétrie

As = A/B


Autres paramètres

Temps de rétention réduit : t’R = tR – t0Facteur de capacité :

0

0,2

2

t

ttk R −

=0

0,1

1

t

ttk R −

=


Temps mort (tm ou t0)

Temps que met un produit pour traverser la colonne sans être retenu.Se calcule si on connaît la porosité de la colonne, définie par :

Le temps mort dépend des caractéristiques de la colonne : la longueur (l), son diamètre (2r), sa porosité (ε) et du débit imposé par la pompe (d).

3 -1éluant m

2 2colonne vide

/ cm .min / minε =

/ cm π / cm

×=× ×

V d t

V l r

2

m

ε π =

l rt

d


Autres paramètres

Sélectivité :

Sous réserve de certaines approximations :

Nk

kRS

+

−=1'

'1

4

1

αα

,

,

1

2

R

R

t

t=α


Objectif

Séparation individuelle de tous les constituants d’un mélange

Deux facteurs :� Miscibilité dans la phase mobile� Interaction (affinité) avec la phase

stationnaire


Principe d’une

séparation

Temps d’analyse :minimal

Performance : maximale

Constitution de la

chaîne


Les pompes

Délivrer un débitconstant sous une pression élevée, constante


Vanne d’injection


Boucle d’injection


Colonnes


Détecteur UV


Détecteur UV


Détecteur

réfractométrique


Détecteur fluorimétrique


Constitution de la

colonne

Colonne remplie de billesBilles de silice tapissées d’un revêtement


Billes


Phase inverse (RP)

/ phase normale

Complémentarité


Physico-chimie

de la rétention

Compromis entre:� phase stationnaire

� phase mobile

Interactions

intermoléculaires



Interactions

intermoléculaires


Moment dipolaire


Autres moments


Interaction dipôle-dipôle


Interaction dipôle-dipôle


Polarisabilité


Interaction dipôle

permanent-dipôle induit


Dispersion


Interactions

de Van der Waals


Liaison hydrogène


Bilan



O

H

O

O

O

H

O

O

H

O


« Magic » LogPoctanol/eau

Constante de partage octanol / eau

i,octanoli

i,eau

P = C

CO

H

HOH

H

OH

H

O H

HO

H

HO

HH

O

H HOH

H

OH

H

O H

HO

H

HO

H

H

O

H HOH

H

OH

H

O H

HO

H

HO

HH

O

H

O

H

O

H

O

H

O

HO

H

O

H

O

H

O

H

?


Version Chemsketch

(ACDLABS)


LogP par la méthode de Villar

(Int. J. Quantum Chem., 44444444, 203 (1992))


LogP / Villar en PM3


LogP par la méthode Ghose, Pritchett et Crippen

(J. Computational Chem., 9999, 80 (1988))


Influence de la polarité

de l’éluant

Notion de force éluante : � Influence de la proportion de solvant apolaire

Isothermes de van’t Hoff

( ) i ii iln k' ln + +

H S

RT Rφ ∆ ° ∆ °=



Préparation d’une

séparation


Choix de l’éluant


Gradient d’éluant


Gradient

d’éluant




Couplages

Identifier les produits sortants par : � Spectrométrie de masse

� Résonance magnétique nucléaire� Spectroscopie Infra-Rouge


Couplage CLHP-SM


Couplage CLHP-RMN


Couplage CLHP-IR


Optimisation d’une

séparation

tanalyse le plus petit possibleRésolution : 1,7 > R > 1,4Asymétrie : centrée sur 1Performance élevéeRobustesse : une légère modification des paramètres ne doit pas influer sur la qualité de la séparation et de l’analyse.


Facteurs d’optimisation

Colonne (longueur, diamètre, particules, chaîne alkyle)Débit - PressionEluant (%polaire-apolaire, pH)Température


Efficacité

-

Débit

Anisotropie d’écoulement


Van-Deemter / Knox

Hauteur Equivalente en Plateaux Théoriques :

N

LH =

3

Van Deemter : .

Knox : . .

VDVD VD

KnKn Kn

BH A C v

vB

H A v C vv

= + +

= + +


Efficacité d’une colonne (nombre de plateaux théorique):

Efficacité réelle (nombre de plateaux efficace) :

avec

222

1654,5

=

=

=ωδσ

RRR tttN

222'

16'

54,5'

=

=

=ωδσRRR

eff

tttN

0' ttt RR −=


Perte de charge


Exemple : optimisation

de la séparation des

bases de l’ADN


Stabilisation


Choix judicieux des

concentrations


Spectre UV-visible



Débit


% MeOH


pH


Température


Bilan


Bilan de l’optimisation


Applications de la CLHP

Analytique

CLHP Analytique � Gamme d’étalonnage

� Ajouts dosés� Etalon interne

CLHP préparative� Dérivation en sortie

� Boucle d’injection à gros volume

Documents

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