Cours M1 - 2011

Introduction aux

techniques de biologie

moléculaire

ADN

ARNm Protéine

Expression des gènes

Analyse des ARNm

Analyse des protéines

Expression des protéines

Western-blot

Immunoprécipitation

Immunocytochimie

Gel retard

Western-blot

Principe:

Séparation des protéines selon leur poids moléculaire

Immunodétection de la protéine d’intérêt

Étapes:

Extraction et préparation des protéines des échantillons

biologiques

Migration et transfert sur membrane

Immunodétection

Expression des protéines

Western-blot

Extraction des protéines

Echantillon d’origine:

Tissu (foie, cœur, etc…)

Cellules (cultures primaires, lignées cellulaires)

Extraction des protéines:

Tampon - PBS/EDTA + Inhibiteurs de protéases

- Tris-HCl

Séparation fraction/extraits totaux

- Centrifugation

- Ultracentrifugation

Débris

cellulaires

Surnageant

= Protéines

Dosage des protéines: pourquoi ?

- Échantillons différents: foie, cœur, poumon, rein, etc…

- Conditions différentes: - témoin,

- traitement inducteur ou inhibiteur

Expression différente de la protéine d’intérêt

Uniformisation des échantillons

Même quantité de protéines analysée quelque soit l’origine de

l’échantillon ou le traitement reçu

Dosage des protéines

Western-blot

Dosage des protéines

- Méthode du Biuret: - Méthode de Lowry:

Réduction du Cu2+ en Cu+ Réduction du Cu2+ en Cu+

Réaction avec Trp, Tyr, Cys Réduction du réactif de Folin

Couleur bleue, pic abs 550 nm (phénolique: jaune en bleue), pic abs 750 nm

Peu sensible 2-100 µg, zone de linéarité étroite

- Méthode de Bradford:

Bleu de Coomassie (se lie à Arg, Tyr, Trp, His, Phe)

Rouge (abs 470 nm) et bleu lorsque lié aux protéines (abs 595 nm)

Très sensible (0,2 – 20 µg), très rapide, interférence avec certains détergents

- Méthode BCA

Acide bicinchonique

Formation complexe coloré avec Cu+

Couleur violette, pic abs à 562 nm

Très sensible, rapide, compatible avec les détergents

Western-blot

Dosage des protéines: exemple

Solution d’Albumine

bovine à 1 mg/mL

Dilution en séries

Mesure au spectrophotomètre

Concentration

DO

Droite étalonnage

DO échantillon

Conc échantillon

Echantillon à

doser Distribution

Préparation des échantillons Protéines: grande hétérogénéité de poids, charges et formes

Contrecarrer ces effets Différenciation sur 1 seul paramètre

Glycérol augmente densité échantillon

-

H2N COOH

+

+

+

+

-

- Ebullition dénaturation

H2N COOH -

- -

+

+

+

Détergent anionique lipophile (SDS)

charges négatives solvatation

+ empêche précipitation

Solution tampon (Laemmli)

Composant sulfhydryl

(β-mercaptoéthanol, DTT) empêche

régénération des ponts disulfures

H2N COOH -

- -

+

+ + - -

- -

- - - - - - -

H2N COOH - - - -

- - -

Protéines dépliées et uniformément chargées (Fct masse)

Migration en fonction du poids moléculaire (+ petite, + vite)

Western-blot

Dépôt et migration des échantillons

Gel SDS-page Sodium Dodecyl Sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis

Gel de séparation (pH 8,8)

5-15% acrylamide

Gel de concentration (pH 6,8)

5% acrylamide)

Sens de

migration

+ pourcentage est élevé

+ densité réseau est élevée

+ mailles sont serrées

Dépôt et migration des échantillons

Solution de dépôt:

- Tampon HCl pH 6,8 Idem gel de concentration

- Bleu de bromophénol Suivi de la migration

- Glycérol Densifier l’échantillon

Western-blot

Séparation selon le poids moléculaire des protéines

Western-blot

Coloration du gel

Contrôle de l’homogénéité de la migration

Vérification de la présence de protéines

Bleu de Coomassie (coloration homogène)

Nitrate d’Argent (plus sensible, parfois moins homogène)

Western-blot

Transfert sur membrane

- Pression, application d’un courant

- Fixation des protéines de façon non-spécifique:

- Interactions ioniques

- Interaction hydrophobes

- Membranes nitrocellulose / PVDF

Western-blot

Coloration de la membrane

Contrôle de l’efficacité du transfert

Contrôle de l’homogénéité des dépôts

Coloration réversible

Western-blot

Immunodétection

Blocage des sites aspécifiques

Incubation avec Anticorps primaires

Incubation avec Anticorps secondaires

Révélation

Western-blot

Blocage de la membrane

Blocage des sites aspécifiques:

- Protéines de lait (solution de lait à 5% dans tampon TBS-Tween)

- BSA (Bovine Serum Albumin – 3-5% dans tampon TBS-Tween)

Membrane X X X X

Blocage avec des protéines inertes

Membrane

Western-blot

Incubation avec Anticorps primaires

Anticorps primaires = dirigé contre un épitope de la protéine X

Dilués dans la solution de blocage (lait ou BSA)

X X X X

Membrane X X X X

Lavage = supprime l’excès d’Ac 1aires

Western-blot

Incubation avec Anticorps secondaires Anticorps secondaire = dirigé contre l’espèce à laquelle

appartient l’anticorps primaire (ex: souris, chèvre, lapin)

Couplés à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline)

Membrane X X X X

Perox Perox Perox Perox

X X X X

Perox Perox Perox Perox

Lavage = supprime l’excès d’Ac 2aires

Western-blot

Révélation par chemiluminescence Ajout du substrat de l’enzyme

Clivage avec relargage d’un produit émettant de la lumière

Impression d’un film photographique

Révélation photo

X X X X

Perox Perox Perox Perox

Ex: Stabilisation du facteur de

transcription HIF-1α par l’hypoxie

Western-blot

Western-blot: Résumé

Extraction et préparation des échantillons

- Protection vis-à-vis des protéases

- Dosage

- Dénaturation

Electrophorèse

- Dépôt et migration des échantillons sur gel (selon leur poids

moléculaire)

- Transfert sur membrane

Immunodétection

- Blocage des sites aspécifiques

- Incubations avec Ac 1aire puis 2aire

- Révélation

Immunoprécipitation Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire

Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt

Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à

des anticorps (ex: Protein G)

Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée

Interactions protéines-protéines, protéine-médicament

Concentration d’une protéines présente en faible quantité

Western-blot

Western-blot

Méthode d’analyse des cellules in situ par une technique

d’immunofluorescence

Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des

anticorps spécifiques

Utilisation d’un fluorochrome couplé à:

- anticorps primaire = immunofluorecence directe

- anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte

Ex: Mise en évidence du cytosquelette

Anticorps 1aire anti-tubuline

Anticorps 2aire couplé à la fluorescéine

Immunocytochimie

Immunocytochimie

Immunocytochimie: Méthode

Immunocytochimie

Cellules en culture

Fixation (PFA 4%) Lavages au PBS

Perméabilisation au

Triton X-100 (0,05%)

Blocage des sites

aspécifiques (BSA 3%)

Anticorps 1aire

(une nuit – 4°C)

Anticorps 2aire

couplé au

fluorochrome

Lavages

au PBS

Analyse au

microscope

Anti-actine

Immunocytochimie: exemple

Immunocytochimie

Facteur de transcription HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor)

- Présence O2 cytoplasmique

- Absence O2 nucléaire transcription de gènes nécessaires à la survie

cellulaire

Fibroblastes de membrane synoviale humains

+ mimétique (CoCl2 150 µM) pendant 24 h

Témoin CoCl2

Les fluorochromes

Immunocytochimie

Substance chimique capable d'émettre de la lumière de fluorescence

après excitation

Sont caractérisés par: - un spectre d’absorption

- un spectre d’émission

Ex: Fluorescéine

Absorption des radiations bleues

(max 490 nm)

Émission d’une fluorescence

verte (max 520 nm)

Les fluorochromes Diagramme de Jablonski

Immunocytochimie

S0

État fondamental

S1 État excité

Niveau

d’énergie des

électrons

d’une

molécule

fluorescente

Laser Absorption

Fluorescence

Emission

Les fluorochromes Exemples

Immunocytochimie

DAPI

- Excitation à 365 nm; émission à 420 nm

- Contre-coloration de fond des noyaux

- Fluorescence bleue

FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine

- Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm

- Fluorescence verte

TRITC: Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate

- Excitation à 541 nm ; émission à 572 nm

- Fluorescence rouge

Le microscope à fluorescence

Immunocytochimie

Filtre correspondant au fluorochrome utilisé

Filtre d’excitation (2): permet de sélectionner les

radiations absorbées par le fluorochrome (fluorescéine:

490 nm)

Miroir dichroïque (3): ne réfléchit que les radiations

absorbables vers l’échantillon et ne laisse passer par

transmission que les radiations vertes

(fluorescéine: > 500 nm)

Filtre d’émission (6): ne laisse passer par

transmission que les radiations vertes

(fluorescéine: > 500 nm)

1-lampe à arc

2-filtre d'excitation

3-miroir dichroïque

4-objectif

5-préparation

6-filtre d'émission

7-oculaire

Le microscope à fluorescence

Ex: Fluorescéine

Immunocytochimie

Le filtre d'excitation

sélectionne les

radiations spécifiques

du fluorochrome...

...qui sont réfléchies

par le miroir et

éclairent

l'échantillon...

...celui-ci émet les

radiations de fluorescence

qui seules atteignent

l'oculaire.

Étude des facteurs de transcription Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

Gel retard

Facteur de

transcription

activé

Recrutement du

complexe d’activation de

la transcription

ADN Séquence de

fixation

spécifique

Gène TATA box

Étude de la fixation d’un facteur de transcription sur sa séquence cible

Principe (1)

Gel retard

Retard de migration dans un gel natif de polyacrylamide de duplexes

d'oligonucléotides de séquences courtes (15 à 30 nucléotides) en

présence de protéines (ou de complexes protéiques) ayant la propriété de

reconnaître spécifiquement la séquence d'intérêt.

Marquage radioactif au P32 des sondes nucléotidiques.

Spécificité de reconnaissance des sondes marquées testée par l'ajout en

excès du même duplexe non radioactif qui entrent en compétition avec la

forme radioactive.

Présence de protéines spécifiques dans le complexe retardé peut être

mise en évidence par l'ajout d'anticorps spécifiques qui permettent un retard

plus important sur le gel appelé " supershift ".

* *

Sonde libre

Principe (2)

Gel retard

* *

* *

* *

Sondes spécifiques

marquées au P32

+

Protéines nucléaires extraites

- Fixation de la protéine sur sa

séquence cible

- Élimination des autres

Dépôt sur un gel natif

* * *

* *

*

* *

Sonde + protéine

* *

Sonde + protéine + Ac

= « Super-Shift »

Résultats

Gel retard

Extraits nucléaires de cellules Hela

Inconvénients: - Extraction de protéines nucléaires

- Manipulation de la radioactivité

Expression des gènes

Étude de l’expression

Extraction des ARNs

Reverse Transcriptase

PCR semi quantitative et quantitative

Blocage de l’expression

siRNA

Extraction d’ARN

Molécules très fragiles

- Matériels stérile, RNAses et DNAses free

- Travail sur glace

- Port de gants

- Pointes avec filtre

Extraction Phénol/Chloroforme

Utilisation du Trizol® : - Phénol = isole les ADN et ARN

- Isothiocyanate de guanidium = dénaturation protéines

- Anti-RNases

Extraction d’ARN

Extraction d’ARN

Extraction d’ARN

Cellules en culture - Enlever le milieu de culture

- Ajouter le Trizol

- Gratter avec une spatule

- Récupérer dans un tube

Ajout Chloroforme

Vortex

Incubation sur glace

Protéines

Culot d’ARN

Resuspension dans l’eau UP

Lavage à l’Ethanol 70°C

Conservation à -80°C

Dosage à 260 nm

Centrifugation

Phénol + Chloroforme

= Débris cellulaires

Phase aqueuse

= ARN totaux Ajout Isopropanol

= Précipitation

ARN à -20°C

Centrifugation

Transcription inverse (1)

Transcription inverse

ARN ADN complémentaire

Molécule moins fragile

Conservation à -20°C

Sélection des ARNm

Matrice pour la réaction d’amplification

Enzyme Transcriptase inverse isolée de rétrovirus à ARN

Transcription inverse (2)

Transcription inverse

Kits commerciaux avec:

- Enzyme + tampon d’activité

- dNTPs en quantité suffisante

- DTT élimination des structures 2aires des ARNs

- Amorces polydT sélection des ARNm

AAAAA

10 min à 70°C

DTT AAAAAAAA

TTTTTTTTT

Amorce oligo dT 1h – 37°C

15 min – 70°C ARNm

TTTTTTTTT

ADNc

Polymerase Chain Reaction (PCR)

PCR

Méthode d’amplification génique in vitro

Permet de copier en grand nombre (facteur de multiplication de l'ordre du

milliard), une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité

(pg) d'acide nucléique

Utilisation d’amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse

(20 à 25 nucléotides) obtention d’un amplicon de taille connue

Basée sur:

L’utilisation d’enzymes ADN polymérase ADN dépendantes thermostables

Les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires

d’ADN en fonction de la température

PCR: étapes d’un cycle

PCR

PCR: en pratique

PCR

Animation Flash

Au final, on obtient un très grand nombre de copies du

gène d’intérêt, visualisables sur gel

PCR: dépôt sur gel

PCR

Gel d’agarose = maillage

Plus solide et moins toxique que l’acrylamide

ADN chargé négativement, migre selon sa taille (ADN linéaire)

Plus % agarose est élevé, plus on sépare les petits fragments

Visualisation avec du Bromure d’Ethidium (agent intercalant)

- Ajouté lors de la préparation du gel

- En solution dans laquelle le gel est plongé après migration

M échantillons

PCR quantitative ou en temps réel

PCR

A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est

mesurée grâce à un marqueur fluorescent.

Suivi de la cinétique complète = quantification absolue de la quantité initiale

d’ADN cible

2 techniques:

- agents se liant à l’ADN (ex: SYBR Green)

- sondes fluorescentes (ex: Taqman)

2 conditions:

- Fluorescence augmentée lorsque lié à l’ADN double brin

- Pas d’inhibition de la réaction de PCR

PCRq: SYBR Green

PCR

Étape de dénaturation: le colorant libre émet

peu de fluorescence

Étape de dénaturation: extinction de la

fluorescence

Mesure à la fin de l’étape d’élongation

Étape d’hybridation et d’élongation:

fluorescence associée à la quantité de colorant se

fixant à l’ADN double brin

Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation du

signal de fluorescence est observée pendant l’étape

de polymérisation et l’émission fluorescente décroît

complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape

suivante

PCRq: SYBR Green

PCR

Avantages:

Utilisation simple

Pas de sonde

Nécessité d’amorces spécifiques

Pas affectée par la présence de mutations sur l’ADN cible

Inconvénient

Se fixe à n’importe quelle molécule d’ADN double brin

Visualisation des produits aspécifiques

PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde

PCR

Basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser

une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape

d’hybridation/extension de la PCR.

Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au

fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET (fluorescence resonance

energy transfer) qui dissipe cette énergie sous forme de chaleur plutôt que

d’émettre de la fluorescence.

Un fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fixé

à l’extrémité 5’ de la sonde d’hybridation et son émission est inhibée par un

second fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l’extrémité 3’ (ex.

TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine).

PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde

PCR

Hybridation de la sonde

Fixation de l’amorce et

élongation

Hydrolyse de la sonde

Émission de fluorescence

L’émission de fluorescence augmente à chaque cycle

proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde

PCRq: Technologie Taqman Hydrolyse de sonde

PCR

Précautions:

Nécessité d’un A, un C ou un T à l’extrémité 5’ parce qu’un G supprime

la fluorescence de l’émetteur même après clivage

Tm de 5 à 10 °C plus élevé que les amorces afin de s’assurer qu’elles

s’hybrideront avant les amorces et qu’elles demeureront hybridées

pendant l’étape combinée d’hybridation et de polymérisation

Avantage:

Plus spécifique

Inconvénient:

Pas idéale pour la détection des mutations

PCRq: Cycle seuil (Ct)

PCR

Base de la quantification précise et reproductible de l’ADN par fluorescence

Valeurs de fluorescence enregistrées à chaque cycle représentent la quantité

d’amplicons produits à un instant précis

Plus il y a de matrices à amplifier au

départ de la réaction de PCR, moins élevé

sera le nombre de cycles requis pour

atteindre un point où le signal d’émission

de fluorescence sera statistiquement et

significativement plus élevé que le bruit de

fond)

Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra toujours au cours de

la phase exponentielle d’amplification.

PCRq: Courbe de fusion « Melting curve »

PCR

Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de

fusion (Tm) spécifique, définie comme étant la température à partir de

laquelle 50% de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme

simple brin.

Étape supplémentaire programmée en fin des cycles d’amplification

45°C à 75°C par palier de 0.1°C avec acquisition de la fluorescence en

continu

PCRq: Courbe de fusion « Melting curve »

PCR

Dérivée première de la fluorescence en fonction de la température

Vérification de la spécificité des sondes

PCRq vs PCR classique

PCR

Quelques ng d’ADN suffisent

Rapidité du run (~ 1 h vs 2h30)

Sensibilité

Quantification précise (si droite d’étalonnage avec une quantité connue)

Logiciels d’analyse = exportation des résultats et gain de temps

small interfering RNA (siRNA)

siRNA

ARN simple ou double brin, qui interfère avec un ARNm spécifique

conduisant à sa dégradation et à la diminution de sa traduction en

protéine

Mécanisme très spécifique

Permet l’étude des gènes

RNA interférence

siRNA

ARN double brin

introduit dans la

cellule (siRNA)

DICER

Complexe RISC

(RNA-Induced Silencer

Complex)

Elimination d’un des brins

du siSNA, dit « passager »

Ciblage des ARNm de la

cellule possédant une

séquence complémentaire

DICER Ribonucléase qui clive l’ARN

double brin toutes les 21 à 25 pb

Clivage de l’ARNm

cible par RISC

- Nécessité d’une complémentarité parfaite entre le siRNA et sa cible

Mécanisme très spécifique

- Possibilité de choisir un siRNA capable de cibler un ARNm porteur

d’une mutation ponctuelle sans affecter l’ARNm sauvage

RNA interférence

siRNA

- Introduction du siRNA 24h avant le début de la manip

- Vérification par western-blot de l’extinction de la protéine

Frede et al., 2005 Anand et al., 2007

Conclusions Importance des outils de la biologie moléculaire

Etude de l’expression génique

- Transcriptionnel (ARNm)

- Traductionnel (Protéines)

Etudes de localisation

- Localisation fonctionnelle

- Physiologique vs pathologique

ne correspondent pas toujours

Limites: - Disposer d’un matériel en quantité suffisante

- Spécificité (anticorps, amorces, etc…)