Archives Internationales de Physiologie et de Biochimie, 1972, 80, 541-548 541

ReCu le 8 mars 1972.

ISOLEMENT ET PROPRgTES DE LA L-MEROMYOSINE-1 DE CAROTIDE

DE B(EUF PAR

Francoise HURIAUX

L‘niversitk de Li&ge,) (Laboratoire de Biologie genkrale, Faculte des Sciences,

( I figure)

INTRODUCTION

La L-meromyosine (LMM) de muscle lisse de VertCbrC (COHEN et al., 1961; HURIAUX, 1965; BARANY et al., 1966) prCsente des propriCtCs de skdimentation et de viscositC semblables a celles de la LMM squelettique. La LMM de carotide, isolCe par fractionne- ment par (NH,),SO, en diffkre toutefois par sa zone de salting-out, sa solubilitC ClevCe, sa tendance a s’agrCger rkversiblement A faible force ionique et sa cristallisabilitC dans des conditions diffirentes de force ionique et de pH (HURIAUX, 1965). Nous nous sommes proposC d’examiner de faGon plus prCcise diverses propriCtCs de la LMM-1 de carotide de bceuf et de les comparer a celles de la LMM-1 d’un muscle squelettique blanc, le peaucier, provenant de la m6me espbce. Les LMM ont CtC isolCes par cristallisations succes- sives; les impuretCs qui ne sont pas CliminCes par ce traitement ont CtC dCnaturCes par l’alcool selon SZENT-GYORGYI et al. (1960) afin d’obtenir la fraction 1 correspondante (LMM-1).

MATBRIEL ET MBTHODES

La myosine de carotide de boeuf, extraite a force ionique ClevCe et pH neutre a CtC prCparCe suivant la technique dCcrite prCcCdem- ment (HURIAUX et al., 1965) et purifiCe selon HURIAUX (1965) mais en prCsence de 2 mM j3-mercaptoCthano1 afin de rCduire les phino- mknes d’agrkgation (GASPAR-GODFROID, 1968). Elle a CtC hydro- lysCe par la trypsine (HURIAUX, 1970) en prCsence de ce mCme agent

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riducteur. La LMM-1 de peaucier a CtC isolCe suivant le mode opCratoire detail16 antkrieurement dans le cas du muscle de lapin (HURIAUX, 1965) et centrifugke 2 h a 165 000 x g (Spinco, Modble L-50) afin d’kliminer complbtement la fraction dCnaturCe par l’alcool.

La concentration en protiine des solutions a CtC dCterminCe par rCfractomCtrie (HURIAUX et al., 1965) ou par la mCthode au biuret (GORNALL et al., 1949). Les techniques de viscositC, d’ultracentri- fugation et d’6lectrophorbse en phase liquide ont CtC dCcrites antkrieurement (HURIAUX et al., 1965). Dans le cas des analyses d’acides aminks (HURIAUX, 1970), la teneur en cystiine a CtC dCterminCe aprbs oxydation par l’acide performique (HIRS, 1956) selon GERDAY & BHUSHANA RAO (1970). L’azote amid6 a CtC dosC par microdiffusion (STEGEMANN, 1958).

RBSULTATS

Isolement et homogknkitf?.

La digestion protColytique de la myosine de carotide de bceuf, suivie par ultracentrifugation et viscosimktrie, est arrCtCe habituel- lement aprbs 40 min, au moment oh la myosine est presque entibre- ment hydrolyde et oh la teneur en LMM cristallisable est maxi- male. L’hydrolysat est ensuite dialyse a 1 0.075 et pH 7.3 puis centrifugC pendant 2 h a 165 000 x g afin d’iliminer un prCcipitC Cventuel. La LMM est isolCe par 3 cristallisations successives a 10.075 pH 6.2 (0.0073 M Na,HPO,, 0.029 M NaH,P04, 0.025 M NaCl) (HURIAUX, 1965). Elle est purifiee par prkcipitation a l’alcool selon SZENT-GYORGYI et al. (1960); la solution opalescente obtenue aprbs Climination de l’alcool est clarifiCe par 2 centrifugations de 2 h 165 OOO x g . La LMM-1 isolCe dans ces conditions sCdimente it 10.35 et pH 7.1 sous forme d’un gradient d’ultracentrifugation homogbne. L e rendement de la prkparation est de 10 mg f 1.5 pour 100 mg de myosine.

PropritWs physico-chimiques.

Diverses propriCtis des deux LMM-1 de baeuf que nous avons isoltes, ont CtC comparCes A celles de la LMM-1 de muscle squelet- tique de lapin dans le tableau I. La LMM-1 de carotide ne pricipite

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pas a faible force ionique et pH neutre contrairement A la LMM-I de muscle squelettique de bceuf qui prCsente un minimum de solu- bilitC a 10.075 et diffbre de celle de lapin, moins soluble. En prtsence de sulfate ammonique, on observe une variation semblable des zones de salting-out des trois LMM-1 considCrCes. La LMM-I de carotide, tout comme la LMM (HURIAUX, 1965) sCdimente nor- malement a I 0. I5 mais s'agrbge partiellement a 1 0.075 et pH 7.3, en un composant plus rapide de 3.8 S environ. Sa teneur qui varie de 20 a 56 % dans le cas de trois prtparations de LMM-1 isolCes aprbs 40 min de digestion (fig. l), peut atteindre plus de 90 % lorsque le temps de digestion est rCduit 10 min. Par contre la LMM-1 de muscle squelettique de bceuf ne donne pas lieu A un phknomkne semblable B I 0.075, malgrt sa solubilitk plus ClevCe que celle de la LMM-1 de lapin. La LMM-1 de carotide se distingue aussi de la LMM-1 de peaucier par sa mobilitC Clectrophoretique plus ClevCe B pH neutre; cette difference de mobilitC des deux protCines reste relativement canstante lorsque le pH varie de 6.4 a 7.65.

FIG. I . Diagrummes d'ultracentrifugation de la L-mCromyosine-I de carotide A 0.075 pH 7.3 (diagramme superieur) et I0.15 pH 7.3 (diagramme infkrieur) obtenus apres 100 min a 59 780 t/min. Concentration : 0.3 %, cellules b double secteur, angle du couteau 55", temperature : 20 "C (preparation presentant 56 % d'agregation A 10.075 pH 7.3).

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Composition en acides aminb.

Nos preparations de LMM-1 de peaucier de bceuf se sont revelees diffkrentes de celles de muscle squelettique de lapin en ce qui concerne leurs teneurs en glycine et en proline (tableau 11). Des analyses complkmentaires ont montrC qu’elles contiennent CgaIe- ment de I’hydroxyprafine et que ces divergences sont de ce fait entikrement imputables a la presence d’environ 4 ”/, de collagbne. Divers essais de dbnaturation par l’alcool i 37 et 50 O C pendant 2 h ‘/2 ou par chauffage au bain-marie B 100 OC pendant 10 min n’ont pas permis de rkduire ce pourcentage de collaghe. Les

TABLEAU 11. composition en nrides arnints de la LMM-I de difftrenis muscles (rtsidusl105 g de prottine).

Lys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . His . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Ser . . . . . . . . . . . . Glu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Pro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Gly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ala . . . . . . . . . . . . . . . . . . . cys . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Val . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ile ....................

. . . . . . . . . .

Asp + Glu . . . . . . . . . . . . . CONHz . . . . . . . . . . . . . . . . Lys + His + Am . . . . . . . Excts de chargesnkgatives

a pH 7 (3) . . . . . . . . . . . .

Muscle squelettique de bceuf

92 18

57 83 36 31

22 I

33 83

27 16 46

100

:res variable

4.8

3.0

7.6 4.6

863

304

167

46

loo& 7

corrigee pour le

collagene

95 19

58 85 37 31

228 0

20 82

27 17 48

103

-

3.2

7.7 4.3

865

313 l03* 7 172

47.5

Muscle squelettique

de lapin (LOWEY &

COHEN, 1962

94 21

108 60 83 33 34

210 0

18 81

38 19 39 96 9 4

843

293 (108) 175

(20.5)

4.0

Carotide de boeuf (l)

(l) Une preparation. (z) Deux prtparations. P) En supposant la moitit des groupements histidine charges a pH 7.

104

100 54 79 27 39

249 0

17 94

30 14 14

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6.3 9.6

860

328 106 zk 8 (a) 166

60

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rksultats expirimentaux ont CtC corrigCs en fonction de la composi- tion du collagkne de tendon de beuf dCterminCe par PIEZ & LIKINS (1960). Les valeurs ainsi obtenues montrent que les LMM-1 de mus- cles squelettiques de beuf et de lapin sont trks semblables. Par contre, la LMM-1 de muscle lisse de carotide prksente des diver- gences importantes de composition : elle possbde des teneurs beaucoup plus faibles en histidine, cystkine et isoleucine ainsi que des teneurs accrues en lysine, acide glutamique, alanine, leucine et surtout phenylalanine. Les teneurs en azote amid6 des LMM-1 de carotide et de muscle squelettique de beuf ne diffkrent gukre et permettent de calculer un excks de charges nCgatives a pH neutre en accord avec la diffkrence de mobilite ClectrophorCtique mesurke. Dans le cas de la LMM-I de lapin, I’absence de dktermination directe de l’azote amid6 rend la comparaison malaisee.

DISCUSSION

La LMM-1 de carotide prCsente les mCmes propriktes de sCdi- mentation et de viscositC que les LMM-1 de muscle squelettique (tableau 1) et de muscle cardiaque (MUELLER et al., 1964; VER- POORTE & KAY, 1966) et doit, de ce fait, avoir les mCmes dimensions moleculaires. Sa longueur et son poids moleculaire dependent vraisemblablement, comme dans le cas de la LMM-I squelettique de lapin (BALINT et al., 1968; LOWEY et al., 1969), de la durCe de la digestion, Ctant don& I’influence de celle-ci sur les phdnombnes d’agrkgation observes a faible force ionique.

Elle diffkre par contre des LMM-1 squelettiques de lapin et de baeuf a divers points de vue. Sa solubilitC plus ClevCe et sa charge nigative plus grande a pH neutre sont vraisemblablement en rapport avec la faible stabilite des filaments de myosine du muscle lisse de VertebrC. Sa composition en acides aminks prCsente d’im- portantes divergences par rapport a celles des LMM-1 de muscle squelettique. Sa teneur en cystCine correspondant a un seul rksidu par molCcule ne semble pouvoir Ctre mise en doute, en raison de la mCthode utiliske et de la trbs bonne concordance obtenue dans le cas des deux preparations CtudiCes. Ce rCsultat n’exclut toutefois pas la possibilitk de l’existence de deux rCsidus de cystkine dans ce fragment de la myosine et par consdquent de deux chaines Cqui- valentes, &ant donnC que cet acide aminC peut &re situC dam la

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rkgion de la molkcule hydrolysie prkfkrentiellement par la trypsine. Nos analyses suggkrent d’autre part que la LMM-I de muscle squelettique de baeuf ne posskde que deux peptides cystkiques diffkrents alors que WEEDS (1967) en dktermine trois dans le cas de la LMM-I de muscle squelettique de lapin.

La contamination par le collagkne des preparations de peaucier de bceuf est vraisemblablement due A I’utilisation de muscles pro- venant d’animaux jeunes. Cette protkine parait fortement stabi- liske par son association avec la LMM-1 de muscle squelettique.

Nous avons isole la fraction 1 de la L-mkromyosine (LMM-1) de carotide de bceuf et compare ses propriktks a celles des LMM-1 provenant de muscles squelettiques de bceuf et de lapin. Ces trois sous-unitks de la myosine posskdent vraisemblablement les mCmes dimensions molkculaires. La LMM-1 de muscle lisse se distingue toutefois des LMM-I de muscle squelettique par une plus grande solubilitk, un excks de charges nkgatives plus Clevk a pH neutre et une composition diffkrente en acides aminks, particulikrement en cystkine et en phknylalanine. La presence de proline dans nos prC- parations de LMM-1 de peaucier de bceuf est attribuable a leur contamination par environ 4 % de collagkne soluble.

Nous remercions vivement Monsieur le Professeur G. HAMOIR et Monsieur CH. GERDAY, Assistant, de leur aide et de leurs conseils. Nous sommes reconnaissante au Docteur A. G. WEEDS (Cambridge) d’avoir suggCrC I’idCe de la prCsence Cventuelle de collaghe dam certaines de nos prkparations.

BIBLIOGRAPHIE

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FranGoise HURIAUX Laboratoire de Biologie ginerale, Institut Van Beneden, Universite de Libge 22, Quai Van Beneden, B-4000 Libge, Belgique

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