CCO Médecine MoléculaireLe 19/11/2012 de 17h30 à 19h30Pr Hélène CavéRonéotypeuse : Marjolaine Engelmann CharneauRonéolectrice : Nisrine Ettajani

Voie RAS normale et pathologique

La voie RAS est tombée à l’examen l’an dernier mais peut retomber !

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SOMMAIRE

I. Introduction 1. Généralités2. Les étapes clés dans la connaissance de RAS

II. La voie RAS normale 1. La protéine Ras2. Le récepteur à tyrosine kinase, RTK3. Activation et Inactivation de la voie RAS4. Une voie de signalisation activée par Ras : la voie des

MAPK/ERKIII. Les pathologies associées à RAS ou Rasopathies

1. La Neurofibromatose de type 12. Le Syndrome de Noonan

a) La maladieb) SHP-2 et les mutations de PTPN11

3. Syndromes associés au syndrome de NoonanIV. Oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs

1. Quel est le risque de cancer ?2. Pourquoi activer la voie RAS est incompatible avec la vie ?3. Mutations des gènes de la voie RAS dans les tumeurs

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I. Introduction

La voie RAS a été abordée en cours de Biochimie par Mme Cavé, elle sera approfondie (dans son fonctionnement normal et pathologique) dans ce cours où l’on abordera en plus les pathologies qui lui sont associées. Ces pathologies sont rares et nous avons peu de chance de les rencontrer en clinique (cependant elles sont un peu plus fréquentes en pédiatrie).

Le but n’est pas de connaître ces maladies mais de les prendre comme modèles de la voie RAS. Il faut retenir les voies de signalisation en particulier celle de Ras et la manière de montrer en pratique comment elles interviennent dans les maladies (degré de mutations somatiques, constitutionnelles…).

1. Généralités

La voie RAS est un point crucial de rencontre des voies de signalisations cellulaires qui intervient dans la signalisation des facteurs de croissance. Elle sert à la transmission de l’information entre le milieu extracellulaire et intracellulaire. La protéine Ras en elle-même est un commutateur moléculaire et induit la voie des MAPKinases.

On a pu la découvrir et l’étudier plus précisément car elle intervient dans une pathologie importante à l’heure actuelle : le cancer.

C’est pour cette raison que cette voie est fondamentale.

2. Les étapes clés dans la connaissance de RAS

RAS (Rat Sarcoma Virus) est un homologue cellulaire de l’oncogène viral associé au sarcome de Harvey (HRAS) et Kirsten (KRAS). C’est un ensemble de protéines codées par des gènes qui a été découvert dans les années 80. RAS est le 1er oncogène à avoir été découvert.

On a découvert les gènes humains HRAS et KRAS (en 1981) puis NRAS (en 1983) parce qu’ils étaient mutés dans les tumeurs (sarcome, neuroblastome pour NRAS…). Comme ils ont été identifiés à partir des cancers on a su dès le départ que la voie RAS est impliquée dans les cancers humains où ces protéines sont constitutivement actives.

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Pour comprendre le fonctionnement de la voie RAS on a utilisé un modèle (1983). On a transfecté dans des cellules primaires, dites « fraîches » (sans anomalie à part celle que l’on introduit), le gène muté pour qu’elles le produisent. On a ainsi regardé si ces cellules acquéraient le phénotype tumoral (par perte de l’inhibition de contact par exemple…). Au lieu de devenir tumorales ces cellules sont mortes.

RAS n’est donc pas capable de transformer seule des cellules primaires en cellules tumorales.

Du fait de son implication dans les cancers, il y a eu énormément de travaux menés autour de cette voie de signalisation. Cette voie est donc particulièrement bien connue même s’il reste des parties inconnues car c’est une voie très complexe.

Au départ RAS est isoprénylée (découverte en 1989). Un isoprène (qui appartient à la famille des "prène"), modification post-traductionnelle, est un radical lipophile (chaîne carbonée) qui permet l’ancrage de la protéine dans la membrane cytoplasmique. Cela joue sur son efficacité. RAS agit principalement dans la membrane cytoplasmique de la cellule, là où se trouvent les récepteurs.

On a ensuite découvert que RAS activait de nombreuses voies intracellulaires en aval (années 90) comme celle des MAPK qui est la plus connue car c’est la 1ère à avoir été découverte. On a ensuite découvert celle de PI3K et d’autres qui sont moins ubiquitaires et moins connues.

En 1997, il y a eu un article qui expliquait que si on prenait des souris auxquelles on supprimait le gène RAS (KO de RAS), ces souris mourraient, étaient incapables de vivre. RAS est donc utile dans le développement in utero normal, fœtal, pas que dans les cancers. A l’inverse de P53 par exemple qui n’entraîne pas de problème dans le développement.

En 2000 on a découvert que la voie RAS était impliquée dans des maladies autres que le cancer, des maladies du développement comme le syndrome de Noonan, de Costello ou encore le syndrome cardio-facio-cutané.

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II. La voie RAS normale

1. La protéine RAS

La protéine RAS appartient à la sous famille des petites protéines G, elle est en réalité l’équivalent de la sous-unité α de la protéine G. Elle possède le site de fixation au nucléotide et l’activité GTPase. Elle est activée par l’échange du GDP en GTP et inactivée par l’hydrolyse du GTP en GDP par une activité GTPase, ce qui libère un phosphate inorganique. La protéine RAS active ensuite les voies de signalisation en aval.

Le cycle se déclenche par la fixation d’un ligand sur son récepteur qui active l’échange du GDP en GTP. C’est Sos, facteur d’échange, qui se fixe sur le récepteur de RAS, quand celui-ci est activé, et qui active la voie.

RAS est une protéine qui possède 4 isoformes. Il existe 3 gènes RAS qui codent pour 4 protéines de 21 kD à forte homologie : HRAS, NRAS, KRAS qui se divisent en 2 protéines différentes par épissage alternatif (4A et 4B). Elles sont composées d’un domaine très conservé dans lequel on retrouve notamment les codons 12,13 et 61. Ces codons sont mutés dans la plupart des cancers et toujours à la même position dans tous les membres de la famille. Il existe ensuite une région hypervariable où auront lieu les modifications post-traductionnelles des protéines.

C’est à ce niveau que se trouvent les différences entre les membres de la famille RAS, ce qui induit des localisations différentes dans la cellule.Les différences permettent aussi la redondance, donc une sécurité pour la cellule au cas où il y aurait des altérations d’une protéine. Mais surtout cela

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permet une expression tissu-spécifique, une régulation plus fine en particulier transcriptionnelle. C’est souvent ce qui nous distingue de la levure dans l’évolution, la présence de plusieurs gènes dans une famille.

2. Le récepteur à tyrosine kinase, RTK

Le récepteur de Ras est un récepteur à tyrosine kinase. Quand le ligand se fixe sur le récepteur il y a dimérisation des 2 récepteurs avec activation de la fonction tyrosine kinase par phosphorylations croisées. De nombreuses tyrosines phosphates apparaissent et permettent la fixation d’autres protéines au récepteur grâce aux domaines récurrents SH2 qu’elles possèdent. SH2 est un motif qui reconnaît les tyrosines phosphates. Il y a ainsi formation de complexe pluri-moléculaire.

Les protéines pouvant se fixer au domaine catalytique du récepteur RAS sont en particulier GRB2 (adaptateur moléculaire), SHC, SHP-2 et Ras-GAP bien qu’il en existe d’autres (qui ne sont pas à connaître).

3. Activation et Inactivation de la voie RAS

Ce qui est important c’est Sos et GRB2.

Quand le récepteur est activé de nombreuses molécules viennent s’y fixer ; notamment Sos qui se trouve à la membrane où Ras est déjà présent. Sos, facteur d’échange, peut modifier la conformation de Ras en ouvrant sa poche. Comme il existe plus de GTP que de GDP dans le cytoplasme, la probabilité qu’un GTP se fixe dans la poche de Ras est plus grande et donc Ras est activée.

La modification de Ras lui confère la propriété de s’accrocher à d’autres molécules. Ras agit par interactions directes avec d’autres molécules activant de nombreuses voies de signalisation en aval : PI3K, RafRBD (Raf Ras Binding Domain, Raf contient un domaine de liaison à Ras, cette liaison n’a lieu que si Ras est activée par un GTP).

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Il est toujours très important d’inactiver le système. L’inactivation se fait par une hydrolyse portée par Ras lui-même. Cette capacité hydrolytique est faible et doit être activée par des protéines extérieures : les Ras-GAP. Ce sont des GTPases actives sur Ras, recrutées par le récepteur activé. Un récepteur active la protéine mais recrute également le processus d’inactivation. C’est la cinétique entre les deux qui crée l’action. L’inactivation est recrutée par le signal lui-même.

4. Une voie de signalisation activée par Ras : la voie des MAPK/ERK

La cascade des MAPK est une cascade de kinases qui entraînent des phosphorylations. Ras (qui n’est pas une kinase) active la 1ère kinase à rentrer en jeu qui est Raf. Raf phosphoryle Mek qui phosphoryle Erk qui va activer d’autres molécules, comme Elk dans le noyau, qui activent la transcription. On appelle cette voie la voie MAPK/ERK car le dernier intervenant activé et qui l’est toujours est Erk.

Pour vérifier que cette voie fonctionne on effectue un Western Blot avec des anticorps anti-phospho-Erk, car c’est la phosphorylation de Erk qui permet de connaître l’état d’activation de la cascade. Doser Erk ne sert à rien car ce sont les modifications de Erk qui sont importantes. On utilise cependant

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également des anticorps anti-Erk pour comparer les proportions de Erk et de phospho-Erk. On peut les identifier car l’ajout d’un phosphoryle entraîne une migration différente des anticorps anti-phospho-Erk et anti-Erk.

Il existe 3 gènes pour Ras (HRAS, NRAS, KRAS), 3 pour Raf (ARAF, BRAF, CRAF), 2 pour Mek (MEK1, MEK2) et 2 pour Erk (ERK1, ERK2). Il y a donc une complexification au cours du développement ce qui induit des mutations différentes en fonction des gènes. A connaître.

Il existe d’autres voies de signalisation en aval de Ras :

- MAPK → Prolifération- PI3K → Survie- RALGDS → Trafic des vésicules- PLCε → Signal Ca++

- TIAM1 → Organisation du cytosquelette

III. Les pathologies associées à RAS ou Rasopathies

Ras est mutée dans 30% des cancers humains en particulier de manière constante au niveau des codons 12, 13 et 61. Ces mutations empêchent l’inactivation de la voie RAS par 2 moyens : en inactivant la fonction GTPase de Ras ou en empêchant la fixation de Ras-GAP.

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1. La Neurofibromatose de type1 (NF1)

Les anomalies de la voie RAS n’interviennent pas que dans les cancers mais également dans des maladies du développement mais ceci a été découvert plus tard. C’est une maladie autosomique dominante qui a une fréquence de 1/3500 naissances.

La cause de la neurofibromatose est la perte d’activité d’un allèle de NF1, haploinsuffisance. C’est une maladie du développement mais qui n’a pas toujours été reconnue comme telle du fait qu’elle donne des signes discrets. Par exemple la NF1 engendre des troubles assez spécifiques de l’apprentissage (difficultés à l’école), des anomalies squelettiques, des nodules de Lish.

Il arrive fréquemment pour ces patients de perdre le 2ème allèle dans une cellule ce qui entraîne une inactivation complète dans cette cellule somatique : c’est le modèle de Knudson (exemple : le rétinoblastome, perte d’un allèle en constitutionnel avec plus de chance d’avoir une inactivation complète en somatique). Cette inactivation bi-allélique est la cause du développement de tumeurs au niveau de cette cellule. Ce syndrome rentre dans la catégorie des syndromes de prédispositions aux tumeurs malignes (neurofibrosarcome, astrocytome, phaeochromocytome et LMMJ). Mais cela dépend des patients.

Une mutation somatique (dans une cellule) s’oppose à une mutation constitutionnelle ou germinale. Une mutation mosaïque est une mutation post-zygotique, entre la mutation somatique et constitutionnelle. Elle intervient dans une cellule mais dans le développement donc cela touchera plusieurs cellules de l’organisme à terme voire plusieurs tissus mais pas tous (le mot utilisé est aussi différent car ce ne sont pas les mêmes personnes qui en parlent : généticiens ou cancérologues).

2. Le syndrome de Noonan

a) La maladieC’est une maladie génétique relativement fréquente, 1/2000 naissances

à transmission autosomique dominante. Elle est caractérisée par :- un retard de croissance (60-70%) - taille adulte : M 162.5 cm - F 152.7

cm - ;

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- des malformations cardiaques hétérogènes +/- graves (66%) ;- un retard psychomoteur de degré variable (30-50%, sans doute moins) –problèmes à partir du CP- ;- une dysmorphie caractéristique (100%) : oreilles basses, en arrière, yeux en forme palpébrale, rhomboïdes, vers le bas, trop d’espaces entre les yeux ;- des prédispositions faibles aux leucémies ;- en prénatal : une nuque épaisse, un hygroma.

On a découvert des mutations ponctuelles hétérozygotes du gène PTPN11 chez 40% des patients atteints pas Noonan. PTPN11 code pour SHP2, une tyrosine phosphatase cytoplasmique régulée par les facteurs de croissance. Il y a 2 bases différentes au lieu d’1 sur un des allèles. C’est une substitution d’un nucléotide en un autre qui a pour conséquence l’apparition d’un nouvel acide aminé de manière hétérozygote (un allèle muté).

Les anomalies cardiaques engendrées par le syndrome de Noonan (75%) sont une sténose de la valve pulmonaire, rétrécissement de la valve, dans 45% des cas ou une cardiomyopathie hypertrophique dans 10% des cas, ce qui est plus rare et plus aigu car cela entraine une insuffisance cardiaque. Noonan est la cause non-chromosomique la plus fréquente d’anomalie cardiaque congénitale.

b) SHP-2 et les mutations de PTPN11SHP-2 est une phosphatase qui participe à l’activation complète de Ras

et de la cascade des MAPK/ERK en s’accrochant au récepteur de Ras où elle possède un site de fixation. On pense qu’elle hydrolyse le phosphate qui sert de liaison au Ras-GAP et donc Ras reste activée trop longtemps. On aboutit à plus de phospho-Erk. C’est une manière d’activer la voie de signalisation par clivage d’un site d’ancrage d’un régulateur négatif. SHP-2 pourrait agir également sur d’autres inhibiteurs mais on ne les connait pas.

Les mutations de PTPN11 modifient l’activité de la protéine. Cette protéine est inactive à l’état basal mais peut être activée très rapidement car elle est déjà synthétisée. Elle est inactive par repliement sur elle-même de

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sorte que le domaine catalytique n’est pas accessible. L’activation de SHP-2 se fait par la fixation de N-SH2 sur une tyrosine phosphorylée d’un récepteur ou sur une molécule fixée par celui-ci ; ceci ouvre la protéine.

En regardant le séquençage de la protéine, on voit que les mutations ne sont retrouvées que dans certains exons (3, 7, 8, 12,13) et surtout dans certains domaines fonctionnels au niveau phosphatase ou N-SH2. On a cristallographié cette protéine pour connaître sa conformation tridimensionnelle et la répartition des mutations.

Ces mutations se trouvent sur les domaines d’interaction, à l’interface entre N-SH2 et PTP. Elles empêchent le repliement donc la protéine est trop active ou elles peuvent l’accentuer et inhiber la protéine ; cela joue sur l’auto-inhibition.

PTP, site catalytique + 2 SH2 se fixant sur les tyrosines phosphorylées

Pour le prouver on peut effectuer plusieurs expériences. On peut introduire la protéine mutée dans une cellule modèle avec des facteurs de croissance et on observe s’il y a plus de signal phospho-Erk qu’avec une protéine non-mutée. On peut surtout utiliser sa fonction, la déphosphorylation, en regardant les modifications de son activité enzymatique par une cinétique enzymatique. Enfin on peut aussi faire des études in silico en regardant dans les bases de données et les modélisations si la mutation modifie quelque chose. Mais les modèles ne sont pas assez pointus pour que cela suffise.

On étudie donc sa capacité enzymatique avec et sans activateur de SHP-2, l’IRS2 (substrat du récepteur à l’insuline, molécule fixée au récepteur de SHP-2). C’est-à-dire sa façon de réagir avec et sans IRS2, sa capacité à

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déphosphoryler un substrat. De manière basale, sans l’activateur, on a pour certaines mutations une augmentation de l’activité phosphatase ; c’est une activité constitutive partielle, qui ne répond plus au signal (≠constitutionnelle, germinale). Cependant, en présence d’activateur, l’activité phosphatase est encore plus augmentée, on a surréaction à l’activateur. Les mutations relaxent la liaison entre les deux sites N-SH2 et PTP et réduisent la capacité auto-inhibitrice de la protéine. L’activité phosphatase est donc nécessaire à l’action sur la voie RAS.

Mutations de Noonan : blanc absence d’IRS 2, noir présence d’IRS2

On a également effectué un Knock-In pour PTPN11, c’est-à-dire qu’on a remplacé le gène des souris par le même gène mais possédant la mutation. Le but est de reproduire la mutation dans un modèle murin. On observe des souris de plus petites tailles, ayant des cardiomyopathies, des anomalies crâniennes et un syndrome myéloprolifératif. Une seule mutation gain de fonction de PTPN11 est suffisante pour induire un phénotype de syndrome de Noonan avec syndrome myéloprolifératif.

3. Syndromes associés au syndrome de Noonan

Chez 40% des patients atteints de Noonan on trouve des mutations de PTPN11 mais pour 60% ce n’est pas le cas. De plus on trouve 3 autres maladies, plus rares encore, qui ressemblent à ce syndrome : le syndrome Cranio-Facio-Cutané (ou CFC), le Syndrome de Costello et le Syndrome Léopard. Ce sont des diagnostics différentiels car les troubles sont similaires : dysmorphies (plus marquées chez Costello), retard statural, cardiopathies de fréquences différentes, troubles cutanés, un retard mental constant. On trouve en plus chez Costello une prédisposition aux cancers dans 15% des cas.

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Pour différencier ces syndromes similaires, on va séquencer le gène PTPN11 dans les 4 cas et on regarde si ces mutations existent dans les autres syndromes. On a retrouvé des mutations de PTPN11 dans un seul autre syndrome, le Léopard qui est proche de Noonan mais avec des petites taches sur le visage, des lentigines.

Pour découvrir les mutations impliquées dans les 2 autres syndromes proches du Noonan on séquence alors tous les gènes de la voie RAS. C’est une approche par gènes candidats (on réalise aujourd’hui des approches pangénomiques, dans tout le génome). On a donc trouvé pour :

- Le syndrome de Costello : des mutations du gène HRAS (oncogène)- Le CFC : mutations de KRAS, BRAF, MEK1, MEK2- Le Noonan s’est complété avec des mutations de RAF-1 (qui

correspond à C-RAF), de Sos1, d’un régulateur de Ras et de NRAS.

On a pu en 8ans élucider tous les cas de ce type de maladie. Tous les intervenants de la voie RAS peuvent donc donner des mutations qui entrainent des pathologies proches les unes des autres avec des gravités différentes.

HRAS est mutée chez 85% des patients atteints du syndrome de Costello. Les mutations touchent aussi le codon 12 mais ces mutations sont rares dans les cancers. Dans les cancers on trouve surtout des mutations G12V

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qui sont rares dans Costello (plutôt G12S à 85% et G12A à 10%). Ces mutations sont compatibles avec la vie (une vie handicapée). Les conséquences des mutations sont : une insensibilité aux protéines GAP (activation constitutive par suractivation de la voie RAS) et une modification d’affinité (déséquilibre en faveur de la forme –GTP).

On a séquencé les gènes de la voie RAS des patients susceptibles de rentrer dans ce type de syndrome. Cela a permis de passer du diagnostic clinique au diagnostic moléculaire en regardant la répartition des mutations au niveau moléculaire. On retrouve dans ces études des mutations prédominantes dans chaque pathologie (HRAS pour Costello ; BRAF, MEK 1 et 2 dans le CFC et PTPN11 dans Noonan) cependant on observe également un mélange de chaque mutation dans les différentes pathologies. On a une inadéquation entre le diagnostic clinique et celui moléculaire.

Comment classer les pathologies ? En fonction du diagnostic clinique ou moléculaire ? Le médecin pouvant se tromper, l’analyse moléculaire permet de l’aider et de

caractériser le type de pathologie. Il est donc plutôt « demandeur » de diagnostic moléculaire. Mais du fait de l’hétérogénéité de présentations des mutations et du manque de connaissances (d’autres interactions possibles du gène), la clinique peut être plus importante.

Le coût est une limite au diagnostic moléculaire car tous les pays ne peuvent pas se permettre de faire un séquençage pour chaque patient (pays pauvres, en développement). On priverait une partie du monde du diagnostic de ces maladies. Un autre avantage est le diagnostic prénatal permis par le diagnostic moléculaire et donc la possible IMG puisqu’on retrouve ces maladies dans la descendance d’1 patient sur 2. De plus le jour où il y aura des traitements (c’est une forte probabilité puisque Ras est impliquée dans le cancer et que la recherche sur le cancer est très développée), on pourra cibler des mutations particulières avec des antagonistes de la voie. On pourra adapter les traitements à ces maladies.

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Au final dans les décisions internationales on a adopté le diagnostic moléculaire uniquement pour le syndrome de Costello du fait que les cancers intervenant dans ce syndrome n’interviennent que chez les patients ayant une mutation de HRAS. Il y a donc un aspect pronostic de cette mutation. Ceux n’ayant pas cette mutation n’ont aucune prédisposition à développer un cancer et ont donc été reclassés dans d’autres pathologies. Il y a donc un bénéfice plus important à associer le risque de cancer aux mutations de HRAS et à Costello. Pour les autres pathologies on considère le diagnostic clinique comme suffisant.

A quoi sert le diagnostic génétique ?

Pour le patient atteint :- s’assurer du diagnostic clinique (le médecin peut se tromper surtout s’il

ne voit pas cette pathologie souvent)- participation / organisation / supervision de la prise en charge médicale

et socio-éducative- pronostic, anticipation de la suite de la vie de l’enfant

Pour les grossesses futures :- fixer le risque de récurrence (autosomique dominant donc un risque

sur 2, bien que ces patients n’ont en général pas d’enfants car ils sont trop atteints)

- informer des possibilités/ou pas et des limites du diagnostic anténatal- information génétique (« conseil génétique »)

Pour la famille :- dépistage des personnes à risque dans la famille

Un jour on espère que cela servira pour les thérapeutiques spécifiques.

Dans 4% des cas du syndrome de Noonan on ne trouve pas de mutations pour les gènes étudiés. Soit ce sont des cas rares soit ce ne sont pas des Noonan mais des pathologies qui y ressemblent.

Des symptômes spécifiques vont apparaître selon les mutations mais pas tout le temps (peu de relation phénotype-génotype). Par exemple pour une mutation de Raf1 dans le syndrome de Noonan il y a des atteintes cardiaques plus graves : cardiomyopathies hypertrophiques avec une possibilité de décès par arrêt cardiaque. Les mutations aident à anticiper les caractéristiques cliniques de la maladie.

IV. Oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs

La plupart de ces gènes sont tout de même des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs : HRAS, KRAS, NRAS, BRAF et SHP-2 un peu moins.

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Dans la plupart des cancers dans lesquels ils ont été décrits se sont des mutations somatiques.

1. Quel est le risque de cancer ?

Ce risque est plus ou moins connu mais il est modeste à part dans le syndrome de Costello où il atteint 15% (différents de P53 : si un enfant naît avec une mutation de P53 le taux est de 100%). Dans les syndromes de Noonan et de Léopard le risque est de 1 à 2 %.

Pour expliquer que ces mutations d’oncogènes ont des répercussions dans les maladies du développement et non dans les cancers, on pourrait penser que les mutations sont de natures différentes (prolifération-survie ou autre) mais ce n’est pas le cas ici. Le problème n’est pas qualitatif mais quantitatif. Déjà dans un cancer il ne faut pas une mais des mutations. De plus pour développer un cancer il faut une activation très forte de la voie ; cette voie n’est pas assez activée dans les maladies génétiques. Les mutations sont plus actives dans le cadre des cancers.

On devrait observer plus de mutations mais on ne les voit en somatique que quand elles touchent les gènes suppresseurs de tumeurs. On observe que celles-là car elles n’induisent pas de cancer. Il existe beaucoup de mutations que l’on n’observe pas car elles ne font mourir qu’une cellule. Si elles n’ont pas pour conséquence une prolifération, une survie où quelque chose qui va les expandre, on ne les verra pas. La plupart des mutations sont délétères pour une petite zone. En somatique on ne verra que ce qui est sélectionné quand il y a un avantage sélectif avec le développement des cellules.

En germinal, on ne voit pas les mutations qui sont incompatibles avec la vie, celles qui sont létales. Ces mutations donnent des interruptions in utero qui passent souvent inaperçues.

Dans le cas des mutations de Noonan, les mutations qui entrainent des cancers sont tellement actives qu’elles ne sont pas compatibles avec la vie. Elles sont trop délétères et donc non visibles. Les mutations de RAS (sauf HRAS) et celles de cancers ne sont pas les mêmes. Celles des cancers ont le même type d’effet mais sont beaucoup plus actives. Ce sont des mutations constitutives totales (cf. schéma p.12). Le gain est trop fort pour être compatible avec la vie ; inversement les mutations compatibles avec la vie n’ont pas un gain d’activité suffisant pour déclencher des cancers.

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2. Pourquoi activer la voie RAS est incompatible avec la vie ?

Ras est un mitogène, il active le cycle cellulaire. Comme tous les mitogènes il existe des freins, des sécurités car si ce mitogène s’emballe cela crée une tumeur. Ces sécurités sont des formes de rétrocontrôle, d’inactivation passant par le signal lui-même. Quand on active Raf, au-delà d’un certain niveau d’activité de Raf, en aval p53 et d’autres protéines (p16, p14…) vont permettre d’arrêter le cycle cellulaire, d’entrainer l’apoptose… On a l’activation de senseurs qui activent des voies qui vont contrer la suractivation de Ras.

Si on a une mutation germinale de cancer sur l’œuf, p53 et les autres protéines vont bloquer le signal et donc l’œuf ne se développe pas. Ces mutations sont donc bien incompatibles avec la vie. C’est ce qu’on a observé quand on a introduit des cellules de RAS dans des cellules primaires ; elles meurent (cf. p.4). Une Ras trop activée ne va pas favoriser la prolifération cellulaire car la cellule est encore apte à bien réagir et à se réguler. C’est pour ça qu’il faut plusieurs mutations pour avoir un cancer car il faut que tous les « verrous » aient sauté. Quand on n’a plus de p53 c’est là qu’interviennent les cancers.

C’est un modèle bien connu dans le cancer du côlon et dans la phase pré-leucémique. On voit que les mutations de RAS ne surviennent pas au début de la maladie mais quand il y a déjà eu des « verrous » sautés comme p16, p53…donc jamais en tout début de la maladie, que quand la cellule ne peut plus maintenir son homéostasie. Ras est rarement une mutation initiatrice de tumeur.

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3. Mutations des gènes de la voie RAS dans les tumeurs

Exemple de Braf

La mutation de Braf est fréquente dans les mélanomes. On voit que dans les mutations de cancer, une est hyperfréquente, celle qui touche le nucléotide 600. Les mutations constitutionnelles sont étendues dans l’ensemble du gène, ce ne sont pas les même mutations, elles n’ont pas les mêmes effets. Ces mutations sont différentes même si ce sont les mêmes gènes, le gain de fonction est moins important et c’est pour ça qu’elles sont compatibles avec la vie et qu’elles n’induisent pas à la même fréquence de cancers.

Il existe d’autres mutations des gènes de la voie RAS qui interviennent dans les cancers. Elles sont très fréquentes et variées.La prof n’a pas du tout insisté dessus.

Comme il existe beaucoup de mutations activatrices de ce type de voie de signalisation, il y a donc aussi beaucoup de traitements qui ont été mis en place. Certains de ces traitements comme les inhibiteurs de farnésyl transférase, les bi-phosphonates ou les statines (utilisées pour le cholestérol car c’est la même voie métabolique qui donne le cholestérol et l’isoprène) sont en fait des médicaments qui ciblent la capacité de modifications post-traductionnelles de la protéine. Cela empêche la fixation du farnésyl. Quand on empêche cette farnésylation, Ras ne peut atteindre son lieu d’activation dans la cellule et la voie est inactivée.

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Les maladies génétiques pourront peut-être bénéficiées un jour de la recherche mise en place pour les cancers. Un certain nombre de drogues, statines et rapamycine (inhibiteur de mTOR), inhibiteurs de Erk, Mek commencent à être testés. On teste d’abord in vitro puis ensuite chez la souris. Il faut donc une souris qu’on a rendu malade (la même maladie que celle qu’on veut traiter) avec la mutation observée chez l’être humain.

On a par exemple testée les mutations qui donnent des cardiomyopathies hypertrophiques car cela donne des décès précoces. On aimerait trouver un médicament permettant d’attendre la greffe de cœur. On étudie une souris qui reproduit les signes qu’on veut traiter et on

détermine ce qu’on considère comme la preuve de l’efficacité du traitement : taille du cœur, organisation cellulaire pathologique du cœur ayant un retour à la normale.

On a également effectué un Western Blot avec du phospho-Akt, phospho-GSK (lié à l’insuline), phospho-TSC2 et phospho-p70S6K qui sont les voies de signalisation de mTOR (donc essai avec la rapamycine). On regarde comment le traitement à la rapamycine a permis un retour à la normale de ces protéines.

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