M6decine e~ M a l a d i e s I n f e c t i e u s e s . 1974 - 4 - 9 - 505 ~ 510

LA CEPHRADINF. D( terminalion de quelques donn( es pharmacocin tiques et enzymatiques

par Franqois LE GOFFIC et Roger LABIA**

La C~phradine ou acide [D-amino-2 (cgclohexadidne-l ,4 gl-1)-2 acetomidol- 7 m~th!tl-3 oxo-8-thia-5-azabicgclo-1 ($-2-0) octo-2-dne-2 carbox!tlique, est u'ne xtouvelle c~phalosporine semi-sgnth~thique.

Cette molecule est constitude de la D-dihgdro-l ,4 phdngI glgcine que l'on trouve aussi dans l 'Epicilline, et de l'acide amino-6 d~acdtoxg c~phalospora'nique.

< >, NH2

S

3 COOH

Comme les autres produits du m~me grou,pe, retie moldcule a une activitd anlibacldrienne intdressante (1) aussi bien sur les mieroorganismes Grmn + que Gram -- .

Les ~tu,des relatdes dans le present article font dtat de nos rdsultats sur l '~limination urinaire de la C~phradine chez l'adulte sein. Nos exp,driences' montrent en particulier que cet antibiotique est dlimind rc~pidement sou:s sa I'orme non mdtabolisde. Nous rap~portons ~galement tree autre donnde pharma- cocin~tique importante : le taux de f ixat ion de ta COphradine aux protdines s~riques que nous avons d~termin~ par ultrafiltralion. En.fin, la nouvelle mdlhode d'dtude des pOniciIlinases nous a petrols' de comparer le comportement de la Cdphradine et de la Cephalexine vis-gt-vis de quelques e~p,halosporinases. Les rdsullats ainsi obtenus et que nous relatons ici montrent clairement que la semi- hydrogdnation du noyau benzOnique est s'uf[isante pout" appr~cier une diffdrence notable dans ce comportement.

MATERIEL ET METHODES

l,a C6phradine utilis6e est fournie par les Labora- toires Squibb. Etle est condi t ionn6e soit en flacons stdriles con tenan t un gramme de C6phradine injec- table (titre 739 mcg/mg), soit en capsules dos~es i~ 500 mg de C~phradine du Lot 4 XL 4. La C6phalexine -est fournie par les Laboratoires Glaxo.

* Manuscrit re~u le 25 juillet 1974. ** Eccle Normale Sup6rieure, Laboratoire de Bioorga-

nique. 24, rue Lhomond, 75231 Paris Cedex 05.

Les sujets qui ont servi h cette exp6rience sont trois adultes (A, B, C), sains, volontaires , en part icu- lier exempts &affections ur ina i res , h6patiques ou h6matologiques. Leur ;age moyen est de 38 ans (32 h 43 ans) et leur poids moyen est de 72 kg (69 h 75 kg).

A c e groupe de trois volontai res on prel6ve un 6chant i l lon &ur ine (A o, Bo, C o) afin de v6rifier toute absence d 'an t ib io t ique puis d6marre l 'exp6rience en leur faisant ing6rer 2 grammes (4 capsules h 5(}0 mg du lot 4 XL 4) de C6phradine. Les trois su- jets ainsi trait6s restent a jeun pendan t route la dur6e de l 'exp6rience.

505

On recueil le alors dans trois flacons st6riles le to- tal des ur ines pendan t les six heures qui suivent la prise de l ' an t ib io t ique (A~, B~, C~) On lyophilyse imm~dia tement ces ~chant i l lons afin d'~viter route d~gradation de la C~phradine ~limin~e et de la C~phalexine 6ventuel lement formSe. Les poids res- pectifs des lyophyl isa ts A0, B 0, C O et A~, B~, C~ sont ensuite d~termin~s (environ 15 grammes).

Le dosage de l ' an t ib io t ique est r~alis6 par la m~- thode microbiologique. Le mil ieu utilis~ est celui de Mfieiler Hin ton et la souche mic rob ienne un Bacil lu~ subt i l i s (2). Les boites de P6tri employees dans cette exper ience sont des boltes de 23 • era. Aprbs avoir 6t6 coul6 ,le mi l ieu de culture solidifiS, contenant le Baci l lus sabt i l is , est perc6 de pulls de 4 mm de diam. Dans ces pui ts on in t rodui t 10 p.l des solutions de l ' an t ib io t ique h tester. Le produi t a 6t6 pr6alablement pr6par~ h une concent ra t ion appro- pri4e par addi t ion d ' un tampon phosphate 0,2 M pH 6 "~ des aliquots des lyophil isats A0, B0, C O ou A~, B~, C~.

Une gamme de C~phradine est ~galement effectu~e afin de d~terminer les concen l ra t ions en anl ibio- tique 61imin4 au bout de six heures de m4tabolisa- lion.

Les boites a insi ensemenc4es sont incub~es dans une 4tuve a4r4e /t 37 ~ C pendan t 18 heures, puis les diambtres des zones d ' i n h i b i t i o n ainsi fortunes sont d4termin4s au lecteur optique (grossissement 7 fois) de manibre h d i m i n u e r l ' e r reur de lecture.

La t ransformat ion m4tabol ique 4ventuelle de la C6phradine est Oudi6e pa r chromatographic sur couche mince sur gel d 'ac ide si l icique impr~gn6 de ni t ra te d 'argent . 4 grammes de AgNO~, 40 gram- rues de silice H (Kielselgel Merck), 10 grammes de silice G (Kieselgel Merck) sonl agit4s avec 400 ml d 'eau et 4tal6s sur des plaques de verre (0,25 mm d'6paisseur) puis s6eh4s h l '4tuve. L '4luant utilis6 est le m4lange ac4tonitri le-4 eau-1. Une double ~lu- t ion est prat iqu4e e t l a r4v41ation est effectu4e "5 l 'a ide de vapeurs d' iode.

La sensibil i t4 de la m~thode vis-/~-vis de la C6- phalexine est d4termin6e /~ l 'a ide d 'une gamme de ce produit .

Les m41anges i~ tester sont pr6par4s comme suit :

1,5 g des 4ehant i l lons Ao, Bo, C~ ne contenant pas d 'an t ib io t iques et 1,5 g des 4ehanl i l lons A,, B~, C~ contenant env i ron 180 mg d ' an t ib io t ique sont dissous dans 7,5 ml d'eau, puis le volume esl ajust~ fi 10 ml.

5 ~1 de ehacune des solut ions ainsi obtenues sont d4pos4s au bas des plaques de siliee impr~gn4 de ni t ra te d 'argent , puis la chromatographic est con- dui te comme indiqu6 pr~c6demment .

Le plasma sanguin utilis4 dans l '6tude de la fixa- t ion de ta C4phradine aux proi~ines s6riques est un s~rum obtenu 'h la manibre habituel le et exempt de tout ant ib iot ique ; ce que l 'on v6rifie par la m4- thode microbiologique. Trois concent ra t ions en C4- phrad ine sont employ6es. Le s4rum et l ' an t ib io t ique sont agit6s lentement h + 4 ~ C pendan t 30 minutes.

506

L 'ul t raf i l t ra t ion est alors effectu4e sur un apparei l Amicon, la membrane utilis6e ~tant une membrane XM 50 Diaflo. La quanti t6 de C6phradine pr~sente dans l 'ul trafi l t rat est ~valu6e par la m6thode micro- biologique pr~e6demment cit6e.

Les souches bact~r iennes h6bergeant des c6pha- lospor inases et utilis~es dans l '~tude du comporte- ment de la C6phalexine et de la C6phradine vis- �9 A-vis de ces enzymes sont hui t souches de bacilles pyocyan iques (P1 h P8) isol4es e n mil ieu hospifa- lier. Quatre sont r~sistantes h ]a Carb~nic i l l ine (R) ; quatre sont sensibles h ee produi t (S).

Les constantes enzymat iques (Km et Vmax de Mi- chaelis Menten) des c6phalosporinases h6berg6es par ces souches r6sistantes /t la c6phradine et h ]a C6phalexine sont d6termin6es par la m6thode micro- ac id im6tr ique coupl6e h un ord ina teur (4, 5). Ces microorganismes sont cultiv6s h la manibre habi- tuelle dans un mi l ieu r iehe (Trypticase Soy Broth), r6colt6s h la fin de la phase exponent ie l le de crois- sance par centr i fugat ion (fi 000 t /minu te ) , lav6s par une solut ion de chlorure de sodium (5 g/l) puis re- cneil l is une nouvelle fois par centr i fugat ion. Les parois bact6r iennes sont alors d6sint6gr6es par les ul tra-sons et le surnageant ainsi obtenu apr~s cent r i fugat ion h 25 000 g pendan t 30 minutes est uti- lis4 comme source de c6phalosporinases.

Le concept de r stabilit~ enzymat ique >> propos~ par Labia (6) est in t rodui t ici~ I1 permet une com- para ison ais6e du compor tcment des deux substrats sur l ' enzyme Oudi~e.

RESULTATS

A. - ELIMINATION URINAIRE DE LA CEPHRADINE

Lcs r6sultals sont consign6s dans le tableau I. Ils mon t r en t que la Cdphradine cst ~limin6e rapi- dement par vole u r ina i re puisque au bout de 6 heu- res, 85 % ou plus de l ' an t ib io t ique se t rouvent dans les ur ines . Nos r6sultats recoupent d 'a i l leurs ceux obtenus par d 'autres auteurs.

TABLEAU I

n ~ de /'6chan- tillon

~o

A 6

B o

B 6

c o

c 6

quantit6 de c6phrad• administr~e

en mg

0

2 0 0 0

0

2 0 0 0

0

2 0 0 0

quantit6 de o6phradine dlimin4e en mg au bout

de 6h

o

7oo

o 1 8 6 o

o

1 7 8 o

r d ' 61imi- nation

O

85

O

93

0

89

Elimination urinaire de la Cdphradine. La quantit6 de Cdphradine 5liminde dans les urines est ddtermin~e par

la mdthode microbiologique.

B. - NATURE DE L 'ANTIBIOTIQUE ELIMINE

Afin de v6rif ier la t ransformat ion possible de la C6phradine en Cdphalexine, on utilise la chroma- tographic sur couche mince d 'ac ide s i l ic ique im- pr6gn6 de ni t ra te d 'a rgent qui permet de s6parer parfa i tement la Cdphradine de la C6phalexine. L 'un des produi t s poss6de en effet un Rf de 0,25 et l 'au- tre un Rf de 0,50 (Tableau II) ,

TABLEAU II

Antibiotique Rf

C4phradine 0,25

C$phalexine 0,50

Rdsultats de la chromatographic cn ccuche mince de deux ~chantillons de Cdphradine et de Cdphalexine. La chro- matographic est eonduite darts un mdlange ae6toni- trile/eau. Lc support est un m61ange d'acide silicique contcnant du nitrate d'argent, ce qui retarde eonsid~ra-

hlement la migration des substances 6thyldniques.

Afin de quant i f ier la mdthode et de ddterminer en par t icu l ie r la quant i t6 min imale de Cdphalexine d6- tectable dans un mdlange donnd, on effectue des dilutions successives de ce produi t et soumet les 6chanti l lons ainsi obtenus "/I l 'dpreuve de la chro- matographie en couche mince.

Le tableau III relate les rdsultats obtenus et montre qu 'une quanti td aussi faible qne 0,05 ~g est ddtec- table par cette technique.

TABLEAU III

quantit6 de cdphalexine ddposde en~g

~5 22 11

5,5 0,25 0,15 0,05 0,025

visuali- sation

+++ +++ ++ ++ ++ + +

+ + + trbs intense ++ intense + tr~s ddtectable - pratiquement indd-

tectable

Sensibilitd de la mdthode de chromatographie en couche mince. Le rdv41ateur est l'iode (vapeurs).

Le tableau IV donne les rdsultats de l 'analyse c h r o - matograph ique de l 'dchant i l lon d 'an t ib io t ique issu des urines. Darts t o u s l e s dchant i l lons testds (90 vg d 'an t ib io t ique d6pos6 au bas de la plaque), la Cdpha- lexine est ind6tectable.

TABLEAU IV

~chanti!lon c6phradine c~phalexine

A O

~t 6

B O

~6

c o

c 6

+

+

+

Analyse par chromatographic en couche mince de P6chan- tillon d'anfibiotique 4limin6 par vole urinaire.

C. - FIXATION DE LA CEPI tRADINE

AUX PROTEINES SERIQUES

Les r6sultats de cette 6tude sont relatds clans le tableau V.

TABLEAU V

quantit6 de cdphradine utilis4e mcg/ml serum

2,5 5 10

quantit4 de cSphradine trouvde dans IIultrafil- trat mc~/ml

2,4 4,8 9,4

d e fixation sur les

prot4ines

Fixation de la Cdphradine aux prot6iques s@iques.

La quanti t6 de C6phradine fixde sur les pro!dines sdriques est ex t r6mement faible (4 %). Les r6sul- tats sont d 'a i l leurs en ple in accord avec ceux ob- tenus par d 'autres anteurs (1).

D. - DEGRADATION ENZYMATIQUE DE LA CEPHRADINE ET DE LA CEPHALEXINE

Les c6phalospor inases qui reconna issen t la C6- pha lex ine comme substrat sont aussi aptes h hydro- lyser la C6phradine. Les r6sultats de l '6tude enzy- mat ique que nous avons r6alis6e sont consign6s darts le tableau VI.

507

TABLEAU VI

n ~ souohe

PIS P2R

P3S P4R

P5S P6R

PTS PSR

I C ephrad ine

Vmax

8,8 45 6,5 ~ 5

9,2 314 10 129

7,o .35 8,0 90

7 , 9 15.3 5 , ~ ~87

-g

0,20 0,05

0 , 2 7 0,07

0 , 2 0,09

0 ,05 0,02

5 , 3 # , 0

5 , 3 7

# , 3 # , 2

.3 ,9 3 , 4

C6phalexine

Vm&x ~/min

#2 Io9

39 121

4o 114

116 65

Constantes enzymatiques Kin et Vm obtenues par plu- sieurs couples de cdphalosporinases en utilisant la Cd- phradinc et la C@halexine comme substrats. La vitesse Vm et la stabilitd enzymatique g sont des valeurs

relatives.

'K

0 , 1 2 O, 02

O, 1.3 O, 05

0 , 1 0 O, 0.3

O, 0.3 O, 0.5

Si les chiffres des colonnes Km et Vmax ne sont pas par lants aux non-sp6cialistes, la colonne ~ (sta- bilit6 enzymat ique) permet d 'appr6cier tr6s ais6- ment la vitesse de d6gradat ion du substrat. Plus le chiffre est 61ev6, plus le substrat est r6sistant h la ddgradation enzymatique. Une analyse rapide du tableau VI montre done que, dans les condi t ions exp6rimentales utilis6es, la C6phradine est deux lois plus stable aux cbphalosporinases que la C6phalexine.

DISCUSSION

Les r6sultats relat6s ici coufirment tout "a fail ceux obtenus par d 'autres auteurs, ~t savoir :

L'61imination rapide et abondante de la C6phra- dine par vole ur inai re . En etl'et, au bout de 6 heu- res, plus de 85 % du produi t sont 61imin6s de ma- nibre inchang6e. La chromatographic en touche mince sur gel d ' ac ide si l icique impr6gn6 de ni t ra te d 'argent mont re en effet que moins de 0,05 % de C6phradine serait m6tabolis6 en sa forme oxyd6e, ce qui est 6videmment tout ~ f a r n6gligeable.

La fixation prot6ique de la C6phradine est aussi extr6mement faible dans les condi t ions op6ratoires utilis6es, ~ savoir ul t raf i l t rat ion sur membrane Dia- flo XM 50. On r6cup6re en effet 96 % de C6phradine dans l 'ultrafiltrat. Ce r6sultat est d 'a i l leurs tout "A fait en accord avec ceux trouv6s par d 'autres au- Ieurs (1).

L'6tude du compor iemenl de la C6phradine et de la C6phalexine vis-'A-vis de cer ta ines c6phalospo- r inases est tout tl fait significative. Si les valeurs Km et Vm ne sont pas tr6s parlantes , leur rapport g , c'est-~-dire la stabilit6 enzymatique, montre claire- ment que, in vitro, la c6phradine est dans l 'ensem- ble d e u x fois plus stable que la C6phalexine il la d6gradat ion enzymatique par les c6phalosporinases.

La pr6sente 6tude confirme donc p le inement cer- taines donn6es pharmacoc in6 t iques d6j~ relat6es dans la l i t t6rature et montre que le temps de demi- vie de la C6phradine est deux fois plus impor tan t que celui de la C6phalexine lorsque ces deux pro- dulls sont soumis ~ la d~gradat ion par des c6pha- losporinases.

RESUME La C6phradine est adminis l r6e par vole orale A trois adultes sains.

L 'analyse des urines, pr61ev6es au bout de 6 heures, montre une forge 61J- ruination (85 %) de ce produi t sans que l 'on ait pu mettre en 6vidence une quelconque t rans format ion en C6phalexine. La f x a t i o n de ce produi t sur les prot6ines s6riques est faible (4 %). Ceci est montr6 par des exp6riences d 'ul t ra- filtrations. Une 6rude enzymatique montre enfin que la C6phradine est d6grad6e enzymat iquement deux lois plus lentement que la C~phalexine.

M o t s - e l e f :

Antibiot ique - E l imina t ion u r ina i re - F ixat ion prot6ique - ~-lactamases.

509

S U M M A R Y

Cephrad ine was ~tdministrated as a single oral dose to each of three hea l t hy i n e r t .

E x c r e t i o n in urine was very rap id : 6 H. af ter a d m i n i s t r a t i o n up to 85 % of Cephrad ine was r ecovered in an un me tabo l i z ed form. The ex t end of pre te in b ind ing was very low : 96 % of Cephrad ine was r e c o v e r e d af ter i n c u b a t i o n mi th h ~ m a n s e r u m and ul traf i l t ra t ion. E n z y m a t i c e x p e r i m e n t s demons t ra t e c lear ly that, in vitro, Cep:hradine is t w o t imes m o r e stable than Cepha lex ine t o w a r d s ~-Iacta- lnases.

K e y - w o r d s :

A n t i b i o t i c s - Ur inary e l i m i n a t i o n - P r o l e i n i c f i xa t ion - ~-lactamases.

B I B L I O G R A P H I E

1. GADEBUSCH H., M1RAGLIA G., BASCH H., GOOD- WIN C., PAN S. et RENZ K. - - Advances Antimicro- bial and Antineoplaslic Chemotherapy, 1972, 1, 1059- 1062.

2. HARVENGT C., de SCHEPPER P., LAMY F. e t HAN- SEN J. - - The Journal of Clinical Pharmacology, 1973, 13, 36-40.

3. WEL1KY I., GADEBUSCH H., KRIPALONI P. ct SCHREIBER E.C. - - Antimicrob. Ag. Chemother., 1974, 5, 49-54.

4. LABIA R., ANDRILLON J. et LE GOFFIC F. - - Febs Letters, 1973, 33, 42-44.

5. KAZMIERCZAK A., P H I L I P P O N A., CHARDON H., LABIA R. et LE GOFFIC F. - - Ann. Inst i tut Pasteur, 1973, 124 B. 259-268.

6. LABIA R. - - C. R. Acad Sci. S~rie D., 1974 (sous pvesse).

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