La cryofracture : c’est quoi? · formation of the cell wall permeability barrier and fracture plane, Microbiology (2001), 147, 1365–1382 Fig. 5. Freeze-fractured and deep-etched

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UMR 9198, I2BC & Institut JOLIOT, CEA-Saclay

La cryofracture : c’est quoi? Quand? Pourquoi? comment ?

1Les rendez-vous d'imagerie, 6 mars 2018

Maïté Paternostre – I2BC, CEA - Saclay (France)

http://pgt.geosciences.ensmp.fr/partenaires/cea-den/resolveUid/a57b8f28f99a80a755420ac1f9193961

http://www.google.fr/imgres?imgurl=http://www.ircam.fr/uploads/pics/cnrs_03.gif&imgrefurl=http://www.ircam.fr/umr.html&usg=__mQNjxwyZaZ2purQcc4l5v2LQpoc=&h=709&w=709&sz=16&hl=fr&start=1&zoom=1&tbnid=Ow3Ra4UnyS2nbM:&tbnh=140&tbnw=140&ei=RakzT8CiJY6IhQeEj8mAAg&prev=/images?q=cnrs&hl=fr&rlz=1T4GGLR_frFR240FR241&tbm=isch&prmd=ivnsm&itbs=1

http://www.google.fr/imgres?imgurl=http://www.kinases-splicing.com/httpdocs/ipsen.jpg&imgrefurl=http://www.kinases-splicing.com/Sponsors.htm&usg=__RuKMGk5bN9O_sghZ0sTaRT0nnag=&h=212&w=750&sz=73&hl=fr&start=1&zoom=1&tbnid=agNHaRip133jvM:&tbnh=40&tbnw=141&ei=WakzT_-vFoHKhAeciLDsAQ&prev=/images?q=ipsen&hl=fr&rlz=1T4GGLR_frFR240FR241&tbm=isch&prmd=ivnsm&itbs=1

http://www.google.fr/imgres?imgurl=http://www.forestplatform.fr/_images_a_inserer/recherche_financements_anr_logo.jpg&imgrefurl=http://www.forestplatform.fr/recherche-collaborative/sources-de-financement/anr.php&usg=__58bthHg95scPAvIdbJKWtPPWLgk=&h=163&w=380&sz=40&hl=fr&start=1&zoom=1&tbnid=IsGhOLJueT5JqM:&tbnh=53&tbnw=123&ei=ZakzT_uOFcOAhQeJ7d3vAQ&prev=/images?q=anr&hl=fr&rlz=1T4GGLR_frFR240FR241&tbm=isch&prmd=ivnsm&itbs=1

Les rendez-vous d'imagerie, 6 mars 2018 2

Les premiers microscopes électroniques

Application des travaux théoriques de Louis deBroglie en 1923 et prouvés expérimentalement en1926 disant que des champs magnétiques ouélectrostatiques pouvaient être utilisés commelentilles pour les faisceaux d'électrons

Le premier prototype de microscopeélectronique est construit en 1931 par lesingénieurs allemands Ernst Ruska et Max Knoll.

Deux ans plus tard, Ruska construit unmicroscope électronique qui dépasse larésolution possible d'un microscope optique.

Reinhold Rudenberg, directeur scientifiquede Siemens initie les travaux sur les applicationsdu microscope pour la visualisation de spécimensbiologiques avec Ernst Ruska et Bobo vonBorries.

Microscope électronique construit par Ernst Ruska en 1933

https://fr.wikipedia.org/wiki/Microscope_%C3%A9lectronique

https://fr.wikipedia.org/wiki/Ernst_August_Friedrich_Ruska

https://fr.wikipedia.org/wiki/1933


La cryofracture : c’est quoi?

Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens, RL Steere, Journal Of Biophysical And Biochemical Cytology, volume: 3 (1) doi: 10.1083/jcb.3.1.45 A Low Temperature Replica Method for

Electron Microscopy C. E. Hall, Journal of Applied Physics 21, 61 (1950)

Cristaux de glace


Electron microscopy of turnip yellow mosaic virus and the associated abnormal protein, 1956, Cosentino, V, Paigen,

K, Steere, RL, Virology, Vol 2(2), 139-148

Les virus et les premières images

Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens, 1957, Steere, RL, Journal Of Biophysical And Biochemical Cytology, Vol 3(1)


Comment? les étapes de la préparation

Echantillon congélationFracture sous vide

Etching(facultatif)

Répliquesmétalliques

Récupération de réplique

Observation de la réplique

Cryo-protectant(glycérol, PEG, sucrose..etc)

Congélation =>pas de cristaux de

glacePropane, fluoro-

ethane

Microtomie à froid & sous vide

OuOuverture d’un

porte échantillon type “sandwich” à froid & sous vide

Accentuation des reliefs

Visualisation de l’extérieur de membranes (organites cellulaires,

cellules, virus, etc)

Pt (dense aux électrons)/C pour

solidifier la réplique

(transparent aux électrons)

nettoyage de la réplique

Dissolution de l’échantillon biologique

TEM ou SEM

Cellules, virus, gels, cristaux

liquides, matière molle

Cryoprotectantnécessaire si

teneur en eau élevée –solution très visqueuse

souvent pas nécessaire

Enceinte sous vide: attendre avant fracture

=> contamination, sublimation de la glace qui a pu se former lors de

l’introduction/enceinte sous vide

Contrôle de la température=>sublimation de

l’eau pour accentuer les

reliefs

Ombrage Pt Angle fixe

en fonction du relief => Ombrage rotatif pour plus

de détails

Carbone: 90° pour solidifier la

réplique (manipulation)

Bain successifsAcides,

détergents, solvants

organiques, pour terminer avec eau

distillée

Microscopie basse résolution

=>architecture,morphologie de

nanobjets, de membranes, d’organites cellulaires

=>Organisation supramoléculaire

au sein de solutions

concentrées et visqueuses

Les rendez-vous d'imagerie, 6 mars

20186

Comment? les étapes de la préparation

Étape par étape


• congélation avec cryo-protectant (cellules biologiques) : glycérolanhydre 30%; fixation gluteraldehyde; PEG, sucrose, etc• congélation sans cryoprotectant

quand échantillon très concentré(faible teneur en eau) et gels=> àessayer

Comment? Cryo-fixation=> pas de cristaux de glace

Echantillons: • Biologie: suspension de cellules, virus, bactéries, • solutions visqueuses (gels, cristaux liquides)• phases organisées de tensio-actifs (lipides, detergents, polymères amphiphiles)• architectures supramoléculaires de peptides, de protéines (filaments, nanotubes, etc.)• Nanoparticules, emulsions

Echantillon

Cryo-protectant(glycérol, PEG, sucrose..etc)

Cellules, virus, gels, cristaux

liquides, matière molle


Comment? Congélation dans differents porte-échantillons

Cupules en or

3 mm

2-3 mL

≈20mm

Echantillon pris ensandwich entre deux

plaques de cuivre

Plaques de cuivre

tetrafluoroethaneAzote liquide

congélation

Congélation =>pas de cristaux de

glacePropane, fluoro-

ethane

Cryoprotectantnécessaire si

teneur en eau élevée –solution très visqueuse

souvent pas nécessaire

Faible épaisseur de l’échantillonpermet une congélation trèes rapideet permet de ne pas avoir à utiliser de cryoprotectant


Comment? Fracture sous vide

• freeze fracturing • freeze etching • freeze drying • double replica (mirror fracturing) • high resolution carbon/metal mix coatings for TEM/SEM analysis

• specimen replication by electron beam evaporation • double layer coating of specimens for cryo SEM analysis • cryo coating for cryo SEM using the EM VCT100 vacuum cryo transfer system


Comment? Fracture sous vide

Cupules en or

3 mm

2-3 mL

Fracture de la goutecongelée par un

microtome sous vide

≈20mm

Séparation mécanique des deuxplaques=>fracture échantillon et

accès à différents plans de fracture du même objet

Echantillon pris ensandwich entre deux

plaques de cuivre

Plaques de cuivre

Fracture sous vide

Microtomie sous vide=> fracture

OuOuverture d’un

porte échantillon type “sandwich”

Enceinte sous vide: attendre avant fracture

=> contamination, sublimation de la glace qui a pu se former lors de

l’introduction dans l’enceinte sous

vide


Etching/sublimation Quand, pourquoi et comment

•Accentuation des reliefs•Permet de révéler l’extérieur des feuillets membranaires (en contact avec milieu aqueux)•Peut être utile quand les structures que l’on veut observer ne se fracturent pas

Etching(facultatif)

Accentuation des reliefs

Visualisation de l’extérieur de membranes (organites cellulaires,

cellules, virus, etc)

Contrôle de la température=>sublimation de

l’eau pour accentuer les

reliefs

https://www.leica-microsystems.com/science-lab/brief-introduction-to-freeze-fracture-and-etching/


Comment? Formation de la réplique métallique

Répliquesmétalliques

Pt (dense aux électrons)/C pour

solidifier la réplique

(transparent aux électrons)


en fonction du relief

=> Ombrage rotatif pour plus

de détails

Carbone: 90° pour solidifier la

réplique (manipulation)


Ombrage Pt rotatif

Ombrage rotatifOmbrage directionnel


Comment? Récupération et nettoyage des répliques

Récupération de réplique

nettoyage de la réplique

Dissolution de l’échantillon biologique

Bain successifsAcides,

détergents, solvants

organiques, pour terminer avec eau

distillé

Le lavage des répliques est très important

•mélange sulfochromique=> “hélas” utilisation interdite dans les laboratoires (brûle tout matériel organique)•acide sulfurique concentré•Solutions de détergents•Finir le lavage avec des bain d’eau distillée


Comment? Congélation/préparation des échantillons biologiques


Exemples :membranes lipidiques

A voir absolument, magnifiques images!Freeze-fracture studies on lipids and membranes H.W. Meyer*, W. Richter, Micron 32 (2001) 615-644https://ac.els-cdn.com/S0968432800000500/1-s2.0-S0968432800000500-main.pdf?_tid=8c189578-00ea-11e8-bde8-00000aab0f6c&acdnat=1516786981_32ee2980d5fdfaa0b9da4db47d2c324a

DMPC-DMPA: 90-10%


201816

Reconstitution of FhuA, an Escherichia coli Outer Membrane Protein, into Liposomes BINDING OF PHAGE T5 TO FhuA TRIGGERS THE TRANSFER OF DNA INTO THE PROTEOLIPOSOMES* Laure Plancon, Mohamed Chami, and Lucienne Letellier, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, No. 27, 1997,Issue of July 4,

Exemple :protéoliposomes


201817

• a small drop of the sample solution (about 0.1 pl) was compressed between two thin copper plates and rapidly plunged into liquid propane

• The fracturing was performed at -150°C by opening a “sandwich” immediately before shadowing, for the ultrarapidly frozen samples.

• The replication of the fractured surfaces was performed in the direction of fractures using tungsten-tantalum (W-Ta) alloys in four to six steps, each lasting a few seconds and separated by about 10 s periods during which the partly shadowed, fractured surfaces were allowed to cool. In order to avoid contamination of the fractured surfaces, the samples were protected, between each shadowing step, by a liquid nitrogen cooled knife

• The replicas were cleaned in chromic acid, washed with distilled water

Exemple :protéoliposomes

Monomer-oligomer equilibrium of bacteriorhodopsin in reconstituted proteoliposomes. A freeze-fracture electron microscope study. Gulik-Krzywicki T, Seigneuret M, Rigaud JL, THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 1987, 262(32)

https://bib.cnrs.fr/category/biologie/




201818

Interaction between Water-Soluble Peptidic CdSe/ZnSNanocrystals and Membranes: Formation of Hybrid Vesicles and Condensed Lamellar Phases Aurelien Dif,† Etienne Henry,‡ Franck Artzner,‡ Michele Baudy-Floch,† Marc Schmutz,§ Maxime Dahan,| and Valerie Marchi-Artzner* JACS 2008


Exemple: Architectures peptidiques: triptoreline

Valery et al, Nature Comm., 2016


Exemple: Architectures peptidiques: somatostatine-14

Van Grondelle et al. Faraday Disc. 2013


Exemple: Architectures peptidiques: lanreotide

23% 29%

5%

7% 11%

14% 18%

2%

Valery et al, PNAS 2003 & Biophys.J. 2004


10 20 30 605040

[Pep

tid

e]

% ePA-ePC

Exemple: Interaction peptides cationiques-lipides anioniques

15Å

42Å

57Å

Pierre Chervy, Doc. Univ Paris-Saclay, 2017


201823

http://www.mdpi.com/2504-5377/2/1/3/htm

FF-TEM images of sample consisting of emulsifier, water and consistency enhancer at T = 23.6 °C (different areas): Coexistence of polydispersevesicles and stacked bilayers

Colloids and Interfaces 2018, 2(1), 3; doi:10.3390/colloids2010003

Structural Analysis of a Modern o/w-Emulsion Stabilized by a Polyglycerol Ester Emulsifier and Consistency EnhancersVerena Dahl 1, Achim Friedrich 1, Jürgen Meyer 1, Joachim Venzmer 1,*, Lhoussaine Belkoura 2, Reinhard Strey 2, Christian Mayer 3, Raphael Michel 4,† and Michael Gradzielski 4

http://dx.doi.org/10.3390/colloids2010003


• Bacterial suspensions were centrifuged at 5000 g. • A drop of the pellet was placed between thin copper holders • quenched in liquid propane. • The frozen samples were fractured at 125 °C in a vacuum of about 10−(

torr• The fractured samples were etched at 100 °C for 3 min at 1±3¬10Pa • replicated with 1–1±5 nm of deposits of platinum-carbon, and backed

with about 20 nm of carbon. • The replicas were cleaned overnight with chromic acid, washed with

distilled water and observed with a Philips 410 electron microscope.

Structure of the cell envelope of corynebacteria: importance of the noncovalently bound lipids in the formation of the cell wall permeability barrier and fracture plane, Microbiology (2001), 147, 1365–1382

Fig. 5. Freeze-fractured and deep-etched preparations of corynebacterial strains grown on BHI-containing agar plates (a–f) and cell envelope outermost lipid material (g). (a) C. glutamicumCGL2025 (PS2−); (b) C. diphtheriae (strain C8r (®) Tox−); (c) C. pseudodiphtheriticum (strain Breuillaud); (d) C. xerosis (ATCC 7711); (e) C. xerosis (ATCC 373T); (f) C. amycolatum (ATCC 49368T). Note the absence of the ordered surface layer on all the strains examined. Depending on the strains, however, a fracture plane is seen either in the cell wall fracture plane (2) close to the bacterial surface (1) in (a)–(d) or in the plasma membrane (3) in (e) and (f). (g) Crude octylglucoside extract recovered by centrifugation, extensively dialysed and then pellet at 200000 g. Note the fracture plane that occurs within the homogeneous smooth vesicles and indicates that the material analysed spontaneously forms liposomes. Bars, 500 nm (a–f); 400 nm (g)

Exemple: corynébactéries, différentes souches


http://www1.udel.edu/biology/Wags/histopage/empage/ecu/ecu.htm

Éxemple: microvilosités (1)


Éxemple: microvilosités (2)


Exemple: membrane d’un noyau cellulaire


Exemple: membrane d’un noyau cellulaire et reticulum endoplasmique


Éxemple: mitochondries


• Appareil de cryofracture I2BC au CEA@saclay• Ouvert à tous (sous avis de RDV)• Déménagement probable au printemps sur

Imagerie-Gif

• Contact: M. Paternostre [email protected]• Le technicien qui sait faire: Keinny [email protected]

Où?

mailto:[email protected]

mailto:[email protected]






Exemple: cellule végétale (Euglena gracilis) après cryo-fracture


201836

Journal of Biotechnology 104 (2003) 55/67

Documents

La cryofracture : c’est quoi? · formation of the cell wall permeability barrier and fracture plane, Microbiology (2001), 147, 1365–1382 Fig. 5. Freeze-fractured and deep-etched