PARASITOLOGIE / PARASITOLOGY

La cryptosporidiose de l’enfant au Sénégal : étude de la prévalenceet apport du diagnostic sérologique par ELISA

Cryptosporidiosis in Senegalese children: prevalence study and use of ELISA serologic diagnosis

B. Faye · T. Dieng · R.C. Tine · L. Diouf · K. Sylla · M. Ndiaye · D. Sow · J.L. Ndiaye · D. Ndiaye · M. Ndiaye ·A.S. Badiane · M.C. Seck · Y. Dieng · O. Faye · O. Ndir · O. Gaye

Reçu le 17 avril 2013 ; accepté le 17 septembre 2013© Société de pathologie exotique et Springer-Verlag France 2013

Résumé Il s’agit d’une étude prospective, descriptive et ana-lytique menée de juillet 2011 à septembre 2011 à l’Hôpitalnational d’enfants Albert Royer de Dakar et dans le districtsanitaire de Vélingara. Elle portait sur des enfants âgés de 0 à15 ans sans préjugé du statut sérologique. Chaque enfant abénéficié d’un prélèvement de selle qui a été examinée par laméthode de Ziehl-Neelsen modifiée et d’une recherche d’an-tigène de Cryptosporidium spp par le kit « CryptosporidiumAntigen Detection Microwell ELISA ». L’objectif de notreétude était de déterminer la prévalence de la cryptospori-diose en milieu rural et en milieu hospitalier et de mesurerles performances du kit ELISA utilisé. Sur les 375 examensde selles réalisés par la méthode de Ziehl-Neelsen modifiée,17 ont révélé la présence de Cryptosporidium spp, soit uneprévalence de 4,53 %. La prévalence en milieu rural était de2 % tandis que la prévalence hospitalière était de 7,4 %. Parla méthode ELISA, 23 cas positifs ont été observés, soit uneprévalence de 6,13 %. En faisant une corrélation de ce testavec la méthode de référence qu’est la technique de Ziehl-Neelsen modifiée, nous avions constaté que ce test avait unesensibilité de 58,82 % et une spécificité élevée à 96,37 %. Lavaleur prédictive positive (VPP) était de 43,4 %, tandis quela valeur prédictive négative était de 98 %. La cryptospori-diose est une cause non négligeable d’infection parasitairechez les enfants au Sénégal ; la détection d’antigènes deCryptosporidium spp peut être un outil complémentaire dansle diagnostic de la cryptosporidiose.

Mots clés Cryptosporidium · Prévalence · Diagnostic ·ELISA · Hôpital · Banlieue · Milieu urbain · Milieu rural ·

Bonconto · Vélingara · Dakar · Sénégal · Afriqueintertropicale

Abstract This is a prospective, descriptive and analytic studyconducted from July 2011 to September 2011 at the ChildrenNational Hospital Albert Royer of Dakar and at the VélingaraHealth District. It was focused on children under 15 withoutreference to HIV status. For each child, a sample of stool wasexamined by the Ziehl-Neelsen modified staining and byELISA using the “Cryptosporidium Antigen DetectionMicrowell ELISA kit” designed to detect Cryptosporidiumspp antigens. The aim of our study was to determine the pre-valence of cryptosporidiosis in rural and hospital areas and tomeasure the performance of the ELISA kit that we used. Outof the 375 stool examinations performed with the Ziehl-Neelsen modified staining, 17 had revealed the presence ofCryptosporidium spp (4.53%). The prevalence in rural areaswas 2% while the hospital prevalence was 7.4%, of which1.8% (1/57) were from urban areas and 9.8% (12/122) fromsuburban areas. No positive case was observed in childrenover 10 years. By ELISA, 23 positives cases were reportedcorresponding to a prevalence of 6.13% (1.8% in childrenliving in urban areas, 13.1% in children from suburban areasand 3% living in rural areas).The correlation of this assay withthe Ziehl-Neelsen modified staining, considered as the refe-rence method, found that this assay had a sensitivity of58.82% and a high specificity reaching 96.37%. The positivepredictive value (PPV) was 43.4% while the negative predic-tive value was 98%. Cryptosporidiosis is a significant causeof parasitic infection among children in Senegal. Antigendetection of Cryptosporidium spp by ELISA in stool can bea complementary tool in the diagnosis of cryptosporidiosis.

Keywords Cryptosporidium · Prevalence · Diagnosis ·ELISA · Hospital · Suburban area · Urban area · Rural area ·Bonconto · Vélingara · Dakar · Senegal · Sub-SaharanAfrica

B. Faye (*) · T. Dieng · R.C. Tine · L. Diouf · K. Sylla ·M. Ndiaye · D. Sow · J.L. Ndiaye · D. Ndiaye · M. Ndiaye ·A.S. Badiane · M.C. Seck · Y. Dieng · O. Faye · O. Ndir · O. GayeService de parasitologie–mycologie,Faculté de médecine, pharmacie et odontologie,Université Cheikh Anta Diop de Dakar, Sénégale-mail : bfaye67@yahoo.fr

Bull. Soc. Pathol. Exot. (2013) 106:258-263DOI 10.1007/s13149-013-0316-7

Introduction

Les maladies diarrhéiques sont une des principales causes demorbidité et mortalité infantile dans les pays en voie dedéveloppement. Au Sénégal, elles sont la deuxième causede mortalité et de morbidité après le paludisme. Cryptospo-ridium spp est de plus en plus incriminé comme pathogèneresponsable de diarrhée chez l’enfant surtout dans les payspauvres. L’absence de traitement efficace augmente la mor-bidité et la mortalité de cette affection. En Afrique noire,l’ampleur de la pandémie du sida et les conditions d’hygiènesouvent précaires font de la cryptosporidiose une parasitosefréquente et l’on estime que 1,3 % à 22,2 % des maladiesdiarrhéiques pourraient être liées à cette protozoose dansles pays en développement [20].

Plusieurs espèces peuvent être retrouvées, mais Cryptos-poridium parvum et Cryptosporidium hominis sont le plussouvent incriminées dans la pathologie humaine. Plusieursétudes ont montré une précocité de l’infection avec une mor-bidité élevée chez les enfants de moins de deux ans, avec depossibles conséquences sur le développement physique etmental de ces enfants. Elle revêt une gravité particulièrechez l’enfant malnutri et le sujet immunodéprimé [8]. Lediagnostic repose principalement sur la recherche des oocys-tes dans les selles par des examens coprologiques. Cetteméthode, bien que sensible, ne renseigne pas sur l’espèce.Ainsi, de plus en plus, des techniques plus pointues sontutilisées telle que la biologie moléculaire et les techniquessérologiques avec en particulier les techniques ELISA.Concernant ces dernières, de nombreux kits sont commer-cialisés pour la détection d’antigènes de Cryptosporidiumspp dans les selles.

Au Sénégal, des études menées il y a plusieurs annéesavaient montré une prévalence non négligeable de la cryp-tosporidiose notamment chez les sujets vivant avec le VIH[6,10]. Cependant, il faut noter que la maladie est sous-estimée, car, dans la majeure partie des structures de santédisposant d’un laboratoire, la technique de Ziehl-Neelsenmodifiée par Henriksen et Pohlenz qui est la technique deréférence dans le pays, n’est pas disponible.

Les objectifs de notre étude étaient de réactualiser lesdonnées sur la place des Cryptosporium spp dans les causesde diarrhée chez les enfants en milieu rural et en milieu hos-pitalier au Sénégal, puis d’évaluer les performances d’un kitELISA, Cryptosporidium Antigen Detection MicrowellELISA, pour le diagnostic de la cryptosporidiose. Ce testest commercialisé depuis plusieurs années en Amérique duNord et présente selon le fabricant une sensibilité de 93 %.De même, des études antérieures menées en Asie ont montréune bonne sensibilité de ce kit [15,22,28]. Cependant à cejour, aucune étude n’a été effectuée en Afrique en particulieren Afrique de l’Ouest pour évaluer ses performances

Méthodologie

Il s’agit d’une étude transversale, prospective, descriptiveréalisée en milieu hospitalier et rural chez des enfants de0 à 15 ans.

En milieu hospitalier urbain, tous les enfants hospitalisésou non, reçus au laboratoire de l’Hôpital d’enfants AlbertRoyer de Dakar (capitale) de juillet à octobre 2011 pour exa-men de selles dans le cadre d’un bilan de troubles digestifs,ont été inclus.

En zone rurale, l’étude a été réalisée dans la communautérurale de Bonconto, située au sud du pays dans le districtsanitaire de Vélingara à 500 km de la capitale du Sénégal.Cette communauté rurale dispose d’un poste de santé etregroupe huit villages. Un échantillon d’enfants vivant dansces différents villages a été inclus. Les prélèvements deselles ont été réalisés en juillet 2011.

La taille de l’échantillon a été calculée à partir du logicielSTATA IC 12. En tenant compte d’une prévalence de la mala-die de 10 %, un risque alpha de 5 %, un niveau de confiance à95 %, le nombre d’enfants à examiner a été estimé à 350, soit175 au niveau hospitalier et 175 au niveau rural.

Au niveau rural, un échantillonnage aléatoire à deux degrésa été effectué. Au premier degré, les villages étaient tirés ausort en utilisant une procédure d’échantillonnage avec proba-bilité proportionnelle à la taille des villages. Au second degré,les individus à inclure étaient sélectionnés demanière aléatoireà partir de la base de sondage constituée par la liste des enfantsde moins de 15 ans résidant dans les villages. Dans chaquegroupe, un nombre minimum de 21 enfants était requis.

Pour le recueil des données, chaque enfant inclus a béné-ficié d’un interrogatoire en présence et avec l’aide desparents pour la description des manifestations cliniques puisd’un prélèvement de selles. Un examen parasitologique desselles à la recherche des oocystes de Cryptosporidium spp aété effectué sur les frottis confectionnés à partir du culot deconcentration (méthode de Ritchie) et colorés par la tech-nique de Ziehl-Neelsen modifiée. Une double lecture a étéfaite pour chaque prélèvement par des techniciens expéri-mentés du laboratoire de parasitologie de la faculté de méde-cine de l’Université Cheikh Anta Diop de Dakar qui est leservice de référence national de parasitologie. En cas de dis-cordance, une troisième lecture était faite par un troisièmelecteur pour la validation du résultat final.

Un test ELISA permettant une détection qualitative del’antigène de Cryptosporidium spp a été également effectuéà partir des selles. Pour cet examen le kit CryptosporidiumAntigen Detection Microwell ELISA a été utilisé et la tech-nique a été effectuée selon les instructions du fabricant tellesque décrites par Masarat et al [22]. Le kit contient tous lescomposants nécessaires à la réalisation du test. Les différen-tes étapes du test ELISA ont été effectuées manuellement,

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tandis que la lecture a été effectuée avec le lecteur ELISA(TECAN Lyon France). Toutes les analyses ont été effec-tuées en double. La moyenne géométrique des densités opti-ques (DO) obtenues était calculée et une DO supérieure ouégale à 0,15 était considérée comme positive.

Les données recueillies ont été saisies sur le logiciel Excelet analysées avec STATA IC 11. Les variables qualitativesont été décrites en termes d’effectif et de pourcentage dedonnées renseignées ; les variables quantitatives ont étédécrites en termes de moyenne et d’écart type. Des compa-raisons de proportions ont été effectuées en utilisant le testdu X2 de Pearson ou le test exact de Fisher selon les condi-tions d’applicabilité. Les seuils de significativité des testsstatistiques étaient de 5 %.

Le consentement libre et éclairé a été obtenu de chaqueenfant ou de son représentant légal avant inclusion. L’étudeen milieu rural s’intégrait dans un essai clinique de plus largeenvergure visant à évaluer l’impact de la mise en œuvre deplusieurs interventions dont l’administration de masse dumébendazole, de vitamine A et le traitement préventif inter-mittent du paludisme sur la survenue de l’anémie de l’enfant.Sur le plan éthique, ce protocole a reçu un avis favorable duConseil national de recherche en santé et l’autorisation admi-nistrative du Ministère de la santé du Sénégal.

Résultats

Au total, 375 enfants âgés d’un mois à 15 ans ont été inclus,199 en milieu rural et 176 en milieu hospitalier. Dans cettedernière population, 54 enfants habitaient en milieu urbain et122 venaient de la banlieue de la capitale (Dakar). Selonl’âge, la répartition suivante était observée : enfants de moinsd’un an : 7,5 % (n= 28), enfants entre un et cinq ans : 55,6 %(n = 208), enfants entre six et 10 ans : 30,5 % (n = 115) etenfants entre 11 et 15 ans : 6,4 % (n = 24)

Sur les 375 examens de selles effectués par la méthode deZiehl-Neelsen modifiée, 17 ont mis en évidence des oocystesde Cryptosporidium spp soit 4,5 %.

Aucun portage n’a été observé chez les enfants de plus de10 ans (Tableau 1).

Sur les 176 enfants de sexe féminin que compte notrepopulation, nous avons obtenu neuf cas de portage d’oocys-tes de Cryptosporidium spp, soit une prévalence de 5,11 %,alors que huit enfants de sexe masculin sur les 199 étaientporteurs de Cryptosporidium spp, soit une prévalence de4,02 % (p = 0,61).

La prévalence hospitalière était de 7,4 % (13/176). Sur les54 enfants provenant du milieu urbain, un seul cas de por-tage d’oocystes a été observé contre 12 parmi les 122 quivenaient de la banlieue dakaroise ; quatre enfants étaientporteurs de Cryptosporidium spp sur les 199 enfants de lazone rurale (Tableau 2).

Concernant la recherche d’antigène dans les selles avec lekit Cryptosporidium Antigen Detection Microwell ELISA,23 selles étaient positives sur les 375 examens réalisés soitune prévalence de 6,1 % (Tableau 3). La prévalence varieinversement avec l’âge (p = 0,003).

Aucune différence significative n’a été retrouvée selon lesexe (p = 0,439). La prévalence hospitalière était de 9,6 %,avec un test ELISA positif chez 1,8 % des enfants vivant enmilieu urbain et 13,1 % chez les enfants venant de la ban-lieue. En milieu rural, la prévalence était de 3 % (6/199).

En utilisant la méthode de Ziehl-Neelsen modifiéecomme référence, nous avons comparé les deux techniques

Tableau 1 Prévalence de Cryptosporidium spp par la méthode

de Ziehl-Neelsen modifiée en fonction de l’âge / Prevalence of

Cryptosporidium spp using Ziehl-Neelsen modified method

according to age.

Catégorie d’âge Effectif Pourcentage

( %)

Moins de 1 an (n = 28)

Positif 03 10,71

Négatif 25 89,28

1-5 ans (n = 208)

Positif 10 04,81

Négatif 198 95,19

6-10 ans (n = 115)

Positif 04 03,47

Négatif 111 96,52

11-15 ans (n = 24)

Positif 00 00

Négatif 24 100

P value = 0,27.

Tableau 2 Prévalence de Cryptosporidium spp par la méthode

de Ziehl-Neelsen modifiée en fonction de l’origine géogra-

phique / Prevalence of Cryptosporidium spp by Ziehl-Neelsen

modified method according to geographical origin.

Milieu Résultat

Ziehl-Neelsen

Pourcentage (%)

Urbain (n=54)

Positif 01 01,85

Négatif 53 98,14

Banlieue (n=122)

Positif 12 09,83

Négatif 110 90,16

Rural (n=199)

Positif 04 02

Négatif 195 98

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de détection (Tableau 4) et calculé la sensibilité et la spéci-ficité du Kit Cryptosporidium Antigen Detection MicrowellELISA avant de déterminer la valeur prédictive positive et lavaleur prédictive négative du test selon les formulessuivantes :

Sensibilité = VP / (VP + FN) × 100 = 10 / (10 + 7) ×100 = 58,8 %

Spécificité = VN / (VN + FP) × 100 = 345 / (345 + 13) ×100 = 96,3 %

VPP = VP / (VP + FP) × 100 = 10 / (10 + 13) × 100 =43,4 %

VPN = VN / VN + FN = 345 / (345 + 7) = 98 %

Discussion

Au cours de ces dernières années, peu d’études se sont inté-ressées à la cryptosporidiose chez les enfants au Sénégal oùles premiers cas ont été observés dans les années 90, aussibien chez des enfants que chez des adultes dont la plupartétaient porteurs du VIH [1,5,6,9]. Les taux de prévalencerapportés à l’époque avec la microscopie étaient variables

en fonction des sites d’études. Une étude réalisée dans lamême structure où a été réalisée la nôtre avait montré unemorbidité hospitalière de 1,5 % (Faye O. données personnel-les 1992) alors qu’Aïdara et al retrouvaient une prévalencede 7,7 % chez les enfants en milieu rural [1]. Une réactuali-sation des données épidémiologiques était donc nécessairepour évaluer la prévalence de Cryptosporidium spp enmilieu hospitalier pédiatrique, mais aussi en milieu rural sanstenir compte du statut immunologique vis-à-vis du VIH.Ceci d’autant plus que plusieurs études réalisées en Afriqueet ailleurs ces dernières années ont montré une augmentationde la prévalence du portage du parasite [24,30]. L’utilisationde nouvelles techniques de diagnostic parmi lesquelles lesméthodes ELISA a permis également l’amélioration de ladétection du parasite. Notre étude a permis de mesurer laprévalence hospitalière et rurale chez les enfants de moinsde 15 ans par la recherche d’oocystes dans les selles et d’éva-luer les performances d’un kit ELISA commercialisé auxÉtats-Unis pour la détection de l’antigène du parasite dansles selles. Il faut cependant noter que, du fait du mode derecrutement différent, la comparaison statistique entre la pré-valence hospitalière et la prévalence en milieu rural n’a pasété effectuée. Une prévalence globale de 4,5 % a été retrou-vée dans notre population d’étude avec une prévalence hos-pitalière de 7,9 % et une prévalence en milieu rural de 2 %.En Afrique de l’Ouest, des prévalences similaires ont étéretrouvées avec 7,7 % en Côte d’Ivoire [16] et 5,5 % auNiger [12]. En Afrique de l’Est, des niveaux de prévalencevariables sont notés avec notamment 4 % au Kenya [11] et30,7 % en Zambie au cours d’une étude longitudinale [26].

Par contre, en Afrique du Nord, l’infection par Cryptos-poridium spp semble diminuer. En Tunisie la prévalence quiétait de 8 % chez les enfants diarrhéiques en 1998 [3] esttombée à 0,3 % [8].

En Asie, des prévalences moins importantes sont notées :3,4 % en Chine avec une variation significative entre lemilieu rural, plus touché et le milieu urbain [21] 4,1 % auNépal [2].

Dans notre population d’étude, la variation de prévalencede la cryptosporidiose en fonction de l’âge des patientsn’était pas statistiquement significative, bien qu’elle dimi-nuait avec l’âge. En effet, chez les enfants de plus de10 ans, aucun cas n’a été diagnostiqué. Le parasite semble

Tableau 3 Prévalence de Cryptosporidium spp par la méthode

ELISA en fonction de l’âge / Prevalence of Cryptosporidium

spp by ELISA according to age.

Catégorie d’âge Effectif Pourcentage (%)

Moins de 1 an (n = 28)

Positif 06 21,43

Négatif 22 78,57

1-5 ans (n = 208)

Positif 13 06,25

Négatif 195 93,75

6-10 ans (n = 115)

Positif 04 03,47

Négatif 111 96,52

11-15 ans (n = 24)

Positif 00 00

Négatif 24 100

P value = 0,003.

Tableau 4 Comparaison des résultats des méthodes de Ziehl-Neelsen modifiée et ELISA / Comparison of results between Ziehl-

Neelsen and ELISA methods.

Méthodes Méthode Ziehl-Neelsen modifiée

ELISA Positif Négatif Total

Positif 10 13 23

Négatif 7 345 352

Total 17 358 375

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toucher plus fréquemment les enfants en bas-âge commel’ont rapporté de nombreux auteurs [6,11,18,24]. Cette étudea également permis de mesurer les performances du kitELISA Microwell comparé au gold standard qui est la tech-nique de Ziehl-Neelsen modifiée. La méthode ELISA est eneffet beaucoup utilisée dans le diagnostic de la cryptospori-diose du fait de sa sensibilité et de sa spécificité. Elle détectel’antigène de Cryptosporidium spp dans les selles permettantde poser le diagnostic quelle que soit l’espèce présente.Ainsi, de plus en plus de kits ELISA sont commercialisés.Cependant, leurs performances sont variables d’où la néces-sité de procéder à des évaluations des caractéristiques (sen-sibilité, spécificité, VPP et VPN) en fonction des conditionspropres à chaque zone géographique. Les résultats obtenusavec le kit Cryptosporidium Antigen Detection MicrowellELISA ont montré une prévalence plus importante par rap-port à la microscopie avec 23 cas détectés (6,1 %) contre 17(4,5 %) pour la microscopie. Plusieurs études effectuées enEurope, en Asie ou en Amérique comparant les techniquesmicroscopiques à la détection des antigènes dans les sellespar ELISA ont démontré que cette dernière diagnostiquaitplus de cas [7,14,17,23,25,27,29]. Cependant, en mesurantles caractéristiques du kit ELISA Microwell par rapport à lamicroscopie comme technique de référence, une sensibilitérelativement faible de 58,8 % est obtenue du fait d’un nom-bre assez important de faux négatifs. En effet, l’antigène duparasite n’a pas été détecté sur sept selles présentant desoocytes à la microscopie. Par contre, la spécificité est relati-vement bonne avec 96,3 %. Des performances plus élevéessont présentées par le fabricant avec 93 % pour la sensibilitéet 98 % pour la spécificité. Une étude menée en Turquie amontré des valeurs proches de celles que nous avons retrou-vées : 60 % et 100 % (Kit ELISA R-Biopharm) [27]. D’au-tres kits ELISA se sont montrés plus sensibles avec desvaleurs de 100 %, mais une spécificité moins importantede 80,1 % (Copro-antigen ELISA) [7], 97 % et 98,3 % enFrance (PCR-enzyme-linked immunosorbent assay) [25],92,6 % et 94,1 % pour la sensibilité chez des patients séro-positifs et séronégatifs respectivement en Inde et une spéci-ficité de 92,2 % et 96,3 % chez les mêmes groupes depatients [17]. Ces résultats montrent que malgré un apportcertain de la détection de l’antigène du parasite dans lesselles comparé à la microscopie, certaines méthodes ELISA(kits commercialisés) semblent plus performantes qued’autres d’où l’importance de les évaluer avant d’en faireun outil de diagnostic de routine. L’absence de diagnosticd’espèce pour certaines méthodes constitue également uninconvénient, notamment pour renseigner sur le profil épidé-miologique de la maladie de même que la difficulté de réa-liser les tests au cas par cas. En effet, le kit CryptosporidiumAntigen Detection Microwell ELISA ainsi que la plupart deskits commercialisés utilisent des plaques de 96 puits néces-sitant d’avoir un nombre assez important d’échantillons

avant leur réalisation. Aussi, la PCR semble être la meilleureméthode de diagnostic, comme le confirment plusieursétudes [13,23,25]. Malheureusement, son coût relativementélevé limite son utilisation en routine dans les pays pauvresoù la maladie est endémique. L’alternative pourrait êtrecependant constituée par les tests de diagnostic rapide. Ils’agit de tests immunochromatographiques simples permet-tant dans certains cas le diagnostic d’espèce. Plusieursétudes ont démontré leur sensibilité élevée de l’ordre de100 % et une spécificité supérieure à 89 % en comparaisonavec la microscopie et l’ELISA [4,13,19]. Ces tests rapidesont l’avantage de ne nécessiter aucun réactif ou matériel etde donner des résultats au bout de 10 à 15 minutes.

Conclusion

Nos résultats suggèrent que la cryptosporidiose est une causenon négligeable d’infection parasitaire chez les enfants auSénégal, justifiant d’en faire une recherche systématiquechez tout enfant présentant des signes digestifs. La détectiond’antigènes de Cryptosporidium spp lorsqu’elle est possiblepermet d’améliorer le diagnostic le plus souvent effectuédans les pays endémiques par les techniquesparasitologiques.

Remerciements Momar Ndao, Centre national de référenceen parasitologie, Université McGill de Montréal, Canada

Conflit d’intérêt : les auteurs ne déclarent aucun conflitd’intérêt .

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