REPUBLIQUE ALGERIENN DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE MOHAMED KHEIDER BISKRAFACULTE DES SCIENCES EXACTES ET DES

SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIEDÉPARTEMENT DES SCIENCES DE LA NATURE

ET DE LA VIE

Les moyens d’étude de la culture des cellules

animale

2011/2012

1ére année master BBM

Sommaire :

IntroductionI- La culture des cellules animales :1-Définition de la culture cellulaire2-La milieu de culture des cellules animales3-L’obtention des culture cellulaires4-A quoi rassemblent les cellules cultivées5-Les avantages et les inconvénients6-L’utilisation des cellules en culture II- Les moyennes d’étude de la culture des cellules animales1-Des méthodes appropriées en microscopie optique permettent l’observation de cellules vivant dans des boites de culture :2-Une technique d’apparition récente est l’étude de la variation de la concentration intracellulaire du calcium :

Introduction :

La culture cellulaire est devenue un des outils majeurs utilisés aujourd'hui dans les sciences de la vie. La culture des cellules animale en dehors de l’organisme permet l’observation des cellules vivantes dans des conditions favorables. De plus, une culture cellulaire représente un système expérimental beaucoup plus simple qu’un animal entier et elle fournit un système qui peut être étudié dans des conditions soigneusement contrôlées. Il existe plusieurs moyennes permet l’étude d’une culture des cellules animales. Dans notre exposé, on présente quelques moyennes.

I- La culture des cellules animales :

I- La culture des cellules animales :

1-Définition de la culture cellulaire :

En biologie, la culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme (ex-vivo) ou de leur milieu d'origine, dans un but d'expérimentation scientifique ou de fécondation in vitro.

2- La milieu de culture des cellules animales :

-Les milieux mis au point pour cultiver les cellules animales sont beaucoup plus complexe que les milieux « minimum » suffisants à la prolifération des bactéries et des levures.

-Les premières tentatives de culture des cellules utilisaient des milieux de compositions incertaines, comme le plasma, le sérum et des extraits embryonnaires ces milieux sont isotoniques et tamponnés.

En 1955, quand Harry Eagle décrivit le premier milieu reconstitué

Le milieu reconstitué comprend: -Les sels et le glucose (1g /l)

-Les acides aminés et les vitamines

-Le PH du milieu doit être maintenu entre 7,2 et 7,4. On utilise donc le tampon physiologique qui est le tampon bicarbonate (H2CO3/HCO-

3). -L’équilibre est maintenu grâce à un atmosphère contenant 5 à 10 % de CO2

-les facteurs de croissance polypeptidiques qui activent leur division.

-Il existe deux méthodes de base pour faire la culture primaire:

•les Cultures d'explants:

de petits morceaux de tissus sont fixés sur un récipient de culture en verre ou en plastique traité et baignés dans du milieu de culture. Après quelques jours, des cellules individuelles se déplacent de l'explant de tissus vers la surface du récipient de culture ou le substrat où elles commencent à se diviser et proliférer.

3- L’obtention d’une culture cellulaire :

Dissociation enzymatique: la méthode la plus généralement utilisée

ce processus est accéléré en ajoutant des enzymes de digestion (protéolytiques), telles que la trypsine ou la collagénase, à des fragments de tissus pour dissoudre le ciment maintenant les cellules ensembles. Ceci crée une suspension de cellules individuelles qui sont placées dans des récipients de culture contenant un milieu de culture pour les laisser pousser et se diviser.

Repiquage :

Lorsque les cellules dans le récipient de culture primaire ont poussé et couvert tout le substrat de culture disponible, elles doivent être repiquées pour leur donner de la place afin d’avoir une croissance continue(culture sécondaire). Cela se fait généralement en les retirant aussi délicatement que possible du substrat avec des enzymes. Ces enzymes sont similaires à celles utilisées pour obtenir la culture primaire et sont utilisées pour rompre les liaisons protéiques liant les cellules au substrat.

À quoi ressemblent les cellules cultivées?

Systèmes de culture cellulaire :

systèmes de culture monocouche:

Ils sont essentiellement basés sur l'aptitude des cellules à pousser attachées sur un substrat de verre ou de plastique traité

systèmes de culture en suspension:

Ils sont essentiellement basés sur l'aptitude des cellules à flotter librement dans le milieu de culture

Types de cellules :

Les cellules cultivées sont généralement décrites d'après leur morphologie (forme et apparence) ou leurs caractéristiques fonctionnelles. Il existe trois morphologies de base:

1. type épithélial: ces cellules sont attachées à un substrat et apparaissent plates et de forme polygonale.

2. type lymphoblaste: ces cellules ne se fixent pas normalement à un substrat mais restent en suspension avec une forme sphérique.

3. type fibroblaste: ces cellules sont attachées à un substrat et apparaissent allongées et bipolaires.

L’utilisation des cellules en culture :

-L’étude des mécanismes de la physiologie cellulaire : contrôle de cycle cellulaire, métabolisme, régulation de l’expression du gènes, études des mouvements et des jonctions cellulaires. La culture cellulaire permet d’étudier la cellule eucaryote et ses relations avec son environnement.

-En médecine humaine, la culture cellulaire est utilisée pour la réalisation de greffes et d’autogreffes (cellules souches sanguines), le dépistage des maladies génétiques (caryotype), la thérapie génique.

-L’industrie pharmaceutique est une grande utilisatrice de ces culture : étude pharmacologique et toxicologique de nouvelles molécules médicamenteuses, production des substances a usage thérapeutique (hormones de croissance, insuline, interférons et cytokines, anticorps monoclonaux) et production de vaccins.

Les avantages et les inconvénients :

Les avantages :

la plus part des tissus animaux et végétaux sont constitué de différent type de cellules, alors que des cellules de type spécifique avec des propriétés homogène peuvent être cultivé.

les conditions expérimentales, peuvent être nettement mieux contrôlées en culture que dans un organisme intacts.

dans de nombreux cas, une cellule unique peut rapidement se développer en une colonie constituée de nombreuses cellules identiques, un processus appelé clonage cellulaire. Cette technique simple, permet d’isolé facilement des clones distincts de cellules.

Les inconvénient :

Un des principaux inconvénients des cellules en culture est le fait qu’elles ne sont pas dans leur environnement normal et que, par conséquent, leurs activités ne sont pas régulées par les autres cellules comme dans le cas d’un organisme intact.

L’environnement immédiat des cellules en culture radicalement de leur environnement « normal », par conséquent, leurs propriétés peuvent être affectées de plusieurs façons.

II- Les moyennes d’étude d’une culture des cellules animales :

2-Des méthodes appropriées en microscopie optique permettent l’observation de cellules vivant dans des boites de culture :

Des méthodes appropriées en microscopie optique permettent l’observation de cellules vivant dans des boites de culture :

-Par exemple, le contraste de phase. Couplées d’abord à la microcinématographie, maintenant à la vidéomicroscopie, ces méthodes rendent possible l’observation de cellules cultivées pendant de longues périodes (mouvements cellulaire, endocytose, différenciation cellulaire…).

-Les progrès de la microscopie à fluorescence, la synthèse de protéines fluorescentes (GFP : la protéine à fluorescence verte) permettent la visualisation en temps réel du devenir intracellulaire de protéines marquées

- Il est possible, à l’aide d’un faisceaux laser, d’éteindre localement la fluorescente , puis de suivre la récupération de la fluorescence

technique permettant l’analyse de la mobilité des protéines, de leur transport actif dans ou à la surface des cellules vivantes.

-Ces techniques sont aussi appliquées à l’étude in vitro du fonctionnement d’organites cellulaires isolés, comme par exemple les mouvement des mitochondries le long des microtubules.

Une technique d’apparition récente est l’étude de la variation de la concentration intracellulaire du calcium :La synthèse chimique a mis à la disposition des chercheurs des molécules qui sont fluorescentes, lorsqu’elles sont en contacte avec du calcium libre dans le hyaloplasme. La mesure de l’intensité de la fluorescence émise permet de mesurer en temps réel (quelques millisecondes) les variations de la concentration intracellulaire du calcium induites par des agents pharmacologiques par exemple. Couplée à un système de vidéomicroscopie avec intensification du signal et analyse d’image, la méthode permet de visualiser à l’intérieur de cellules en culture ces variations de la concentration du calcium, et ce en temps réel

D’autres fluorocromes sont maintenant disponibles pour mesurer dans les mêmes conditions les variations du PH ou celles de la concentration en sodium.

La microscopie vidéo et traitement d’image :De même qu’il possible d’observer un champ microscopique à l’œil ou de la photographier, on peut aussi le filmer avec un caméra vidéo.

Les caméra vidéo offrent de nombreux avantages pour l’observation des objets:On construit des types particuliers de caméra vidéo très sensibles à la lumière, permettant de donner des images d’objets sous un éclairage très faible.

C’est particulièrement utile pour l’observation de spécimens vivants, qui sont facilement détériorés par la chaleur dégagée par une source lumineuse, et des spécimens colorés par fluorescence, qui se décolorent rapidement quand ils sont exposés à la lumière. De plus, les caméras vidéo augmenter fortement le contraste de l’image et faire apparaitre des objets très petits.

La microscopie à fluorescence :

Microscope à fluorescence verticale (Olympus BX61), équipé de filtres et d'un appareil photo numérique

Microscope à fluorescence inversé (Nikon TE2000) ; La plaque orangée permet à l'utilisateur de regarder l'échantillon, tout en protégeant les yeux de la lumière UV qui excite la cible pour la rendre fluorescent.

La microscopie à fluorescence :•Le phénomène de fluorescence:certaines molécules (appelées fluorochromes) absorbent des radiation ultraviolettes invisibles et libèrent une partie de l’énergie sous forme de lumière visible de plus grande longueur d’onde 

•Dans ce microscope, la source lumineuse produit un faisceau de lumière ultraviolette qui traverse un filtre bloquant toutes les longueurs d’onde à l’exception de celles peuvent exciter le fluorochrome.

•Le faisceau de lumière monochromatique est focalisé par l’objectif sur l’objet contenant le fluorochrome, celui-ci est excité et émet une lumière de longueur d’onde visible susceptible d’etre perçue par l’observateur.

•La source lumineuse ne produisant que de la lumière ultraviolette (noire), les objets colorés par un fluorochrome apparaissent avec des couleurs brillantes sur un fondanoir, et le contraste est très fort.

Immunofluorescence:

le fluorochrome (comme la rhodamine ou la fluorescéinne) et uni par covalence (conjugué) à un anticorps, afin de produire un anticorps fluorescent utilisable pour localiser une protéine spécifique au sein de la cellule.

Supposons, par exemple, que vous vous intéresser à la localisation d’une protéine motrice particulière, comme la dynéine cytoplasmique, avant et au cours de la mitose. Pour ce faire, vous pourriez prendre des objets entiers ou des coupes de cellules en division et au repos, puits les traiter par un anticorps contre la dynéine, marqué par fluorescence. L’examen de la préparation au microscope à fluorescence montrait la localisation de la dynéine aux deux stades du cycle cellulaire.

On peut aussi utiliser les protéines marquées par fluorescence pour étudier des processus dynamiques tels qu’ils se déroulent dans la cellule vivante. On peut, par exemple, fixer un fluorochrome spécifique à une protéine cellulaire, comme l’actine ou la tubuline, et injecter la protéine marquée par fluorescence dans une cellule vivante.

protéine fluorescence (GFP): on construit un ADN recombinant qui réunit la région codante de la GFP à celle de la protéine étudiée. Et ADN recombinant sert à la transfection des cellules, qui synthétisent ainsi une protéine chimérique contenant la GFP fluorescente fusionnée à la protéine.Dans toutes ces stratégies, les protéines marquées participent aux activités normales de la cellule et il est possible de suivre leur localisation au microscope pour mettre en évidence les activités dynamiques auxquelles participe la protéine.

On peut aussi utiliser des fluorochromes pour localiser les molécules d’ADN ou d’ARN contenant des séquences nucléotidiques spécifiques.

Cytométrie en flux :

Initialement développée pour le dénombrement de cellule en suspension et l'évaluation de leur taille ,la cytométrie en flux a été rapidement appliquée à l'analyse, la caractérisation et la séparation des cellule eucaryotes des constituants cellulaire (mitochondries, chromosomes).

Le principe de cytométrie en flux :

L'appareil : deux modèles différents.

Un cytomètre analyseur de paillasse

un  cytomètre trieur de cellules,beaucoup plus imposant.

Les lasers :

Les lasers produisant une lumière monochromatique, celle-ci n'est pas forcément adaptée à la mesure recherchée.

Différents lasers sont donc nécessaires pour étendre les possibilités de l'appareil : en particulier pour mettre en évidence différents types de fluorochromes qui ne sont pas excités par les mêmes longueurs d'onde.

Les détecteurs :

Un système complexe de filtres et de détecteurs permet de faire plusieurs mesures simultanées (2 mesures de diffraction et des mesures de fluorescence).

Le tri des cellules :

Conclusion :

On conclure que la culture des cellules animales jouent un grand rôle dans l’étude des mécanismes de la physiologie cellulaire, dans la médecine humaine, et dans L’industrie pharmaceutique. Leur études se fait à l’aide de plusieurs moyennes, la plus utilisable c’est la microscope de fluorescence et la cytométrie en flux.

Merci pour votre attention