A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

La nutrigénomique chez les

ruminants

C. Leroux, Y. Faulconnier et al.

Unité de Recherche sur les Herbivores

INRA, UMR1213

63122 St Genès-Champanelle

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

La nutrigénomique c’est quoi ?

L ’étude des effets de l’alimentation

sur l’expression génique globale

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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Intégration des technologies de la génomique aux recherches en nutrition

Analyses biochimiques

• Composition

• Conversion

1750 - 1900

• Métabolisme

• Pathways

• Physiologie

Biologiques

1900 - 1955

• Comprendre les fonctions

Cellulaires

1955 - présent

• Prévention de maladies

• Améliorer les performances

Génomique

présent

Nutrigénomique

(Milenkovic D.)

La nutrigénomique permet d’identifier et de comprendre les interactions entre la

nutrition et le génome en utilisant des technologies à haut débit

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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L’expression des gènes

Gène

ARNm(s)

Protéomique

Génomique structurale

Transcription maturation stabilité

Traduction modification, dégradation

Transcriptomique

Protéine(s)

Exon Intron

Exon AAAAA

AATAAA

STOP ATG

Noyau

Cytoplasme

Activation

Stratégies à haut

débit

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

La nutrigénomique pourquoi ?

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Avant Une approche ciblée:

•Sur la fonction d’un gène: candidat

fonctionnel

•Sur sa localisation chromosomique: candidat

positionnel

Non exhaustif et……

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

L’animal est un système complexe

• De nombreux acteurs pour former un système complexe

• Différents niveaux de régulation

• Des interactions qui jouent un rôle essentiel

Des études globales et à haut débit

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Des objectifs ambitieux:

– Comprendre les régulations des systèmes complexes

– Identifier et hiérarchiser les principaux acteurs

– Moduler leur expression pour mieux maîtriser les

phénotypes

– Modéliser le fonctionnement des organismes et leur

réponse à l’environnement pour pouvoir les prédire!

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

La nutrigénomique comment ?

A L I M E N T A T I O N

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Les analyses ‘Omiques’

métabolome

D:\Documents\...\Human Plasma_1 27/05/2003 09:50:06 Human Plasma No1, LCrun, manual injection of 5 ultargetfsms4e5

RT: 0.0000 - 21.9416

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Time (min)

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

11.5643 19.5967

15.911012.5526

9.4713

10.85746.6989 20.332917.4764

15.20531.0502 9.93107.5684 18.4599

13.9725 21.16212.3065

5.1317 8.53594.88222.8708

NL:

1.57E7

TIC F:

MS Human

Plasma_1

Human Plasma_1 #10-709 RT: 2.03-21.93 AV: 644 NL: 7.48E4

T: FTMS + p ESI Full ms [ 150.00-2000.00]

150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370

m/z

0

20

40

60

80

100

Re

lative

Ab

un

da

nce

214.0896

260.1855

218.8295

366.1756204.1230

195.0877 334.0986231.1161

279.1591254.1598 263.2043298.1259235.1110188.1645 339.0539178.0896 319.0878 352.0739

328.9980

288.1362246.1698 274.1217 307.1323175.2444157.7074

LC - LTQ-FTMS

GC & LC-MS/MS

génome

SNPs, polymorphismes

protéome transcriptome

Microarrays ou

séquençage haut debit :

mesure de l’expression

de “tous” les gènes

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Le pipeline nutrigénomique

Celacanthus

Acquisition de données

Analyses des données

Interprétation

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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n échantillons

x variables

- Transcripts

- Protéines

- Métabolites

Le pipeline nutrigénomique

Acquisition de données

Analyses des données

Interprétation

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Les analyses transcriptomiques

A L I M E N T A T I O N

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La nutrigénomique animale

A L I M E N T A T I O N

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Objectifs chez les animaux

d’élevage

• Prédire la réponse aux changements nutritionnels

chez les animaux d’élevage

• Améliorer l’efficacité de reproduction et prévenir

les maladies

• Optimiser la qualité nutritionnelle des produits

• Optimiser le potentiel génétique par une

alimentation adaptée

A L I M E N T A T I O N

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E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

• La quantité et la composition des rations modulent

l’expression de nombreux gènes impliqués dans

l’élabotaion des produits animaux

• Les mécanismes par lesquels sont régulés l’expression

génique ne sont pas totalement élucidés chez les

animaux d’élevage

génomique

environment +

?

Encore beaucoup d’inconnues….

gènes tissus

Produits

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Comprendre les mécanismes de régulation du

métabolisme mammaire pour mieux maîtriser la

composition du lait

Nutrigénomique

RégionQTL

RégionQTL

Fonction

in silico

Identification de

nouveaux acteurs de

la biosynthèse des

constituants du lait Gènes nutri-

régulés

Améliorer la qualité

nutritionnelle,

technologique et

sensorielle du lait

Modéliser et prédire la

qualité des laits

A L I M E N T A T I O N

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La nutrigénomique au service de la qualité du lait

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Régulation nutritionnelle de la

composition du lait

Nutrigénomique:

Chez la vache laitière

Chez la chèvre

→ supplémentation lipidique

→ supplémentation lipidique

→ un modèle contrasté

A L I M E N T A T I O N

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Effets de la supplémentation lipidique:

4 régimes: fourrage (F) ± graine de colza (GC)

concentré (C) ± huile de tournesol (HT)

F F+GC C C+HT Chaque période: 4 semaines

F F+GC C C+HT

F F+GC C C+HT

F F+GC C C+HT

Collecte de tissus

mammaires (biopsies) et de

laits à chaque fin de période

N=4

N=4

N=4

N=4

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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Effets de la supplémentation lipidique:

1- sur le lait

Régimes F F-GC C C-HT

PL (kg/d) 18,1a 17,0b 18,6a 17,8ab

TP (g/kg) 31,1b 30,4a,b 30,8b 29,8a

TB (g/kg) 40,0b 41,9b 40,1b 37,0a

Ac Oléique (% AGs) 17,3a 26,1b 17,3a 25,3b

Total AG trans (%) 2,7a 4,1b 2,5a 12.4c

Plus de différences suite à la supplémentation en

HT qu’en GC

Leroux et al., 2016

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Effets de la supplémentation lipidique:

2- sur l’expression des gènes mammaires

F vs F+GC: 0 Gène Différentiellement Exprimé (DEG)

C vs C+HT: 49 DEG

Plus de différence suite à la supplémentation en HT qu’en GC

Leroux et al., 2016

Des gènes impliqués dans le métabolisme des lipides (nvx gènes

clés?) & dans le « remodellage des tissus » ?

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

La nutrigénomique pour comprendre l’adaptation des

ruminants à la restriction alimentaire

Un modèle drastique mais complet

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

PL

(kg/

j)

0

20

40

60

80

100

120

140

MG MP Lactose

(g/j

)

* P < 0,05**

* *

AG C4-C16

AG C18:0 et C18:1 cis-9

AG C18:2 cis-9, cis-12

AG C18:3 cis-9, cis-12, cis-15

A

NA

A

NA

Nutrigénomique et adaptation des

ruminants laitiers 12 chèvres

Standard = A

(n=6)

48hNon-Alim=NA

(n=6)

Composition du lait

Tissus mammaires

Analyses transcriptomiques

12 chèvres

Standard = A

(n=6)

48hNon-Alim=NA

(n=6)

Composition du lait

Tissus mammaires

Analyses transcriptomiques

12 chèvres

Standard = A

(n=6)

48hNon-Alim=NA

(n=6)

Composition du lait

Tissus mammaires

Analyses transcriptomiques

12 chèvres

Standard = A

(n=6)

48hNon-Alim=NA

(n=6)

Composition du lait

Tissus mammaires

Analyses transcriptomiques

Tissus adipeux (TA) (périrénal + omental) Etudes

transcriptomiques

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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Perirenal adipose tissue

(199 DEG)

Omental adipose tissue

(456 DEG)

102 359 97

54 upregulated (including FABP4, HIF1A, ANGPTL4)

43 downregulated (including LPL, SCD, ELOVL5, GPAM, GPD1, ACSS2)

54 upregulated

48 downregulated

191 upregulated

168 downregulated

Nutrigénomique adipocytaire

Une amplitude différente mais de nombreux gènes

en commun entre les sites

Faulconnier et al., 2011

A L I M E N T A T I O N

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E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Réduction de l’expression des gènes de la synthèse des lipides et

augmentation de ceux impliqués dans l’oxydation des acides gras

ainsi que ceux de l’inflammation

Effets de la non alimentation sur le

métabolisme des lipides dans les TA

Faulconnier et al., 2011

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

PL

(kg/

j)

0

20

40

60

80

100

120

140

MG MP Lactose

(g/j

)

* P < 0,05**

* *

AG C4-C16

AG C18:0 et C18:1 cis-9

AG C18:2 cis-9, cis-12

AG C18:3 cis-9, cis-12, cis-15

A

NA

A

NA

Nutrigénomique et adaptation des

ruminants laitiers 12 chèvres

Standard = A

(n=6)

48hNon-Alim=NA

(n=6)

Composition du lait

Tissus mammaires

Analyses transcriptomiques

12 chèvres

Standard = A

(n=6)

48hNon-Alim=NA

(n=6)

Composition du lait

Tissus mammaires

Analyses transcriptomiques

12 chèvres

Standard = A

(n=6)

48hNon-Alim=NA

(n=6)

Composition du lait

Tissus mammaires

Analyses transcriptomiques

12 chèvres

Standard = A

(n=6)

48hNon-Alim=NA

(n=6)

Composition du lait

Tissus mammaires

Analyses transcriptomiques

Tissus adipeux (TA) (périrénal + omental)

Etudes

transcriptomiques

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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Adhésion cellulaire et Cytosquelette

Transduction du signal

Vie cellulaire

Transcription et Métabolisme des ARN

Métabolisme et transport des protéines

Protéines majeures du lait

Métabolisme et transport des lipides

Métabolisme divers

Transport divers

Divers

Processus biologique inconnu

EST

Nombre de gènessous-expriméssur-exprimés

22

36

3

17

6

6

5

14

8

11

9

4

4

4

1

1

1

4

2

1

2

-10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40

Ollier et al., 2007

Effet du niveau d’alimentation sur le

transcriptome mammaire

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Noyau

Cellule épithéliale mammaire

RE

Golgi

VS

0

20

40

60

80

100

120

140

MG MP Lactose

(g/j

)

Globule gras

Acétyl-CoA

Acétate

(C4 à C16)

b-hydroxybutyrate

Malonyl-CoA

ACC

FAS

AG C4-C16

(C16 à C22)

ACS + CoA

acyl-CoA

AZGP1

Lipolyse ?

Espace interstitiel

Lumière alvéolaire

MG MP Lactose

Métabolisme lipidique

FASN (Fatty acid synthase)

ACSBG1 (Lipidosin)

AZGP1 (Zinc-a2-glycoprotein)

㊀ 1,4

㊀ 1,2

㊀ 1,2

Gènes impliqués dans la synthèse

des constituants majeurs du lait

ACSBG1

AZGP1

Fct ds

GM ?

Ollier et al., 2007

«Journée AFTAA» 22/11/2016

AZGP1

Chez la chèvre :

Modèle génétique

Supplémentation lipidique

→ Gène clés?

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Chute de la production laitière

et de la sécrétion des

constituants du lait

Effet de la non alimentation sur le

fonctionnement de la GM

↘ synthèse de novo

des AG courts

et moyens

LIPIDES ↘ Synthèse des

protéines majeures

PROTEINE

↘ synthèse

LACTOSE

Expression

génique mammaire

↘ protéine, lactose,

matière grasse

LAIT

↘ prolifération

↘ différentiation

↗ mort cellulaire programmée

Vie cellulaire

↗ stabilité des ARNm

Machinerie

cellulaire

Non-Alimentation

1ière étape du processus

d’involution

Mécanismes de régulation?

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A G R I C U L T U R E

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L’expression des gènes

Gène

ARNm(s)

Protéomique

Génomique structurale

Transcription maturation stabilité

Traduction modification, dégradation

Transcriptomique

Protéine(s)

Exon Intron

Exon AAAAA

AATAAA

STOP ATG

Noyau

Cytoplasme

Activation

Stratégies à haut débit

microARN

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

MicroARNs sont de petits ARN

(~22-nucléotides), simple brin, non-

codants

A ce jour plus de 800 microARNs

connus chez les bovins

Les microARNs (microRNAs)

Qu’est-ce?: Ils sont impliqués dans la régulation de

nombreuses fonctions biologiques en inhibant

l’expression des gènes en ciblant les ARNm

Chaque microARN peut réguler

l’expression de différents gènes et un gène

peut être régulé par plusieurs microARNs

Ils induisent la dégradation des ARNm ou inhibent

leur traduction en protéines

Les microARNs réguleraient

l’expression de plus de 60% de gènes

Leur fonctionnement:

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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La régulation nutritionnelle des

microARNs mammaires

Séquençage haut débit des petits ARN:

539 microARNs connus

dont 117 jamais décrits chez la chèvre

Parmi les 470 microARNs comparés selon le

niveau d’alimentation

30 microARNs différentiels

Les microARNs permettent de séparer

les animaux selon leur niveau d’alimentation

Mobuchon et al., 2015

A L I M E N T A T I O N

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Parmi leurs ARNm cibles, 19 ont été identifiés comme différentiels

dans l’étude transcriptomique antérieure

Etude des 30 microARNs régulés

Ex: ESR1 nutrirégulé

(Ollier et al., 2007) est la

cible de 3 microARNs

nutrirégulés (Mobuchon

et al., 2015)

Mobuchon et al., 2015

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E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Rôle potentiel des

30 microARNs

nutrirégulés sur le

métabolisme des

lipides

Mobuchon et al., 2015

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E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Et alors …..

Un lien avec la qualité nutritionnelle du lait?

A L I M E N T A T I O N

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microARNs espèce-spécifiques

MiRNomes (NGS) dans la glande mammaire de différentes

espèces en lactation

Les microARNs, la glande mammaire et le lait

Nutri-régulation du miRNome mammaire chez les ruminants.

[Li et al., 2012, Wang et al., 2012, Le Guillou et al.,2014]

miRNome mammaire de chèvres

30 microARNs affectés par la

non alimentation de 48h

2 microARNs modulés par la

supplémentation en huile de tournesol [Mobuchon et al., 2015]

miRNA in milk:

Les microARNs présents dans le lait sont différents entre le colostrum et le lait mature [Chen et al., 2010]

[Mobuchon et al., 2015]

[Mobuchon et al., submitted]

miR-223 est présent dans les exosomes du lait. Il serait un biomarqueur potentiel des infections mammaires par Staphylococcus. Mais les exosomes sont difficiles à obtenir

[Sun et al., 2015 & Li et al., 2015]

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

Identifier des indicateurs précoce et facilement

accessibles de l’inflammation mammaire

La fraction grasse du lait est-elle une source de microARN

et si oui est-ce représentatif de la glande mammaire?

Comparison des profils en microARN de la MGL et de la GM

Biopsies mammaires

(GM)

Matière grasse laitière

(MGL)

Les globules gras contiennent des ARNm [Brenaut et al., 2012; Canovas et al., 2014]

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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Expérimentation

Post traite

GM MGL

N=6 N=6

Biopsies

9 microARNs candidats

RT-qPCR

Extraction ARN

miR-29a, miR-125, miR-126, miR-141, miR-148a, miR-

204, miR-223, miR-320 and miR-494

[Brenaut et al., 2012]

[Le Guillou et al., 2014; Mobuchon et al., 2015]

A L I M E N T A T I O N

A G R I C U L T U R E

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Quantification de microARN à partir de

la GM et de la MGL

RT-qPCR de 9 microARNs dans la MGL et dans la GM

[Lago-Novais, Pawlowski et al., submitted]

2 microARNs sont sous le seuil de détection : miR-126 and miR-204

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• La fraction lipidique est une source facile d’accès et non invasive de microARNs

Les microARNs de la matière grasse du lait

• Les profils microARNs de la GM et de la MGL ne sont pas totalement identiques,

• Soulèvent beaucoup de questions sur les mécanismes de sécrétion et quid de la nutrirégulation des microARN dans le lait?

mais une grande partie d’entre-eux

présente la même abondance

A L I M E N T A T I O N

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E N V I R O N N E M E N T «Journée AFTAA» 22/11/2016

• Des microARNs sont détectés dans le lait commercial [Izumi et al., 2012; Pieters et al., 2015]

même si certains sont éliminés lors des traitements technologiques [Howard et al., 2015]

• Les effets biologiques des vésicules extracellulaires qui contiennent des microARNs sont démontrés in vitro [Pieters et al., 2015] et chez la souris [Arntz et al., 2015]

• L’action des microARNs du lait pourrait être modulée en fonction de leur empaquetage dans des vésicules de transports [Alsaweed et al., 2015]:

→ qu’en est-il pour les globules gras?

Les microARNs pourraient influencer

la santé des consommateurs:

[Laubier et al., 2015; Title et al., 2015]

Plus d’études sont nécessaires !

• MAIS la surconsommation d’un microARN chez des souris n’a pas permis leur détection dans les tissus

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Les messages:

• Meilleure connaissance de la régulation nutritionnelle du fonctionnement de la glande mammaire : données à compléter pour une intégration d’ensemble

• Des gènes « clès » peu impactés MAIS de nouveaux gènes candidats acteurs de la lipogenèse

• Des pistes d’investigation pour la génétique et la nutrigénétique

• De potentiels indicateurs moléculaires de l’équilibre métabolique et de la santé des ruminants laitiers

• De nouveaux éventuels acteurs du potentiel santé des laits de ruminants

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• Identifier des microARNs potentiellement biomarqueurs précoces des mammites

Perspectives

• Caractériser les mécanismes de sécrétion des microARNs dans le lait

• Participer aux études portants sur la caractérisation génétique des microARN (en coll, avec Inra-Gabi de Jouy)

Analyses des miRNomes avant et après un challenge

inflammatoire (LPS)

• Préciser la valeur ajoutée des laits selon les conditions d’élevage via le potentiel santé des microARNs

1- pour « nos » petits microARNs

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Adaptation des

femelles

2- « Percer les secrets des phénotypes laitiers » vers une

approche intégrative

Nutrigénomique

mammaire Nutrigénomique

adipocytaire

Biologie intégrative de la biosynthèse des

constituants du lait au niveau de l’animal

Composition

du lait

Modélisation

de la glande

mammaire ?

Mise en réseau des données « omics »

• Comprendre la hiérarchie des niveaux de régulation du

métabolisme des lipides

• Prédire un phénotype laitier ou une réponse aux changements

• Proposer de nouvelles questions de recherche

Nutrigénétique

Perspectives

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De nombreux acteurs dont….

UMRH

& Gabi-Jouy,

GenePhyse-Toulouse

ApisGene,

ANR,UE