~) ELSEVIER Paris 1988

Ann. Inst. Pasteur/Immunol. 1988, 139, 267-278

LA RI~PONSE HUMORALE CHEZ L'HOMME

DANS LES INFECTIONS A, LEISHMANIA INFANTUM

A. Berneman, X. RoHand et G. Broun

Institut de Technologie des surfaces actives, Universitd de Technologie de Compibgne, BP233, 60206 Compi~gne Cedex (France)

SUMMARY

HUMORAL RESPONSE IN LEISHMANIA INFANTUM CLINICAL INFECTIONS

We sought a specific humoral response in man in order to find an antigenic marker of Leishmania infantum infection. This study was carried out by the Western blot technique; 42 sera from human patients were analysed cn a stan- dard electrophoretic pattern (SDS-PAGE) of L. infantum antigens. Patient sera reacted specifically with 4 (160-, 140-, 94- and 79-Kd) antigens, and reactive antibodies were IgG. We suggest that these antigens may be used for diagnosis of L. infantum visceral leishmaniasis.

KEY-WORDS: Leishmania infantum, IgG; Specificity, Diagnosis, Im- munoblotting.

INTRODUCTION

Les leishmanioses sont des maladies end6miques provoqu6es par un pro- tozoaire monoflagell6 du genre Leishmania dont la cible est le macrophage chez l'h6te vert6br6.

Le diagnostic des leishmanioses visc6rales est fond6 sur l'identification du parasite et par l'apparition d'anticorps dans le s6rum des patients; l'identifi- cation du parasite est longue et fastidieuse et surtout peut 8tre dangereuse

Manuscrit re~u le 24 d~cembre 1987, ac.cept~ le 25 mars 1988.

Adresse de oarrespondance: A. Berneman, Immuno~tochimie, Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15.

268 A. B E R N E M A N E T COLL.

(ponctions de moelle osseuse, ponctions spl~niques). Le d6pistage des affec- tions visc~rales n~cessite actuellement des tests s6rologiquos par immunofluo- rescence et ~lectrosyn~r~se, qui sont des m~thodes lourdes b, mettre en oeuvre. La m~thode ELISA se r~v~le plus rapide et plus sensible. Mais la plupart des tests s~rologiques manquent de sp6cificit6. C'est ainsi que Homme! et coll. [8] et Pappas et coll. [14] ont d6crit un test de type ELISA pour le diagnostic de la leishmaniose visc6rale, mais ces derniers obtiennent 20 % de faux posi- tifs avec des malades ayant une trypanosomiase ainsi qu'avec des sujets sains d'Afrique. En fait, les r~actions crois6es entre Leishmania et les trypanoso- mes ont d~j/t ~t~ d6crites, tant avec les trypanosomes am~ricains (maladie de Chagas) [3, 13, 2, 1, 7, 4] qu'avec les trypanosomes africains (maladie du sommeil) [19]. D'autres r~actions crois6es avec les Leishmanie ont 6t~ d~cri- tes pour des s~rums de malades atteints de l~pre [12], de tuberculose [12, 16, 5, 17] et de paludisme [6, 9].

Nous avons ~tudi~ la r~activit~ des anticorps, dans le cas de leishmanioses visc~rales i~ L. infantum, par analyse en immunoempreinte des s~rums, apr~s transfert d 'un profil ~lectrophor~tique d'antig~nes parasitaires.

MATI~RIEL ET Mt~THODES

Souches.

La souche de L. infantum utilis6e (MCAN/GR/82/LEM497) nous a 6t~ fourn_ie par le l~boratoire du Pr Rioux (Laboratoire d'Ecologie M~dicale) oh elle a subi un typage r~gulier.

Les souches L. tropica (MHOM/IQ/LV556), L. mexicana ~n~icana (MHOM/BR/84/LV4), L. donovani (MHOM/IN/DEVI/LEM138) nous ont 6t~ fournies par le Dr M. Rabinovitch (Institut Pasteur, Paris). Les souches L. mexicana amazonensis (MHOM/GF/83/ITS5), L. brasiliensis guyanensis (MHOM/GF/79/ LEM85.) nous ont 6t6 fournies par le Dr J.P. Dedet 0nstitut Pasteur de la Guyane Fran~mse, Cayenne). La souche L. infantum (MHOM/GR/78/LGR4) nous a 6t6 fournie par le Dr M. Hatziantoniou (Institut Pasteur Heii~nique, Ath~nes). Toutes ces souches ont subi un typage r~gulier au Laboratoire d'Ecologie m~licale de Montpellier (Pr Rioux).

Culture.

La souche de L. infantum est cultiv6e dans un m~lange de milieu RPMI-1640 et de milieu 199 (vol/vol) additionn6 de 10 % de s6rum de foetus de veau. Apr~s cinq passages en culture, la virulence de la souche est test6e par inoculation de la souche /t la souris BALB/c.

EIectrophor~e.

Les ~lectrophor~ses sont r~s~es scion la technique de Laemmli [10] avec des gels de polyacrylamide ~t 10 %. On provoque la lyse de 6 × 10s Leishmania dans 500 ttl de tampon de d6p6t (glyc2Tol 10 %, ~-mercapto6thanol 5 %, dod~cylsulfate de sodium 3 070, Tris 6× 10-2M pH 6,8) mis ~t 90°C pendant 5 min en pr6sence de p~6nyl-

L E I S H M A N I A I N F A N T U M E T REPONSE HUMORALE 269

m6thylsulfonylfluorure et de tosyleucylchlorom6thylc6tone, tous deux ~ la concen- tration de 5x 10-4M; le lysat est ensuite centrifug6 a temp6rature ambiante (10.000 g, 5 rain) et le surnageant est d6pos6 sur une partie de la largeur du gel d'61ec- trophor6se (12 cm). Des marqueurs de poids m ol6culaire (Pharmacia) sont d6pos6s dans un puits adjacent.

Eleetrotransfert.

Les 61ectrotransferts sont r6alis6s A temp6rature ambiante sur nitrocellulose (Sehlei- cher et Schiill BA85 0,45 _L~n) selon la m6thode de Towbin et coll. [18], avec un appa- reil r6frig6r6 ~Biorad, . On courant de 200 mA est appliqu6 pendant 16 h.

R6vdation des Electrotransferts.

Le profil transf&6 est alors conserv6 ~ sec ~ temp&ature ambiante et d6coup~ sous forme de bandelettes an fur et/ l mesure des besoins, tandis qu'une partie est color6e ~ l'encre de Chine (1 ~1 d'encre de Chine du commerce par ml de PBS/Tween

0,3 070, le tout 6tant filtr6 sur papier avant usage) pendant 20 min a temp6rature ambiante.

Immunoempreintes.

Les immunoempreintes sont r~alisc~.s de la fa¢on suivante: (1) saturation pendant 1 h a 20°C avec du PBS contenant du Tween-20 ~ 0,3 °70 et du lait ~cr6m6 en poudre /t 0,5 070; (2) cinq lavages de 2 rain, dans 1 ml de PBS/Tween-20/~ 0,1 °70 ~ 20°C; (3) incubation pendant 1 h avec la dilution de s6rum dans du PBS/Tween-20/~ 0 ,1%, et enfin (4)incubation avec une dilution (1/2000-1/5000) d 'un anticorps anti- immunoglobuline humaine conjugu~/~ la peroxydase (anti-IgG, Nordic Laborato- ries; anti-IgM, anti-IgE et anti-IgA, Dakopat; anti-sous-classes d'IgG humaines, ICN Biomedicals Ltd).

La r~v~lation de l'activit6 peroxydasiaue se fair par addition d 'un m61ange diami- nobenzidine/eau oxyg6n~e dans un tampon TRIS 10-2 M pH 7,0. La r6action est arr~t6e par rinCage ~ l'eau.

S~rums.

Les s6rums de sujets infest6s par L. infantum nous ont 6t6 fournis par le Dr M. Hatziantoniou de l'Institut Pasteur Hell6nique et par le Dr Touabti de l'H6pi- tal de S6tif. Les s6rums de malades atteints de leishmaniose cutan6e du Nouveau Monde proviennent de l'Institut Pasteur de Cayenne (Dr J.P. Dedet). Les s&ums de patients atteints de la maladie de Chagas proviennent d'Argentine (Dr E. Segura).

Les s6rums de 16preux, tuberculeux et patients impalud~s proviennent de l'H6pi- tal Henri Mondor, Cr&eil (Dr M. Liance, Service de Parasitologie, Pr Houin).

Les s6rums et les fiches cliniques nous ont 6t6 fournis par l'Institut Pasteur Hell6- nique pour la leishmaniose visc6rale m6diterran6enne (Dr M. Hatziantoniou) et par l'Institut Pasteur de Cayenne (Dr J.P. Dedet) pour les leishmanioses cutan~.s du Nou- veau Monde.

270 A. BERNEMAN ET COLL.

RI~SULTATS E T D I S C U S S I O N

La figure I montre l'immunoempreinte, sur un profil ~lectrophor6tique de la souche LEM497, de s6rum de sujets atteints de leishmaniose visc6rale i~ L. infantum en Grace (bandes I ~ 15') et en Afrique (bandes 16-17). Pour la majorit6 de ces malades, les immunoempreintes ont 6t6 faites avec des s~rums provenant d'individus ayant subi une chimioth6rapie (glucantime). Pour deux

K d

3 3 0 - - ' 2 2 0

1 1'1"22'3 3' 4 5 $ 7 8

-- 9 4

910111213141515" , 18,2021,23, , 1617 19 22 ~125

- 6 7 --, 6 0

-, 4 3

'" 3 6

--, 3 0

-., 2 0 . 5

,:~

-" 14.4 28

FIG. 1. - - lmmunoempreintes sur un profil de L. infantum de s6rums de malades atteints de ieishmaniose ou d'autres parasitoses.

Les s6rums sont dilu6s/t 1/200, et la r6v61ation est faite avec des anticorps de lapin anti-Ig humaines conjugu~s ~t la peroxydase et dilu~s/~ 1/500.

Bandes 1 ~ 15' = leishmaniose visc~ale m~diterran6enne (Gr~e); bandes 16 et 17 = leishmaniose visc6rale africaine ~ L. donovani; bande 18 = s~rums :~:~gatifs; bande 19 = toxoplasmose (m~lange de 10 s6rums); bandes 20 et 21 = leishmaniose ~ L. mexicana; bande 22 = leish- maniose t L. bras$liensis guyanensis; bande 23 = matadie de Chagas (m61ange de 5 s6rums); bandes 24 et 25 = maladie du sommeil (T. gambiense); bande 26= prof'd antig6nique de L~ infantum color~ ~ l'encre de Chine; bande 15' =s6rum ayant subi plusieurs cycles de cong61at~on et d~cong61ation.

LEISHMANIA INFANTUM ET RI~PONSE I'IUMORALE 271

malades, nous poss6dons des "mLmunoempreintes r~alis~es avant traitement (bandes 1, 2 et 3) et aprb~ Coandes 1', 1", 2' et 3').

Des 6preuves de r~actions crois6es ont ~t6 r6alis6es avec le mSme prof'd de la souche de L. infantum et des s6rums regroup6s de sujets infest~s par d'autres parasites (bande 19, toxoplasmose; bande 23, maladie de Chagas; bandes 24 ¢t 25, trypanosomiase africaine a T. gambier.~e; bandes 20 ~ 22, leishmanioses cutan~es sud-am6ricaines).

Les r~actions t~moins ont ~t~ r6alis6es avec un m61ange de s6rums d'indi- vidu~ sakes (bande n ° 18).

La reconnaissance d'antig~nes de Leishmania ayant ~t6 d6crite pour des s6tarns de malades atteints de mycobact6rioses (l~pre, tuberculose), nous avons fait des contrSles supp!~mcntaites avec des s6rums de ]~preux et de tubercu- leux (fig. 2).

a b c d e

- Kd

- ' .~94

- . q 6 7

- - ~ 6 0

- . . t43

'~ "~36 ID " ~ 3 0

,, m " ~ 1 4 , 4 #

FIG. 2. - - Immunoempreintes sur un profil de L. infantum de s~rums de malades atteints de l~pre (b) ou de tuberculose (c).

S~rum normal (d), s~rums de malade atteints de leishmaniose i~ L. infantum (e), profil de l'empreinte color(~e ~ l'encre de Chine (a). I~es conditions sont les m~nes que pour la figure 1.

272 A. BERNEMAN ET COLL.

Par rapport aux t~moins, nous constatons que tousles s6rums provenant de sujets atteints de leishmaniose visc~al¢ reconnaissent sp~fiquement quatre r~gions antig6niques avec les fr~luences suivantes: (1) 160 Kd: 21/22 s~rums; (2) 140 Kd: 22/22 s~rums; (3) 94 Kd: 21/22 s~rums; et (4) 79 Kd: 21/22 s6rums.

Nous avons d'autre part testb, la r~ctivit6 d'un m61ange de s~rums de mala- des infestb, s par L. infantum, sur les prof'ds antig6niques de diff6rentes Le/sh- mania autres que L. infantum LEM497 (fig. 3): L. ~ropica, L. brasiliensis guyanensis, L. mexicana amazonensis, L. mexicana mexicana, L. infantum LGR4 et L. donovani. On constate ainsi que le m~lange de s~rums de mala- des infest6s par L. infantum reconnait les antig~nes de 79 et 72 Kd pour rou- tes les souches test~es tandis que l'antig~ne de 94 Kd n'est reconnu que pour L. donovani (LEM138) et L. infantum (LGR4 et LEM497).

a b c d ef g | B •

-- 20

FIG. 3. - - Immunoempreinte de profiis antigdniques provenant de diffdrentes souches de I_~shmm~ avec un mdlange de s~rums de malades atteints de leishmaniose ~ L. infantum.

(a) L. tropica, (b) L. brasiliensis guyanensis, (c) L. mexicana amazonensis, (d) L. mexicana mexicana, (e) L. infantum LGR4, (f) L. donovani et (g) L. infantum LEM497.

u

274 A. BERNEMAN E T COLL.

L'antig6ne de 26 Kd n'est reconnu que po,~: L~ infantum (LGR4 et LEM497).

L'~tude des reactions crois~es montre que ces 4 antig~mes ne sont pas recon- nus par les anticorps presents dons Ies s~rums de malades infest~s par d'autres parasites.

Par contre, certains autres antig~nes die L. infantum semblent aussi reconnus par les s&ums de sujets porteurs d'autres parasitoses, qu'elles soient dues des flagell~ ou non. Ainsi, des antig~nes de 72 Kd et de 55-60 Kd sont reconnus par des s6rums (1) de malades atteints de leishmoniose vise&ale, (2) de sujets infest6s par d'autres flagell6s (tels les trypanosomes de la maladie de Chagas ou de la maladie du sommeil) et (3) de malade~s attein~ de leishmaniose cuta- n6e du Nouveau Monde. Une parent6 antig6nique entre Leishmania ne peut surprendre dam la mesure of~ Lopes et coll. [1t] avaient d~j/l observ6 une telle parent~ antig~nique entre des protozoaires flagell~ extr~mement diff,- rents tels que Crithidia, Leptomonas, Herpetomonas et Trypanosama cruzi. Reed et.. coll. [15] ont &galement observ~ une comn~-naut~ antig6nique avec d'ontres paras;tes flagell~s p c ~ ta r~gion 60 Kd.

Par cons6quent, les 4 ontig~nes qui sont sp~ifiquement reconnus par les s&ums de malades infeet~s par L. infantum pourraient etre utilis~s pour dia- gnostiquer les leishmanioses ~t L. infantum.

Le hombre insuffisont de s&ums provenant de malades infest~s par L. dono- vani ne nous permet pas d'~tendre la valeur diagnostique de ces ontig~nes aux leishmoniozes visc6rales ~ L. donovani.

L'~tude de. la r~activit~ isotypique de ces s~rums (fig. 1 et 4) ~ m~attr que la majorit~ des r6ponses sp~cifiques sont obtenues avec des immunoglobu~- nes de elasse IgG.

L'6tude des sous-classes d'IgG (fig. 5 ~.¢ tableau I) montre que les 4 antig~nes semblent suseiter une r~ponse des quatre sous-classes.

C'e~t le cas notamment pour les antig~nes 160 et 140 Kd pour lesquels on a une r~ponse totale en IgG2 et IgG4 (23/23) et quasi syst~matique pour IgG3 (22/23).

FIG. 5. - - Rdactivitds des sous-classes dTgG des sdrums de sujets atteints de leishmaniose L. infantum.

Immunoempreinte r~dis6e sur un profd de L./nfantum. Apr~s r~action avec les s~rums, une incubation est faite avec des anticorps de mouton anti-IgGl, -IgG2, -IgG3 ou -IgG4 et la rt~v~lation est faite avec des anticorps de Lapin anti-mouton marquis par la peroxydase.

A =r~activit~ des IgG1; B =r~activit~ des IgG2; C = r~activit~ des IgG3 et D = r6activit~ des

o = r(mctivit~ du s ~ a m correspondant ~ la bande n 12 en IgG totales; bande 2= s&axm de sujet normal; bandes 3 ~ 25 =lcishmanioses vL~h~ales.

LEISHMANIA INFANTUM ET R~PONSE HUMORALE 275

Kd

t60,. 140,- 94,.- 79,.- 72'-

Kd

160,- 140"- 94. 79,- 72,-

2B,.-

15,.

1 " 3 e S • 7 q' 9o11o13o15o1"/4,19o21"23o25

9. : IgGt

1 " 3 " 5 • 7 " 9 • 1t"13~15 -17019"2~ " 2 3 ~ 5

15"-"

1 • 3 0 5 * 7 • 9 * tJ= 13"t5"t7*19"21°23"25

b:lgG2 "

| * 3 " 5" 7 " 9 • I~ "13°15"17"~; '2 t '23 • 25

C: lgG3 (]: IgG4

276

S6rum

A. BERNEMAN E T COLL.

TABLEAU I. - - R~activitE des sons-classes d'IgG humaines avec L. infantum (d'apr~s la fig. 3).

AntigOne (Kd) n ° 160 et 140 94 79 72 ~a) 26 Co) 15

3 2.3.~ 1.2.3.4 1 1 2 1.2.3.4 4 2.3.4 1.3.4 1.3 1 1.2 1.2.3 5 2.3.4 1.2.3.4 3 2 6 2.3.4 1.2.3.4 7 1.2.3.4 1.2.3.4 1.3.4 1 1 1.3.4 8 2 4 2 2 9 1.2.3.4 1.2.4 1.2.3.4 1 1.2 1.3.4

10 2.3.4 1 3 1 1 2.3 11 2.3.4 1.2.3 1.2.3.4 ! 12 1.2.4 1 1.2.3.4 1 13 1.2.3.4 1.2.3.4 1 14 " 3.4 1.2.3 1 1 1 15 " 1.2.3.4 1.2.3.4 1 1 16 " 1.3.4 1.2.3.4 1 1.2.3.4 17 " 1.2.3 2.3.4 1 1 18 " 3.4 1.3 1 1 19 " 3.4 1.3 1 1 1.2.3.4

" 1.2.3 1.2.3.4 1 1 1.2 21 " 1.2.3.4 1.2.3.4 1 1 1.2.3.4

" 1.2 1.2 1 1 23 " !.2 !.2 1 !

" 1.2 1.2 1 1 1 25 " 1.2.3.4 1.2.3.4 1 1 1.3

Les chiffres 1, 2, 3 et 4 se rapportent respectiveraent/~ IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4. ~ R6activit6 d'IgG2, IgG3 et IgG4 pour tous 1~ s~ams, sauf le s6rum n ° 15. 0~ R~activit6 d'IgG3 et d'IgG4 pour tousles s~ums.

Cette r6activit6 semble modif i6e individuel lement par une th6rapeut ique m6dicamenteuse (fig. 1, bandes 1, 1' et 1", bandes 2 et 2' et 3 et 3') sans qu 'un marqueur de la protec t ion puisse 8tre d6termin6 globalement .

Cela semblerait indiquer que la plupart des anticorps r6agissant sur l ' immu- noempre in te sont p robab lement d~pourvus d 'ef fe ts protecteurs , la chimio- th6rapie 6tant indispensable pou r juguler l ' infestat ion. Toutefois~ cette immunit6 humorale peut permettre de d6tecter pr~r.oc~ment r infect ion visc~rale et, par cons6que~:t, permet t re u n t ra i tement plus rapide du malade.

Nous avons recherch6 tme r6ponse humora le s p ~ f i q u e chezJ ' homme pour d6tecter un marqueur anfig6nique des in fes ta t ions / t Leishmania infantum. Cette ~tude a b.t6 faite ~ ! 'aide de la technique du ~ Western blot>>. Quarante-

LEISHMANIA INFANTUM ET REPONSE HUMORALE 277

deux s6rums de malades on* 6t6 analys6s sur un prof'fl 61ectrophor6tique stan- dard d'antig6nes de L. infantum. Les s6rmns r6agissent sp6cifiquement avec 4 antig6nes (160, 140, 94 et 79 Kd).

Les anticorps actifs sont des IgG. Nous sugg6rons une utilisation poten- tielle de ces antig6nes pour le diagnostic des leishmanioses visc6rales/t L. infantum.

MOTS-CL1LS: Leishmania infantum, IgG; Sp6cificit6, Diagnostic, Immuno- empreintes.

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