La régulation du transport du glucose dans le muscle ... · CAMKK De l’anglais Ca2+/calmodulin dependent protein kinase kinase CCL2 Chimiokine C-C de type 2 de l’anglais Chemokine

La régulation du transport du glucose dans le muscle squelettique

L’implication des protéines AMPK et iNOS

Thèse

Emmanuelle St-Amand

Doctorat en physiologie-endocrinologie

Philosophiae doctor (Ph.D.)

Québec, Canada

© Emmanuelle St-Amand, 2015

iii

Résumé

Le tissu musculaire squelettique contribue considérablement au maintien de l’homéostasie du

glucose chez l’humain. Que ce soit en situation postprandiale ou lors d’un travail musculaire, le

muscle squelettique capte de grandes quantités de glucose sanguin à des fins d’entreposage ou de

production d’énergie. Les voies de signalisation cellulaire impliquées dans la régulation du transport

du glucose à l’intérieur de la cellule musculaire sont nombreuses et complexes. En présence de

désordres physiologiques et/ou métaboliques, de nombreux médiateurs chimiques et enzymatiques

peuvent interagir avec les différentes protéines de ces voies de signalisation et entraîner des

perturbations importantes au niveau de l’homéostasie du glucose.

Notre première étude nous a permis de confirmer l’implication de la protéine AMPK dans le transport

du glucose induit par la contraction musculaire. L’AMPK est un senseur énergétique important activé

dans le muscle squelettique au cours d’un effort physique. Toutefois, son rôle dans le transport du

glucose induit par la contraction musculaire demeure controversé. Grâce à un modèle murin

d’invalidation génétique de l’AMPK spécifique au tissu musculaire et à l’élaboration d’un protocole de

contraction ex vivo approprié, nous avons établi l’importance de l’AMPK dans la régulation du

transport du glucose.

Notre seconde étude nous a permis de démontrer que l’incubation ex vivo prolongée du muscle

épitrochléen modifie l’expression du transporteur de glucose GLUT1. Nous avons également observé

l’induction de la protéine iNOS et la production du NO. Parallèlement, nous avons mesuré une

augmentation de l’expression de GLUT1 à la suite d’une exposition au NO dans un modèle de

cellules musculaires ainsi qu’une augmentation du transport basal du glucose. L’ensemble de nos

résultats nous permet de consolider le lien causal entre la production du NO et la modulation de

l’expression de GLUT1 et potentiellement, le développement de perturbations au niveau du

métabolisme du glucose musculaire.

v

Table des matières

RÉSUMÉ ............................................................................................................................................ III

TABLE DES MATIERES ..................................................................................................................... V

LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................................... IX

LISTE DES FIGURES ........................................................................................................................ XI

LISTE DES ABRÉVIATIONS ET DES SIGLES ............................................................................... XIII

REMERCIEMENTS .......................................................................................................................... XIX

AVANT-PROPOS ............................................................................................................................. XXI

INTRODUCTION ................................................................................................................................. 1

1 LE TRANSPORT DU GLUCOSE DANS LE MUSCLE SQUELETTIQUE ................................... 1 1.1 LE MUSCLE SQUELETTIQUE ...................................................................................................... 1

1.1.1 Anatomie et structure ....................................................................................................... 1

1.1.2 Type de fibres musculaires .............................................................................................. 2

1.2 TRANSPORTEURS DE GLUCOSE ................................................................................................ 3

1.2.1 GLUT1 ............................................................................................................................. 4

1.2.2 GLUT4 ............................................................................................................................. 5

1.3 VOIE DE SIGNALISATION DE L’INSULINE ..................................................................................... 7

1.3.1 Récepteur de l’insuline ..................................................................................................... 7

1.3.2 Substrat du récepteur de l’insuline ................................................................................... 8

1.3.3 Phosphatidylinositol 3-kinase ........................................................................................... 9

1.3.4 Protéine kinase B ou Akt ................................................................................................ 10

1.3.5 Substrats d’Akt ............................................................................................................... 10

1.3.5.1 TBC1D4 ................................................................................................................. 11

1.3.5.2 TBC1D1 ................................................................................................................. 12

1.3.6 Rac1 .............................................................................................................................. 14

1.4 VOIES DE SIGNALISATION DE LA CONTRACTION MUSCULAIRE ..................................................... 14

1.4.1 Calcium .......................................................................................................................... 14

1.4.2 Protéine Kinase C .......................................................................................................... 15

1.4.3 Les protéines kinases activées par les facteurs mitogènes ........................................... 16

1.4.4 Monoxyde d’azote .......................................................................................................... 17

1.4.5 Espèces réactives de l’oxygène ..................................................................................... 17

1.4.6 Rac1 .............................................................................................................................. 18

1.4.7 Substrats d’Akt ............................................................................................................... 18

1.4.7.1 TBC1D4 ................................................................................................................. 18

1.4.7.2 TBC1D1 ................................................................................................................. 19

vi

2 AMPK ........................................................................................................................................ 20 2.1 STRUCTURE ET EXPRESSION ................................................................................................. 21

2.2 RÉGULATION DE L’AMPK ...................................................................................................... 23

2.2.1 Nucléotides de l’adénine ................................................................................................ 23

2.2.2 AMPKK .......................................................................................................................... 24

2.2.2.1 LKB1 ...................................................................................................................... 24

2.2.2.2 CAMKK .................................................................................................................. 25

2.2.2.3 TAK1 ...................................................................................................................... 26

2.3 ACTIVATION DE L’AMPK ....................................................................................................... 26

2.3.1 Activateurs pharmacologiques ....................................................................................... 26

2.3.1.1 AICAR .................................................................................................................... 27

2.3.1.2 Metformine ............................................................................................................. 27

2.3.1.3 Thiazolidinediones ................................................................................................. 28

2.3.1.4 A-769662 ............................................................................................................... 28

2.3.1.5 Composés naturels ................................................................................................ 29

2.3.2 Activation par la contraction musculaire ......................................................................... 29

2.3.2.1 Statut énergétique .................................................................................................. 30

2.3.2.2 Calcium .................................................................................................................. 30

2.3.2.3 Espèces réactives de l’oxygène ............................................................................. 31

2.3.2.4 Interleukine-6 ......................................................................................................... 31

2.4 RÉGULATION DU TRANSPORT DU GLUCOSE DANS LE MUSCLE SQUELETTIQUE ............................. 32

2.4.1 Modèles transgéniques des sous-unités catalytiques de l’AMPK ................................... 32

2.4.1.1 Souris AMPK KD1 .................................................................................................. 32

2.4.1.2 Souris AMPK α2i TG .............................................................................................. 34

2.4.1.3 Souris AMPKα1/α2 KO .......................................................................................... 34

2.4.1.4 Souris AMPKα1α2 mdKO ...................................................................................... 35

2.4.2 Modèles transgéniques des sous-unités régulatrices de l’AMPK ................................... 35

2.4.2.1 Souris AMPKγ3 KO ................................................................................................ 35

2.4.2.2 Souris AMPKβ1/β2 KO ........................................................................................... 36

2.4.2.3 Souris AMPKβ1/β2M-KO ....................................................................................... 36

3 RÉSISTANCE À L’INSULINE MUSCULAIRE ........................................................................... 38 3.1 DÉFINITION .......................................................................................................................... 38

3.2 DÉFAUT DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L’INSULINE ............................................................... 38

3.2.1 Récepteur à l’insuline ..................................................................................................... 39

3.2.2 Substrat du récepteur à l’insuline 1 ................................................................................ 39

3.2.3 Phosphatidylinositol 3-kinase ......................................................................................... 39

3.2.4 Protéine kinase B/Akt ..................................................................................................... 40

3.3 LIPOTOXICITÉ ....................................................................................................................... 40

3.3.1 Acyl-coenzyme-A ........................................................................................................... 41

3.3.2 Diacylglycérol ................................................................................................................. 41

3.3.3 Céramides ...................................................................................................................... 42

vii

3.4 INFLAMMATION ..................................................................................................................... 43

3.4.1 LPS ................................................................................................................................ 44

3.4.2 TNFα .............................................................................................................................. 45

3.4.3 Interleukine-6 ................................................................................................................. 46

3.4.4 Macrophages ................................................................................................................. 48

4 INOS .......................................................................................................................................... 48 4.1 STRUCTURE ET EXPRESSION ................................................................................................. 48

4.2 RÉGULATION DE L’EXPRESSION D’INOS ................................................................................. 49

4.3 INOS ET LA RÉSISTANCE À L’INSULINE MUSCULAIRE................................................................. 50

4.3.1 Nitration ......................................................................................................................... 52

4.3.2 S-nitrosylation ................................................................................................................ 53

5 OBJECTIFS DE RECHERCHE ................................................................................................. 54

CHAPITRE 1 ..................................................................................................................................... 57 RÉSUMÉ .......................................................................................................................................... 58

ABSTRACT ....................................................................................................................................... 59

INTRODUCTION ................................................................................................................................. 60

EXPERIMENTAL PROCEDURES ............................................................................................................ 62

RESULTS ......................................................................................................................................... 66

DISCUSSION .................................................................................................................................... 68

ACKNOWLEDGEMENTS ...................................................................................................................... 71

REFERENCES ................................................................................................................................... 72

LEGENDS TO FIGURES ....................................................................................................................... 75

CHAPITRE 2 ..................................................................................................................................... 81 RÉSUMÉ .......................................................................................................................................... 82

ABSTRACT ....................................................................................................................................... 83

INTRODUCTION ................................................................................................................................. 84

EXPERIMENTAL PROCEDURES ............................................................................................................ 86

RESULTS ......................................................................................................................................... 89

DISCUSSION .................................................................................................................................... 91

REFERENCES ................................................................................................................................... 94

LEGENDS TO FIGURES ....................................................................................................................... 97

CONCLUSION ................................................................................................................................. 103 LE RÔLE DE L’AMPK DANS LE TRANSPORT DU GLUCOSE INDUIT PAR LA CONTRACTION MUSCULAIRE ...... 103

L’INCUBATION À LONG TERME DU MUSCLE ÉPITROCHLÉEN CAUSE L’INDUCTION D’INOS ET L’AUGMENTATION

DE L’EXPRESSION DE GLUT1 .......................................................................................................... 109

BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................ 115

ix

Liste des tableaux

INTRODUCTION

TABLEAU 1 CLASSIFICATION DES GLUTS ...................................................................................... 4

TABLEAU 2 EXPRESSION DES DIFFÉRENTS ISOFORMES DE L'AMPK DANS LES MUSCLES

EDL ET SOLÉAIRE DE SOURIS ............................................................................................... 21

xi

Liste des Figures

INTRODUCTION

FIGURE 1 ORGANISATION STRUCTURELLE D'UNE FIBRE MUSCULAIRE ................................... 2

FIGURE 2 STRUCTURE DE L’IR ........................................................................................................ 8

FIGURE 3 STRUCTURE D'IRS1 ......................................................................................................... 9

FIGURE 4 STRUCTURE DE LA PI3K DE CLASSE IA ........................................................................ 9

FIGURE 5 STRUCTURE DE AS160/TBC1D4 ET TBC1D1 ............................................................... 13

FIGURE 6 VOIE DE SIGNALISATION DE L'INSULINE .................................................................... 13

FIGURE 7 VOIES DE SIGNALISATION DE LA CONTRACTION MUSCULAIRE ............................. 20

FIGURE 8 STRUCTURE DE L'AMPK ............................................................................................... 23

FIGURE 9 RÉGULATION DE L'AMPK .............................................................................................. 26

FIGURE 10 STRUCTURE D'INOS .................................................................................................... 49

FIGURE 11 MODIFICATIONS NITROSATIVES DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L'INSULINE54

CHAPITRE 1

FIGURE 1 LACK OF AMPKα2 ACTIVATION AND GLUCOSE TRANSPORT STIMULATION BY

AICAR IN EDL OF AMPK-KD MICE .......................................................................................... 77

FIGURE 2 FORCE PRODUCTION AND FATIGABILITY OF EDL MUSCLES OF WT AND KD-

AMPKα2 .................................................................................................................................... 78

FIGURE 3 EFFECTS OF DIFFERENT STIMULATION FREQUENCIES ON AMPKα

PHOSPHORYLATION IN EDL FROM WT MICE ....................................................................... 79

FIGURE 4 LACK OF AMPKα2 ACTIVITY REDUCES CONTRACTION-MEDIATED GLUCOSE

TRANSPORT IN EDL FROM KD-AMPKα2 MICE ..................................................................... 80

CHAPITRE 2

FIGURE 1 LONG-TERM INCUBATION OF EPITROCHLEARIS MUSCLE MODULATES NOS

EXPRESSION ........................................................................................................................... 98

FIGURE 2 TIME COURSE OF INCUBATION-MEDIATED INDUCTION OF INOS AND GLUT1 ...... 99

FIGURE 3 INOS INDUCTION CAUSES GLUT1 EXPRESSION IN EPITROCHLEARIS MUSCLE . 100

FIGURE 4 NO INDUCTION INCREASE GLUT1 EXPRESSION AND BASAL GLUCOSE UPTAKE

INL6 MUSCLE CELLS ............................................................................................................. 101

xiii

Liste des abréviations et des sigles

ACC Acétyl-coenzyme A carboxylase

Acyl-Coa Acyl-coenzyme A

Adn Adiponectine

ADP Adénosine diphosphate

AGL Acides gras libres

AICAR 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucléotide

Akt De l’anglais Ak transforming

AMP Adénosine monophosphate

AMPK Kinase activée par l’AMP

AMPKK AMPK kinase

ARK De l’anglais AMPK-related kinase family

ARNm Acide ribonucléique messager

AS160 De l’anglais Akt susbtrat of 160kDa

ATP Adénosine triphosphate

BH4 Tétrahydrobioptérine

C2C12 Cellules musculaires de souris

Ca2+ Calcium

CAM Calmoduline

CAMK Kinase Ca2+/calmoduline dépendante de l’anglais Ca2+/calmodulin

kinase

CAMKK De l’anglais Ca2+/calmodulin dependent protein kinase kinase

CCL2 Chimiokine C-C de type 2 de l’anglais Chemokine ligand2

CCR Récepteur de chimiokine de la famille C-C de l’anglais C-C

chemokine receptor type 2

CBS Cystathionine β-synthase

C-terminal Carboxyl-terminal

DAG Diacylglycérol

DGAT1 Diglycéride acyltransférases1

EDL Long extenseur des orteils du latin extensor digitorum longus

FAD Flavine adénine mononucléotide

FAS Acide gras synthase de l’anglais Fatty acid synthase

FMN Flavine mononucléotide

G6Pase Glucose-6-phoshatase

GAP De l’anglais GTPase-activating protein

GDP Guanosine diphosphate

GLUT Transporteur de glucose de l’anglais glucose transporter

GP Glycogène phosphorylase

GTP Guanosine triphosphate

H2O2 Peroxyde d’oxygène

xiv

HeLa Cellules cancéreuses humaines

HMG-CoA reductase Hydroxyméthylglutaryl-CoA réductase

HMIT Cotransporteur de proton/myoinositol de l’anglais Proton Myo-

inositol Transporter

HuR De l’anglais Hu antegen R

KD De l’anglais Kinase dead

IκB Inhibiteur de kappa B

IKK Kinase iκB de l’anglais IκB kinase

IL Interleukine

INF Interféron

IR Récepteur de l’insuline de l’anglais Insulin receptor

IRS1 Substrat du récepeteur de l’insuline de l’anglais Insulin receptor

substrate

JNK Kinase c-Jun-N-terminale de l’anglais c-Jun-n-terminal kinase

KI De l’anglais Knockin

KO De l’anglais Knockout

L6 Cellules musculaires de rat

LKB1 De l’anglais Liver kinase B1

L-NAME NG-Nitro-L-arginine-methyl

L-NMMA L-N-monométhyl-arginine

LPS Lipopolysaccharide

MAPK Kinase activée par les facteurs mitogènes de l’anglais Mitogen-

activated protein kinase

MAP3K De l’anglais Mitogen-activated protein kinase kinase kinase

MEF Cellules embryonnaires fibroblastiques de souris

mTORC2 Complexe 2 de la cible de la rapamycine chez les mammifères de

l’anglais mammalian target of rapamycin

NADPH Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate

NF-κB Facteur nucléaire kappaB de l’anglais Nuclear factoe kappaB

NO Monoxyde d’azote de l’anglais Nitric oxide

NOS Synthase de monoxyde d’azote de l’anglais Nitric oxide synthase

N-terminal Amino-terminal

O2 Oxygène

O2- Superoxyde

ONOO- Peroxynitrite

PDK1 Kinase phosphoinositide-dépendente de l’anglais phosphoinositide-

dependent kinase1

PEPCK Phosphoénolpyruvate carboxykinase

PH De l’anglais pleckstrin homology

PI Phosphoinositols

PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

xv

PIP2 Phosphoinositide-4, 5-biophosphate

PIP3 Phosphoinositide-3, 4, 5-triphosphate

PKB Protéine kinase B

PKC Protéine kinase C

PTB De l’anglais phosphotyrosine binding

PP2A/2C Protéine phosphatases

PPARγ Récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes gamma

RAC1 De l’anglais Ras-related C3 botulinum toxin substrate1

RNS Espèces réactives de l’azote de l’anglais Reactive nitrogen species

ROS Espèces réactives de l’oxygène de l’anglais reactive oxygen species

Ser Sérine

SH De l’anglais Src homology

SNF1 De l’anglais Sucrose non-fermenting1

SphK1 Kinase sphingosine1 de l’anglais sphingosine kinase1

SPT1 Sérine palmitoyltransférase

STAT3 De l’anglais Signal transducer and activator of transcription 3

TA Tibial antérieur

TAK1 De l’anglais Transforming growthn factor-β- activated kinase1

TBC1D1 De l’anglais TBC1 (tre-2/USP6, BUB2, cdc16) domain family,

member 1

TBC1D4 De l’anglais TBC1 (tre-2/USP6, BUB2, cdc16) domain family,

member 4

Thr Thréonine

TNF Facteur de nécrose tumoral de l’anglais Tumoral necrosis factor

TLR4 Récepteur de type Toll4 de l’anglais Toll like receptor4

Tubule-t Tubule transverse

Tyr Tyrosine

VL Vaste lateral

W-7 N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenessulfonamide

ZMP 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-ribofuranosyl monophosphate

xvii

À mes parents,

À mes frères et sœurs

xix

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de recherche, le Dr. André Marette, pour m’avoir

donné la chance de faire partie de son équipe. Je tiens également à lui dire merci pour les

opportunités uniques qu’il m’a permis de vivre tout au long de mes études supérieures.

Je tiens à dire merci à mon codirecteur, le Dr. Claude Côté, pour son soutien, sa disponibilité, ses

encouragements et ses conseils jusqu’à la toute fin de ce long parcours.

Merci à tous mes collègues passés et présents du laboratoire Marette. Votre support et votre aide

tout au long de ces années furent très appréciés. Un merci tout particulier à Bruno Marcotte et Marie-

Julie Dubois sans qui toutes ces années n’auraient pas été les mêmes. Un gros merci à Geneviève

Pilon, la responsable de mon projet, une collègue, mais avant tout et par-dessus tout, une amie.

Un merci tout particulier à ma famille pour leur soutien et leurs encouragements.

Finalement, merci aux organismes subventionnaires qui ont rendu possible mes études: Diabète

Québec, le CRIUCPQ, le FQRNT, le CDA et l’Université Paris Descartes.

xxi

Avant-propos

CHAPITRE 1 Ce manuscrit fut publié dans la revue American Journal of Physiology Endocrinology & Metabolism. N. Lefort*, E. St-Amand*, S. Morasse, CH. Côté, A. Marette. The alpha subunit of AMPK is essential for submaximal contraction-mediated glucose transport in skeletal muscle in vitro. American Journal of Physiology Endocrinology Metabolism 2008; 295:1447-1454. * Les auteurs ont collaboré également à la rédaction du manuscrit. Pour cette étude, j’ai contribué à la collecte de l’ensemble des données publiées en collaboration

avec Nathalie Lefort. J’ai participé à la rédaction finale du manuscrit.

CHAPITRE 2 Ce manuscrit est en préparation. Pour cette étude, j’ai contribué à la collecte des données en

collaboration avec Geneviève Pilon et Kathleen Lemieux. J’ai participé à la rédaction du manuscrit

avec l’aide de Phillip J White.

Outre les deux manuscrits présentés de cette thèse, j’ai participé à la collecte de données des quatre

articles suivants:

P. J. White, P. St-Pierre, A. Charbonneau, P. Mitchell, E. St-Amand, B. Marcotte, A. Marette. Protectin DX alleviates insulin resistance by activating a myokine-liver glucoregulatory axis. Nature Medecine, 2014, 20(6):664-9.

L. Lantier, J. Fentz, R. Mounier, J. Leclerc, J. T. Treebak, C. Pehmøller, N. Sanz, I. Sakakibara, E. Saint-Amand, S. Rimbaud, P. Maire, A. Marette, R. Ventura-Clapier, A. Ferry, J. F.P. Wojtaszewski, M. Foretz, B. Viollet. AMPK controls exercise endurance, mitochondrial oxidative capacity and skeletal muscle integrity. 2014 Jul;28(7):3211-24.

E. Xu,M. P. Forest, M. Schawb, R. K. Avramoglu , E. St-Amand, A. Z. Caron, K. Bellmann, M. Shum, G. Voisin, M. Paquet, A. Montoubis, E. Lévy, K. A. Siminovitch, B. G. Neel, N. Beauchemin, A. Marette. Hepatocyte-specific Ptpn6 deletion promotes insulin-sensitive hepatic steatosis in diet-induced obesity. Hepatology2014, 59(5):1803-15

M. Sanchez, C. Darimont, V. Drapeau, S. Emady-Azar, L. Philippe, C. Ammon-Zuffrey, G. Chevrier, E. St-Amand, A. Marette, J. Doré, A. Tremblay. Effect of Lactobacillus rhamnosus CGMCC1.3724 supplementation on weight loss and maintenance in obese men and women. British Journal of Nutrition 2014, 111(8):1507-19.

1

INTRODUCTION

1 Le transport du glucose dans le muscle

squelettique

1.1 Le muscle squelettique

Chez l’humain, le muscle squelettique représente environ quarante à cinquante pourcent de la

masse corporelle totale. Bien qu’on en dénombre plus de six cents, chaque muscle est un organe

bien distinct. L’une des fonctions du muscle squelettique est la mise en mouvement des os du

squelette, caractéristique qui lui a valu son nom. De plus, il possède la capacité de transformer

l’énergie chimique, l’adénosine triphosphate (ATP), en énergie mécanique, la contraction musculaire.

Ceci lui permet de développer la force nécessaire à la production du mouvement.

1.1.1 Anatomie et structure

Un muscle est un ensemble de fibres musculaires regroupés et maintenus ensemble par un tissu

conjonctif. Le nombre de fibres musculaires qui constitue un muscle varie selon la fonction de celui-

ci. De plus, ces fibres ont différentes grosseurs et différentes longueurs. Chez l’adulte, leur diamètre

peut varier de 10μm à 100μm tandis que leur longueur peut atteindre jusqu’à 30cm, bien que la

majorité soit de l’ordre de 10cm. Chaque fibre musculaire est entourée d’une membrane plasmique,

nommée le sarcolemme, qui la relie à l’os via le tendon. De nombreuses myofibrilles, éléments

contractiles du muscle squelettique, composent chacune des fibres musculaires. Chaque myofibrille

est entourée d’un réseau de tubules transverses (tubules-T) et de tubules longitudinaux, mieux

connus sous le nom de réticulum sarcoplasmique. Les tubules-T sont de minuscules invaginations

qui s’enfoncent transversalement dans chacune des fibres musculaires à partir du sarcolemme. Les

tubules-T permettent la propagation des potentiels d’action qui engendrent la contraction musculaire

et ils servent également de canaux de transport pour différentes molécules telles le glucose et

l’oxygène. Le réticulum sarcoplasmique est parallèle aux myofibrilles. Les extrémités du réticulum

sarcoplasmique se nomment les citernes terminales. Elles emmagasinent les ions calcium (Ca2+)

essentiels à la contraction musculaire. Une triade est l’ensemble formé d’un tubule-T et de deux

citernes terminales du réticulum sarcoplasmique [1]. L’organisation structurelle est représentée à la

figure 1.

2

Figure 1 Organisation structurelle d'une fibre musculaire, tirée de [1]

1.1.2 Type de fibres musculaires

Tout d’abord identifiées en fonction de leur vitesse de contraction et de la nature des enzymes

métaboliques qui les composent, les fibres musculaires furent divisées en trois catégories: les fibres

oxydatives lentes, les fibres oxydatives-glycolytiques rapides et les fibres glycolytiques rapides. Au

cours des dernières décennies, une nouvelle classification basée sur le type de myosine présent

dans la fibre musculaire fut introduite. Ainsi les fibres oxydatives lentes sont devenues les fibres de

type 1; les fibres oxydatives-glycolytiques rapides, les fibres de type 2A; fibres glycolytiques rapides,

les fibres de type 2B. Cette nouvelle méthode de classification a permis d’identifier un quatrième type

de fibres soit les fibres de type 2X. Leur vitesse de contraction est rapide et leur résistance à la

fatigue se situe à mi-chemin entre celles des fibres de types 2A et 2B. Contrairement aux rongeurs,

les fibres de types 2B ne sont pas détectées chez l’humain et les fibres glycolytiques rapides sont, en

réalité, des fibres de type 2X. La distribution respective de chaque type de fibres est génétiquement

déterminée et varie d’un muscle à l’autre selon la fonction de celui-ci et de l’espèce. Par exemple, le

muscle soléaire est majoritairement composé de fibres oxydatives lentes tandis que le long

extenseur des orteils (EDL) en contient peu. Certains facteurs, tels que l’entraînement ou l’inactivité

3

physique, peuvent également faire varier la proportion des types de fibres retrouvés dans un muscle

[2].

Les fibres oxydatives lentes se caractérisent par leur petit diamètre et leur couleur rouge. Elles

contiennent une grande quantité de myoglobine et de nombreuses mitochondries. Ainsi, elles

produisent l’ATP nécessaire à la contraction musculaire principalement par la respiration cellulaire

d’où leur qualificatif de fibres oxydatives. Ce type de fibres développe peu de puissance musculaire,

mais il est très résistant à la fatigue ce qui lui permet d’effectuer des contractions soutenues et

prolongées nécessaires à la stabilisation de la posture et aux activités d’endurance musculaire tel

que le marathon [1].

Les fibres oxydatives-glycolytiques rapides se caractérisent par un diamètre moyen comparativement

aux deux autres types de fibres et par une couleur rouge-violet. Puisqu’elles possèdent une bonne

quantité de mitochondries et de glycogène intramusculaire, elles utilisent, à la fois, la respiration

cellulaire et la glycolyse anaérobie pour produire de l’ATP. Leur vitesse de contraction est rapide et

leur résistance à la fatigue est modérée. Elles sont donc sollicitées lors d’activités telles que la

marche et le sprint [1].

Finalement, les fibres glycolytiques rapides sont de couleur blanche et elles se caractérisent par la

grosseur de leur diamètre. Elles possèdent peu de mitochondries, mais un contenu élevé en

glycogène intramusculaire. La production d’ATP se fait essentiellement par glycolyse anaérobie. Leur

vitesse de contraction est rapide et leur nombre élevé en myofibrilles leur permet de développer la

puissance musculaire nécessaire aux mouvements explosifs, mais de courte durée. Ainsi, les fibres

glycolytiques rapides se fatiguent rapidement [1].

1.2 Transporteurs de glucose

Outre sa capacité à produire un mouvement, le muscle squelettique joue un rôle primordial dans le

maintien de l’homéostasie énergétique. Le principal substrat énergétique du muscle squelettique est

le glucose. À jeun, le muscle squelettique capte environ soixante-cinq pourcent du glucose sanguin

produit par le foie tandis qu’en situation post prandiale, environ quatre-vingt pourcent du transport du

glucose stimulé par l’insuline se fait au niveau du muscle squelettique chez l’humain [3].

4

La captation du glucose sanguin par le muscle squelettique se fait par diffusion facilitée et elle

nécessite la présence des transporteurs de glucose (GLUT) au niveau du sarcolemme et des

tubules-T. Douze transporteurs de glucose (GLUT1–GLUT12) ainsi que le cotransporteur de

proton/myoinositol (HMIT) furent identifiés. Les GLUTs sont des protéines possédant douze

domaines transmembranaires. L’expression tissulaire est spécifique à chaque GLUT ainsi que son

affinité aux différents saccharides. Les GLUTs sont subdivisés en trois classes. Cette classification

est essentiellement basée sur la séquence d’acides aminés et l’affinité pour le glucose des différents

GLUTs. La classe I comprend les GLUT1-4; la classe II, les GLUT5, GLUT7, GLUT9 et GLUT11. Par

conséquent, la classe III comprend tous les autres GLUTs ainsi que le HMIT [4, 5]. Les différents

GLUTs sont présentés dans le tableau 1. En ce qui concerne le tissu musculaire squelettique,

GLUT1 et GLUT4 sont les transporteurs de glucose les plus étudiés à ce jour.

Tableau 1 Classification des GLUTs, tiré de [4]

1.2.1 GLUT1

La protéine GLUT1 est exprimée de façon ubiquitaire tant chez l’humain que chez l’animal. Certaines

études ont observé un contenu élevé en GLUT1 dans le muscle squelettique à la naissance et au

cours des premières semaines de vie chez le rat. Toutefois, il semble que l’expression de GLUT1

chute de façon drastique au cours du développement musculaire [6, 7]. D’ailleurs, les niveaux d’acide

ribonucléique messager (ARNm) de GLUT1 sont faiblement détectés dans le muscle vaste latéral

(VL) adulte chez l’humain [8]. Des études d’immunofluorescence chez le rat ont permis de d’établir

que la localisation de GLUT1 dans le muscle squelettique est restreinte à la surface de la membrane

plasmique, plus particulièrement au niveau du sarcolemme [9, 10]. De plus, il fut suggéré que les

5

fibres musculaires oxydatives aient un contenu plus élevé en GLUT1 que les fibres musculaires

glycolytiques chez le rat [9, 11]. Cependant, certaines études n’ont observé aucune variation dans

l’expression de GLUT1 entre les différents types de fibres chez ce même modèle animal [12, 13].

L’expression et l’activité de GLUT1 varient en réponse à diverses conditions métaboliques.

L’exposition prolongée des cellules musculaires L6 de rat (cellules L6) à de fortes concentrations de

glucose diminue l’expression des GLUT1 à la surface de la membrane plasmique tandis que

l’absence de glucose provoque le phénomène inverse [14]. De plus, une exposition de vingt-quatre

heures à un cocktail de cytokines combiné à une endotoxine, le lipopolysaccharide (LPS), augmente

l’expression de GLUT1 dans les cellules L6. Le même phénomène fut rapporté lors d’une exposition

à un stress oxydatif induit par du peroxyde d’oxygène (H2O2) [15, 16]. Chez l’humain, une diminution

de la protéine GLUT1 fut observée dans le muscle VL des individus atteints de diabète de type 2

tandis qu’une augmentation de l’ARNm de GLUT1 fut mesurée dans les cellules musculaires

d’individus soumis à huit semaines d’entraînement aérobie [17, 18].

L’implication de GLUT1 dans transport basal de glucose fut rapidement démontrée. En effet, une

forte augmentation du transport basal de glucose fut observée dans des cellules L6 surexprimant

GLUT1 [19]. Des résultats similaires furent rapportés dans les muscles épitrochléen et soléaire de

souris transgéniques surexprimant GLUT1 ainsi que dans le muscle gastrocnémien de rat pour

lequel la protéine fut surexprimée après électroporation [20-22]. Néanmoins, il fut rapporté que

l’utilisation d’un inhibiteur de GLUT4, l’indinavir, diminue de quatre-vingt pourcent le transport basal

de glucose dans les cellules musculaires L6 enrichies de protéines GLUT4 (L6GLUT4myc) [23]. Par

ailleurs, chez les souris génétiquement invalidées pour GLUT4 dans le tissu musculaire, une

diminution importante du transport basal de glucose fut observée dans les muscles EDL et soléaire

[24, 25]. L’ensemble de ces résultats suggère que GLUT1 n’est pas seul responsable du transport

basal dans les cellules musculaires. La protéine GLUT4 semble également impliquée.

1.2.2 GLUT4

Contrairement à GLUT1, l’expression de GLUT4 croît au cours du développement musculaire et

devient le transporteur de glucose dominant dans le muscle squelettique adulte [6-8]. Sa localisation

intracellulaire en condition basale et sa translocation au niveau du sarcolemme et plus

6

particulièrement, au niveau des tubules-T en présence d’insuline le distingue de tous les autres

GLUTs. En effet, des études en immunofluorescence ont permis de localiser GLUT4 à la surface du

sarcolemme ainsi qu’à l’intérieur de la cellule musculaire de rat. Il fut démontré qu’en condition

basale, le rapport GLUT4:GLUT1 à la surface du sarcolemme est de 4:1. Ce rapport augmente à 7:1

à la suite d’une infusion d’insuline in situ au niveau des muscles des membres inférieurs chez le rat

[9, 10]. Selon plusieurs études réalisées chez les rongeurs, les fibres musculaires oxydatives

seraient plus riches en GLUT4 que les fibres musculaires glycolytiques [9, 11-13, 26-28].

L’utilisation de modèles de souris transgéniques a permis d’établir l’importance de cette protéine

dans la régulation du transport du glucose stimulé par l’insuline. En effet, une résistance à l’insuline

périphérique ainsi qu’une propension au diabète furent observées chez la souris où l’expression de

GLUT4 est partiellement réduite dans le muscle squelettique et dans le tissu adipeux (GLUT4+/-) [29,

30]. La réinsertion de la protéine GLUT4 dans le muscle squelettique de la souris GLUT4+/- rétablit la

sensibilité à l’insuline ainsi que la tolérance au glucose à des niveaux normaux [31]. De plus, chez la

souris génétiquement invalidée pour GLUT4 spécifiquement dans le tissu musculaire (GLUT4 KO

muscle), une résistance à l’insuline sévère et une intolérance au glucose furent rapportées [24]. Par

ailleurs, le transport du glucose stimulé par l’insuline ex vivo dans les muscles EDL et soléaire est

aboli chez la souris GLUT4 KO muscle et chez la souris qui présente une invalidation totale de

GLUT4 (GLUT4-/-) [24, 25]. En contrepartie, la souris qui surexprime GLUT4 dans le muscle

squelettique est caractérisée par une augmentation de sa sensibilité à l’insuline ainsi que par une

tolérance au glucose améliorée comparativement à la souris contrôle [32, 33].

Fait intéressant, il fut également observé que l’insuline induit la translocation des GLUT12 des

vésicules cytoplasmiques vers la membrane plasmique dans le muscle squelettique humain [34].

Néanmoins, des études complémentaires seront nécessaires pour définir le rôle exact et le

mécanisme d’action des GLUT12.

Parallèlement à l’insuline, la contraction musculaire engendre aussi la translocation des GLUT4 des

vésicules cytoplasmiques vers la membrane plasmique et les tubules-T. De plus, tant chez l’humain

que chez l’animal, les études ont démontré une augmentation de l’expression de l’ARNm ainsi que

de la protéine GLUT4 dans le muscle squelettique immédiatement après une seule séance

7

d’exercice aérobie chez le sujet entraîné ou non [35-39]. L’importance de GLUT4 dans les effets de

la contraction musculaire fut démontrée par l’abolition du transport du glucose induit par un protocole

de stimulation électrique (contraction ex vivo) dans les muscles EDL et soléaire des souris GLUT4-/-

et des souris GLUT4 KO [24, 25]. De plus, une réduction marquée du métabolisme du glucose fut

observée dans les muscles soléaire, gastrocnémien et VL chez la souris GLUT4-/- en réponse à un

exercice in vivo sur tapis roulant [40]. L’analyse du contenu musculaire en GLUT4 de différents

muscles squelettiques chez le rat a démontré que la stimulation maximale du transport du glucose

induit par la contraction musculaire ex vivo corrèle positivement avec la quantité de GLUT4 présent

dans le muscle. Cette même étude a démontré que la contraction musculaire et une stimulation à

l’insuline ex vivo ont des effets additifs sur le transport du glucose dans ces mêmes muscles

squelettiques [26].

Ainsi, l’insuline et la contraction musculaire stimulent le transport du glucose dans le muscle

squelettique grâce à la participation des GLUT4. Néanmoins, ces deux stimuli physiologiques

agissent par des voies de signalisation bien distinctes.

1.3 Voie de signalisation de l’insuline

L’insuline est une petite hormone synthétisée et sécrétée par les cellules β des îlots de Langerhans

du pancréas en réponse à une augmentation de la glycémie. Le rôle de l’insuline est de normaliser la

glycémie. Ainsi, l’augmentation de la concentration plasmatique d’insuline entraîne la translocation

des GLUT4 et par conséquent, la captation du glucose sanguin par le muscle squelettique et le tissu

adipeux. Dans le muscle squelettique, l’insuline entraîne la translocation des GLUT4 par la voie de

signalisation de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) [41].

1.3.1 Récepteur de l’insuline

Le récepteur à l’insuline (IR de l’anglais insulin receptor) appartient à la famille des récepteurs de

facteurs de croissance. Il forme un complexe hétérotétradimère composé de deux sous-unités α liées

aux deux sous-unités β par des ponts disulfures. Les sous-unités alpha (α) sont situées sur la

membrane plasmique extracellulaire et elles possèdent un domaine de liaison à l’insuline. Les sous-

unités bêta (β) sont transmembranaires et elles possèdent une activité tyrosine kinase dans leur

domaine intracellulaire. La liaison de l’hormone aux sous-unités α entraîne un changement de

8

conformation de l’IR et par conséquent, induit l’autophosphorylation des sous-unités β sur les résidus

tyrosine 1158, 1163, 1162 (Tyr1158, Tyr1163, Tyr1162). La phosphorylation de ces résidus est

essentielle à l’activation de l’IR et à la transmission du signal insulinique. En effet,

l’autophosphorylation des sous-unités β permet l’activation complète du domaine tyrosine kinase et la

phosphorylation d’autres tyrosines présentes sur les chaînes β. La phosphorylation du résidu tyrosine

960 ou 972 (Tyr960/972) dans le domaine juxta membranaire de la sous-unité β permet l’ancrage

des substrats du récepteur de l’insuline [42-44]. La structure de l’IR est représentée à la figure 2.

Figure 2 Structure de l’IR, tirée de [45]

TM: Domaine Transmembranaire; JM: Domaine Juxta Membranaire; TK: Domaine tyrosine kinase;

CT: Région C-Terminale

1.3.2 Substrat du récepteur de l’insuline

La famille des substrats du récepteur de l’insuline (IRS de l’anglais insulin receptor substrat)

comprend six membres, IRS1-6 [46-50]. Bien que les protéines IRS1 et IRS2 soient toutes deux

impliquées dans la signalisation de l’insuline, IRS1 serait celle responsable du transport du glucose

stimulé par l’insuline au niveau du muscle squelettique [51-53]. La région amino-terminale (N-

terminale) de la protéine IRS1 contient un domaine pleckstrin homology (PH) adjacent au domaine

de liaison à la phosphotyrosine (PTB). Le domaine PH permet à la protéine IRS1 de se lier aux

phosphoinositols (PI) à la membrane plasmique près de l’IR tandis que le domaine PTB est

responsable de la liaison de la protéine IRS1 au résidu Tyr960/972 de l’IR [54-56]. Cette liaison

entraîne la phosphorylation des résidus tyrosine contenus dans la région carboxy-terminale (C-

9

terminale) de la protéine IRS1. Ces nouveaux sites de liaisons sont reconnus, à leur tour, par des

protéines contenant un domaine src homology 2 (SH2) dont la sous-unité régulatrice p85 de la

phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) reconnue pour son implication dans la transmission du signal

insulinique [57]. La structure d’IRS1 est représentée à la figure 3.

Figure 3 Structure d'IRS1, tirée et modifiée de [58]

1.3.3 Phosphatidylinositol 3-kinase

La protéine IRS1 se lie à la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) de classe IA, un complexe

hétérodimère composé d’une sous-unité régulatrice, la p85, et d’une sous-unité catalytique, la p110.

Il existe deux isoformes de la sous-unité p85, les isoformes α et β. La sous-unité p85 possède un

domaine SH3 et deux domaines SH2 [59-61]. Ces derniers servent, entre autre chose, à lier la p85 à

IRS1 [62]. Cette liaison permet le recrutement de la sous-unité catalytique p110. Il existe également

trois isoformes de la sous-unité p110, les isoformes α, β et delta (δ). Toutefois, l’isoforme δ ne

semble pas être exprimée dans le muscle squelettique [63-66]. L’activation de la PI3K résulte de la

liaison de ces deux sous-unités. La structure de la PI3K de classe 1A est représentée à la figure 4.

Figure 4 Structure de la PI3K de classe IA, tirée de [67]

La PI3K activée se lie aux phospholipides membranaires. La phosphorylation des phospholipides

membranaires par la PI3K permet la conversion du phosphoinositide-4,5-biphosphate (PIP2) en

phosphoinositide-3, 4, 5-triphosphate (PIP3). Les premières évidences de l’importance de la PI3K

dans la voie de signalisation de l’insuline dans le muscle squelettique furent révélées par l’utilisation

d’un inhibiteur de la PI3K, la wortmannine. En effet, il fut démontré qu’un traitement à la wortmannine

10

inhibe la translocation des GLUT4 et le transport du glucose stimulés par l’insuline dans les cellules

musculaires L6 et les muscles épitrochléen et soléaire de rat [68, 69]. Le PIP3 produit par la PI3K

interagit avec le domaine PH de la protéine kinase B/Akt.

1.3.4 Protéine kinase B ou Akt

La protéine kinase B (PKB), communément nommée Akt, est une sérine/thréonine kinase dont il

existe trois isoformes, Akt1(PKBα), Akt2 (PKBβ) et Akt3 (PKB gamma (γ)) [70-73]. L’utilisation de

modèles murins transgéniques a démontré que chaque isoforme joue un rôle bien distinct dans

divers processus biologiques. Il est suggéré que la protéine Akt2 soit l’isoforme impliquée dans le

maintien de l’homéostasie du glucose par l’insuline dans le muscle squelettique [74, 75].

Le recrutement d’Akt à la membrane plasmique par les PIP3 provoque un changement de

conformation de la protéine démasquant ainsi ses sites de phosphorylation sur la thréonine 308

(Thr308) et la sérine 473 (Ser473). L’activation maximale d’Akt implique la phosphorylation de ces

deux sites par deux intermédiaires distincts [76, 77]. La phosphoinositide-dépendante kinase 1

(PDK1), également activée par PIP3, phosphoryle la Thr308 située dans le domaine catalytique

d’Akt. Ensuite, le complexe 2 de la cible de la rapamycine chez les mammifères (mTORC2)

phosphoryle la Ser473 située dans le domaine hydrophobe d’Akt [78, 79]. L’activation d’Akt mène à

la translocation des GLUT4 dans le muscle squelettique par l’intermédiaire des substrats d’Akt soient

les protéines TBC1D4 et TBC1D1.

1.3.5 Substrats d’Akt

Les protéines TBC1D4 et TBC1D1 sont codées par le même gène et elles possèdent une activité

Rab GTPase. Au cours de la dernière décennie, plusieurs études ont suggéré que ses substrats

d’Akt seraient le filon manquant entre l’activation d’Akt par l’insuline et la translocation des GLUT4.

Récemment, une étude a rapporté l’implication du substrat d’Akt Girdin dans la régulation du signal

de l’insuline dans les cellules musculaires. En effet, l’utilisation de petits ARN interférents pour la

protéine Girdin diminue la phosphorylation de la Thr308 d’Akt en réponse à une stimulation à

l’insuline dans les cellules musculaires de souris C2C12 (cellules C2C12) tandis qu’une

surexpression de la protéine produit l’effet inverse [80]. Toutefois, des études complémentaires

11

seront nécessaires afin de définir le rôle exact et le mécanisme d’action de la protéine Girdin dans le

transport du glucose musculaire.

1.3.5.1 TBC1D4

La protéine TBC1D4, également nommée AS160 (de l’anglais Akt substrat of 160kDa), fut le premier

substrat d’Akt découvert pour son implication dans la translocation des GLUT4 dans les cellules

musculaires. Elle possède deux domaines PTB dans la région N-terminale ainsi qu’un domaine de

liaison à la calmoduline (CBD de l’anglais calmodulin-binding domaine) et un domaine GTPase-

activating protein (GAP) dans la région C-terminale [81, 82]. La protéine TBC1D4 possède plusieurs

sites de phosphorylation dont le motif est reconnu par Akt. La transfection d’un plasmide

surexprimant une forme mutante des résidus sérine 318, 588, 751 et thréonine 642 (Ser318, Ser588,

Ser751 et Thr642) de TBC1D4 dans les cellules L6 a permis de démontrer le rôle de cette protéine

dans la translocation des GLUT4. En effet, une abolition de la translocation des GLUT4 à la

membrane plasmique fut observée en réponse à une stimulation à l’insuline dans ces conditions [83].

Des résultats similaires avaient été obtenus chez la souris. En effet, il fut rapporté que l’introduction

d’un plasmide mutant pour ces mêmes résidus de TBC1D4 dans le muscle tibial antérieur (TA) par

électroporation diminue le transport du glucose stimulé par l’insuline. Par ailleurs, le transport du

glucose était complètement inhibé lorsque le plasmide introduit contenait à la fois des mutants de

quatre sites de phosphorylation et un mutant qui inhibe l’activité Rab GTPase [84]. De plus, la souris

TBC1D4 T649 KI, génétiquement modifiée pour l’invalidation du résidu Thr649, présente une

intolérance au glucose et une résistance à l’insuline. L’abolition partielle du transport du glucose

stimulé par l’insuline occasionnée par une diminution de la translocation des GLUT4 dans le muscle

squelettique des souris TBC1D4 T649 KI serait la cause de ces perturbations au niveau de la

régulation du métabolisme du glucose. Fait intéressant, la diminution du transport du glucose stimulé

par l’insuline est plus marquée dans le muscle soléaire comparativement au muscle EDL [85]. Cette

observation concorde avec le fait que la protéine TBC1D4 fut rapportée pour être plus exprimée dans

les muscles davantage oxydatifs comparativement à ceux glycolytiques [86].

Chez l’humain, il fut rapporté qu’une stimulation à l’insuline entraîne la phosphorylation des résidus

sérine 318, 341, 588 et 751 de TBC1D4 dans le muscle squelettique. Ces résultats suggèrent

12

l’implication de la protéine TBC1D4 dans la voie de signalisation de l’insuline chez l’humain telle

qu’observée chez la souris [87].

1.3.5.2 TBC1D1

La protéine TBC1D1 est un paralogue de TBC1D4. Quarante-sept pourcent de leur séquence est

commune et la grande majorité des similitudes que partagent ces deux protéines se situe au niveau

du domaine GAP [88]. Tout comme TBC1D4, la protéine TBC1D1 contient deux domaines PTB dans

la région N-terminale ainsi qu’un domaine CBD et un domaine GAP dans la région C-terminale.

TBC1D1 possède également plusieurs sites de phosphorylation dont le motif est reconnu par Akt.

Entre autre chose, une augmentation de la phosphorylation des résidus sérine 489, thréonine 499,

sérine 501 et thréonine 590 (Ser489, Thr499, Ser501, Thr590) de TBC1D1 fut rapportée en réponse

à un traitement à l’insuline dans les cellules C2C12 et L6, respectivement [89, 90]. Chez la souris,

une stimulation à l’insuline entraîne la phosphorylation des résidus Thr590 et thréonine 253 (Thr253)

dans le muscle TA. Toutefois, la Thr253 n’est pas présente chez l’humain. Ainsi, il est proposé que la

phosphorylation du résidu Thr590 chez la souris, Thr596 chez l’humain, par une stimulation à

l’insuline serait responsable de la régulation de l’activité Rab GTPase dans le domaine GAP de

TBC1D1. Le résidu Thr590 est l’équivalent du résidu Thr649 retrouvé sur la protéine TBC1D4 [86,

91]. De plus, une diminution du transport du glucose en réponse à un traitement à l’insuline ex vivo

chez différents modèles d’invalidation génétique de l’activité Rab GTPase de TBC1D1 fut observée

dans le muscle EDL de souris [92-94]. L’ensemble de ces résultats suggère un rôle pour TBC1D1

dans la translocation des GLUT4 induite par l’insuline. Toutefois, une étude chez l’humain n’a noté

aucune augmentation de la phosphorylation du résidu Thr596 de TBC1D1 dans le muscle VL à la

suite d’une infusion d’insuline [95]. Les structures des substrats d’Akt TBC1D4 et TBC1D1 sont

représentés à la figure 5.

Chez la souris, il est suggéré que la protéine TBC1D1 soit principalement exprimée dans le tissu

musculaire, et plus particulièrement dans les muscles davantage glycolytiques, contrairement à

TBC1D4 [86].

13

Figure 5 Structure de AS160/TBC1D4 et TBC1D1, tirée de [96]

Ainsi, il est proposé que la phosphorylation des protéines TBC1D4 sur le résidu Thr642 et de

TBC1D1 sur le résidu Thr596 augmente la liaison de celles-ci avec les protéines 14-3-3 et inactive

les substrats d’Akt. En effet, il est suggéré que cette interaction entre TBC1D4 et les protéines 14-3-3

serait responsable de l’inhibition de l’activité Rab GTPase dans le domaine GAP dont le rôle est

l’hydrolyse de la guanosine triphosphate (GTP) en guanosine diphosphate (GDP) par les protéines

Rab. Cette inhibition de l’activité Rab GTPase a pour conséquence l’augmentation du nombre de

protéines Rab actives, c’est-à-dire l’augmentation du nombre de protéines Rab liées à la GTP (Rab-

GTP) comparativement à sa forme inactive liée à la GDP (Rab-GDP). L’activation des protéines Rab

entraîne la translocation des GLUT4 des vésicules cytoplasmiques vers la membrane plasmique et

les tubules-T [97]. Néanmoins, la liaison de TBC1D1 aux protéines 14-3-3 ne semble pas induite par

la phosphorylation de la Thr590 [90]. La figure 6 résume la voie de signalisation de l’insuline dans la

cellule musculaire.

Figure 6 Voie de signalisation de l'insuline, tirée et modifiée de [96]

14

1.3.6 Rac1

Au cours des dernières années, certaines études ont démontré l’implication d’une nouvelle protéine

dans le transport du glucose stimulé par l’insuline, soit Rac1 (De l’anglais Ras-related C3 botulinum

toxin substrate 1). Il fut d’abord suggéré que l’insuline entraîne une réorganisation structurale des

filaments d’actine et que cette modification participe à la translocation des GLUT4 via la PI3K dans

les cellules L6 [98, 99]. Par la suite, l’implication de la protéine Rac1 dans le réarrangement du

cytosquelette des filaments d’actine et dans la translocation des GLUT4 stimulée par l’insuline fut

démontrée dans les cellules L6 et le muscle gastrocnémien de souris [100-102]. Récemment, il fut

proposé que les protéines Rac1 et Akt agissent de manière indépendante sur la translocation des

GLUT4 stimulée par l’insuline bien que toutes deux soient dépendantes de l’activation de la PI3K

[103, 104]. À l’inverse, d’autres études stipulent qu’Akt2 régule l’activité de Rac1 [105, 106].

1.4 Voies de signalisation de la contraction musculaire

Contrairement à la voie de signalisation de l’insuline où plusieurs étapes menant à la translocation

des GLUT4 furent largement étudiées, le mécanisme d’action par lequel la contraction musculaire

induit le transport du glucose demeure encore à être élucidé. Ceci dit, la translocation des GLUT4 au

sarcolemme et aux tubules-T est essentielle au transport du glucose induit par la contraction

musculaire et plusieurs médiateurs furent suggérés pour participer à ce phénomène.

1.4.1 Calcium

Les premières évidences de l’implication du calcium dans le transport du glucose lors de la

contraction musculaire furent démontrées par l’utilisation de la caféine. En effet, Clausen et ses

collaborateurs rapportèrent l’augmentation de la tension musculaire, des concentrations

cytoplasmiques de Ca2+ et du transport du glucose, tel qu’observé lors de la contraction musculaire,

dans le muscle soléaire de rat incubé en présence de caféine [107]. Par la suite, il fut démontré que

l’incubation du muscle épitrochléen de rat en présence de faibles concentrations de caféine provoque

le relâchement de Ca2+ des citernes terminales du réticulum endoplasmique ainsi que l’augmentation

du transport du glucose sans toutefois, induire une augmentation de la tension musculaire. Des

résultats similaires furent obtenus avec l’utilisation d’un composé chimique, le N-(6-aminohexyl)-5-

chloro-1-naphthalenesulfonamide (W-7), qui provoque le relâchement de Ca2+ des citernes externes

du réticulum endoplasmique. À cet instant, il fut suggéré que le calcium stimule le transport du

15

glucose dans le muscle squelettique par une voie, du moins partiellement indépendante de celle de

la contraction musculaire [108]. De plus, des études subséquentes ont rapporté que la caféine

augmentait l’activité de la kinase activée par l’adénosine monophosphate (AMPK), plus

particulièrement de l’isoforme AMPKα1, dans les muscles squelettiques de souris et de rats. Par

ailleurs, l’effet de la caféine sur le transport du glucose est altéré chez la souris surexprimant une

forme inactive de l’AMPK dans les tissus musculaires [109-111]. L’ensemble de ces résultats

suggère que l’augmentation du transport du glucose induit par le relâchement de Ca2+ par la caféine

serait dépendante de l’AMPK.

Toutefois, il fut également démontré que l’ajout de dantrolène, un myorelaxant qui inhibe le

relâchement de Ca2+ par le réticulum endoplasmique, dans le milieu d’incubation diminue le transport

du glucose induit par la contraction musculaire ex vivo dans le muscle soléaire de rat. Des résultats

similaires furent obtenus dans les muscles épitrochléen et soléaire de rat avec l’ajout d’inhibiteurs

des protéines kinases Ca2+/calmoduline-dépendante (CAMK), le KN62 et le KN93, suggérant

l’implication de la voie Ca2+/calmoduline (Ca2+/CaM) dans le transport du glucose induit par la

contraction musculaire [112, 113]. De plus, il fut démontré que la protéine CAMKII, dont l’activation

dépend de la formation du complexe Ca2+/CaM, est fortement exprimée dans le muscle squelettique

humain [114-116]. Son activité ainsi que la phosphorylation du résidu thréonine 287 (Thr287) dans le

muscle VL sont rapidement augmentées et maintenues en réponse à un exercice musculaire modéré

sur ergocycle ainsi que lors d’un sprint [117, 118]. Finalement, l’introduction d’un plasmide invalidant

la CAMKII par électroporation dans le muscle TA de souris diminue le transport du glucose induit par

une contraction musculaire ex vivo. Ni l’expression ni la phosphorylation de l’AMPK n’est affectée par

l’invalidation de la CAMKII [119]. L’ensemble de ces résultats suggère l’implication du Ca2+ dans la

régulation du transport du glucose induit par la contraction musculaire et ce, indépendamment de

l’AMPK contrairement à ce qui fut observé avec la caféine.

1.4.2 Protéine Kinase C

Des études préliminaires ont rapporté une augmentation de la translocation de la protéine kinase C

(PKC) et par conséquent, de son activité dans le muscle gastrocnémien de rat à la suite d’une

contraction in situ et ex vivo [120, 121]. De plus, les résultats obtenus par l’utilisation d’un inhibiteur

de la PKC, la calphostine C, suggérèrent que celle-ci participe au transport du glucose induit par la

16

contraction musculaire in situ chez le rat [122, 123]. La protéine kinase C (PKC) est une

sérine/thréonine kinase qui comporte plusieurs isoformes regroupées en trois catégories: les PCK

conventionnelles, les nouvelles PKC et les PKC atypiques. La classe des PKC conventionnelles

comprend 3 isoformes, α, β et γ. L’isoforme PKCα est la plus abondante dans le muscle squelettique.

Toutefois, le transport du glucose induit par une contraction musculaire ex vivo chez la souris

génétiquement modifiée pour l’invalidation de la PKCα est semblable à celui de la souris contrôle. De

plus, l’effet des inhibiteurs de la classe des PKC conventionnelles, dont la calphostine C, sur le

transport du glucose est le même chez les deux phénotypes de souris [124].

Comparativement aux résultats obtenus chez les modèles animaux, aucune augmentation de

l’activité des PKC conventionnelles ne fut observée à la suite d’une séance d’exercice modéré sur

ergocycle dans le muscle VL chez l’humain. Par contre, une augmentation de l’activité des PKC

atypiques fut mesurée [125-127]. La classe des PKC atypiques comprend deux isoformes, zêta (ζ) et

lambda (λ). L’expression de l’isoforme PKCλ, l’homologue de l’isoforme PKCι chez l’humain,

prédomine dans le muscle squelettique de souris. Une étude a rapporté que l’invalidation génétique

de l’isoforme PKCλ dans le muscle squelettique de souris n’affecte pas le transport du glucose induit

par un exercice sur tapis roulant suggérant que la PKCλ n’est pas un médiateur de la régulation du

transport du glucose induit par la contraction musculaire [128].

1.4.3 Les protéines kinases activées par les facteurs mitogènes

Parmi les protéines kinases activées par les facteurs mitogènes (MAPK), la MAPK3 (ou ERK1), la

MAPK1 (ou ERK2), la p38 MAPK et la protéine kinase c-Jun-N-terminale (JNK) sont activées par la

contraction musculaire. Néanmoins, il fut rapporté que l’invalidation chimique ou génétique des

protéines ERK1, EKR2 et JNK n’altère pas le transport du glucose induit par la contraction

musculaire [129-131].

En contrepartie, l’utilisation d’un l’inhibiteur de la p38 MAPK, le SB203580, suggéra l’implication de

cette protéine dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire. En effet, une

diminution du transport du glucose fut observée dans les muscles EDL et soléaire de souris soumis à

une stimulation électrique en présence de SB203580 [132]. Par contre, des études subséquentes ont

démontré que le SB203580 se liait directement au GLUT4 rendant ainsi laborieuse l’interprétation

17

des résultats obtenus par l’utilisation de cet inhibiteur [133, 134]. De plus, il fut rapporté que la

surexpression de l’isoforme p38MAPKγ par électroporation dans le muscle TA de souris augmente le

transport basal du glucose, mais le transport du glucose induit par la contraction musculaire tend à

diminuer. Encore une fois, l’interprétation de ces résultats demeure ardue puisque la surexpression

de la p38MAPKγ diminue l’expression des GLUT4 [135].

1.4.4 Monoxyde d’azote

La synthase de monoxyde d’azote (NOS de l’anglais nitric oxyde synthase) est une protéine qui

produit le monoxyde d’azote (NO) à partir de la L-arginine et de l’oxygène [136]. Il existe trois formes:

la forme neurale (nNOS), la forme endothéliale (eNOS) et la forme inductible (iNOS). Le muscle

squelettique exprime chacune des trois isoformes. Néanmoins, cette dernière est très peu exprimée

dans le muscle squelettique sain [137-142]. La contraction musculaire augmente l’activité de la sous-

unité μ de nNOS (nNOSμ) et de eNOS dans le muscle squelettique de rat tandis que seule l’isoforme

nNOSμ est augmentée dans le muscle squelettique humain [143, 144]. Il fut démontré que

l’administration d’un compétiteur de L-arginine qui inhibe la production de NO, le L-N-monométhyl-

arginine (L-NMMA), diminue la captation du glucose au cours d’un exercice modéré sur ergocycle

chez l’humain. À l’inverse, l’infusion simultanée de L-arginine rétablit la captation du glucose à des

niveaux semblables à ceux des sujets contrôles [145]. Toutefois, il fut rapporté que l’infusion de L-

NMMA au cours d’un travail musculaire de faible intensité n’affecte pas le transport du glucose dans

le muscle VL chez l’humain [146]. Des études chez le rat et la souris ont également démontré une

réduction du transport du glucose induit par la contraction musculaire ex vivo et in situ ainsi que par

un exercice sur tapis roulant en présence d’inhibiteurs de NOS. Fait intéressant, l’étude menée chez

la souris suggère que l’effet du NO sur le transport du glucose serait plus important dans le muscle

EDL comparativement au muscle soléaire [147-150]. En contrepartie, certaines études chez les

animaux n’ont rapporté aucune altération du transport du glucose induit par la contraction musculaire

en présence d’inhibiteurs de NOS [151, 152].

1.4.5 Espèces réactives de l’oxygène

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS de l’anglais reactive oxygen species) sont continuellement

produites, entre autre, par le muscle squelettique et leur production s’accroît lors de la contraction

musculaire. La production de ROS par le muscle squelettique est associée à la fatigue musculaire.

18

D’ailleurs, l’utilisation d’un antioxydant, le N-acétylcystéine (NAC), retarde la fatigue musculaire lors

d’exercices physiques [153]. Une étude a démontré que la présence de NAC dans le milieu

d’incubation lors d’une contraction musculaire ex vivo diminue le transport de glucose de moitié dans

le muscle EDL de souris [154]. Par contre, des études menées chez l’humain et le rat ont démontré

que l’infusion de NAC simultanément à un travail musculaire d’intensité modérée n’affecte pas le

transport du glucose induit par ce dernier [155, 156].

1.4.6 Rac1

Parallèlement à l’insuline, il fut récemment rapporté qu’un exercice physique sur tapis roulant active

Rac1 dans les muscles gastrocnémien et soléaire chez la souris et chez l’humain. De plus, le

transport du glucose induit par un protocole de contraction musculaire ex vivo est diminué dans les

muscles EDL et soléaire des souris génétiquement invalidées pour Rac1. Il s’agit d’une nouvelle

piste qui demande à être approfondie afin de préciser le rôle de Rac1 dans le transport du glucose

induit par la contraction musculaire [157].

1.4.7 Substrats d’Akt

Au cours des dernières années, plusieurs études ont suggéré que les TBC1D4 et TBC1D1 sont le

point de convergence entre la voie de signalisation de l’insuline et la voie de signalisation de la

contraction musculaire qui mène à la translocation des GLUT4 et par conséquent, l’entrée massive

de glucose dans la cellule musculaire.

1.4.7.1 TBC1D4

Chez l’humain, plusieurs études ont démontré une augmentation de la phosphorylation de TBC1D4

en réponse à des exercices d’endurance d’intensité modérée comparativement à des exercices de

courte durée à haute intensité ou à des exercices de résistance musculaire. En effet, il fut rapporté

que la protéine TBC1D4 est phosphorylée dans le muscle VL chez l’humain à la suite d’une séance

d’entraînement modéré sur ergocycle, mais cette augmentation de la phosphorylation de TBC1D4

n’est observable qu’à partir de quarante minutes d’exercice. Bien qu’aucune augmentation de

TBC1D4 ne soit mesurée immédiatement à l’arrêt d’exercices de courte durée ou de résistance

musculaire, des études suggèrent une augmentation de la phosphorylation de certaines sérines

(Ser318, Ser341, Ser751) dans les heures subséquentes [87, 158-161]. Des résultats similaires

19

furent observés à la suite de deux heures de nage chez le rat. Plus intéressant encore, la

phosphorylation de TBC1D4 était toujours mesurable dans les vingt-sept heures suivant l’arrêt de

l’exercice [162, 163].

Chez la souris surexprimant une forme mutante des Ser318, Ser588, Ser751 et Thr642 de TBC1D4

(4P), une diminution du transport du glucose induit par la contraction musculaire fut observée

suggérant l’implication de cette protéine [84]. Il fut également rapporté que l’introduction d’un

plasmide mutant pour le domaine liant à la calmoduline (de l’anglais calmodulin binding domain,

CBD) de TBC1D4 dans le muscle TA de souris par électroporation diminue le transport du glucose

induit par la contraction musculaire. De plus, la combinaison des deux plasmides mutants (4P+CBD)

n’a pas d’effet additif sur la diminution du transport du glucose [164]. Néanmoins, le transport du

glucose induit par la contraction musculaire n’est pas affecté chez la souris TBC1D4 T649 KI [165].

Aussi, l’inhibition de la phosphorylation de TBC1D4 par un inhibiteur de la PI3K, la wortmannine,

n’altère pas le transport du glucose induit par une contraction musculaire ex vivo dans le muscle

épitrochléen de rat [166].

Il est important de prendre en compte que dans les études précédentes chez des modèles murins, la

phosphorylation de TBC1D4 est augmentée à la suite de protocoles d’exercices musculaires de

courte durée, ce qui ne semble pas être nécessairement le cas dans les études effectuées chez

l’humain.

1.4.7.2 TBC1D1

La phosphorylation de TBC1D1 est également augmentée par des protocoles de contraction

musculaire in situ ou ex vivo chez le rat et contrairement à TBC1D4, la phosphorylation de TBC1D1

n’est pas inhibée par la wortmannine [86, 166]. Autre différence notoire, en plus de posséder un site

de phosophorylation dont le motif est reconnu par Akt (Thr590/Thr596), TBC1D1 possède des sites

de phosphorylation dont le motif est reconnu par l’AMPK soient la sérine 231 (Ser231), la sérine 660

(Ser660) et la sérine 700 (Ser700) chez la souris. Il fut démontré qu’un protocole de contraction ex

vivo et in situ chez la souris augmente significativement la phosphorylation de la Ser231 et de la

Ser660 dans les muscles EDL et TA. La phosphorylation de la Ser700 tend également à augmenter

tandis la phosphorylation de la Thr590 par la contraction musculaire semble accrue dans une étude

20

et inchangée dans une autre [91, 167]. De plus, une étude chez l’humain a démontré que la

phosphorylation de la Sérine 237, équivalent de la Ser231 chez la souris, est augmentée par des

exercices de courte durée (30 secondes-20 minutes) et d’intensité modérée à très élevée [168].

L’introduction d’un plasmide mutant de TBC1D1 pour les sites de phosphorylation reconnus par

l’AMPK par électroporation dans le muscle TA de souris diminue significativement le transport du

glucose induit par un protocole de contraction musculaire in situ [91, 169]. De plus, l’invalidation

génétique du gène TBC1D1 chez la souris diminue également le transport du glucose induit par un le

5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucléotide (AICAR) dans le muscle EDL de souris, un

activateur pharmacologique de l’AMPK connu pour induire la translocation des GLUT4 [92]. Ces

résultats suggèrent une interaction entre TBC1D1 et l’AMPK dans la régulation du transport de

glucose dans le muscle squelettique. D’ailleurs, certaines évidences tendent à démontrer l’implication

de l’AMPK dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire.

La figure 7 représente les différentes protéines proposées pour participer au transport du glucose

induit par la contraction musculaire.

Figure 7 Voies de signalisation de la contraction musculaire, tirée de [170]

2 AMPK L’année 1973 est associée à la découverte de l’AMPK alors que deux études indépendantes

rapportèrent l’existence d’une kinase pouvant phosphoryler et inhiber l’acétyl-coenzyme A

21

carboxylase (ACC) et l'hydroxyméthylglutaryl-CoA réductase (HMG-CoA reductase), deux enzymes

impliquées, respectivement, dans la synthèse des acides gras et du cholestérol [171, 172]. Il faudra

attendre 1989 pour que Carling et ses collaborateurs purifient cette enzyme et démontrent que cette

kinase responsable de la phosphorylation de l’ACC était en fait, la même que celle responsable de la

phosphorylation de l’HMG-CoA reductase [173]. Cette enzyme devint la kinase activée par l’AMP

(AMPK). Rapidement, l’AMPK fut reconnue comme un joueur clé dans la régulation du métabolisme

énergétique.

2.1 Structure et expression

L’AMPK est un sérine/thréonine kinase composée d’une sous-unité catalytique α et de deux sous-

unités régulatrices, β et γ [174, 175]. Le complexe hétérotrimère formé par ces trois sous-unités est

essentiel à la stabilité et l’activation de l’AMPK [176-178]. Chaque sous-unité présente différentes

isoformes (α1, α2, β1, β2, γ1, γ2, γ3) [178-182]. L’AMPK est exprimée de façon ubiquitaire dans tout

l’organisme, mais les complexes formés par les différentes isoformes varient selon le tissu et

l’espèce étudiés. Chez le rat et la souris, le complexe formé par les isoformes α2β2γ1 prédomine

dans le muscle squelettique. Le pourcentage d’expression des différents complexes de l’AMPK dans

les muscles EDL et soléaire de souris est présenté dans le tableau 2. Chez l’homme, les complexes

formés par α2β2γ1 et α1β2γ1 représentent quatre-vingt pourcent de l’AMPK totale et le complexe

α2β2γ3 représente le vingt pourcent restant dans le muscle squelettique [182-185].

Tableau 2 Expression des différents isoformes de l'AMPK dans les muscles EDL et soléaire de

souris, tiré de [186]

22

La sous-unité α contient un domaine catalytique où se trouve la boucle d’activation du résidu

thréonine 172 (Thr172) situé dans la région N-terminale. De plus, elle possède un domaine

autoinhibiteur et un domaine globulaire situé dans la région C-terminale qui interagit avec le domaine

C-terminal de l’isoforme β afin de former le complexe hétérotrimère [187-195]. La sous-unité α

contient également d’autres sites de phosphorylation dont la sérine 485 (Ser485) sur l’isoforme α1 et

son homologue sur l’isoforme α2, la sérine 491(Ser491) [196]. Les isoformes α1 et α2 sont toutes

deux exprimées dans le muscle squelettique de rat, mais l’isoforme α2 prédomine [197]. Des études

suggèrent que l’isoforme α2 serait localisée à l’intérieur et à l’extérieur du noyau cellulaire tandis que

l’isoforme α1 serait principalement localisée à l’extérieur du noyau cellulaire. Néanmoins, l’absence

totale de l’isoforme α1 à l’intérieur du noyau cellulaire n’est pas encore démontrée [198, 199].

La sous-unité β contient un site de myristoylation situé dans le domaine N-terminal, un module

central de liaison des carbohydrates, plus connu sous le nom de site de liaison du glycogène, et un

domaine C-terminal qui se lie aux sous-unités α et γ afin de former le complexe hétérotrimère [152,

176, 189, 190, 194-196, 200-206]. La sous-unité β possède également des sites de phosphorylation

dont les résidus sérine 24 (Ser24), sérine 25 (Ser25), sérine 108 (Ser108) et sérine 182 (Ser182)

[200]. Selon une étude, les isoformes β1 et β2 seraient localisées à l’intérieur et à l’extérieur du

noyau cellulaire [198]. Bien que chaque isoforme soit fortement exprimée, l’isoforme β2 prédomine

dans le muscle squelettique tant chez le rat que chez l’homme [181-185].

La sous-unité γ contient une région N-terminale avec ou non une extension de longueur variable

selon l’isoforme, un site d’interaction avec la sous-unité β et deux domaines Bateman formés par

deux paires de séquences cystathionine β-synthase (CBS) situés dans sa région C-terminale. On

dénombre donc quatre sites de CBS [190, 207-211]. L’isoforme γ1 s’exprime de façon ubiquitaire

tandis que l’expression de l’isoforme γ2 se limite aux muscles squelettiques et au muscle cardiaque.

L’isoforme γ3 ne s’exprime que dans le muscle squelettique [182, 208, 212]. La localisation de

l’isoforme γ1 serait davantage nucléaire comparativement aux deux autres isoformes [213].

Les structures des sous-unités de l’AMPK sont représentées dans la figure 8.

23

Figure 8 Structure de l'AMPK, tirée de [214]

2.2 Régulation de l’AMPK

2.2.1 Nucléotides de l’adénine

Tel que son nom l’indique, l’AMPK est une kinase activée par l’adénosine monophosphate (AMP),

mais plus particulièrement par l’augmentation du rapport AMP: ATP. L’AMP est un ribonucléotide

contenant des résidus d’adénine telles que l’adénosine diphosphate (ADP) et l’adénosine

triphosphate (ATP). En condition basale, les niveaux d’AMP sont relativement faibles puisque

l’adénylate kinase favorise la synthèse d’ADP.

ATP+AMP ↔ 2ADP

Néanmoins, la déplétion accélérée de l’ATP par un stress métabolique provoque l’augmentation du

rapport ADP: ATP et par conséquent, l’adénylate kinase favorise la réaction inverse, c’est-à-dire la

synthèse d’ATP et d’AMP. Ainsi, il y a augmentation des niveaux d’AMP et par le fait même, du

rapport AMP: ATP [215, 216].

Les quatre sites de CBS que contient l’isoforme γ facilitent la liaison des nucléotides de l’adénine.

Les sites CBS1 et 3 peuvent lier chacun des nucléotides tandis que le site CBS4 ne se lie qu’à

l’AMP. Des études suggèrent qu’en condition basale, les sites CBS1 et 3 seraient liés à l’ATP tandis

qu’en présence d’un stress métabolique, l’ADP et l’AMP compétitionneraient pour les sites de liaison

CBS1 et 3. La liaison de l’ADP ou de l’AMP à la sous-unité γ entraîne un changement de

24

conformation du complexe hétérotrimère et ainsi active l’AMPK [190, 191, 211]. L’activation

allostérique de l’AMPK dévoile le site de phosphorylation du résidu Thr172 et le rend ainsi

inaccessible aux protéines phosphatases 2A et 2C (PP2A et PP2C) responsables de la

déphosphorylation de la sous-unité catalytique α [191, 205, 217-220].

2.2.2 AMPKK

La phosphorylation du résidu Thr172 sur la boucle de la sous-unité α par les AMPK kinases

(AMPKK) est essentielle à l’activation maximale de l’AMPK [221]. L’identification des deux premières

AMPKK, la liver kinase B1 (LKB1) et la Ca2+/calmodulin dependent protein kinase kinase (CAMKK),

fit suite à la démonstration par Sutherland et ses collaborateurs de trois kinases Tos3, Sak1 et Elm1

responsables de l’activation du complexe sucrose non-fermenting 1 (SNF1), ortologue de l’AMPK

chez la levure [222-224]. Outre le fait que la séquence du domaine catalytique de la LKB1

correspondait à celle des trois kinases identifiées chez la levure, LKB1 présentait des similitudes de

séquences sur la boucle d’activation de la Thr172 laissant présager un rôle en amont de l’AMPK

[224, 225].

2.2.2.1 LKB1

LKB1 est une sérine/thréonine kinase qui fut d’abord identifiée comme un gène suppresseur de

tumeurs dont la mutation est associée au syndrome de Peutz-Jeghers [226, 227]. Hawley et ses

collaborateurs furent les premiers à démontrer que la LKB1 active directement l’AMPK grâce à

l’utilisation de cellules cancéreuses humaines (HeLa). L’activation de l’AMPK par la phenformine, un

médicament de la famille des biguanides, et par l’AICAR est abolie dans les cellules HeLa

génétiquement modifiées pour le gène LKB1. La réintroduction du gène actif de la LKB1 dans les

cellules HeLa génétiquement modifiées rétablit l’activation de l’AMPK par ces deux composés [223].

Des résultats similaires furent observés dans des cellules embryonnaires fibroblastiques de souris

(MEF) génétiquement invalidées pour LKB1 [223-227].

LKB1 forme un complexe hétérotrimère avec les protéines STRAD (α/β) et MO25 (α/β) [228, 229]. Il

fut démontré que LKB1 serait responsable de la phosphorylation et de l’activation de treize kinases

dont l’AMPK, maintenant regroupées sous le nom de l’AMPK-related kinase family (ARK) [230].

Récemment, il fut proposé qu’un changement de localisation subcellulaire de LKB1 soit responsable

25

de la phosphorylation du résidu Thr172 d’AMPK dans le muscle squelettique et dans les cellules L6

[231, 232]. De plus, il fut démontré que l’invalidation génétique du site de farnélysation du résidu

cystéine433 de la protéine LKB1 chez la souris (LKB1C433S/C433S KI) diminue l’activité basale de

l’AMPK ainsi que son activation pharmacologique (AICAR) et physiologique (contraction musculaire)

dans le muscle EDL [233]. Ces résultats corroborent ceux obtenus chez la souris invalidée

génétiquement pour LKB1 dans le muscle squelettique où une forte diminution de l’activation de

l’AMPK par AICAR, la phenformine et la contraction musculaire avaient été démontrée. Cette même

étude suggéra que l’activation de l’isoforme AMPKα2 serait davantage dépendante de LKB1

comparativement à l’isoforme AMPKα1 [234].

2.2.2.2 CAMKK

L’activation de l’AMPK par la CAMKK fut étudiée pour la première fois en 1995. Néanmoins, les

résultats obtenus ne parvinrent pas à conclure que la CAMKK activait l’AMPK de façon significative

[219]. Il fallut attendre une décennie pour que des études démontrent le contraire. En effet,

l’activation de l’AMPK par le A23187, un ionophore calcique, fut rapportée dans les cellules HeLa.

Cette activation était bloquée par le STO-609, un inhibiteur spécifique de la CAMKK [235]. Deux

autres études indépendantes rapportèrent également l’activation de l’AMPK par l’ionomycine, un

ionophore calcique sélectif. Cette activation était abolie par la présence de STO-609, mais maintenue

dans les cellules HeLa génétiquement invalidées pour LKB1 [236, 237]. Ces études permirent de

reconnaître la CAMKK comme une seconde AMPKK.

Il existe deux isoformes de la CAMKK, la CAMKKα et la CAMKKβ. Les études démontrent la

présence de l’isoforme CAMKKα dans le muscle squelettique des modèles animaux tandis qu’une

première étude avait échoué à détecter la présence de l’isoforme CAMKKβ. Néanmoins, des études

subséquentes l’ont détecté [238-240]. Entre autre chose, l’augmentation de l’activité de la CAMKKβ

fut observée lors du développement hypertrophique des fibres musculaires des muscles

gastrocnémien et soléaire en réponse à un programme d’entraînement en résistance [241]. De plus,

il fut rapporté que la surexpression d’une forme constitutivement active de la CAMKKα dans le

muscle squelettique de souris augmente la phosphorylation du résidu Thr172 de l’AMPK [242].

26

2.2.2.3 TAK1

Momcilovic et ses collaborateurs furent les premiers à démontrer la régulation de l’AMPK par la

Transforming growth factor-β- activated kinase 1 (TAK1) [243]. TAK1 est une sérine/thréonine kinase

appartenant à la famille des protéines kinases activées par les facteurs mitogènes (MAP3K) [244].

TAK1 est une protéine qui contient un domaine de liaison à une protéine adaptatrice TAB1 dans sa

région N-terminale et un domaine de liaison aux protéines adaptatrices TAB2 et TAB3 dans sa région

C-terminale [245, 246].

TAK1 est sensible aux variations du rapport AMP: ATP induites par un traitement AICAR ou

metformine, deux activateurs de l’AMPK. Entre autre chose, il fut démontré que l’inhibition de TAK1

dans le muscle cardiaque prévient la phosphorylation de l’AMPK sur la Thr172 par un traitement à la

metformine [247]. Néanmoins, l’implication de TAK1 dans la régulation de l’activité de l’AMPK dans le

muscle squelettique reste à démontrer. L’expression des protéines TAK1 et TAB1 fut rapportée dans

le muscle squelettique de souris [241].

Les différentes protéines proposées pour réguler l’AMPK sont représentées à la figure 9.

Figure 9 Régulation de l'AMPK, tirée et modifiée de [248]

2.3 Activation de l’AMPK

2.3.1 Activateurs pharmacologiques

Afin de mieux comprendre les mécanismes qui régissent l’activation de l’AMPK, mais également son

rôle dans l’organisme, l’emploi d’agents pharmacologiques fut indispensable. Parmi ces agents, nous

27

y retrouvons des composés chimiques, mais également des médicaments et des produits naturels

utilisés depuis de nombreuses années bien avant la découverte de l’AMPK.

2.3.1.1 AICAR

Le groupe de Van de Berghe fut le premier à utiliser l’AICAR afin d’activer l’AMPK [249]. L’AICAR est

un nucléoside transporté à l’intérieur de la cellule par les transporteurs d’adénosine où il sera

converti en 5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-ribofuranosyl monophosphate (ZMP) par

l’adénosine kinase [250]. Le ZMP mime l’effet de l’AMP de par sa capacité à se lier sur le site CBS3

de la sous-unité AMPKγ. Cette liaison active l’AMPK, mais son pouvoir activateur est beaucoup plus

faible que celui de l’AMP [251]. De nombreuses études rapportent l’activation de l’AMPK par AICAR

dans le muscle squelettique in vitro et in vivo. Néanmoins, l’AICAR n’est pas un activateur spécifique

de l’AMPK. Entre autre chose, il fut également démontré que l’AICAR active la glycogène

phosphorylase (GP) et la fructose-1,6-bisphosphatase [252, 253].

2.3.1.2 Metformine

La metformine est un médicament de la famille des biguanides utilisé pour le traitement du diabète

de type 2 depuis 1957. La metformine est reconnue pour diminuer la glycémie, le taux de lipides

sanguins ainsi qu’augmenter la sensibilité à l’insuline chez les patients atteints de diabète de type 2

[254]. Bien que son mécanisme d’action ne soit pas totalement élucidé, sa capacité à activer l’AMPK

fut démontrée par plusieurs groupes. Malgré le fait que la principale cible de la metformine semble le

foie, il fut également rapporté que la metformine active l’AMPK dans le muscle squelettique de rat

ainsi que dans le muscle squelettique humain [255, 256].

Il fut également démontré que la metformine inhibe le complexe 1 de la chaîne respiratoire suggérant

une activation de l’AMPK déclenchée par l’augmentation des rapports ADP: ATP et AMP: ATP [257,

258]. Cette hypothèse fut corroborée récemment par une étude qui observa une augmentation du

rapport ADP: ATP par la metformine. De plus, aucune activation de l’AMPK par la metformine ne fut

mesurée dans les cellules génétiquement modifiées pour le site CBS3 de la sous-unité AMPK γ

[259]. Aussi, l’invalidation de LKB1 dans le muscle squelettique de souris prévient l’activation de

l’isoforme AMPKα2 par la phenformine bien que l’activité de LKB1 ne soit modulée ni par la

metformine ni par la phenformine [234, 260].

28

2.3.1.3 Thiazolidinediones

La rosiglitazone, la pioglitazone ainsi que la troglitazone font partie des thiazolidinediones, une

famille de médicaments dont certains sont prescrits dans le traitement du diabète de type 2 [261-

263]. Les thiazolidinediones sont connues pour leurs effets hypoglycémiants [264]. L’activation du

récepteur des proliférateurs de peroxysomes gamma (PPARγ) suivie du relâchement d’adiponectine,

une hormone sécrétée par le tissu adipeux, est connue pour améliorer la sensibilité à l’insuline chez

des animaux insulino-résistants traités au pioglitazone. La sécrétion d’adiponectine en réponse à

l’activation des PPARγ serait un mécanisme d’action responsable des effets bénéfiques des

thiazolidinediones au niveau du foie, mais non au niveau du muscle squelettique [265].

Une activation rapide de l’AMPK fut observée dans le muscle squelettique de rat traité à la

troglitazone ainsi qu’à la pioglitazone [261]. Selon certaines études, l’inhibition du complexe 1 de la

chaîne respiratoire et par conséquent, l’augmentation du rapport ADP: ATP serait partiellement

responsable de cette activation tel qu’observé dans le cas de la metformine [259, 262, 266]. De plus,

il fut rapporté que l’activation de l’AMPK par les thiazolidinediones dans le muscle squelettique des

souris génétiquement invalidées pour l’adiponectine (AdnKO) est diminuée. Toutefois, les niveaux

initiaux de la phosphorylation ainsi que l’activité de l’AMPK tendent à être augmentés chez les souris

AdnKO [267]. Finalement, il fut récemment observé que l’adiponectine entraîne la translocation de

LKB1 du noyau cellulaire vers le cytoplasme et par conséquent, l’activation de l’AMPK dans les

cellules L6 [232].

2.3.1.4 A-769662

En 2006, les laboratoires Abbott ont caractérisé un nouvel activateur synthétique de l’AMPK nommé

A-769662, une petite molécule de la famille des thiénopyridines. À l’instar de la metformine et des

thiazolidinediones, l’étude préliminaire menée sur cette nouvelle molécule démontra des résultats

prometteurs pour un éventuel traitement du diabète de type 2. En effet, l’injection intrapéritonéale de

cette molécule augmenta l’oxydation des lipides chez le rat sain. Chez un modèle de souris obèses,

l’injection de l’A-769662 diminua le gain de poids corporel, les niveaux sanguins de glucose et de

triglycérides ainsi que les niveaux d’expression hépatique de la phosphoénolpyruvate carboxykinase

(PEPCK), de la glucose-6-phoshatase (G6Pase) et de l’acide gras synthase (FAS de l’anglais fatty

acid synthase) [268]. En 2012, des résultats similaires furent rapportés par l’injection de salicylate, un

29

médicament utilisé pour abaisser la fièvre et diminuer l’inflammation. Le salicylate activerait

directement l’AMPK de la même manière que l’A-769662 [269].

Il fut proposé que l’A-769662 active la Ser108 de la sous-unité AMPKβ1 [270, 271]. Cette liaison

entraînerait un changement de conformation du complexe hétérotrimère, activerait l’AMPK,

indépendamment de l’AMP, et empêcherait sa déphosphorylation par les phosphatases PP2C [272].

Néanmoins, la biodisponibilité du composé A-769662 dans le muscle squelettique est très faible

comparativement aux autres tissus, particulièrement au niveau du foie [268]. L’activation de la sous-

unité AMPKβ1 par le A-769662 fut observée dans les muscles EDL et soléaire chez la souris [273].

2.3.1.5 Composés naturels

Au cours des dernières années, plusieurs composés naturels furent l’objet d’études dus, entre autre

chose, à leur capacité à activer l’AMPK. Parmi ceux-ci, il fut démontré que le resvératrol, un

polyphénol de la classe des stilbènes, augmente la phosphorylation et l’activité de l’AMPK dans le

muscle squelettique de la souris et de l’humain [274, 275]. De plus, la berbérine, une molécule

extraite des végétaux fréquemment utilisée dans la médecine traditionnelle chinoise pour traiter le

diabète de type 2, fut rapportée pour activer l’AMPK dans les cellules musculaires L6 ainsi que dans

les muscles épitrochléen et soléaire de rat [276, 277]. Il fut suggéré que, le resvératrol et la

berbérine, activent l’AMPK par l’augmentation du rapport AMP: ATP causée par l’inhibition de l’ATP

synthétase de type F1 et du complexe 1 de la chaîne respiratoire, respectivement [278, 279].

2.3.2 Activation par la contraction musculaire

L’AMPK est un senseur du métabolisme énergétique qui a pour fonction de maintenir l’homéostasie

cellulaire. Ainsi, toutes variations physiologiques des rapports AMP: ATP et ADP: ATP causées par

un stress énergétique activent l’AMPK. L’activation de l’AMPK stimule les voies cataboliques

impliquées dans la synthèse d’ATP. L’hypoxie, l’ischémie, la restriction calorique, les chocs

osmotiques et thermiques ainsi que l’exercice physique sont tous des facteurs physiologiques de

stress énergétiques.

L’une des découvertes majeures entourant l’AMPK fut son activation par la contraction musculaire

ainsi que par l’exercice physique tant chez le rongeur que chez l’humain [280-285]. Chez l’humain,

http://fr.wikipedia.org/wiki/Polyph%C3%A9nol

30

un exercice physique active en premier lieu, le complexe AMPKα2β2γ3 dans le muscle squelettique

suivi du complexe AMPKα2β2γ1 lorsque l’exercice se prolonge au-delà de soixante minutes [159,

286]. Lors de la contraction musculaire, de nombreux facteurs peuvent expliquer l’activation de

l’AMPK dont un changement du statut énergétique qui se traduit par une augmentation du rapport

AMP: ATP, l’augmentation des niveaux intracellulaires de Ca2+, l’induction des espèces réactives de

l’oxygène (ROS) ainsi que le relâchement d’hormones, de cytokines et de facteurs de croissance.

2.3.2.1 Statut énergétique

La contraction musculaire augmente considérablement la demande énergétique [287]. Cette grande

consommation d’ATP par la contraction musculaire entraîne une augmentation du ratio AMP: ATP et

par conséquent, l’activation allostérique de l’AMPK de par la liaison de l’AMP à la sous-unité γ.

Certaines études suggèrent que LKB1 serait l’AMPKK responsable de la phosphorylation de la

Thr172 et ainsi de l’activation maximale de l’AMPK par la contraction musculaire. En effet, l’activation

de l’AMPKα2 est considérablement inhibée dans les muscles TA et EDL des souris LKB1 KO bien

que les rapports AMP: ATP et ADP: ATP soient augmentés en réponse à des contractions

musculaires de haute intensité [234, 288, 289]. Pour sa part, l’augmentation de l’activité de l’isoforme

AMPKα1 par la contraction musculaire demeure controversée. Il fut rapporté que ni une contraction

musculaire ex vivo ni une contraction musculaire in situ n’augmente significativement l’activité de

l’isoforme AMPKα1 dans les muscles EDL, TA et gastrocnémien [234, 290]. Néanmoins, une autre

étude a démontré l’augmentation de l’activité de l’isoforme AMPKα1 en réponse à une contraction ex

vivo de courte durée et de faible intensité dans le muscle épitrochléen de rat. Aucun changement du

rapport AMP: ATP ne fut observé lors de ce protocole de contraction [291].

2.3.2.2 Calcium

Tel que précédemment discuté dans la section 1.4.1, lors de la contraction musculaire, une grande

quantité de Ca2+ contenu dans les citernes terminales du réticulum sarcoplasmique est relâchée

dans le sarcoplasme. L’interaction entre le Ca2+ et la calmoduline active une autre AMPKK, la

CAMKK. Il fut démontré qu’un protocole de contraction musculaire in situ augmente l’activité de la

CAMKKβ dans le muscle gastrocnémien de rat. De plus, cette même étude a rapporté une diminution

de l’activité de l’isoforme AMPKα2 induite par la contraction musculaire en présence d’un inhibiteur

spécifique de la CAMKK, le STO-609 [239]. Des résultats similaires furent obtenus avec l’utilisation

31

du KN-93, un inhibiteur de la Ca2+/CaM. En effet, il fut également rapporté que la phosphorylation de

la Thr172 et l’activité des deux isoformes AMPKα sont inhibées par la contraction musculaire ex vivo

de faible intensité et de courte durée dans les muscles EDL et soléaire de souris traitées

préalablement avec le KN-93 [238].

2.3.2.3 Espèces réactives de l’oxygène

Certains groupes de recherche ont également étudié l’activation de l’AMPK par les ROS lors de la

contraction musculaire. Une augmentation de l’activité de l’AMPKα1 dans le muscle épitrochléen de

rat fut rapportée lors d’un traitement au H2O2 bien qu’aucune modification du ratio AMP: ATP ne fut

observée. Cet effet fut bloqué par un antioxydant, le N-acétylcystéine [292]. Dans le même ordre

d’idée, une réduction de cinquante pourcent de la phosphorylation et de l’activité de l’AMPK fut

démontrée lors d’un protocole de contraction musculaire ex vivo dans le muscle EDL de souris

incubé en présence de N-acétylcystéine [154].

2.3.2.4 Interleukine-6

Finalement, la contraction musculaire induit également l’augmentation des niveaux sanguins de

certaines hormones, de facteurs de croissance et de cytokines dont l’interleukine-6 (IL-6). IL-6 est

une cytokine impliquée dans le système immunitaire et le processus inflammatoire dont le rôle

physiologique demeure controversé. Certaines études rapportent un rôle pro-inflammatoire tandis

que d’autres suggèrent plutôt l’inverse. En effet, depuis quelques années, IL-6 est également

reconnue comme une myokine, c’est-à-dire une cytokine induite et relâchée par le muscle

squelettique. Par ailleurs, une augmentation des concentrations plasmatiques en IL-6 fut observée à

la suite d’une contraction musculaire tant chez l’humain que chez le rongeur [293-295]. Une

augmentation de la phosphorylation de l’AMPK fut démontrée dans le muscle EDL de rat traité avec

IL6 ex vivo. Une forte diminution de la phosphorylation de l’AMPK fut également observée à la suite

d’un exercice physique chez la souris dont le gène IL6 fut génétiquement invalidé (IL6 KO)

comparativement à la souris contrôle [295]. De plus, une augmentation des niveaux intracellulaires

de Ca2+ fut rapportée à la suite d’un traitement avec IL6 dans des cellules musculaires de souris

suggérant l’implication de la CAMKK dans l’activation de l’AMPK par IL6 [296].

32

2.4 Régulation du transport du glucose dans le muscle

squelettique

Dès 1997, Merrill et ses collaborateurs démontrèrent que l’AMPK est impliquée dans le transport du

glucose stimulé par AICAR dans le muscle squelettique. Ils observèrent une augmentation de

l’AMPK ainsi qu’une augmentation du transport du glucose dans le muscle gastrocnémien de rat à la

suite d’une perfusion des membres inférieurs avec l’AICAR [297]. Ces résultats furent corroborés par

un autre groupe à la suite d’un traitement AICAR ex vivo du muscle épitrochléen de rat. De plus,

cette même étude démontra une augmentation de l’activité de l’AMPK en réponse à une stimulation

électrique ex vivo du muscle épitrochléen ainsi qu’une augmentation du transport du glucose. La

stimulation électrique du muscle épitrochléen suivie d’un traitement à l’insuline présentait des effets

additifs au niveau du transport du glucose tandis qu’une stimulation électrique suivie d’un traitement

AICAR n’en présentait pas [298]. En 2001, Mu et ses collaborateurs créèrent le premier modèle

murin transgénique d’invalidation de l’AMPK spécifique aux muscles squelettiques et cardiaque en

surexprimant une forme inactive de l’isoforme AMPKα2 inhibant ainsi son activité (souris AMPK

KD1). Le transport du glucose induit par l’AICAR fut aboli dans le muscle EDL des souris AMPK KD1.

Ils observèrent également une diminution partielle du transport du glucose en réponse à une

stimulation électrique ex vivo et à une stimulation électrique in situ dans le muscle EDL des souris

AMPK KD1 [299]. L’ensemble de ces résultats suggérèrent un rôle pour l’AMPK dans le transport du

glucose dans le muscle squelettique. Les études qui ont utilisé d’autres activateurs

pharmacologiques de l’AMPK dont la metformine et le A-769662 ont d’autant plus démontré

certaines évidences de l’implication de l’AMPK dans les effets de ces composés sur le transport du

glucose. Néanmoins, l’implication de l’AMPK dans le transport du glucose induit par la contraction

musculaire demeure controversée. Plusieurs modèles transgéniques de l’AMPK furent générés afin

de répondre à cette question.

2.4.1 Modèles transgéniques des sous-unités catalytiques de l’AMPK

2.4.1.1 Souris AMPK KD1

Tel que précédemment mentionné, le premier modèle transgénique de l’AMPK (AMPK KD1) fut

généré par Mu et ses collaborateurs. Il s’agit d’une surexpression d’une forme inactive de l’isoforme

AMPKα2 spécifique aux muscles squelettiques et cardiaque inhibant ainsi l’activité AMPKα2. Chez

ce modèle, le transport du glucose induit par un traitement AICAR ex vivo est inhibé dans le muscle

33

EDL. Cette donnée suggéra que l’isoforme AMPKα2 soit responsable des effets bénéfiques d’un

traitement AICAR au niveau du transport du glucose dans le muscle squelettique. Une diminution de

quarante pourcent du transport du glucose fut également observée dans le muscle EDL de la souris

AMPK KD1 comparativement au muscle contrôle en réponse à un protocole de contraction ex vivo.

Le transgène n’a aucun effet sur le transport du glucose stimulé par l’insuline. De plus, une

diminution de trente pourcent du transport du glucose fut rapportée dans le muscle EDL de la souris

AMPK KD1 en réponse à un protocole de contraction in situ. Le transport du glucose dans le muscle

soléaire est également diminué de façon significative, mais dans une moindre mesure. Il est à noter

que ce modèle transgénique présente également une force musculaire absolue réduite ainsi qu’une

diminution de l’activité physique volontaire quotidienne.[299, 300].

Récemment, une seconde étude a également démontré un défaut au niveau du transport du glucose

dans le muscle gastrocnémien de la souris AMPK KD1 en réponse à un protocole de contraction

musculaire in situ [301]. Toutefois, un autre groupe n’a observé aucun défaut chez cette même lignée

de souris dans les muscles EDL et soléaire à la suite d’un protocole de contraction ex vivo [149]. En

complément, une étude a voulu tester le rôle de l’AMPK dans le transport du glucose induit par un

exercice physique in vivo sur tapis roulant. Trois protocoles d’exercices furent élaborés. Le premier

protocole était identique pour les deux génotypes de souris. Néanmoins, puisque la souris AMPK

KD1 présente une diminution de sa capacité physique à l’exercice, les deux autres protocoles furent

élaborés en fonction du pourcentage de la vitesse maximale prédéterminée pour chaque sujet, soit

trente pourcent et soixante-dix pourcent. Aucune différence ne fut observée au niveau de la clairance

du glucose dans les muscles quadriceps et gastrocnémien en réponse à chacun des trois protocoles.

Les seules différences significatives rapportées entre les deux génotypes furent des niveaux de

glycogène plus faibles avant et après chaque protocole d’exercice chez la souris AMPK KD1 ainsi

qu’une diminution du contenu musculaire en GLUT4. Toutefois, le pourcentage de GLUT4 qui subit

une translocation à la membrane en réponse au protocole d’exercice est similaire chez les deux

génotypes [302]. D’un autre côté, une toute autre conclusion fut rapportée par un groupe ayant

également testé les souris AMPK KD1 sur tapis roulant. En effet, une diminution de la captation du

glucose dans le muscle gastrocnémien de ces souris fut rapportée en réponse à un protocole

d’exercice sur tapis roulant comparativement aux souris contrôles [303].

34

2.4.1.2 Souris AMPK α2i TG

Une autre lignée transgénique d’invalidation de la sous-unité catalytique α2 dans le muscle

squelettique fut générée, soit la souris AMPK α2i TG. L’activité basale de l’isoforme α2 ainsi que son

activation par un traitement AICAR dans le muscle EDL sont fortement réduites par le transgène.

Néanmoins, l’activité basale de l’isoforme α1 n’est pas affectée par le transgène et son activation par

un traitement AICAR est partiellement diminuée. Le transport du glucose induit par un traitement

AICAR est aboli dans le muscle EDL des souris. En complément, le muscle EDL des souris AMPK

α21TG fut soumis à un premier protocole de contraction ex vivo. Une faible diminution, mais

significative, du transport du glucose fut observée. Néanmoins, tel qu’observé chez la souris AMPK

KD1, les souris AMPK α2i TG génèrent une force musculaire absolue plus faible que les souris

contrôles. Afin de contrer ce facteur, certains paramètres du protocole de contraction musculaire

furent modifiés dont le voltage qui fut ajusté à la baisse pour les souris contrôles afin que la force

générée par le muscle EDL soit identique à celle des souris AMPK α2i TG. Sous ces nouveaux

paramètres, le transport du glucose induit par la contraction musculaire dans le muscle EDL est

identique chez les deux génotypes de souris. Des résultats identiques furent obtenus à la suite d’un

protocole de contraction musculaire in situ. L’ensemble des résultats obtenus par ce modèle

transgénique suggèrent que l’AMPK n’est pas impliquée dans le transport du glucose induit par la

contraction musculaire [290].

2.4.1.3 Souris AMPKα1/α2 KO

Des modèles transgéniques de suppression totale des sous-unités catalytiques α1 et α2 dans tout

l’organisme furent également générés (AMPK α2KO et AMPK α1KO). Chez la souris AMPK KOα2,

l’effet hypoglycémiant en réponse à un traitement AICAR est diminué. De plus, cette souris se

caractérise par une intolérance au glucose et une résistance à l’insuline comparativement à la souris

contrôle. Sans surprise, le transport du glucose induit par un traitement AICAR est inhibé dans les

muscles EDL et soléaire des souris AMPK α2KO. Néanmoins, aucun défaut au niveau du transport

du glucose ne fut observé dans le muscle EDL et soléaire en réponse à un protocole de contraction

ex vivo chez les souris AMPK α2KO. Par contre, il faut tenir compte de l’augmentation de

l’expression de l’isoforme α1 dans les muscles EDL et soléaire des souris AMPK α2KO. De plus, il fut

rapporté que l’activité de l’AMPKα1 est doublée à la suite du protocole de contraction

35

comparativement à la souris contrôle. Ces résultats suggèrent une compensation de l’isoforme α1

dans les muscles de la souris AMPK KOα2 [304, 305].

Comparativement aux souris AMPK KOα2, aucune intolérance au glucose et aucune résistance à

l’insuline ne furent observées chez les souris AMPK KOα1. De plus, le transport du glucose stimulé

par un traitement AICAR n’est pas altéré dans les muscles EDL et soléaire par l’absence de

l’isoforme AMPKα1. Néanmoins, une diminution d’environ vingt-cinq pourcent du transport du

glucose fut mesurée dans le muscle soléaire des souris AMPK KOα1 en réponse au protocole de

contraction ex vivo [305].

2.4.1.4 Souris AMPKα1α2 mdKO

Récemment, un nouveau modèle transgénique d’invalidation concomitante des sous-unités

catalytiques α1 et α2 spécifique au tissu musculaire (AMPKα1α2 mdKO) fut étudié. Tel que

préalablement décrit chez d’autres modèles d’invalidation génétique de l’AMPK, les souris

AMPKα1α2 mdKO présentent une diminution de l’activité physique volontaire quotidienne, une

diminution de la durée d’un exercice sur tapis roulant ainsi qu’une diminution de la force maximale

absolue des muscles soléaire et TA. À la suite d’un protocole de contraction ex vivo, aucune

différence au niveau du transport du glucose ne fut observée dans le muscle EDL des souris

AMPKα1α2 mdKO comparativement aux souris contrôles tant chez les femelles que chez les mâles.

Des résultats similaires furent obtenus pour ce qui est du muscle soléaire chez les souris AMPKα1α2

mdKO femelles. Toutefois, le transport du glucose induit par une contraction musculaire ex vivo est

réduit dans le muscle soléaire de ces mêmes souris de sexe masculin [306].

2.4.2 Modèles transgéniques des sous-unités régulatrices de l’AMPK

2.4.2.1 Souris AMPKγ3 KO

Barnes et ses collaborateurs ont généré un modèle transgénique de suppression de la sous-unité

AMPKγ3, soit la souris AMPK γ3KO. Ni l’isoforme γ1 ni l’isoforme γ2 ne semble affectée par le

transgène de l’isoforme γ3 et aucune compensation ne fut observée dans le muscle squelettique à

l’état basal. La souris AMPK γ3KO présente une tolérance au glucose semblable à celle de la souris

contrôle ainsi que des niveaux normaux d’insuline. Bien que la phosphorylation de l’AMPK soit

augmentée par un traitement AICAR, le transport du glucose stimulé par ce traitement est

36

complétement inhibé dans le muscle EDL des souris AMPK γ3KO tel qu’observé pour les modèles

transgéniques de la sous-unité catalytique α2. Toutefois, aucune réduction du transport du glucose

induit par la contraction musculaire ne fut observée dans le muscle EDL des souris AMPK γ3KO à la

suite d’un protocole de contraction ex vivo. Il est à noter que l’augmentation de la phosphorylation de

l’AMPK en réponse au protocole de contraction est similaire à celle obtenue chez les souris contrôles

[307].

2.4.2.2 Souris AMPKβ1/β2 KO

Deux modèles transgéniques de suppression totale des isoformes AMPKβ1 (AMPKβ1 KO) et

AMPKβ2 (AMPKβ2 KO) furent générés. La souris AMPKβ1 KO se caractérise par une adiposité

inférieure à la souris contrôle soumise tant à une diète standard qu’à une diète riche en gras. Ces

résultats s’expliquent par une consommation alimentaire plus faible chez la souris AMPKβ1 KO. Il fut

observé que l’ablation totale de l’isoforme β1 entraîne une réduction de quatre-vingt-dix pourcent de

l’activité basale de l’AMPK dans le foie. Néanmoins, aucune différence ne fut mesurée dans les

muscles squelettiques et cardiaque [308].

En contrepartie, chez la souris AMPKβ2 KO, une diminution de l’expression et de l’activité des deux

sous-unités α fut observée malgré une augmentation de l’expression de l’isoforme β1 dans les

muscles VL et EDL. Le transport du glucose stimulé par un traitement AICAR est aboli dans le

muscle EDL de la souris AMPKβ2 KO tel qu’observé lors de la suppression des isoformes α2 et γ3.

De plus, la souris AMPKβ2 KO se caractérise par une diminution de sa vitesse maximale ainsi

qu’une diminution de son endurance lors d’un exercice sur tapis roulant. Toutefois, aucun défaut ne

fut rapporté en ce qui a trait au transport du glucose induit par un protocole de contraction musculaire

ex vivo dans le muscle EDL de la souris AMPKβ2 KO [309]. L’ensemble de ces résultats suggère

que l’isoforme β2 joue un rôle prédominant dans le muscle squelettique comparativement à

l’isoforme β1.

2.4.2.3 Souris AMPKβ1/β2M-KO

Afin de mieux comprendre l’implication de la sous-unité AMPKβ, trois modèles transgéniques de

suppression des différentes isoformes spécifiques au muscle (AMPKβ1M-KO, AMPKβ2M-KO et

AMPKβ1β2M-KO) furent étudiés.

37

Chez la souris AMPKβ2M-KO, spécifique au tissu musculaire, l’expression des isoformes α1 et β1

demeure inchangée par le transgène, mais l’expression de l’isoforme α2 n’est plus détectable dans le

muscle squelettique. Cette suppression des niveaux d’expression des isoformes α2 et β2 se traduit

par des niveaux initiaux réduits de la phosphorylation de la Thr172 sans pour autant empêcher son

augmentation par un protocole de contraction ex vivo. La souris AMPKβ2M-KO présente une

intolérance à l’exercice comparable à la souris AMPK KD1. Néanmoins, aucune réduction du

transport du glucose induit par un protocole de contraction musculaire ex vivo ne fut observée dans

le muscle EDL. Aucun phénotype particulier ne fut observé chez la souris AMPKβ1M-KO.

La souris AMPKβ1β2M-KO fut générée à partir du croisement des souris AMPK β1M-KO et

AMPKβ2M-KO. Dans le muscle squelettique, l’expression des isoformes α2 et β2 est nulle tandis que

l’expression des isoformes α1 et β1 est réduite de soixante-dix et quarante-cinq pourcent,

respectivement. L’ensemble de ces modifications se traduit par une inhibition de la phosphorylation

de la Thr172 tant en condition basale qu’en réponse à un protocole de contraction ex vivo.

Comparativement aux souris transgéniques AMPK KD1 et AMPK β2M-KO, la souris AMPK β1β2M-

KO est fortement intolérante à l’exercice sur tapis roulant en ce qui a trait à la vitesse maximale et à

la distance parcourue. À la suite d’un protocole sur tapis roulant, la clairance du glucose sanguin

observée dans les muscles gastrocnémien et soléaire est fortement inhibée chez la souris AMPK

β1β2M-KO comparativement à la souris contrôle. De plus, le transport du glucose induit par un

protocole de contraction musculaire ex vivo établi en fonction de chaque muscle est réduit de

soixante-dix pourcent dans le muscle EDL et de quarante-cinq pourcent dans le muscle soléaire. En

parallèle, la phosphorylation de TBC1D1 par la contraction musculaire est fortement diminuée dans

le muscle EDL des souris AMPK β1β2M-KO. Les résultats obtenus par ce modèle transgénique

suggèrent l’implication de l’AMPK dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire

ainsi qu’une interaction avec TBC1D1, responsable de la translocation des GLUT4 [310].

Finalement, dépendamment et/ou indépendamment de l’AMPK, le transport du glucose induit par la

contraction musculaire demeure fonctionnel chez les individus résistants à l’insuline

comparativement à celui stimulé par l’insuline. Il s’agit donc d’une avenue intéressante dans la

recherche d’un traitement pour contrer la résistance à l’insuline.

38

3 Résistance à l’insuline musculaire

3.1 Définition

La résistance à l’insuline se définit comme une diminution de la réponse des tissus sensibles à

l’insuline qui se traduit par une réduction du transport du glucose dans le muscle squelettique et le

tissu adipeux, une diminution de la suppression de la production hépatique de glucose et une

augmentation de la lipolyse du tissu adipeux. La résistance à l’insuline se caractérise, entre autre

chose, par une hyperinsulinémie à jeun, une hyperglycémie à jeun et postprandiale, une

hyperlipidémie, une intolérance au glucose, une augmentation de l’hémoglobine glycosylée (HbA1c)

et une augmentation de nombreux marqueurs inflammatoires plasmatiques.

De nombreux mécanismes furent suggérés pour contribuer au développement de la résistance à

l’insuline et la majorité d’entre eux sont associés à l’augmentation du tissu adipeux et plus

particulièrement, du tissu adipeux viscéral [311, 312]. Des études ont observé une résistance à

l’insuline des tissus périphériques associée à l’augmentation de l’adiposité bien avant l’apparition de

l’hyperglycémie à jeun et postprandiale, indice utilisé pour diagnostiquer la résistance à l’insuline

chez l’humain. Par ailleurs, il fut rapporté qu’une augmentation de trois pourcent du tissu adipeux à la

suite d’une augmentation de l’apport calorique quotidienne résulte en une hyperinsulinémie à jeun et

une diminution de la sensibilité à l’insuline postprandiale chez de jeunes adultes en santé malgré

l’absence d’hyperglycémie [313]. De plus, il fut démontré qu’une diminution de la masse adipeuse

augmente la sensibilité à l’insuline chez les individus obèses tolérants au glucose [314]. Ces résultats

suggèrent que l’augmentation de l’adiposité contribue à résistance à l’insuline des tissus

périphériques dont le muscle squelettique.

3.2 Défaut de la voie de signalisation de l’insuline

Puisque le muscle squelettique est responsable de quatre-vingts pourcent de la captation du glucose

en situation post prandiale, une diminution de sa sensibilité à l’insuline entraîne des perturbations

métaboliques majeures et peut mener, entre autre chose, à l’apparition du diabète de type 2. Un

défaut au niveau de la cascade de signalisation de l’insuline est principalement à l’origine de la

diminution du transport du glucose dans le muscle squelettique.

39

3.2.1 Récepteur à l’insuline

Une diminution, ou non, de la liaison de l’insuline à son récepteur fut rapportée dans le muscle

squelettique d’individus obèses et diabétiques [315-317]. Similairement, certaines études ont

démontré une diminution de l’activité tyrosine de l’IR tandis que d’autres n’ont observé aucune

différence entre les sujets [316-322]. Néanmoins, chez les individus diabétiques, une réduction de

l’expression de l’IR ne serait pas la cause de la diminution de son activité tyrosine [318]. Toutefois,

une étude in vitro a démontré que l’incubation de cellules musculaires isolées à partir du muscle

soléaire de rat en présence d’acide palmitique, un acide gras saturé, diminue l’expression et l’activité

de l’IR [323].

3.2.2 Substrat du récepteur à l’insuline 1

Des études ont démontré une diminution de la phosphorylation des résidus tyrosine d’IRS-1 dans le

muscle VL des individus obèses et diabétiques comparativement aux sujets sains ainsi qu’une

diminution de la liaison d’IRS-1 à la sous-unité régulatrice p85 de la PI3K [320, 324, 325]. De plus,

une augmentation de la phosphorylation du résidu sérine 312 (Ser312), l’équivalent de la sérine 307

(Ser307) chez la souris et le rat, fut rapportée chez les individus résistants à l’insuline [326]. La

phosphorylation du résidu sérine 1101 (Ser1101) d’IRS-1 dans le muscle VL humain fut également

associée à la résistance à l’insuline ainsi que la phosphorylation de la sérine 636 (Ser636) observée

dans des cultures primaires de cellules musculaires d’individus atteints de diabète de type 2 [327,

328]. Par ailleurs, il fut rapporté qu’une diète riche en gras augmente la phosphorylation des

Ser636/639 dans le muscle EDL de rat [329]. Ainsi, il fut suggéré que la phosphorylation des résidus

sérine d’IRS-1 empêche la phosphorylation des résidus tyrosine de cette protéine bloquant ainsi sa

liaison à la PI3K. D’ailleurs, l’invalidation des résidus Ser302, Ser307 et Ser612 dans le muscle

squelettique de souris prévient le développement de la résistance à l’insuline induite par une diète

riche en gras [330]. Il est également suggéré que la dégradation d’IRS-1 contribue au défaut de la

voie de signalisation de l’insuline. Néanmoins les mécanismes moléculaires responsables de cette

dégradation restent à être démontrés.

3.2.3 Phosphatidylinositol 3-kinase

Une diminution de l’activité de la PI3K associée à IRS-1 fut observée dans le muscle VL d’individus

obèses et d’individus atteints de diabète de type 2 ainsi qu’à la suite d’une infusion de lipides [325,

40

331, 332]. L’activation de la PI3K dépend de l’interaction entre ses deux sous-unités. De façon

inattendue, il fut démontré que l’invalidation génétique totale de la sous-unité régulatrice p85α et

p85β améliore la sensibilité à l’insuline systémique, entre autre chose, par une augmentation du

transport du glucose musculaire [333, 334]. À la suite de la démonstration de ces résultats, il fut

suggéré que l’activation de la PI3K dépend du rapport entre les deux sous-unités, p85 et p110 [335].

Toutefois, il demeure que l’invalidation génétique des sous-unités p85 et p110 de la PIK3

spécifiquement dans le muscle squelettique de souris résulte en une résistance à l’insuline

musculaire et une intolérance au glucose systémique [336]. En somme, les mécanismes de

régulation de l’activité PI3K associée à IRS-1 demandent à être davantage étudiés.

3.2.4 Protéine kinase B/Akt

Certaines études ont démontré une réduction de l’activité d’Akt dans le muscle VL d’individus obèses

ainsi que dans le muscle gastrocnémien de rats génétiquement obèses tandis que d’autres n’ont

révélé aucun défaut de l’activité d’Akt tant chez l’humain que chez le rongeur [325, 332, 337, 338].

Malgré ces résultats contradictoires, il n’en demeure pas moins que la phosphorylation des résidus

Ser473 et Thr308 est diminuée dans le muscle squelettique en présence de résistance à l’insuline.

Ceci dit, certaines études ont suggéré que la phosphorylation du résidu Ser473 ne serait pas

corrélée nécessairement à l’activité d’Akt [339, 340].

3.3 Lipotoxicité

La lipotoxicité se définit par une accumulation ectopique de lipides, entre autre lieu, dans le muscle

squelettique causée par un dysfonctionnement du métabolisme des lipides menant à une

augmentation de la concentration plasmatique des acides gras libres (AGL). Il est maintenant bien

établi que l’augmentation aigue et chronique des concentrations plasmatiques d’AGL, en lien avec

l’augmentation du tissu adipeux, contribue à l’apparition de la résistance à l’insuline musculaire. En

effet, quatre heures d’infusion de lipides chez des individus sains résultent en une résistance à

l’insuline musculaire. De plus, la sévérité de la résistance à l’insuline musculaire est dose-

dépendante des concentrations plasmatiques d’AGL [341, 342]. Le développement de la résistance à

l’insuline musculaire causée par des concentrations plasmatiques élevées d’AGL serait associé à

l’augmentation des lipides intramyocellulaires, et plus particulièrement à l’accumulation des

41

métabolites issus des acides gras dont l’acyl-coenzyme-A (acyl-CoA), le diacylglycérol (DAG) et les

céramides dans les cellules musculaires [343-345].

3.3.1 Acyl-coenzyme-A

L’acyl-CoA est un métabolite formé d’un acide gras à chaîne longue et d’une coenzyme A impliqué

dans la dégradation des acides gras par la bêta oxydation (β-oxydation). Une corrélation négative fut

démontrée entre la sensibilité à l’insuline et l’accumulation d’acyl-CoA dans le muscle VL chez

l’humain. L’amélioration de la sensibilité à l’insuline observée par l’administration d’acipimox, un

médicament qui a pour mode d’action d’inhiber la lipolyse, est concomitante à une diminution des

niveaux plasmatiques d’AGL ainsi qu’à une diminution du contenu musculaire d’acyl-CoA chez des

individus atteints de diabète de type 2. De plus, l’infusion de lipides et trois semaines de diète riche

en gras induisent également l’accumulation d’acyl-CoA dans le muscle gastrocnémien de rat. Entre

autre, il fut démontré que l’infusion de lipides résulte en une augmentation du contenu musculaire en

acyl-CoA et en DAG ainsi qu’en une activation de la protéine kinase C thêta (PKCθ) et en la

phosphorylation du résidu sérine 307 (Ser307) d’IRS-1. Ces résultats suggèrent que l’acyl-CoA

contribue à la résistance à l’insuline musculaire en activant directement, ou par l’intermédiaire d’un

autre métabolite, la PKCθ inhibant ainsi la capacité d’IRS-1 à recruter et à activer la PI3K [346-349].

3.3.2 Diacylglycérol

L’infusion de lipides ainsi qu’une diète riche en gras résultent en une augmentation du contenu

musculaire en diacylglycérol (DAG). Le DAG, également nommé diglycéride, est un métabolite formé

de résidus d’acide gras liés à un résidu de glycérol. Il s’agit d’un second messager impliqué dans le

métabolisme des triglycérides et des phospholipides. La diglycéride acyltransférase1 (DGAT1) est

l’enzyme responsable de la synthèse des triglycérides à partir du DAG. Il fut démontré que la

surexpression d’une forme active de la DAGT1 dans le muscle squelettique de souris prévient

l’accumulation musculaire en DAG et le développement de la résistance à l’insuline induite par une

diète riche en gras. Ces résultats suggèrent que l’augmentation du contenu musculaire en DAG

contribue à la résistance à l’insuline. De plus, il fut suggéré que le DAG participe à la résistance à

l’insuline via l’activation de la PKCθ [347, 350-352].

42

Il fut démontré que l’infusion de lipides résulte en une augmentation du contenu musculaire en DAG

en concomitance avec une activation de la PKCθ, une augmentation de la phosphorylation du résidu

Ser307 d’IRS-1 et par conséquent, une diminution de la phosphorylation des résidus tyrosine d’IRS-1

et une diminution de l’activité de la PI3K. En dépit de l’accumulation de lipides intramyocellulaires,

l’invalidation de la PKCθ dans le muscle squelettique de souris prévient la déphosphorylation d’IRS-1

sur ses résidus tyrosine et le développement de la résistance à l’insuline induite par une diète riche

en gras. De plus, il fut démontré que l’invalidation des résidus Ser302, Ser307 et Ser612 dans le

muscle squelettique prévient le développement de la résistance à l’insuline induit par une diète riche

en gras malgré l’accumulation de lipides intramyocellulaires. Toutefois, le mécanisme par lequel

l’activation de la PKCθ mène à la phosphorylation de la Ser307 d’IRS-1 reste à démontrer [330, 353].

3.3.3 Céramides

Outre l’accumulation d’acyl-CoA et de DAG, certaines études ont rapporté une augmentation du

contenu musculaire en céramides tant chez le rat que chez l’humain obèse résistant à l’insuline [354-

356]. De plus, il fut rapporté que l’infusion de lipides chez l’humain résulte aussi en une augmentation

du contenu en céramides [357]. À l’inverse, certaines études n’ont mesuré aucun changement du

contenu musculaire en céramides à la suite d’une infusion de lipides chez l’humain et le rat [347,

352]. Le céramide est un métabolite de la famille des sphingolipides formé d’un acide gras à longue

chaîne et d’un alcool aminé, la sphingosine. Il s’agit d’un second messager essentiel à la synthèse

de la plupart des sphingolipides. L’administration de myriocine, un inhibiteur de la sérine

palmitoyltransférase 1 (SPT1), une enzyme responsable de la synthèse des céramides, fut rapportée

pour prévenir l’accumulation du contenu musculaire en céramides ainsi que le développement de la

résistance à l’insuline induite par une diète riche en gras ou une infusion de lipides [358, 359]. De

plus, la surexpression de la kinase sphingosine 1 (SphK1), impliquée dans le catabolisme des

céramides, prévient également l’accumulation musculaire en céramides et améliore la sensibilité à

l’insuline à la suite d’une diète riche en gras [360].

Il fut observé que l’accumulation du contenu musculaire en céramides inhibe la cascade de

signalisation de l’insuline par la déphosphorylation du résidu Thr308 d’Akt et par conséquent, sa

translocation à la membrane plasmique. En effet, il fut démontré que le traitement des cellules L6

avec un analogue des céramides, le céramide C2, inhibe le transport du glucose stimulé par l’insuline

43

dû à l’absence de translocation d’Akt. L’inhibition de la synthèse des céramides prévient cette

absence de translocation d’Akt. Des résultats similaires furent obtenus en réponse à l’administration

de myriocine [358, 361, 362]. De plus, il fut démontré que les céramides activent la PKCζ et les

PP2A qui seraient responsables de la déphosphorylation du résidu Thr308 d’Akt. Enfin, un dérivé des

céramides, le glycosylcéramide pourrait également inhiber l’activité tyrosine de l’IR [363-365].

L’ensemble de ces résultats suggère que les céramides contribuent au développement de la

résistance à l’insuline musculaire causée par l’augmentation des concentrations plasmatiques en

AGL.

Finalement, il fut proposé que l’activation de la voie de signalisation des récepteurs de type Toll4

(TLR4) en réponse à une infusion d’acides gras saturés serait responsable de la biosynthèse des

céramides via l’activation de la protéine kinase IκB beta (IKKβ) dans le muscle squelettique. Des

médiateurs pro-inflammatoires, le lipopolysaccharide (LPS) et le facteur de nécrose tumorale alpha

(TNFα), furent également rapportés pour induire la biosynthèse des céramides [366]. Ces résultats

suggèrent la présence d’interactions entre la lipotoxicité et l’activation des voies inflammatoires dans

le développement de la résistance à l’insuline musculaire.

3.4 Inflammation

Outre une augmentation des lipides intramyocellulaires causée par des concentrations plasmatiques

élevées en AGL, l’obésité se caractérise par un état inflammatoire chronique. Il fut proposé que

l’inflammation débute dans le tissu adipeux où il se produit une infiltration massive de macrophages

[367, 368]. L’infiltration de macrophages pourrait être une conséquence d’une hypoxie causée par

l’expansion du tissu adipeux [369-371]. Il fut proposé que le tissu adipeux, et plus particulièrement

les macrophages présents dans celui-ci, sécrète des cytokines pro-inflammatoires dans la circulation

sanguine participant ainsi à l’inflammation systémique associée à l’obésité. Entre autre chose, des

concentrations plasmatiques élevées des cytokines pro-inflammatoires TNFα, interleukine 1β (IL-1β)

et IL-6 sont associées à la résistance à l’insuline induite par l’obésité [372, 373]. Récemment, il fut

également suggéré que l’endotoxémie métabolique, c’est-à-dire l’augmentation des concentrations

plasmatiques de l’endotoxine LPS, participe au développement de l’inflammation chronique associée

à l’obésité [374].

44

Les myocytes expriment différents récepteurs de cytokines dont les récepteurs 1 et 2 d’IL-1, le

récepteur d’IL-6, les récepteurs 1 et 2 de TNFα, le récepteur d’interféron γ (INFγ) et les récepteurs

des chimiokines de la famille CC dont CCR2, CCR4 et CCR10 [375, 376]. La présence de TNFα

dans le milieu d’incubation augmente l’expression des récepteurs d’IL-6 et de TNFα tandis qu’un

cocktail de cytokines (TNFα et INFγ) combiné à du LPS augmente l’expression des récepteurs d’IL-1,

d’IL6, d’INFγ et de TNFα dans les cellules L6 [376]. Ce cocktail de cytokines/LPS induit une

résistance à l’insuline [15]. De plus, l’administration de LPS augmente également l’expression des

récepteurs d’IL-6 et de TNFα dans le muscle épitrochléen de rat [376]. Ces résultats suggèrent que

le muscle squelettique est sensible à l’inflammation systémique induite par l’obésité et que

l’augmentation plasmatique de cytokines pro-inflammatoires puisse contribuer au développement de

la résistance à l’insuline musculaire.

3.4.1 LPS

Les concentrations plasmatiques de l’endotoxine LPS sont de deux à trois fois plus élevées chez la

souris soumise à une diète riche en gras comparativement à la souris soumise à une diète standard

[374]. Le LPS est la composante principale de la membrane externe de bactéries à gram négatif

présentes dans le microbiote intestinal. Il fut démontré que la nature de la diète alimentaire influence

la composition bactérienne du microbiote de même que l’intégrité des parois intestinales [377].

D’ailleurs, une diète riche en gras augmente la perméabilité de la paroi intestinale et par conséquent,

facilite la migration des produits bactériens, dont le LPS, vers la circulation sanguine [378]. Il fut

rapporté que l’infusion chronique d’une faible dose de LPS, comparable aux concentrations

plasmatiques mesurées à la suite d’une diète riche en gras, pour une durée de quatre semaines chez

la souris induit une augmentation du tissu adipeux viscéral comparable à celle observée pour la

même période de temps à la suite d’une diète riche en gras. De plus, une augmentation de

l’expression des cytokines IL-1 et TNFα comparable à celle obtenue à la suite d’une diète riche en

gras fut démontrée dans le muscle squelettique de souris en réponse à ce traitement [374]. Des

résultats similaires furent observés conséquemment à l’infusion de LPS dans le muscle VL chez

l’humain [379]. Ces données suggèrent une interaction entre le LPS et le développement de

l’inflammation associé à l’obésité.

45

L’inhibition et l’invalidation génétique du récepteur de type Toll4 (TLR4) ont permis d’identifier l’un

des mécanismes d’action du LPS dans le muscle squelettique. En effet, la présence d’un inhibiteur

spécifique de TLR4, le TAK-242, lors d’un traitement au LPS dans les cellules L6 prévient l’activation

de la voie du facteur nucléaire kappa B (NF-κB) et le développement de la résistance à l’insuline

[380]. Des résultats similaires furent observés dans un modèle de cellules musculaires humaines. De

plus, l’augmentation la phosphorylation de la kinase c-Jun N-terminale (JNK), impliquée dans la

réponse inflammatoire, ainsi que l’augmentation de l’expression d’IL-6 et de la chimiokine ligand 2

(CCL2) furent observées en réponse au traitement au LPS [381]. Il fut également rapporté que le

LPS active la voie NF-κB [382]. NF-κB est un facteur de transcription de gènes impliqués dans la

réponse inflammatoire, via l’activation des protéines kinase IκB α et β (IKKα/β) et la dégradation des

protéines inhibitrices de NF-κB α et β (IκBα/α). Par ailleurs, il fut démontré que l’activation de la voie

NF-κB par le LPS induit la transcription et la production de médiateurs inflammatoires tels le TNFα et

l’IL-6 dans les cellules C2C12 et le muscle quadriceps de souris [383]. Ainsi, l’induction de cytokines

et chimiokines par le LPS dans le muscle squelettique pourrait exacerber la réponse inflammatoire

systémique liée à l’obésité et participer au recrutement de macrophages au niveau des muscles

squelettiques.

Fait intéressant, il fut rapporté qu’un protocole d’exercice physique chronique diminue les

concentrations plasmatiques de LPS ainsi que l’ARNm des récepteurs TLR4 dans le muscle

gastrocnémien chez le rat soumis à une diète riche en gras. Ces modifications sont accompagnées

par une diminution de la phosphorylation de JNK, d’IKKβ et du résidu Ser307 d’Akt [384].

3.4.2 TNFα

Le facteur de nécrose tumorale α est une glycoprotéine de la famille des cytokines impliquée dans la

réaction inflammatoire. Il fut rapporté que l’ajout du TNFα dans le milieu de culture de cellules

musculaires primaires de souris prévient la phosphorylation tyrosine de l’IR ainsi que l’association

d’IRS-1 à la sous-unité p85 de la PI3K induite par l’insuline [385]. De plus, l’infusion de TNFα

pendant quatre heures induit une résistance à l’insuline dans le muscle VL chez l’humain. Une

augmentation de la phosphorylation de JNK en concomitance avec une augmentation de la

phosphorylation du résidu Ser312 d’IRS-1 et une diminution de la phosphorylation de AS160 furent

observées à la suite d’une infusion de TNFα [386]. Ces résultats suggèrent que les effets néfastes du

46

TNFα pourraient être expliqués par une activation de JNK1. Il fut établi que JNK1 est une kinase

impliquée dans la voie de signalisation du stress cellulaire et dans la transcription de gènes, eux-

mêmes impliqués dans la réponse inflammatoire. L’invalidation génétique globale de JNK prévient la

résistance à l’insuline induite par une diète riche en gras chez la souris [387]. Au niveau musculaire,

il fut démontré que la surexpression d’une forme constitutivement active de JNK par électroporation

augmente la phosphorylation sérine d’IRS1, diminue la phosphorylation de la Tyr1361 d’IRS1 et des

résidus Ser473 et Thr308 d’Akt dans le muscle TA de souris diminuant ainsi la clairance du glucose

[388].

Outre la voie JNK, le TNFα est connu pour activer la voie NF-κB. Il fut rapporté qu’un traitement au

TNFα diminue le contenu en IKKβ dans des cellules musculaires primaires humaines. L’utilisation de

petits ARN interférents pour IKKβ prévient la diminution de la phosphorylation des résidus Ser473 et

Thr308 d’Akt ainsi que la diminution du transport du glucose stimulé par l’insuline. Ces résultats

suggèrent l’implication de la voie IKK/NF-κB dans la résistance à l’insuline induite par TNFα [389].

Toutefois, il fut rapporté que l’invalidation génétique globale de TNFα ne prévient pas l’accumulation

de lipides et l’apparition de marqueurs inflammatoires dans le muscle squelettique de souris

soumises à une diète riche en gras, contrairement aux résultats obtenus dans le foie de ces mêmes

souris [390]. Ces résultats suggèrent que les concentrations plasmatiques élevées de TNFα

associées à l’obésité n’influencent pas l’activation de la réponse inflammatoire dans le muscle

squelettique. Ainsi, d’autres médiateurs, dont les acides gras et le LPS, seraient responsables de

l’activation des voies JNK et IKK/NFκ-B observée dans le muscle squelettique résistant à l’insuline

[352, 381, 382, 391, 392].

3.4.3 Interleukine-6

Chez l’humain, il fut démontré que l’augmentation des concentrations plasmatiques d’IL-6 est

corrélée à l’augmentation de l’adiposité [393-395]. Récemment, il fut rapporté que les concentrations

artérielles et veineuses d’IL-6 sont négativement corrélées avec le transport du glucose dans les

muscles de l’avant-bras chez les individus obèses comparativement aux individus contrôles [373]. De

plus, une diminution de la sensibilité à l’insuline systémique fut observée à la suite d’une infusion

aigue d’IL-6 chez la souris. Cette perte de sensibilité à l’insuline correspond à une réduction de

quarante pourcent du transport du glucose ainsi qu’à une diminution de l’activité PI3K associée à

47

IRS-1 dans le muscle gastrocnémien. Une augmentation des acyl-Coa et de la phosphorylation

tyrosine du facteur de transcription STAT3 fut également observée dans le muscle quadriceps

conséquemment à l’infusion d’IL-6 [396]. Toutefois, une étude précédente n’avait révélé aucun défaut

au niveau de la voie signalétique de l’insuline dans le muscle squelettique de souris à la suite d’une

infusion chronique d’IL-6 [397]. De plus, des augmentations du transport basal du glucose et de celui

stimulé à l’insuline ainsi que la translocation des GLUT4 furent observées dans les cellules L6

traitées deux heures avec l’IL-6 [398].

Il fut également démontré qu’un traitement de trois heures avec l’IL-6 suivi d’une stimulation à

l’insuline a des effets additifs sur le transport du glucose ainsi que sur la phosphorylation de TBC1D4

dans les cellules C2C12. Néanmoins, le transport du glucose, la phosphorylation du résidu Ser473

d’Akt et la phosphorylation de TBC1D4 stimulés par l’insuline sont inhibés après vingt-quatre de

traitement avec l’IL-6. Ces défauts observés dans la voie de signalisation de l’insuline sont associés

à une augmentation de la phosphorylation de JNK et du résidu Ser307 d’IRS-1. L’inhibition de JNK

par un agent pharmacologique ou par de petits ARN interférents rétablit le transport du glucose

stimulé par l’insuline en présence d’IL-6 dans les cellules C2C12. Ces effets furent aussi obtenus

chez la souris. En effet, quarante-huit heures d’infusion d’IL-6 inhibent la phosphorylation d’Akt dans

le muscle squelettique de souris et induit une hyperglycémie systémique à court terme. Cependant,

une augmentation de la sensibilité à l’insuline fut observée après trois heures d’infusion [399].

En somme, le rôle d’IL-6 dans le développement de la résistance à l’insuline musculaire demeure

controversé. Récemment, nous avons démontré que la production et la sécrétion d’IL-6 par le muscle

gastrocnémien conséquemment à une infusion de la protectine DX améliorent la sensibilité à

l’insuline chez des modèles de souris résistantes à l’insuline [400]. Par ailleurs, tel que mentionné à

la section 2.3.2.4, l’exercice physique provoque l’induction et le relâchement d’IL-6 par les fibres

musculaires. Fait intéressant, tandis que les concentrations plasmatiques basales d’IL-6 sont plus

élevées chez les individus obèses et résistants à l’insuline, les concentrations plasmatiques basales

d’IL-6 sont plus faibles chez les individus entraînés comparativement aux individus sédentaires [401].

48

3.4.4 Macrophages

Les macrophages sont des cellules provenant de la différenciation des monocytes impliqués dans la

défense immunitaire. La présence d’une infiltration de macrophages dans le muscle squelettique

causée par l’obésité est beaucoup moins évidente que celle observée dans le tissu adipeux. Malgré

tout, certaines études tendent à démontrer que le phénomène est aussi présent dans le muscle

squelettique [402]. En effet, une étude a démontré une augmentation du marqueur de macrophage

CD68 dans le muscle VL d’individus obèses. L’augmentation de CD68 est corrélée positivement à

l’indice de masse corporelle [403]. De plus, il fut démontré que la mise en culture de cellules

musculaires humaines isolées à partir du muscle VL avec des macrophages en présence d’acide

palmitique induit une augmentation de l’expression des cytokines TNFα, IL-6 et IL-1β. De plus, une

diminution d’IκBα, une augmentation de la phosphorylation de JNK et une diminution de la

phosphorylation du résidu Ser473 d’Akt furent également observées dans ces conditions [402].

Certaines études ont aussi rapporté l’augmentation des marqueurs de macrophages CD68, F4/F80+

et CD11c+ dans les muscles gastrocnémien et quadriceps de souris soumises à une diète riche en

gras en concomitance avec une augmentation des cytokines TNFα et IL-6 et du récepteur de

chimiokine CCR2 [404, 405]. De plus, une diminution du contenu musculaire en macrophages ainsi

que de l’expression de CD68, de la chimiokine CCL2 et de TNFα fut observé à la suite d’une

déplétion en cellules CD11c+ [406]. Ces résultats suggèrent que l’obésité résulte en une infiltration de

macrophages dans le muscle squelettique. L’infiltration de macrophages pourrait contribuer à

l’activation de la réponse inflammatoire et au développement de la résistance à l’insuline musculaire

par une action paracrine.

Les cytokines TNFα, IL-6 ainsi que l’endotoxine LPS et les macrophages ont tous en commun la

capacité d’induire l’expression d’iNOS, la forme inductible du monoxyde d’azote.

4 iNOS

4.1 Structure et expression

La forme inductible de la synthase du monoxyde d’azote (iNOS) fait partie de la famille des enzymes

responsables de la production endogène NO, c’est-à-dire la conversion de l’oxygène (O2) et de la L-

arginine en NO et en L-citruline [136]. La protéine iNOS est un complexe tétradimère constitué de

deux NOS monomères et deux calmodulines. La protéine iNOS contient deux domaines catalytiques.

49

Le domaine oxygénase dans la région N-terminale contient des sites de liaison à la

tétrahydrobioptérine (BH4), à l’hème et à L-arginine. Le domaine réductase dans la région C-

terminale contient les sites de liaison à la flavine adénine mononucléotide (FAD), à la flavine

mononucléotide (FMN) et au nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) [407-409].

L’interaction de la calmoduline avec iNOS est essentielle à son activité. Contrairement à eNOS et

nNOS, l’enzyme iNOS se lie de façon constitutive à la calmoduline, ce qui en fait une forme

indépendante de la présence du Ca2+ [410, 411]. La structure d’iNOS est représentée à la figure 10.

Figure 10 Structure d'iNOS, tirée de [412]

D’abord découverte dans les macrophages, iNOS s’exprime dans différents tissus dont le muscle

squelettique [413]. Son expression n’est pas détectée, ou très peu, dans le muscle squelettique sain

contrairement aux formes constitutivement actives nNOS et eNOS. En contrepartie, la présence de

facteurs inflammatoires entraîne l’expression d’iNOS qui à son tour, génère de grandes quantités de

NO de façon continue jusqu’à la dégradation de l’enzyme [414]. Bien qu’iNOS joue un rôle primordial

dans la défense immunitaire, son induction chronique est associée à plusieurs conditions

pathophysiologiques, dont la résistance à l’insuline liée à l’obésité [415-421].

4.2 Régulation de l’expression d’iNOS

De nombreux facteurs inflammatoires mènent à l’induction d’iNOS dont l’endotoxine LPS, les

cytokines IFNγ, IL-1β, IL-6 et TNFα. La combinaison de deux ou plusieurs de ces facteurs semble

nécessaire pour activer les voies signalétiques impliquées dans l’induction de l’ARNm d’iNOS dans

les cellules C2C12 et L6 [15, 141, 422]. Toutefois, le LPS seul induit l’expression d’iNOS dans les

muscles soléaire, EDL et gastrocnémien de rat en réponse à une stimulation LPS in vivo et ex vivo

[423, 424].

50

Peu d’études furent menées sur les mécanismes d’action par lesquels le LPS et/ou les cytokines

induisent l’expression d’iNOS dans le muscle squelettique. Néanmoins, il fut rapporté que l’IFNγ en

combinaison avec l’IL-1β induisent l’expression d’iNOS dans les cellules L6 par l’augmentation des

récepteurs d’IL-1 par l’INFγ. De plus, cette même étude a également démontré que l’inhibition de la

voie NF-κB par un antioxydant, le PDTC, inhibe l’expression d’iNOS tandis que l’inhibition de ERK1/2

par l’agent pharmacologique PD98059 réduit partiellement l’expression d’iNOS [425]. Une seconde

étude a également observé l’inhibition de l’expression d’iNOS par un traitement TNFα/INFγ dans les

cellules C2C12 en présence de la surexpression d’un mutant négatif de NF-κB. En complément, la

synthèse d’iNOS requiert la présence d’une protéine liant son ARN, la protéine Hu antegen R (HuR).

En effet, il fut démontré que l’inhibition de la protéine HuR par l’utilisation de petits ARN interférents

dans les cellules C2C12 prévient l’induction d’iNOS par le traitement TNFα/INFγ [426]. L’ensemble

de ces résultats suggère que la voie NF-κB ainsi que la protéine HuR sont des médiateurs de la

régulation de l’expression d’iNOS dans le muscle squelettique par les cytokines.

Outre les cytokines, il fut rapporté que les acides gras saturés induisent également l’expression

d’iNOS. En effet, un traitement avec de l’acide palmitique, un acide gras saturé, induit l’expression

d’iNOS et active la voie NF-κB dans les cellules musculaires humaines [427].

Fait intéressant, il fut démontré que l’activation de l’AMPK par des agents pharmacologiques (AICAR,

metformine, troglitazone) inhibe la production de NO et l’expression d’iNOS dans les cellules L6

traitées avec du LPS et des cytokines. L’administration intrapéritonéale d’AICAR prévient également

la production de NO induite par l’injection de LPS dans les muscles TA et gastrocnémien de rat [424].

Des résultats similaires furent obtenus avec un traitement au resvératrol, un composé naturel qui

active l’AMPK. En effet, l’administration intrapéritonéale de resvératrol précédant une injection de

LPS prévient l’induction d’iNOS dans le muscle gastrocnémien de souris. Par ailleurs, la suppression

de l’AMPK par de petits ARN interférents dans les cellules L6 prévient les effets inhibiteurs du

resvératrol sur iNOS [428].

4.3 iNOS et la résistance à l’insuline musculaire

L’induction d’iNOS dans le muscle squelettique fut rapportée dans plusieurs modèles d’obésité et de

résistance à l’insuline. En effet, l’expression d’iNOS fut observée dans le muscle gastrocnémien de

51

souris génétiquement obèses (ob/ob) ainsi que de souris soumises à une diète riche en gras [416,

429]. Des résultats similaires furent rapportés dans le muscle soléaire de rats soumis à une diète

riche en gras et dans le muscle gastrocnémien de rats génétiquement obèses [416, 429, 430]. Chez

l’humain, une étude a rapporté une augmentation de l’expression de la protéine iNOS dans le muscle

quadriceps d’individus atteints de diabète de type 2 comparativement aux sujets contrôles [431].

Toutefois, une étude récente a échoué à détecter une augmentation significative de l’expression

d’iNOS dans le muscle VL de sujets résistants à l’insuline comparativement aux sujets contrôles

[432].

Des études de notre laboratoire ont démontré que l’induction d’iNOS par une combinaison de

LPS/cytokines dans les cellules L6 diminuait le transport du glucose stimulé par l’insuline. L’ajout

d’un inhibiteur de NOS, le NG-Nitro-L-arginine-methyl ester (L-NAME), prévient la production de NO

par iNOS et la diminution transport du glucose stimulé par l’insuline [15]. Des résultats similaires

furent obtenus par l’ajout d’un donneur de NO, le GEA 5024, dans les muscles EDL et soléaire de rat

ainsi que dans les cellules L6 suggérant ainsi un rôle pour iNOS dans la régulation du transport du

glucose stimulé par l’insuline dans le muscle squelettique [423]. Par la suite, il fut rapporté que

l’invalidation génétique totale d’iNOS prévient le développement de la résistance à l’insuline

musculaire induite par une diète riche en gras malgré la présence d’obésité. En effet, la délétion

d’iNOS prévient la diminution de l’activité PI3K et de la phosphorylation du résidu Ser473 d’Akt

induite par une diète riche en gras [416]. Ces résultats furent corroborés par des études

subséquentes chez l’animal. La délétion génétique et l’usage d’un inhibiteur pharmacologique

d’iNOS, le L-NIL, améliorent le signal insulinique dans le muscle gastrocnémien de souris ob/ob

[430]. De plus, l’invalidation génétique totale d’iNOS prévient la diminution du transport du glucose,

de l’activité de la PI3K ainsi que de la phosphorylation du résidu Ser473 d’Akt dans le muscle

gastrocnémien de souris soumises à une infusion de lipides en dépit des niveaux élevés en cytokines

[433].

Fait intéressant, il fut rapporté que l’inhibition d’iNOS par des activateurs pharmacologiques de

l’AMPK prévient également la diminution de l’activité PI3K par le cocktail LPS/cytokines dans les

cellules L6 [424]. En contrepartie, une étude récente a rapporté que l’activation de l’AMPK par

l’AICAR lors d’une infusion de lipides ne réduit pas l’expression d’iNOS et n’améliore pas la

52

sensibilité à l’insuline systémique. Néanmoins, une forte expression d’iNOS fut observée dans le

muscle gastrocnémien de la souris AMPK KD1 en condition basale [434].

Il fut suggéré que les modifications nitrosatives de la voie de signalisation de l’insuline par le NO

produit par iNOS expliqueraient la résistance à l’insuline musculaire observée.

4.3.1 Nitration

La nitration résulte en une liaison covalente entre un ou plusieurs groupements nitro (NO2)

triatomiques à l’anneau phénol des résidus de tyrosine [435, 436]. Toutefois, il demeure un

processus sélectif et seul un nombre restreint de résidus de tyrosine sont sujets à la nitration [437]. Il

fut démontré que non seulement la nitration survient à la suite de l’interaction entre des protéines

avec le NO, mais également à la suite d’interactions entre les protéines et les espèces réactives de

l’azote (de l’anglais reactive nitrogen species, RNS), des intermédiaires secondaires du NO.

Néanmoins, le NO ne semble pas un joueur majeur dans le processus de nitration. Le peroxynitrite

(ONOO-) représente un puissant oxydant capable de nitration. Le ONOO- résulte de l’interaction

entre le NO et l’anion superoxide (O2-) [438].

Des concentrations élevées en nitrotyrosines furent rapportées dans le plasma et le muscle

squelettique d’individus atteints de diabètes de type 2 suggérant une production accrue de ONOO-

chez ces derniers [431, 439]. Des résultats similaires furent observés dans le muscle soléaire de

souris soumises à une diète riche en gras. Il fut démontré que l’administration de FeTTPS, un agent

qui provoque la dégradation du ONOO-, prévient l’augmentation du contenu musculaire en

nitrotyrosines ainsi que la diminution de la phosphorylation du résidu Ser347 d’Akt et du transport du

glucose stimulé par l’insuline dans le muscle soléaire de souris soumises à une diète riche en gras

[440]. De plus, une étude subséquente a démontré que l’administration intrapéritonéale d’un donneur

de ONOO-, le 3-morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1), résulte en la nitration de l’IRβ, d’IRS-

1 et d’Akt dans le muscle squelettique de souris. La nitration de l’IRβ et d’IRS-1 fut également

observée dans le muscle squelettique des souris soumises à une diète riche en gras.

L’administration de FeTTPS renverse la nitration de ces protéines [441]. Finalement, il fut rapporté

que l’endotoxine LPS induit la nitration d’IRS-1 dans les cellules L6. L’utilisation d’un inhibiteur

d’iNOS, le 1400W, prévient cette induction [442]. L’ensemble de ces résultats suggèrent qu’iNOS

53

contribue, entre autre chose, à la résistance à l’insuline musculaire via la nitration des protéines

impliquées dans la voie de signalisation de l’insuline.

4.3.2 S-nitrosylation

La S-nitrosylation résulte en une liaison covalente entre un composé nitroso diatomique et le

groupement thiol-SH (groupement sulfhydryle) d’une cystéine à la suite d’une réaction

d’oxydoréduction [443]. À l’instar de la nitration, la S-nitrosylation demeure restreinte à un nombre

sélectif de cystéines [444]. Les trioxydes d’azote (N2O3) générés à la suite de la réaction entre deux

atomes d’azote avec l’oxygène constituent les RNS capables de S-nitrosylation [445].

Une induction de la S-nitrosylation d’Akt fut observée dans le muscle gastrocnémien de souris

génétiquement diabétiques (db/db) comparativement aux souris contrôles. La S-nitrosylation d’Akt

est corrélée à une diminution de la phosphorylation du résidu Thr308 ainsi qu’à une diminution de

l’activité d’Akt [446]. De plus, la S-nitrosylation de l’IRβ, d’IRS-1 et d’Akt fut également rapportée

dans le muscle soléaire de souris ob/ob et de rats soumis à une diète riche en gras. L’inhibition

d’iNOS par des oligonucléotides renverse la S-nitrosylation de ces protéines dans le muscle soléaire

des souri ob/ob de même qu’un traitement à la rosiglitazone chez le rat soumis à une diète riche en

gras [429]. Des résultats similaires furent obtenus en réponse à un traitement avec l’endotoxine LPS.

En effet, le LPS induit également la S-nitrosylation de l’IRβ, d’IRS-1 et d’Akt dans le muscle soléaire

de souris. L’invalidation génétique d’iNOS prévient la S-nitrosylation de ces protéines [447]. Ces

résultats suggèrent qu’iNOS contribue également à la résistance à l’insuline musculaire via la S-

nitrosylation des protéines impliquées dans la voie de signalisation de l’insuline. La figure 11 résume

les modifications nitrosatives de la voie de signalisation de l'insuline.

Fait intéressant, ces mêmes auteurs ont rapporté une diminution de la S-nitrosylation de l’IRβ, d’IRS-

1 et d’Akt dans le muscle gastrocnémien de rats induite par une diète riche en gras à la suite d’un

protocole d’exercice aigu. Cette diminution de la S-nitrosylation des protéines impliquées dans la voie

de signalisation de l’insuline est corrélée à une augmentation de la sensibilité à l’insuline systémique,

une diminution d’iNOS et une activation de l’AMPK dans le muscle gastrocnémien [448].

54

Figure 11 Modifications nitrosatives de la voie de signalisation de l'insuline, tirée et modifiée de [449]

Y-NO2: Nitration; S-NO: S-Nitrolysation

5 Objectifs de recherche Que ce soit à la suite d’un repas (augmentation des niveaux plasmatique d’insuline) ou lors d’un

exercice physique (contraction musculaire), le tissu musculaire squelettique capte de grandes

quantités de glucose grâce à la translocation des GUT4 à la membrane plasmique et aux tubules-T.

Les mécanismes moléculaires responsables de la translocation des GLUT4 à la membrane

plasmique de la cellule musculaire sont bien définis lors d’une stimulation à l’insuline, mais ceux

impliqués dans la régulation du transport du glucose induit par la contraction musculaire restent à

être élucidés.

Certaines évidences tendent à démontrer l’implication de la protéine AMPK dans le transport du

glucose induit par la contraction musculaire. Toutefois, encore aujourd’hui, son rôle demeure

controversé. La diminution de la force absolue observée au niveau des muscles squelettiques des

différents modèles transgéniques pour la protéine AMPK comparativement aux souris contrôles rend

laborieuse l’interprétation des résultats obtenus. Puisque le transport du glucose est proportionnel au

niveau de force développé par le muscle squelettique, nous nous sommes penchés sur l’élaboration

d’un protocole de stimulation électrique (contraction ex vivo) qui permettrait de produire des forces

semblables entre les souris AMPK KD1 et les souris contrôles pour un même stimulus. L’élaboration

55

de ce protocole nous a permis de clarifier le rôle de l’AMPK dans le transport du glucose induit par la

contraction musculaire.

Notre laboratoire s’intéresse également à la modulation du transport du glucose dans la cellule

musculaire par le NO produit par la protéine iNOS. En effet, nous avons démontré que l’induction

d’iNOS et par conséquent, la production de NO par un cocktail de cytokines combiné à la LPS

modulent l’expression de GLUT1 et de GLUT4 et diminuent le transport du glucose stimulé par

l’insuline dans les cellules L6. Des résultats préliminaires obtenus dans le muscle épitrochléen de rat

suggèrent que l’incubation prolongée d’un muscle squelettique induit l’expression d’iNOS. Nous nous

sommes donc intéressés à l’impact de l’induction d’iNOS sur l’expression des transporteurs de

glucose lors d’une incubation prolongée du muscle épitrochléen. Nous nous sommes également

penchés sur l’impact de l’induction d’iNOS sur le transport du glucose lors d’une incubation

prolongée du muscle épitrochléen.

57

CHAPITRE 1

The α subunit of AMPK is essential for submaximal contraction-mediated glucose transport in skeletal muscle in vitro

Natalie Simard-Lefort1,3+, Emmanuelle St-Amand1,3+, Sébastien Morasse1,3, Claude H. Côté2,3, and André Marette1,3 *

Departments of 1Anatomy and Physiology and 2of Rehabilitation, and 3Lipid Research Unit, Laval University Hospital Research Center, Québec, Canada

Running title: AMPK is essential for contraction-induced glucose transport

+ These authors have contributed equally to this work.

*Address correspondence to: Dr. André Marette Department of Physiology & Lipid Research Unit Laval University Hospital Research Center 2705, Laurier Bld Ste-Foy, (Québec), Canada, G1V 4G2 Tel: (418) 656-4141 ext. 47549 Fax: (418) 654-2176 E-mail:[email protected]

58

Résumé

L’AMPK est une sérine/thréonine kinase clé dans la régulation du transport du glucose dans le

muscle squelettique. Toutefois, son implication dans le transport du glucose induit par la contraction

musculaire demeure controversée. Une réduction du transport du glucose induit par la contraction

musculaire fut observée dans le muscle EDL de souris surexprimant une forme inactive de l’isoforme

AMPKα2 (AMPK KD1). Néanmoins, une diminution de la force maximale du muscle EDL fut

également rapportée chez la souris AMPK KD1 évoquant la possibilité que la réduction du transport

du glucose observée chez la souris AMPK KD1 puisse s’expliquer par cette diminution de la force

musculaire. L’étude des courbes force/fréquence lors d’une stimulation électrique du muscle EDL a

permis d’établir que pour des fréquences ≤ 50Hz, la force générée par les souris AMPK KD1 est

comparable à celle des souris sauvages. Par ailleurs, l’activation de l’AMPK est maximale à une

fréquence de 50Hz. Chez la souris sauvage, une stimulation électrique du muscle EDL à une

fréquence de 50Hz sur une période de 2 minutes (200ms, 1/s, 30V) induit une activation de l’AMPK

et une augmentation du transport du glucose de 2 fois supérieur à celui observé en condition basale

chez la souris sauvage. Contrairement à la souris sauvage, aucune activation de l’AMPK n’est

observée dans le muscle EDL des souris AMPK KD1 à la suite du protocole de stimulation électrique.

De plus, le transport du glucose est réduit de 50% comparativement à celui mesuré chez la souris

sauvage. L’ensemble de ces résultats suggère un rôle essentiel de l’AMPK dans le transport du

glucose induit par la contraction musculaire ainsi que l’implication de mécanismes indépendants de

l’AMPK.

59

Abstract

AMPK is a key signaling pathway in the regulation of skeletal muscle glucose uptake but its role in

mediating contraction-induced glucose transport is still debated. The effect of contraction on glucose

transport is impaired in EDL muscle of transgenic mice expressing a kinase-dead, dominant negative

form of the AMPK α2 subunit (KD-α2AMPK mice). However, maximal force production is reduced in

this muscle, raising the possibility that the defect in glucose transport was due to a secondary

decrease in force production and not impaired AMPK α2 activity. Generating force: frequency curves

revealed that muscle force production is matched between wild-type (WT) and KD-α2AMPK mice at

frequencies ≤ 50 Hz. Moreover, AMPK activation is already maximal at 50 Hz in muscles of WT mice.

When EDL muscles from WT mice were stimulated at a frequency of 50 Hz for 2 min (200ms train,

1/s, 30V), contraction caused a ~3.5-fold activation of AMPKα2 activity and a ~2-fold stimulation of

glucose uptake. Conversely, while force production was similar in EDL of KD-α2AMPK animals, no

effect of contraction was observed on AMPKα2 activity and glucose uptake stimulation was reduced

by 50% (P<0.01) As expected, AICAR caused a 2.3-fold stimulation of AMPKα2 activity and a 1.7-

fold increase in glucose uptake in EDL from wild-type (WT) mice while no effect was detected in

muscle from KD-α2AMPK mice. These data demonstrate that AMPK activation is essential for both

AICAR and submaximal contraction-induced glucose transport in skeletal muscle, but that AMPK-

independent mechanisms are also involved.

60

Introduction

5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) is a member of a metabolite-sensing protein kinase family

that responds to modulations in cellular energy levels (6, 14). When AMPK "senses" decreased

energy stores, it acts to switch off ATP-consuming pathways and switch on alternative pathways for

ATP regeneration. AMPK is a ubiquitous heterotrimer comprised of a catalytic α, and regulatory β

and γ subunits. It is thought to be a key actor in the alternative, noninsulin-mediated, pathways

leading to glucose uptake in skeletal muscle (13). As AMPK is potently activated by muscular

contraction, it is also believed to represent a key signaling molecule for exercise-induced glucose

transport (15, 28, 29, 35, 38). In rats, exercise predominantly increases the activity of the α2-subunit

of AMPK while tetanic contractions ex vivo increase both the α1 and α2 AMPK subunits (26).

Exercise performed at 65-70% VO2max preferentially stimulates AMPKα2 in human muscle whereas

activation of AMPKα1 at this intensity is still controversial (4, 7, 39). In type 2 diabetic patients,

exercise at 70% VO2max stimulates AMPKα2 activity to an extent similar to that observed in healthy

subjects (25), making AMPK an attractive target for glucose-lowering pharmacological therapies.

Transgenic models have proven essential in elucidating the role of AMPKα2 in the alternative

glucose transport pathway. Mu et al. (24) first showed that muscle-specific expression of a dominant

inhibitory mutant of AMPK in transgenic mouse (KD-α2AMPK) reduced contraction-induced glucose

uptake by 30-40% whereas it fully abrogated the stimulatory effect of AICAR (a pharmacological

activator of AMPK) or hypoxia on glucose transport. Knockout (KO) mouse models for individual

AMPKα subunits were also generated. Whereas α1-AMPK KO mice exhibited normal glucose

homeostasis, mice lacking the α2-AMPK showed impaired insulin secretion and in vivo insulin

resistance (36, 37). However, α2-AMPK KO mice also exhibited increased adrenergic tone which

could explain both decreased insulin secretion and insulin resistance. Surprisingly, isolated muscles

from α2-AMPK KO mice failed to respond to AICAR but exhibited normal response to contraction-

induced glucose uptake (20). However, this is likely explained by a compensatory increase in

expression and activity of the α1-AMPK subunit. This compensatory response of the α1-AMPK

subunit was not observed in muscle-specific expression of a dominant inhibitory mutant of α2-AMPK

(24). Interestingly, γ3-AMPK KO mice also display impaired AICAR- but not contraction-induced

glucose uptake (2). In this case, no compensatory increases in other γ or α-subunits were observed.

61

Thus, there is still some debate as to the exact role of AMPK in contraction or exercise-induced

glucose uptake in skeletal muscle.

A recent report suggests that contraction-mediated glucose transport is fully independent of AMPKα2

since it is not ablated in a second murine model expressing an inactive form of AMPKα2 in skeletal

muscle (α2i TG) (12). This conclusion relies on the premise that when force generation was matched

between muscles of α2i TG mice and their wild-type (WT) littermates, no deficit in contraction-

induced glucose transport was observed. To match force production between WT and α2i TG mice,

Fujii and colleagues opted to use a non supramaximal stimulation voltage (8.4-21V) in the WT group

as compared to a supramaximal voltage (i.e. >30V) to stimulate α2i TG muscles. However, this

strategy has the inherent limitation of leading to differential recruitment in muscle fibers even though

force production is matched between the genotypes. In the present study, a contraction stimulation

protocol was designed to match force production between WT and KD-α2AMPK mice without

compromising the voltage stimulation parameters in the WT mice and resulting in comparable fiber

recruitment in both groups. This allowed us to investigate the role of AMPK in contraction-mediated

glucose transport under conditions of similar fiber recruitment and muscle force responses, and thus

test the hypothesis that AMPK is essential for contraction-induced glucose transport. When force

development between KD-α2AMPK and WT EDL muscles is matched, while using identical

stimulation voltage and contraction protocols, glucose transport is diminished by half in EDL of KD-

α2AMPK mice. Our data are thus consistent with a major role for AMPK in contraction-induced

glucose transport.

62

Experimental procedures

Materials

AICAR was purchased from Toronto Research Chemicals (Toronto, Canada). [-32P] ATP, protein A-

and G-Sepharose, and antimouse or antirabbit immunoglobulin G conjugated to horseradish

peroxidase were purchased from Amersham Pharmacia Biotech (Baie d’Urfé, Canada). SAMS

peptide was synthesized at the Eastern Quebec Proteomics Centre at the CHUL Research Centre.

Protein A/G PLUS-Agarose and anti-AMPKα2 (C-20) were from Santa Cruz Biotechnology (Santa

Cruz, CA). Polyclonal antibodies used for immunoblotting: anti-phospho-AMPKα1/α2 (pThr172), anti-

phospho-ACC recognizing both α and β isoforms (pSer79), an anti-AMPKα1 and anti-AMPKα2

antibody from Cell Signaling (Beverly, MA, USA) and anti-cmyc (9E10) was purchased from Santa

Cruz Biotechnology. All common chemicals were from Sigma and of the highest analytical grade.

Animals

All animal handling and treatments were approved and followed the guidelines set by Laval University

Hospital Research Centre Animal Care and Handling Committee. Mice were housed 2-5 per cage

under a 12-hr light/dark cycle in animal quarters at 22°C and allowed unlimited access to standard

rodent food and water WT and KD-α2AMPK mice (20-25 g) were generated by an established colony

at the CHUL Research Center, from original breeders generously provided by Dr. Morris Birnbaum

(University of Pennsylvania). Food was withdrawn 15-18 hours prior to experiments. Mice were

anesthetized (50mg/kg sodium pentobarbital, i.p.) and were given the analgesic buprenorphine

(0.1mg/kg, i.p.). Extensor digitorum longus (EDL) muscles were carefully dissected and either

mounted vertically between two platinum electrodes for contraction studies or on a plastic support for

AICAR treatments.

In vitro contraction studies

EDLs were incubated in vitro and allowed to equilibrate for 15 min in 29°C oxygenated (95% O2/5%

CO2) Krebs buffer (137mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgSO4, 1mM NaH2PO4, 2mM CaCl2, 24mM

NaHCO3, 8mM glucose and 32mM mannitol) at which time the optimal length (Lo) (the muscle length

which allows maximal twitch tension) was determined using 5 twitches. Muscles were incubated at

this length for an additional 30 min. The force produced was visualized and analyzed on a digital

oscilloscope (Hewlett-Packard) throughout the contraction protocol. A force: frequency curve was

63

obtained on a set of muscles not used for glucose transport studies by using supramaximal voltage

(30-35 volts) and 200ms train stimulations at frequencies ranging between 10 and 300Hz with 2 min

rest in between each contraction. The contraction protocol used for the contraction-stimulated

glucose uptake (30V, 50Hz, 200ms train, 1/s), which is near-physiological conditions (42), was

performed during the last 2 min of the 30 min incubation. For immunoblotting studies and kinase

activity assays, EDLs were frozen in liquid nitrogen immediately at the end of the protocol and stored

at -80°C until processed.

AICAR treatment

EDLs were allowed to recover from the surgery for 30 min in oxygenated Krebs buffer supplemented

with 8mM glucose and 32mM mannitol. EDLs were then incubated 30 min in 2mM AICAR in Krebs

buffer in which the osmolarity was reduced to account for the contribution of AICAR (8mM glucose

and 30mM mannitol). AICAR stock solution was prepared in Krebs buffer lacking glucose and

mannitol and the same volume of this buffer was added to basal muscles. Immediately after the

protocol, EDLs underwent glucose transport measurement or were frozen in liquid nitrogen and

stored at -80°C until processing.

In vitro glucose transport measures

Following the appropriate treatments (i.e. contraction or AICAR), EDLs were mounted on a plastic

support if not previously done. Extracellular glucose was removed during a 10 min wash in Krebs

buffer with 40mM mannitol. Glucose transport was then measured via the incorporation of

radiolabeled [2-[1,2 3H(N)]-deoxyglucose (DG)] during 20 min, as previously described (21). In brief,

the muscles were incubated in 4 ml of Krebs buffer containing 8 mM 2-[3H]-DG (1.125μCi/ml), 32 mM

[14C]mannitol (0.15μCi/ml), 2 mM sodium pyruvate, and 0.1% BSA at 29°C. Muscles were quickly

dried, frozen in liquid nitrogen and kept at -80°C. 2-[3H]-DG incorporation was determined by adding

1 mL of H2O to the muscles, incubating in boiling water for 10 min and centrifuging at 10 000g for 10

min. Aliquots of the supernatant and the radioactive incubation media were read using a Liquid

Scintillation Analyzer (Tri-Carb 2800TR, Perkin-Elmer) for quantification of 3H and 14C. Results were

expressed as µmol glucose/g•h.

64

Kinase assays

AMPK activity. EDLs were ground to a powder and resuspended in lysis buffer (30mM HEPES, pH

7.4, 2.5mM EGTA, 3mM EDTA, 70mM KCl, 0.1% NP-40, 20mM β-glycerophosphate, 20mM NaF,

2mM sodium tetrapyrophosphate, 1mM Na3VO4, 200uM phenylmethylsulfonylfluoride, 1mM

benzamidine, 1:1000 protease inhibitor cocktail (Sigma)). Insoluble material was removed by

centrifugation at 10 000g for 10 min. Protein concentration was determined using the DC Assay (Bio-

Rad Laboratories, Inc., Richmond, CA). 200µg of total protein lysate was added to protein A/G-

Sepharose coupled to anti-AMPKα2 (2µg) or anti- AMPKα1 (1µg) antibodies. Following an overnight

incubation, beads with immunocomplexes were washed extensively: 4X with 500uL lysis buffer with

500mM NaCl and 2X with 500uL reaction buffer (40mM HEPES, pH 7.4, 80mM NaCl, 5mM MgCl2,

1mM DTT). Immunocomplexes were incubated, in the presence of 50uL reaction mix (200uM SAMS

peptide, 100uM ATP, 240uM AMP, 1μCi [-32P] ATP, completed with reaction buffer) 10 min at 37°C

at 850rpm. 30µL of the reaction mix was blotted on p81 Filter paper (Whatman International Ltd,

England). Filter papers were washed 5 x 20 min with 1% phosphoric acid to remove excess

radioactivity not bound to the peptide. Remaining radioactivity on Filter papers was quantified using a

Liquid Scintillation Analyzer (Tri-Carb 2800 TR, Perkin Elmer).

Western blotting

50µg of muscle protein lysate was resolved by 7.5% SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane

and analyzed by western blot. Blots were blocked with 5% non-fat dry milk in 10 mM Tris pH 7.5, 150

mM NaCl, and 0.04% Igepal and 0.02% NP-40, incubated with primary antibody overnight at 4°C (in

5% non-fat milk or 1-3% BSA); and then incubated with a secondary horseradish-conjugated

antibody for 1 hr at room temperature. Immunoreactive bands were visualized by enhanced

chemiluminescence (Immubilon Western, Millipore Corporation, MA, USA) and quantified by

ImageQuant TL software. Relevant primary antibodies used: anti-phospho-AMPKα, (1:1000 dilution),

anti-phospho-ACC (1:1000 dilution), anti-c-Myc (1:500 dilution), anti-AMPKα1 (1:1000), and anti-

AMPKα2 (1:1000).

65

Data analysis

All results are presented as mean ± SEM. Statistical analysis of results was performed either by one

or two-way analysis of variance and the assumptions of these models were systematically tested

each time. Differences were considered to be statistically significant at P<0.05.

66

Results

Lack of AMPKα activation and glucose transport stimulation by AICAR in EDL from KD-

α2AMPK mice.

As shown previously (24), the mutated form of AMPKα2 is tagged with a c-Myc epitope which

contributes to the slower electrophoretic mobility of this isoform on SDS-PAGE (Fig. 1A). As expected

the endogenous α2 subunit was fully replaced by the KD-dominant inhibitory mutant in the KD-

α2AMPK mice. The c-Myc epitope was solely expressed in muscles, as expected from its targeted

expression in this tissue. Analysis of EDL muscles from several animals also revealed that the forced

expression of the KD-dominant inhibitory mutant of α2AMPK also reduced the expression of the

AMPKα1 subunit by 66% (rel. Densit. Units of WT: 0.67±0.16 versus KD: 0.23±0.17, mean±SE, P <

0.05). This is consistent with the observations of Mu et al. (24) who reported that the forced

overexpression of the KD AMPKα2 leads to displacement of the endogenous α1/α2 subunits from the

heterotrimer followed by degradation of the free alpha subunits.

We first assessed the effect of the AMPK pharmacological activator AICAR on EDL muscle of WT

and KD-α2AMPK mice. AICAR induced the phosphorylation of AMPKαThr172 (Fig. 1B and 1C) and

its downstream target ACCSer79 (Fig. 1B and 1D) but these effects were markedly reduced in

muscles from KD-α2AMPK mice. The elevated basal phosphorylation of AMPKα in muscle of KD-

α2AMPK mice has been reported previously (24) and may be considered a compensatory

mechanism attempting to increase the activity of AMPK under fasting conditions. Direct

measurements of AMPK kinase activity confirmed that expression of the kinase-dead form of AMPKα

functions as a dominant inhibitory protein in muscle, blunting the AICAR-induced activation of both

the α1 and α2 AMPK isoforms (Fig. 1E). Incubation of WT EDL muscles with 2 mM AICAR led to a

~1.7-fold increase in glucose transport (P<0.01) but AICAR failed to increase glucose transport in

EDL of KD-α2AMPK mice (Fig. 1F). These experiments confirm that the AMPK pathway is blunted in

muscle of the KD-α2AMPK mouse, and thus makes it an appropriate model for the study of AMPK-

dependent processes in skeletal muscle.

Effects of different stimulation frequencies on muscle force and AMPK activation

In order to test the role of AMPK in contraction-induced glucose transport it is imperative that the

force produced by the WT muscle during electrical stimulation is matched to that of the KD-α2AMPK

67

muscle. As shown in figure 2A, EDL muscles from WT mice have a significantly higher maximal

absolute tetanic force compared to muscles of KD-α2AMPK mice. The deficit in force generation of

the EDL from KD-α2AMPK mice only became significant in the upper end of the force: frequency

curve. At frequencies ≤ 50Hz, absolute force generation of KD-α2AMPK EDL was similar to that of

WT EDL (Fig. 2A). When muscles were electrically stimulated in vitro at 50Hz, no significant

difference was observed in the force generation or muscle fatigability over a 2-min period (Area under

curve : KD-α2AMPK: 94.4±7.2 vs WT: 107.0±7.4, NS) (Fig. 2B). Furthermore, we found that

AMPKαThr172 phosphorylation is already maximally induced at 50Hz (Fig. 3), indicating that this

stimulation frequency is relevant to investigate the role of AMPK signaling in glucose uptake

stimulation by contraction. Therefore, a 2-min 50Hz electrical stimulation protocol was employed in

order to study the contribution of AMPK in contraction-mediated glucose transport under matched

force production.

Lack of AMPKα activity reduces contraction-induced glucose transport in EDL muscles from

KD-α2AMPK mice.

Phosphorylation of both AMPKThr172 and ACCSer79 were increased following submaximal

contraction of WT mouse muscles at 50Hz whereas these responses were markedly blunted in EDL

of KD-α2AMPK mice (Figs. 4A-C). A ~3.5-fold stimulation of AMPKα2 activity was observed in

electrically-stimulated EDL muscles from WT mice, whereas contraction failed to increase AMPKα2

activity in EDL of KD-α2AMPK animals (Fig. 4D). Contraction also enhanced AMPKα1 activity in WT

muscle but this effect was also abrogated in the KD- α2AMPK mice. We next triggered contraction of

EDL muscles from both genotypes (50Hz, 200ms stimulation, 1/s, supramaximal voltage) and

measured glucose uptake stimulation. After 2 min, glucose transport was stimulated 2.1-fold over

basal in WT EDL muscles, whereas it was only stimulated 1.6-fold in muscles of KD-α2AMPK mice

(Fig. 4E). Thus, glucose transport stimulation by contraction was reduced by 50% (P<0.01 vs WT

muscles) in KD-α2AMPK muscles when compared to WT mice.

68

Discussion

Early studies showed that exercise (29) and electrically-stimulated contractions (15, 28, 35, 38)

increase the activity of AMPK in muscle. Moreover, several studies have shown that AICAR

stimulates glucose transport in fast-twitch muscles and that its effect is not additive to that of

contraction (3, 15, 23, 26). Further genetic evidence for a role of AMPK in contraction-induced

glucose uptake came from the work of Mu et al.(24) who showed that expression of a dominant

inhibitory mutant of AMPK in KD-α2AMPK muscle reduced contraction-induced glucose uptake by

30-40% whereas it fully abrogated the stimulatory effect of AICAR or hypoxia on glucose transport.

Using another mouse model expressing an inactive form of AMPKα2 in muscle, Fujii et al. (12)

recently suggested that the stimulatory effect of contraction on glucose transport is fully independent

of AMPKα2. This is based on the finding that when force generation was matched between muscles

of α2i TG mice and their WT littermates, no deficit in contraction-induced glucose transport was

observed. The need to match force production is related to the fact that mouse models lacking an

active α2AMPK have a reduced capacity for maximal force production, a finding we have confirmed

in KD-α2AMPK mice (see Fig. 2). However, the conclusion of Fujii et al. (12) relies on the premise

that contraction-mediated glucose transport is proportional to force development (1, 17) but this is in

fact a matter of debate as early and more recent studies indicate that work load plays little, if any, role

in contraction-mediated glucose transport (16, 33). Of more concern is that Fujii and colleagues

opted to use a non supramaximal voltage (8.4-21V) in the WT group in order to match force

production to the level of the α2i TG animals that were stimulated with a supramaximal voltage (i.e.

>30V). However, during electrical stimulation of isolated muscles ex vivo and particularly in the

context of measuring glucose uptake, it is imperative that the voltage remains supramaximal in order

to ensure activation of all (especially the deepest) muscle fibers (9). Thus the option of reducing the

stimulation voltage in the WT mice would inevitably lead to a lesser recruitment of the deepest

muscle fibers, even though the work load was equal to that of α2i TG muscle.

To circumvent these limitations, we designed a contraction stimulation protocol to match force

production between WT and KD-α2AMPK Tg mice without compromising the voltage stimulation

parameters in the WT mice and thus fiber recruitment remained similar between groups. This was

made possible by stimulating both WT and KD-α2AMPK EDL muscles at a lower frequency (50Hz),

where genotypic differences in absolute force production were no longer observed (Fig. 2). This

69

allowed us to investigate the role of AMPK in contraction-mediated glucose transport under

conditions of equivalent electrical stimulation and muscle force responses. When muscle force

development between genotypes is matched, using identical stimulation voltage and contraction

protocols, glucose transport stimulation is diminished by half in EDL of KD-α2AMPK mice as

compared to WT littermates. Our data are therefore entirely consistent with a significant role for

AMPK in submaximal contraction-induced glucose transport.

AMPK is currently believed to be primarily involved in glucose transport stimulation following high

intensity contraction or strenuous exercise. This is partly based on the observation that AMPK is

absolutely required for hypoxia-induced glucose uptake (24); (32) since oxygen availability may be

reduced during strenuous exercise and intense muscle contraction. However, this dogma is now

challenged by recent data showing that AMPK is activated by low-intensity contraction of muscles in

vitro. Indeed, Toyoda et al. recently reported that the α1-subunit, but not the α2 subunit, of AMPK is

activated by a very low-intensity 2 min electrical stimulus (1-2 Hz) of epitrochlearis muscle (34). Both

isoforms were activated when the frequency was increased to > 5 Hz or when the duration of the

stimulus was > 15 min. Furthermore, Jensen et al. (18) found that both the α1 and α2-subunits of

AMPK can be activated in soleus and EDL muscles using a mild, low-work load tetanic contraction

protocol for 2-10 min where a high frequency (100 Hz) but a low train stimulation (1 s trains every 15

s) is applied. When this paper was under review, Jensen et al. (19) also reported that activation of the

α1 AMPK, but not the α2 AMPK subunit, is necessary for twitch-stimulated (2 Hz, 2 min) glucose

transport in soleus muscle. Our own protocol consisted of a middle-range frequency (50 Hz)

combined with a more intense tetanic stimulation rate (0.2 s trains every s) for 2 min. Whatever the

protocol used in these different studies, the general concept that can be derived from these data is

that both the α1 and α2-subunits of AMPK can be activated by low intensity contraction protocols

(lower tetanic or reduced frequency) and our data in KD-α2AMPK mice further indicate that this

activation is required for at least partial stimulation of glucose transport. These data also suggest that

compensatory activation of the α1 AMPK subunit may have contributed to maintain contraction-

induced glucose transport in muscle of α2 AMPK knockout mice (20). However, in muscle of KD-

α2AMPK mice, the forced expression of the α2AMPK dominant negative inhibitory mutant also

blunted the activation of the α1AMPK subunit by contraction (Fig. 4D), suggesting that the non-

70

abrogated portion of the contraction-induced glucose transport in EDL of KD-α2AMPK mice is not

explained by a compensatory increased activation of the α1AMPK subunit.

Our finding that submaximal contraction-induced glucose uptake is only partially inhibited in muscle

expressing a dominant-negative AMPK is in agreement with earlier work from Mu et al. (24) using a

more intense contraction stimulus in the same model and with the growing concept that AMPK-

independent mechanisms are also required for full stimulation of hexose uptake during contraction.

AMPK-independent mechanisms are also essential for GLUT4 translocation to the muscle cell

surface. Indeed, we previously found that AMPK activation with AICAR increases GLUT4

translocation to the plasma membrane but fails to induce recruitment of the transporter to T-tubules

(22), which represent 60% of the total cell surface area in skeletal muscle fibers (8, 10). Since we

have reported that exercise and contraction stimulate GLUT4 translocation to both the plasma

membrane and the T-tubules (30, 31), it is conceivable that contraction induces GLUT4 mobilization

to the tubular elements through an AMPK-independent mechanism.

The nature of AMPK-independent pathways remains elusive. It was suggested that Ca2+/calmodulin-

dependent protein kinase (CaMK) may represent one such pathway as inhibitors (e.g. KN-93) of this

kinase were reported to reduce contraction-induced glucose uptake during intense electrical

stimulation of fast- and slow-twitch muscles without affecting AMPK activation (40, 41). However, KN-

93 was recently shown to inhibit AMPK activity and glucose uptake stimulation at the onset (i.e. 2

min) of mild tetanic contraction of EDL muscle and further studies strontly suggested that low-

intensity contraction rapidly activates CaMK kinase upstream of AMPK (18). More recently, Raney

and Turcotte (27) also showed that KN-93 inhibits contraction-induced AMPK activity, glucose uptake

as well as lipid uptake and oxidation in perfused rat hindlimb muscles. Thus it is unlikely that CaMK

represents the AMPK-independent pathway that is stimulated by our contraction protocol which is of

short duration (2 min) and of submaximal intensity. Other molecules that have recently emerged as

potential contraction-induced metabolic signals in skeletal muscle are neuregulins, a family of growth

factors belonging to the epidermal growth factor family (5, 11). Guma and colleagues recently

reported that neuregulins are released by a Ca2+-dependent metalloproteinase activity, which

causes phosphorylation of the type I tyrosine kinase ErbB receptors. They further showed that

recombinant active neuregulin-1 (HRG) increases glucose transport in myocytes and rat skeletal

71

muscle. Both HRG and contraction-induced glucose uptake in isolated muscles are blunted by ErbB4

blockade. Importantly, HRG does not increase AMPK activity and AICAR-induced glucose transport

is not affected by ErbB4 blockade, strongly suggesting that neuregulins mediate at least part of

contraction-mediated glucose uptake through an AMPK-independent mechanism. It will be interesting

to investigate in future studies whether the neuregulin/ErbB4 pathway is activated by submaximal

contractions and contributes to glucose uptake stimulation in muscle of KD-α2AMPK mice.

In summary, the present study shows that when force development is matched between electrically-

stimulated EDL muscles from WT and KD-α2AMPK mice, contraction-induced glucose transport is

diminished by half in muscle of KD-α2AMPK mice. These results are thus consistent with a major role

for AMPK in contraction-induced glucose transport in vitro. Our data also support the contribution of

AMPK-independent mechanisms to the stimulation of glucose transport by contraction.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Canadian Diabetes Association to A.M. A.M. is the

recipient of a National Researcher Award of the “Fonds de la Recherche en Santé du Québec”. N.L.

and E. St-A were supported by studentships from the National Sciences and Engineering Research

Council of Canada and Association Diabète Québec. We thank Dr. Morrie Birnbaum for generously

providing KD-AMPKα2 mouse breeders.

72

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75

Legends to figures

Figure 1. Lack of AMPKα2 activation and glucose transport stimulation by AICAR in EDL of

AMPK-KD mice. (A) Western blots for AMPKα1, α2 and c-Myc expression in different tissues (heart

[H], adipose tissue [A], liver [L], gastrocnemius [G], tibialis [T], soleus [S] and EDL [E]) of wild-type

(WT) and muscle-specific AMPKα2 kinase-dead (KD) Tg mice. Results are representative of 5

mice/group. The AMPKα2 transgene contains a cmyc epitope tag, contributing to the slower

electrophoretic migration of AMPKα2 in KD mice. (B) Representative western blots for

pAMPKαThr172 and pACCSer79 levels. Equal loading for western blots was verified by α-tubulin

content in each lane. (C-F) Isolated EDL muscles from WT(■) and AMPKα2-KD Tg(□) were

stimulated for 30 min with 2mM AICAR. (C-D) Quantification of pAMPKαThr172 and pACCSer79

western blots, n= 6-8 mice/group, (E) AICAR-stimulated AMPKα1 or α2 kinase activity in muscle

lysates, n=3-7 mice/group. (F) AICAR-stimulated glucose transport, n=5 mice/group. Results are

presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01 versus basal in same genotype; §P<0.5, §§P<0.01

versus EDL from WT mice in same condition. nd : non-detectable

Figure 2. Force production and fatigability of EDL muscles of WT and KD-AMPKα2 mice. (A)

Force generation-frequency curves. Muscles were allowed to recover 15 min at which time the Lo

was determined by delivering 5 twitches. Muscles were allowed to rest for 30 min. The force

generated at increasing frequency stimulation was measured every 2 min. §P<0.05, §§P<0.01 versus

EDL from WT mice in same condition. (B) Electrical stimulation was performed during the last 2 min

of a 30 min incubation. Force generation was measured every fourth contraction during a 50Hz

(200ms train, 30V and 1/s rate), 2 min electrical stimulation in WT (●) and KD-AMPKα2 (○) EDL

muscles. The areas under the curve for WT (107.0±7.4) and KD-AMPKα2 (94.4±7.2) were not

significantly different (NS). No significant difference was observed in the Lo between WT and KD

EDL muscles (data not shown). Results presented as the mean ± SEM from n=8-9 mice/group.

Figure 3. Effects of different stimulation frequencies on AMPKα phosphorylation in EDL from

WT mice. Representative western blots and quantification for pAMPKαThr172 are shown. Muscles

were allowed to recover 15 min at which time the Lo was determined by delivering 5 twitches.

76

Electrical stimulation was performed during the last 2 min of a 30 min incubation at frequencies of 20,

40, 50 and 100 Hz. Results are presented as mean ± SEM of n=6 mice/group. *P<0.05 versus basal.

Figure 4. Lack of AMPKα2 activity reduces contraction-mediated glucose transport in EDL

from KD-AMPKα2 mice. EDLs were stimulated to contract for 2-min at 50Hz. The electrical

stimulation was performed during the last 2 min of a 30 min incubation as described in methods and

muscles were used for the following analyses. (A) Representative blots for pAMPKαThr172 and

pACCSer79 levels as detected by immunoblotting. Equal loading was verified by α-tubulin content in

each lane. (B-C) Quantification of pAMPKαThr172 and pACCSer79 immunoblots, n=4 mice/group.

*P<0.05 versus basal in same genotype. (D) Contraction-mediated AMPKα1 and α2 kinase activity,

n=5-11 mice/group. (E) Contraction-stimulated glucose transport in WT and KD-AMPKα2 EDL

muscles. Glucose transport was measured as described in Methods. n=8-9 mice/group. Results are

presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 versus basal condition from same

genotype, §P<0.05, §§P<0.01 versus WT mice in same condition. nd: non-detectable

77

Figure 1 Lack of AMPKα2 activation and glucose transport stimulation by AICAR in EDL of AMPK-KD mice

78

Figure 2 Force production and fatigability of EDL muscles of WT and KD-AMPKα2

79

Figure 3 Effects of different stimulation frequencies on AMPKα phosphorylation in EDL from WT mice

80

Figure 4 Lack of AMPKα2 activity reduces contraction-mediated glucose transport in EDL from KD-AMPKα2 mice

81

CHAPITRE 2

Long-term incubation of epitrochlearis muscle causes iNOS induction and nitric oxide production:

potential impact on muscle glucose transport

Emmanuelle St-Amand, Geneviève Pilon, Phillip J. White, Kathleen Lemieux, and André Marette*

Department of Medicine, Quebec Heart and Lung Institute (Laval Hospital), Pavillon Marguerite

d'Youville, Ste-Foy, Québec, Canada, G1V 4G5, and Laval University Hospital Research Center,

Metabolism, Vascular and Renal Health Axis, Quebec,

Canada G1V 4G2

* To whom correspondence should be addressed at: The Quebec Heart and Lung Institute Hôpital Laval, Pavillon Marguerite d'Youville, Bureau Y4340 Ste-Foy, Québec, Canada, G1V 4G5 Tel 418-656-8711 (ext. 3781) Fax 418-656-4749 Email: [email protected]

mailto:[email protected]

82

Résumé

L’incubation ex vivo de différents muscles squelettiques est une technique régulièrement utilisée

dans de nombreuses études. Toutefois, il fut rapporté que l’incubation prolongée du muscle

épitrochléen de rat altère le transport du glucose. Les mécanismes responsables de ces

perturbations métaboliques ne sont pas bien définis. Il est possible que l’incubation prolongée ex vivo

induise un stress et par conséquent, la production de facteurs inflammatoires dont la forme inductible

de monoxyde d’azote synthase (iNOS). En effet, l’induction de la protéine iNOS est connue pour

altérer le métabolisme du glucose dans le muscle squelettique. Les résultats de cette étude nous ont

permis d’observer qu’effectivement, dix heures d’incubation ex vivo du muscle épitrochléen de rat

entraînent une augmentation de l’expression de l’ARNm et de la protéine iNOS ainsi qu’une

importante production de NO. L’induction d’iNOS est également associée à une augmentation de

l’expression des transporteurs de glucose GLUT1. La présence d’un inhibiteur pharmacologique

d’iNOS, le 1400W, dans le milieu d’incubation prévient la surexpression des GLUT1. De plus,

l’utilisation d’un donneur de NO, le NOC-15, dans des cellules musculaires L6 a permis de confirmer

le lien causal entre la production de NO et l’augmentation de l’expression des GLUT1. Afin d’évaluer

les altérations métaboliques causées par l’induction d’iNOS dans le muscle épitrochléen lors d’une

incubation prolongée, nous avons mesuré le transport basal de glucose et celui stimulé à l’insuline

après une période de 10 heures. Aucune altération du transport basal du glucose ni de celui stimulé

par l’insuline ne fut observée à la suite de 10 heures d’incubation ex vivo du muscle épitrochléen.

Toutefois, le traitement de cellules musculaires L6 pendant 24 heures avec le NOC-15 résulte en une

augmentation de la captation du glucose en condition basale et par conséquent, une diminution du

transport du glucose stimulé par l’insuline. L’ensemble de ces résultats suggèrent que l’incubation

prolongée ex vivo d’un muscle squelettique entraîne la production de facteurs inflammatoires, qui

pourraient potentiellement participer au développement de perturbations métaboliques.

83

Abstract

Long-term incubation of isolated skeletal muscle has been reported to alter the regulation of glucose

uptake but the underlying mechanisms remain unclear. We hypothesized that stress associated with

long-term skeletal muscle incubation might trigger inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS) that

could impact upon both basal and insulin-stimulated glucose metabolism. Here we observed that

prolonged (10 hours) epitrochlearis muscle incubation leads to iNOS mRNA and protein induction, as

well as NO production in the incubation medium. These changes were associated with increased

iNOS activity and reduced constitutive NOS (cNOS) activity. iNOS induction in the incubation model

was associated with an increase in glucose transporter 1 (GLUT1) expression that was prevented by

the presence of a specific iNOS inhibitor (1400W) in the incubation medium. Importantly, these data

were upheld in L6 skeletal muscle cells where the NO donor NOC-15 also increased GLUT1

expression. We investigated whether iNOS induction alters glucose transport by measuring 2-

deoxyglucose (2-DG) uptake in epitrochlearis muscle following the 30 minute or 10 hour incubation

periods. Unexpectedly, long-term muscle incubation did not impair either basal or insulin-stimulated

glucose transport despite iNOS induction. However, 24 hours NOC-15 treatment in L6 skeletal

muscle cells did result in a significant dose dependent increase in basal glucose transport and

decreased of insulin stimulated glucose transport. Taken together, these results suggest that long-

term skeletal muscle incubation causes iNOS induction and leads to increased GLUT1 expression.

Induction of this pro inflammatory marker could potentially impact metabolic pathways during long

term muscle incubation. These findings provide futher support for reports of abnormal skeletal muscle

responses during long-term incubation and call for caution when using this technique for metabolic

studies.

84

Introduction

The isolated skeletal muscle preparation is a useful technique that permits the study of skeletal

muscle metabolism in a highly controlled environment ex vivo (6). This technique is widely employed

for the study of skeletal muscle responses to hormones and metabolic substrates and has played an

instrumental role in the development of our understanding of the etiology of skeletal muscle insulin

resistance. The utility of this technique for such studies relies on the premise that the viability of

skeletal muscle preparations can be maintained throughout the duration of the experimental

procedure with minimal impact on metabolic pathways. Indeed, Alkhateeb et al. have shown that the

viability of isolated soleus muscle can be maintained for 18h ex vivo without altering the expression of

the glucose transporter, GLUT4, and the fatty acid transporters FAT/CD36 and FABPpm (2). Despite

these findings, it has also been reported that long term skeletal muscle incubation may perturb

glucose metabolism by increasing basal glucose transport. However, the mechanism underlying this

effect of muscle incubation is poorly understood (14). Since such a metabolic perturbation may limit

the interpretation of findings derived from studies using this widely employed technique it is important

to fully understand the contributing mechanisms.

The radical gas nitric oxide (NO) is an essential player in an ever–growing number of cellular

processes. This diffusible and reactive molecular messenger is fundamental for the regulation of

vasodilatation, neurotransmission and immune responses. The synthesis of NO is generated by the

oxidation of nitrogen atoms from L-arginine by at least three isoforms of nitric oxide synthase (NOS):

the endothelial form (eNOS or NOS3), the neuronal form (nNOS or NOS1) and the inducible form

(iNOS or NOS2) (37). While eNOS and nNOS are expressed constitutively and transiently activated

by an increase in intracellular Ca2+, iNOS activity is relatively calcium independent and its prolonged

activation plays an important role in host defense. Indeed, iNOS is expressed at very low levels under

normal conditions; however, inflammatory cytokines and bacterial endotoxins markedly stimulate

iNOS expression (33). Although this mechanism likely evolved to protect the host from bacterial or

viral invaders, it is well accepted that uncontrolled iNOS induction is directly involved in the etiology of

many disease states. Indeed, iNOS has been associated with the necrosis of pancreatic islets,

hypotension, Huntington’s disease, Alzheimer’s disease, rheumatoid arthritis, and inflammatory

bowel disease (1, 9, 20, 22, 23).

85

Adding to these unfavorable effects of iNOS induction, we have demonstrated a role for iNOS in the

etiology of insulin resistance (3, 18, 28, 29). We have shown that iNOS knockout mice are protected

against high fat diet-induced insulin resistance (28) and these results have since been confirmed by

Noronha et al. (24). It has also been reported that treatment with the iNOS inhibitor L-NIL reverses

fasting hyperglycemia and restores hyperinsulinemia in ob/ob mice (11, 32). Furthermore we have

shown that iNOS induction by cytokines and LPS in L6 muscle cells causes insulin resistance by

blunting insulin-induced IRS-1 associated PI3-kinase activity, a key signaling event in insulin’s

metabolic action (29). iNOS has been detected in aorta and skeletal muscle of high-fat fed mice, in

skeletal muscle, liver and adipose tissue of ob/ob mice, in heart of diabetic Zucker rats and in skeletal

muscle and platelets from type 2 diabetic subjects (7, 24, 34). It is conceivable that induction of iNOS

as a result of stress associated with muscle denervation could also contribute to the altered glucose

metabolism in isolated skeletal muscles incubated for prolonged periods of time. However to the best

of our knowledge the effect of long term muscle incubation on iNOS expression and NO production

has not been investigated.

In the present study, we show that prolonged muscle incubation gives rise to iNOS induction causing

nitric oxide accumulation in the medium. Our findings point out a limitation for long-term muscle

incubation and further support a role for iNOS as a mediator of GLUT1 expression.

86

Experimental procedures

Materials

1400W was from Biomol Research Laboratories (Plymouth, PA). ADP-Sepharose 4B beads were

from Amersham Biosciences, and the Renaissance enhanced chemiluminescence kit was from

PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA). Monoclonal antibodies against iNOS and eNOS and the

polyclonal antibody against nNOS were obtained from Transduction Laboratories (Mississauga,

Canada). IRS-1 antibody (C-20) was obtained from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

NOC-15 was from Alexis (San Diego, Calif., USA). [3H]-L-arginine, [3H]2-deoxy-D-glucose and

[14C]mannitol were was from Amersham (Oakville, Ont., Canada) and Dowex AG50W-X8 from Bio-

Rad (Mississauga, Ont., Canada). α-Minimum essential medium (α-MEM), fetal bovine serum and

other tissue-culture products were obtained from Gibco BRL. Human insulin (Humulin R) was

purchased from Eli Lilly. 2,3-diaminonaphthotriazole (DAN) was purchased from Aldrich chemicals

(Milwaukee, WI) and all others products were from Sigma Chemicals (St. Louis, MO).

Animals

This study was approved by the Animal Care and Handling Committee of Laval University. Male

Sprague-Dawley rats (175–200 g) purchased from Charles River (Montreal, Qc, Canada) were

maintained on a 12 h dark and light schedule, and fed ad libitum with Purina rat chow.

Muscle isolation and incubation

Rats were anesthetised by a ketamine/xylazine injection after over-night fasting. The epitrochlearis

muscles were rapidly isolated and immediately flash frozen in liquid nitrogen or preincubated for 30

min in 4 ml of Krebs-Ringer bicarbonate (KRB) buffer pH 7.4 at 30˚C, containing 2 mM sodium

pyruvate (KRB-P). Muscles were then incubated for the appropriate times (up to 12 hours) in the KRB

buffer supplement containing 0.1% BSA and amino acids at concentrations similar to those found in

plasma (Asn 70µM, Thr 300µM, Ser 280µM, Asp 15µM, Glu 200 µM, Pro 180 µM, Gln 600 µM, Gly

400 µM, Ala 350 µM, Cys 40 µM, Met 70 µM, phe 1000 µM, Ile 100 µM, Leu 170 µM, Lys 600 µM,

His 80 µM, Trp 120 µM, Arg 80 µM, Val 200 µM, Tau 200 µM, Orn 90 µM, Cit 80 µM.). The

incubation medium was changed every two hours and was under constant oxygenation via

continuous bubbling of 95% O2-5% CO2. After the appropriate incubation period, the muscles were

87

extensively washed in KRB and frozen in liquid nitrogen, or kept for in vitro glucose uptake

determinations.

In vitro glucose uptake in isolated muscle

Glucose transport in isolated epitrochlearis muscles was measured using the glucose analogue 2-

[3H]2-deoxy-D-glucose as described previously (18).

Cell Culture

A line of L6 skeletal muscle cells (kind gift of Dr. Amira Klip, Hospital for Sick Children, Toronto, ON,

Canada) clonally selected for high fusion potential was used in the present study. The L6 cell line

was derived from neonatal rat thigh skeletal muscle cells and retains many morphological,

biochemical, and metabolic characteristics of skeletal muscle. Cells were grown and maintained in

monolayer culture in -MEM containing 2% (v/v) fetal bovine serum and 1% (v/v) antibiotic/antimycotic

solution (10000 units/ml penicillin, 10000 µg/ml streptomycin and 25 µg/ml amphotericin B) in an

atmosphere of 5% CO2 at 37°C. Next, different doses of NOC-15 (1μM, 5μM, 10μM, 25μM, 50μM,

100μM) were added to the appropriate wells for 24 hours. After the treatment, cells were washed and

glucose uptake assay and protein extraction were performed.

Glucose uptake assay

2-Deoxyglucose uptake was determined as previously described (3). Briefly, L6 myotubes were

incubated with or without NOC-15 for 24h, followed by the addition of insulin 100nM (or medium

alone) for an additional 30 min. Cells were rinsed once with glucose-free Hepes-buffered saline

solution, pH 7.4 (140 mM NaCl, 20 mM Hepes/Na, 5 mM KCl, 2.5 mM MgSO4 and 1 mM CaCl2), and

were subsequently incubated for 8 min with 10 µM 2-deoxy-D-glucose containing 0.3 µCi/ml 2-

deoxy-D-[3H]glucose in the same buffer. After the incubation in transport medium, cells were rinsed

three times with ice-cold saline solution, and then disrupted by adding 50 mM NaOH. Cell-associated

radioactivity was determined by scintillation counting. Protein concentrations were determined by the

bicinchoninic acid method (Pierce), and the results were expressed in pmol/min per mg. Glucose

uptake values were corrected for non-carrier-mediated transport by measuring hexose uptake in the

presence of 10 µM cytochalasin B.

88

Western blotting

Protein extraction was performed using (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% Triton

X-100, 1 mM EDTA, 2 mM Na3VO4, 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 10 µg/ml aprotinin, and 10

µg/ml leupeptin), and insoluble material was removed by centrifugation at 12,000 x g. For western

blotting, protein extracts were resolved by SDS-PAGE and transferred to a polyvinylidene difluoride

(PVDF) membrane. Blots were blocked with 5% non-fat dry milk in 10 mM Tris (pH 7.5), 150 mM

NaCl, and 0.05% Tween 20; incubated with primary antibody; and then incubated with a secondary

horseradish-conjugated antibody. Immunoreactive bands were visualized by enhanced

chemiluminescence.

RNA analysis

Total cellular RNA was isolated using guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction and

iNOS, eNOS, nNOS, GLUT4 and GLUT1 mRNAs were measured by semi-quantitative RT-PCR as

described previously (3, 27).

Nitric oxide synthase activity

Nitric oxide synthase activity was quantified by the conversion of [3H]-L-arginine to [3H]-L-citrulline as

described previously (3, 28).

NO production

NO production was measured by fluorometric detection of both nitrite and nitrate products (NOx)

levels in plasma and incubation medium. Nitrate was reduced to nitrite using nitrate reductase and

the NADPH regenerating system as described previously (30) . NOx levels were determined by

measuring the fluorescence of 2,3-diaminonaphthotriazole DAN at ex of 360 nm and em of 450 nm.

Data Analysis

The effects of the treatments were compared by an analysis of variance followed by Fisher's post hoc

test. Differences were considered to be statistically significant at P < 0.05

89

Results

Long-term incubation of epitrochlearis muscle modulates NOS expression

We speculated that stress associated with muscle incubation may lead to induction of the iNOS

enzyme. Rat epitrochlearis muscles were isolated and snap frozen immediately in liquid nitrogen or

incubated for 10 hours and then snap frozen. In figure 1 we show that long-term muscle incubation

leads to robust iNOS mRNA induction (Fig. 1A) and protein expression (Fig. 1B). In contrast, the two

calcium dependent constitutive NOS, eNOS and nNOS, were down-regulated following muscle

incubation. This alteration in NOS expression was associated with shifts in NOS activity. Indeed,

constitutive NOS activity (e.g. eNOS/nNOS-dependent) was reduced by long-term skeletal muscle

incubation while iNOS activity was up-regulated under the same conditions (Fig. 1C). We also

measured NO2 accumulation, an index of NO production, in the incubation medium. In accordance

with the iNOS expression and activity data we observed that NO production was ~ 4 times higher in

long-term incubated muscle medium compared to the control muscles that were only pre-incubated

for 30 min (Fig.1D). These results suggest that long-term incubation of skeletal muscle enhances

iNOS expression and activity.

Time course of iNOS and GLUT1 induction

To further characterize iNOS modulation by muscle incubation, we examined the time course of iNOS

induction. Muscles were incubated and frozen every hour for up to 12 hours. In muscles incubated for

3 hours, a slight iNOS induction was observed both at the protein (Fig. 2A) and mRNA (Fig. 2B)

levels, followed by a stronger induction at ≥ 4 hours. We have previously reported that iNOS

induction by cytokines and LPS increased the expression of the glucose transporter-1 (GLUT1),

leading to increased basal glucose transport (3). We thus next investigated whether GLUT1 was

associated with iNOS induction in the incubated epitrochlearis. GLUT1 expression was indeed

induced during the muscle incubation and the time course of its expression closely followed the time

course of iNOS expression (Fig. 2B).

iNOS induction causes GLUT1 expression in epitrochlearis muscle

To clarify the link between iNOS induction and GLUT1 expression, we measured the expression of

GLUT1 in long-term incubated muscles in the presence or absence of 1400W, a specific iNOS

90

inhibitor. GLUT1 mRNA expression was induced by long-term skeletal muscle incubation but this

response was repressed by the presence of the iNOS inhibitor (Fig. 3A). Importantly, no changes in

GLUT4 expression were observed in incubated muscle treated with 1400W (Fig. 3B). These results

confirm GLUT1 expression is dependent on iNOS induction. We next sought to determine whether

iNOS induction leads to alterations of glucose uptake in these long-term incubated muscles. We

measured basal and insulin-stimulated glucose transport in muscle incubated following the 30 minute

or 10 hour incubation periods. Despite elevated GLUT1 expression, basal glucose transport was not

significantly different in long-term incubated muscle compared to short-term incubated muscle. (Fig.

3C) Moreover, insulin was found to increase glucose transport (~1.5 fold) in both conditions and there

was no difference observed between the 30 minute and 10 hour incubations. (Fig. 3C-D)

NO induction increases GLUT1 expression and basal glucose uptake in L6 muscle cells

To further test the role of high NO output in mediating GLUT1 expression and glucose transport, we

looked at the effects of NOC-15, a chemical NO donor, in L6 muscle cells after 24 hour. Increasing

doses of NOC-15 caused a dose dependent increase in GLUT1 mRNA expression (Fig. 4A). The

induction of GLUT1 mRNA corresponded with GLUT1 protein expression at 50 and 100 µM of NOC-

15 (Fig. 4B). As in incubated muscle, no effect of the NO donor was observed on GLUT4 mRNA

expression in this cellular model (Fig. 4A). We next sought to determine whether NO leads to

alterations of glucose uptake in these cells, we looked at the effects of NOC-15 on basal and insulin-

stimulated glucose uptake. L6 myocytes were incubated with increasing doses of NOC-15 (1μM,

5μM, 25μM) for 24h, followed by measurement of glucose uptake. Basal glucose uptake was

augmented by the NO donor while insulin-stimulated glucose uptake was reduced (Fig. 4C and 4D).

In contrast to our observations in incubated muscles, the presence of NO in the incubation media for

24 hour causes perturbations of glucose metabolism in L6 myocytes.

91

Discussion

We have previously established a causal link between iNOS induction and skeletal muscle insulin

resistance. Using known inducers of iNOS, such as inflammatory cytokines and LPS, we showed that

iNOS induction impairs insulin stimulated glucose transport in myocytes and rat muscle (3, 18).

Furthermore, at the genetic level, we demonstrated that targeted disruption of iNOS prevents obesity-

linked skeletal muscle insulin resistance caused by high fat feeding (28). In the present study, despite

a strong iNOS induction in rat epitrochlearis muscle and NO release, neither basal nor insulin-

stimulated glucose uptake were altered after a 10 hour ex vivo incubation Here we observed that,

long-term skeletal muscle incubation induces iNOS, giving rise to GLUT1 expression. However,

under these conditions, we observed that basal glucose uptake was not altered and insulin mediated

glucose transport was comparable following a 10 hour incubation period. However, 24 hour of

exposure to NOC-15, a NO donor, lead to GLUT1 overexpression that was associated with increased

basal glucose and reduced insulin-stimulated glucose uptake in L6 myocytes. According to the

results observed in L6 cells, we could hypothesize that a longer incubation time, and thus a longer

NO exposure would result in a significant increase in glucose uptake in epitrochlearis muscle.

Therefore the time limitations of long term muscle incubation may explain the difference observed on

glucose metabolism between isolated skeletal muscle and cultured muscle cells. Taken together,

these results provide further understanding of the impact of iNOS on insulin sensitivity and glucose

metabolism.

The elevated GLUT1 protein observed in long-term incubated muscles is in line with the findings of a

previous study (19). Here, it had been proposed that the increase in basal glucose uptake in

incubated muscle could be due to a greater amount of glucose reaching the cells by diffusion

compared to the amount of glucose available from capillaries within the muscle in vivo. Furthermore,

it was also proposed that a less-than optimal supply of oxygen to the incubated muscle could give

rise to regional hypoxia and an increase in basal glucose uptake (6). However, it is well appreciated

that GLUT1 is induced in stressful conditions such as oxidative stress, denervation, hyperosmolarity,

glucose deprivation and hypoxia (5, 8, 16). Indeed, in stressful situations, where energy is critical for

survival, GLUT1 is mobilized to fulfill essential functions and ensure host defense. It is noteworthy

that such stress situations have also been linked to insulin resistance (25, 36).

92

One might consider that long-term incubation of isolated muscles as a stressful process since it

involves muscle denervation and prolonged isolation from the physiological milieu. Accordingly, it has

been demonstrated that situations such as crush injuries, shear stress or oxidative stress, also lead

to iNOS induction (12, 21, 31). Under these circumstances, cellular damage or stress may induce

cytokine expression leading to iNOS induction. Interestingly, it has been shown that heat shock

protein 70 (HSP70), which is produced during cellular stress, enhances cytokine-induced iNOS

expression by activating p38 MAP kinase (4). In our model, muscle denervation may have caused

enough stress to increase cytokine expression and/or activate stress-signaling pathways leading to

iNOS induction. Importantly, high NO concentrations are known to activate GLUT1 in different

models. In fact, we have previously reported that cytokine and LPS treatment increases glucose

transport in L6 muscle cells via GLUT1 induction (3). Furthermore, the NO donors sodium

nitroprusside (SNP) and diethylenetriamine (DETA) induce GLUT1 in HUVEC cells (26). However, to

the best of our knowledge, the potential role of NO as an inducer of GLUT1 in isolated intact muscle

has never been investigated. Here, we provide novel complementary evidence that iNOS induction

leads to GLUT1 overexpression since the iNOS inhibitor 1400W blunted GLUT1 protein expression.

We also observed a decreased expression and activity of constitutive NOS isoforms following long-

term skeletal muscle incubation. This downregulation could be explained by the effect of high NO

output from iNOS. Indeed, some studies have reported that NO inhibits NOS activity through a

negative feedback loop and that nNOS and eNOS are more sensitive than iNOS to the inhibitory

action of NO (13). Our finding of reduced expression of eNOS and nNOS is consistent with previous

observations that iNOS induction in endothelial cells reduces the expression of eNOS (10). It is thus

possible that this mechanism has evolved to temporarily inhibit cNOS in an effort to keep cofactors

available for iNOS during infection.

While previous studies on denervated and incubated muscles reported a decrease in GLUT4

expression (17), we did not observe any change in the expression of this glucose transporter. This

apparent discrepancy may be explained by the composition of the muscle fiber type. Following

denervation, Handberg et al. reported a much greater GLUT4 decrement in oxidative red muscle

(type I) compared to (type IIB) glycolytic white muscle (15). Thus, the fact that epitrochlearis is a fast

93

twitch glycolytic muscle could explain why we did not observe a reduction of GLUT4 expression in

our study. However, Alkhateeb et al. (2) failed to detect a reduction in GLUT4 expression after long

term incubation of the soleus muscle. Taken together, our data are more consistent with the

hypothesis that long-term skeletal muscle incubation modifies glucose metabolism by upregulation of

GLUT1 expression. Importantly, since the induction of iNOS and GLUT1 are clearly evident after just

6 hours of muscle incubation. These data illustrate a potential limitation of using prolonged skeletal

muscle incubation to study glucose metabolism ex vivo.

In summary, our data clearly demonstrate that long-term skeletal muscle incubation causes robust

iNOS induction leading to elevated GLUT1 expression that could impact glucose metabolism. Taken

together these results provide a potential molecular basis for the alterations in glucose utilization that

manifest in patients suffering from denervated muscle following injuries. Moreover our findings

provide important considerations for researchers planning long-term incubation studies with isolated

muscle preparations.

94

References

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97

Legends to figures

Figure 1. Long-term incubation of epitrochlearis muscle modulates NOS expression. Rat

epitrochlearis muscles were isolated and frozen immediately or incubated for 10h before being

frozen. A) RT-PCR of iNOS, eNOS, nNOS and GAPDH mRNA. B) immunoblot of iNOS, eNOS and

nNOS protein C) NOS activity in non incubated (CTL) or incubated muscle (INC). D) NO production

in the incubation medium was measured by nitrite/nitrate (NOx) accumulation. Results in C and D

represent the mean± SD of 2-3 independent experiments. * P<0.05 vs corresponding CTL values.

Figure 2. Time course of incubation-mediated induction of iNOS and GLUT1. Rat epitrochlearis

muscles were removed and frozen immediately or incubated for the indicated hours before being

frozen. Muscle were processed for protein or RNA isolation and used for western blot analyses of

iNOS protein (A) or RT-PCR determinations of iNOS and GLUT1 mRNAs (B). Immunoblots and gels

are representative at 2 independent time-course experiments.

Figure 3. iNOS induction causes GLUT1 expression in epitrochlearis muscle. (A) and (B) show

GLUT1 and GLUT4 mRNA expression, respectively, following muscle incubation in the presence or

absence of specific iNOS inhibitor, 1400W (0.1M) . (C) Basal (BA) and insulin-stimulated (INS)

glucose transport were measured in muscle that was incubated following a 30 min or 10 hours

period. (D) Insulin-stimulated glucose transport is expressed as fold stimulation over basal. Results

represent the mean ± SE of 5-7 independent experiments. * P<0.05 vs corresponding CTL values. #

P<0.05 vs corresponding INC (C) or Insulin (E) values.

Figure 4. NO induction increase GLUT1 expression and basal glucose uptake in L6 muscle

cells. L6 muscle cells were incubated with increasing doses of the chemical NO donor NOC-15. (A)

GLUT1 and GLUT4 were measured by RT-PCR (B) GLUT1 protein expression was assessed by

western blotting. (C) Basal and (D) insulin-stimulated 2-DG uptake were measured in L6 cells

pretreated for 24 hours with increasing doses of NOC-15. Results in C and D represent the mean±

SE of 6-7 independent experiments. * P<0.05 vs cells not exposed to NOC-15.

98

Figure 1 Long-term incubation of epitrochlearis muscle modulates NOS expression

99

Figure 2 Time course of incubation-mediated induction of iNOS and GLUT1

100

Figure 3 iNOS induction causes GLUT1 expression in epitrochlearis muscle

101

Figure 4 NO induction increase GLUT1 expression and basal glucose uptake inL6 muscle cells

103

CONCLUSION

Le tissu musculaire squelettique représente l’organe le plus volumineux du corps humain. Outre sa

capacité à mettre en mouvement les os du squelette, il joue un rôle primordial dans le maintien de

l’homéostasie énergétique. Chez l’humain, en condition à jeun, le muscle squelettique capte environ

soixante-cinq pourcent du glucose sanguin produit par le foie tandis qu’en situation post prandiale,

environ quatre-vingt pourcent du transport du glucose stimulé par l’insuline se font au niveau du

muscle squelettique. Le glucose est le substrat énergétique principal du muscle squelettique. Ainsi, il

n’est plus à démontrer qu’une diminution de la sensibilité aux effets de l’insuline au niveau du muscle

squelettique entraîne des perturbations métaboliques majeures.

Les travaux de notre laboratoire ont permis de révéler l’implication de différentes protéines, dont

l’AMPK et iNOS, dans la régulation du transport du glucose dans le muscle squelettique.

Le rôle de l’AMPK dans le transport du glucose induit par la

contraction musculaire

Tel que décrit précédemment, de nombreuses études ont rapporté l’implication de la kinase activée

par l’adénosine monophosphate (AMPK) dans la régulation du métabolisme énergétique au cours

des dernières années. En effet, l’AMPK est sensible aux variations du rapport AMP/ADP : ATP, un

indicateur du statut énergétique cellulaire. L’augmentation du rapport ADP : ATP, et plus

particulièrement l’augmentation du rapport AMP : ATP, par un stress physiologique active l’AMPK.

Rapidement, il fut démontré que l’exercice physique induit l’activation de l’AMPK dans le muscle

squelettique. De plus, l’utilisation d’un activateur pharmacologique de l’AMPK, l’AICAR, suggéra

l’implication de l’AMPK dans la régulation du transport du glucose dans la cellule musculaire.

Toutefois, encore à ce jour et malgré de nombreux modèles décrits à la section 2.4, le rôle de

l’AMPK dans la régulation du transport du glucose lors de la contraction musculaire demeure

controversé.

L’arrivée du premier modèle transgénique d’invalidation de la sous-unité α2 de l’AMPK (AMPK KD1),

spécifique au tissu musculaire, permit d’observer une réduction du transport du glucose à la suite de

104

protocoles de contraction ex vivo et in situ. Cependant, ce modèle animal se révéla intolérant à

l’exercice physique et une étude subséquente démontra une diminution de la force absolue des

muscles EDL et soléaire [299, 300]. Considérant que le transport du glucose induit par la contraction

musculaire est proportionnel à la force développée par le muscle, l’interprétation des résultats

préalablement obtenus devint discutable.

Tels nos prédécesseurs et la majorité des études subséquentes, nous avons observé une diminution

de la force maximale absolue du muscle EDL des souris AMPK KD1. Afin de confirmer ou non

l’implication de l’AMPK dans la régulation du transport du glucose induit par la contraction

musculaire, nous avons élaboré un protocole de stimulation électrique ex vivo au cours duquel les

muscles EDL des souris AMPK KD1 et des souris contrôles développaient une force équivalente

pour un même stimulus donné. Sous ces conditions expérimentales, nous avons obtenu une

diminution de cinquante pourcent de la captation du glucose par le muscle EDL à la suite du

protocole de contraction musculaire ex vivo. Ainsi, nos résultats suggèrent un rôle essentiel de

l’AMPK dans la captation du glucose lors de la contraction musculaire bien que des voies alternatives

soient également impliquées. De plus, notre étude a démontré l’importance du choix du protocole de

contraction musculaire lors de la comparaison de deux phénotypes musculaires différents.

Des études subséquentes au cours desquelles d’autres protocoles de contraction musculaire et/ou

d’autres modèles d’invalidation génétique de l’AMPK furent utilisés rapportèrent des conclusions à la

fois similaires et contradictoires. L’ensemble de ces études ne permet toujours pas de confirmer ou

non l’implication de l’AMPK dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire.

Chacune d’entre elles apporta son lot de réponses et d’interrogations. Le choix du type (ex vivo, in

situ, in vivo), de la durée et de l’intensité de la contraction musculaire ainsi que et le phénotype

musculaire généré par l’invalidation génétique de la protéine doivent être considérés lors de

l’interprétation des résultats. En effet, sur un total de douze études portant sur l’implication de l’AMPK

dans le transport du glucose au cours d’un protocole de contraction musculaire, neuf modèles

différents d’invalidation génétique de l’AMPK furent utilisés. Ceci dit, toutes ces études s’entendent

sur la présence de voies AMPK-indépendantes dans le transport du glucose induit par la contraction

musculaire. Par ailleurs, la section 1.4 présente diverses autres protéines proposées pour réguler le

transport du glucose induit par la contraction musculaire.

105

L’entrée du glucose dans les myocytes au cours d’un exercice physique dépend à la fois de la

disponibilité du glucose sanguin, du transport du glucose par l’intermédiaire des GLUT4 et de la

phosphorylation du glucose à l’intérieur de la cellule. Chez l’humain, au cours d’un exercice

physique, le flux sanguin en direction des muscles squelettiques peut augmenter jusqu’à vingt fois ce

qui accroit considérablement la quantité de glucose disponible [450]. De plus, l’exercice physique

augmente le recrutement de capillaires permettant d’augmenter les échanges entre la circulation

sanguine et la cellule musculaire tant chez l’humain que chez l’animal [451-454]. Une diminution du

nombre de capillaires au niveau du muscle chez la souris AMPK KD1 fut rapportée. De plus, une

réduction de l’expression de nNOSμ ainsi que de l’activité totale de NOS fut observée dans les

muscles gastrocnémien et VL de la souris AMPK KD1 [303]. Par ailleurs, une diminution de la

phosphorylation du résidu sérine 1446 (Ser1446) de nNOSμ fut rapportée dans le muscle TA de la

souris AMPK β1β2M KO parallèlement à une réduction de la densité de capillaires et à une

augmentation de l’agrégation plaquettaire [455]. Le nNOSμ est connu pour être, du moins

partiellement, responsable de la vasodilation des artérioles lors de la contraction musculaire [456].

Ces altérations vasculaires pourraient contribuer à la diminution du transport du glucose observée

chez la souris AMPK KD1 dans certaines études.

Outre la disponibilité du glucose sanguin, la translocation des GLUT4 à la membrane plasmique et

aux tubules-T régule la captation du glucose au cours d’un exercice physique. Chez les rongeurs,

une relation directe entre le contenu en GLUT4 et le transport du glucose lors d’un protocole de

contraction musculaire ex vivo fut rapportée ainsi que lors d’un exercice musculaire d’extension de la

jambe chez l’humain [26, 457]. Ces résultats suggèrent que le contenu en GLUT4 régule directement

le transport du glucose lors d’une contraction musculaire. Toutefois, aucune différence du contenu

musculaire en GLUT4 ne fut observée dans les différents modèles d’invalidation génétique de

l’AMPK, de sorte que la perte des différentes sous-unités de l’AMPK n’influence pas l’expression de

GLUT4. De plus, aucun défaut de la translocation de GLUT4 induite par la contraction musculaire ne

fut rapporté chez la souris AMPK α2iTg. Toutefois, la translocation des GLUT4 à la suite d’une

stimulation AICAR est abolie chez ce même modèle suggérant l’implication de l’AMPK dans la

mobilisation des GLUT4 dans la cellule musculaire [458].

106

Par ailleurs, le contenu musculaire en glycogène semble également influer sur la translocation des

GLUT4 au cours de la contraction. En effet, il fut observé que le contenu en glycogène musculaire et

la translocation des GLUT4 lors d’un exercice physique sont corrélés négativement chez le rat. Ainsi,

plus les réserves en glycogène musculaire sont diminuées, plus il y a translocation de GLUT4 et vice

versa [459]. Il fut rapporté que le contenu musculaire en glycogène tant au repos qu’à la suite d’un

protocole de contraction musculaire, est réduit dans la majorité des modèles d’invalidation génétique

de l’AMPK. En présence d’un déficit en glycogène musculaire, une augmentation plus importante de

la translocation de GLUT4 par des voies indépendantes de l’AMPK pourrait contribuer à masquer le

défaut observé au niveau du transport du glucose induit par la contraction musculaire en l’absence

de l’AMPK dans certaines études.

Une fois à l’intérieur de la cellule musculaire, le glucose est phosphorylé en glucose-6-phosphate

(G6P) par l’intervention de l’hexokinase II (HKII). Certaines études suggèrent que chez la souris, la

phosphorylation du glucose serait une étape limitante dans la captation du glucose par le muscle

squelettique lors d’un exercice physique. La surexpression de HKII augmente la captation du glucose

induite par la contraction musculaire tandis que l’effet inverse fut observé chez la souris partiellement

invalidée pour la HKII (souris HKII+/-) [460, 461]. Des résultats non publiés de notre laboratoire ont

démontré une diminution de l’ARNm de la HKII dans le muscle EDL des souris AMPK KD1. Une

diminution de l’expression de la HKII pourrait contribuer au défaut observé au niveau du transport du

glucose chez la souris AMPK KD1 dans certaines études. Toutefois, cette observation ne fut pas

corroborée par d’autres études. Par ailleurs, chez l’humain, cette étape, la phosphorylation du

glucose, semble s’avérer beaucoup moins limitante dans la régulation du transport du glucose dans

le muscle squelettique au cours d’un exercice physique. Le glucose sanguin semble constituer

l’apport énergétique primordial chez la souris lors de la contraction musculaire en comparaison au

glycogène musculaire. En effet, les réserves de glycogène musculaire sont beaucoup plus faibles

chez la souris comparativement à l’humain. De plus, l’invalidation génétique de la synthase du

glycogène qui résulte en l’absence de glycogène musculaire n’altère pas les capacités physiques de

la souris lors d’un exercice sur tapis roulant tandis qu’il est bien connu que des niveaux bas en

glycogène musculaire limitent les performances physiques chez l’humain [462, 463].

107

Finalement, tous les modèles murins d’invalidation de l’AMPK utilisés se caractérisent par une

intolérance à l’exercice qui se traduit par une diminution de la vitesse maximale et de la distance

parcourue sur tapis roulant ainsi qu’une diminution de l’activité physique volontaire. Les études

s’entendent de plus en plus pour dire que l’invalidation génétique de l’AMPK altère la fonction

mitochondriale de la cellule musculaire, et plus particulièrement au niveau de la chaîne de transport

des électrons. Un défaut de la fonction mitochondriale ainsi qu’une diminution des échanges entre le

myocyte et la circulation sanguine sont des facteurs qui peuvent contribuer à réduire la production

d’énergie nécessaire au maintien d’une activité contractile normale chez la souris déficiente en

AMPK. De plus, des dommages ultrastructuraux au niveau de la cellule musculaire ainsi que la

présence de fibres musculaires nécrosées et pourvues de noyaux centraux furent récemment

rapportés dans les muscles TA et gastrocnémien des souris AMPKα1α2 mdKO et AMPKβ1β2M KO

[306, 455]. L’ensemble de ces résultats suggère l’implication de l’AMPK dans le maintien de

l’intégrité du tissu musculaire squelettique. De plus, ces nouvelles données peuvent contribuer à

expliquer la diminution de la force maximale absolue observée chez la souris génétiquement

invalidée pour l’AMPK.

Somme toute, bien que l’implication de l’AMPK dans la régulation du transport du glucose induit par

la contraction musculaire demeure controversée, ces nombreuses études ont permis de révéler

l’importance de l’AMPK, à bien des égards, dans le tissu musculaire squelettique. De plus, il ne faut

pas négliger que tous les modèles utilisés sont invalidés pour l’AMPK depuis leur développement

embryonnaire. La présence de mécanismes compensatoires afin de contrecarrer les impacts

physiologiques et métaboliques occasionnés par la perte de l’AMPK ne peut être écartée dans

l’interprétation des résultats de chacune de ces études.

Du point de vue des perspectives, les résultats obtenus par Abbott et ses collaborateurs laissent

suggérer que l’implication de l’AMPK dans le transport du glucose induit par la contraction musculaire

serait dépendante de la durée de la contraction [464]. Il serait donc pertinent de comparer les

résultats que nous avons obtenus, soit une diminution de la captation du glucose à la suite d’une

contraction d’intensité élevée d’une durée de deux minutes, à différents protocoles de contraction

d’intensité et de durée variable. L’apport des différents substrats énergétiques utilisés au cours d’un

exercice physique varie en fonction de l’intensité et de la durée de celui-ci, il serait donc intéressant

108

de clarifier l’implication de l’AMPK dans la régulation du transport du glucose en fonction de ces

mêmes paramètres.

De plus, nous ne pouvons exclure la présence de mécanismes compensatoires, connus ou non, lors

de l’utilisation d’un modèle murin transgénique, telle la souris AMPK KD1 que nous avons utilisée.

Par ailleurs, Dzamko et ses collaborateurs ont démontré que la phosphorylation de plusieurs kinases

est plus importante chez la souris AMPK KD1 en réponse à une contraction musculaire

comparativement aux souris contrôles [465]. Ainsi, l’invalidation génétique de l’AMPK depuis le

développement embryonnaire n’est sans doute pas le modèle idéal pour étudier son rôle dans le

métabolisme du glucose au cours d’une contraction musculaire. Au cours des dernières années, un

nouveau modèle d’invalidation a vu le jour. Il s’agit de l’invalidation génétique conditionnelle qui

consiste à contrôler le moment de l’induction de la mutation grâce, entre autre, à l’utilisation de

protéines de fusion sur un gène spécifique. Cette nouvelle approche d’invalidation pourrait nous

permettre d’invalider le gène de l’AMPK au moment voulu, c’est-à-dire juste avant d’entamer des

protocoles de contractions musculaires/d’exercice physique.

Il est probable que des mécanismes compensatoires pourraient également survenir chez ces

modèles d’invalidation conditionnelle. Ainsi, des études phosphoprotéomiques sur des muscles

préalablement contractés de souris contrôles et/ou de souris transgéniques, suivant différents

protocoles de contraction, pourraient nous donner des pistes sur de nouvelles kinases phosphorylées

au cours d’un exercice physique. Des études complémentaires seraient nécessaires afin de clarifier

le rôle de ces protéines dans la régulation du transport du glucose induit par la contraction

musculaire. Ceci dit, il est primordial de garder à l’esprit qu’il s’agit de modèles murins et qu’il existe

des différences importantes entre la souris et l’homme, entre autre chose, au niveau du métabolisme

du glucose.

109

L’incubation à long terme du muscle épitrochléen cause

l’induction d’iNOS et l’augmentation de l’expression de GLUT1

Tel que pour la contraction musculaire par stimulation électrique, l’utilisation de la technique

d’incubation ex vivo d’un muscle squelettique procure certains avantages. En effet, elle permet

d’étudier les impacts de différents traitements sur diverses fonctions musculaires tout en éliminant les

facteurs exogènes qui pourraient influencer l’interprétation des résultats. Toutefois, des changements

au niveau du métabolisme énergétique musculaire furent observés lors d’une incubation ex vivo

prolongée, et plus particulièrement au niveau du transport du glucose [466]. Bien que les modalités

d’incubation soient maximisées pour simuler les conditions physiologiques environnantes du muscle

squelettique à l’intérieur de l’organisme, il n’en demeure pas moins que l’extraction du muscle, en

soi, représente un stress physiologique.

Il est bien admis que la réponse physiologique à un stress modifie le métabolisme glucidique. De

nombreuses études ont démontré la présence d’une résistance à l’insuline des tissus périphériques

simultanément à une augmentation du transport basal de glucose à la suite de divers stress dont les

accidents traumatiques, les états septiques et post opératoires ainsi qu’à la suite d’un exercice

physique [467-470]. La libération de cytokines en présence d’un stress est l’un des mécanismes

proposés pour expliquer ces changements observés au niveau du métabolisme du glucose.

L’implication de la voie de synthèse du NO dans l’action des cytokines est fortement suggérée.

Le NO joue un rôle essentiel dans divers processus cellulaires dont la vasodilatation des vaisseaux

sanguins, la transmission du signal nerveux et la réponse immunitaire. Toutefois, la surproduction de

NO par l’induction prolongée d’iNOS est associée à diverses conditions pathologiques dont la

résistance à l’insuline musculaire. Par ailleurs, nous avons précédemment démontré que l’induction

d’iNOS par un cocktail de cytokines/LPS modifie l’expression des transporteurs de glucose GLUT1 et

GLUT4 dans les cellules L6. L’ensemble de ces modifications altère le transport basal de glucose et

cause une résistance à l’insuline. L’utilisation d’un inhibiteur de NOS, le L-NAME, rétablit l’expression

de GLUT1 à des niveaux basaux dans ce modèle cellulaire suggérant une interaction entre iNOS et

la régulation de l’expression de GLUT1 [15].

110

À la suite d’une période de dix heures d’incubation ex vivo, nous avons observé une augmentation

de l’expression de la protéine iNOS dans le muscle épitrochléen de rat. Cette induction est

concomitante à une diminution de l’expression des isoformes eNOS et nNOS. Il est possible que la

diminution de l’expression des isoformes eNOS et nNOS soit attribuable à l’augmentation de

l’expression de iNOS. La protéine iNOS est connue pour induire une grande quantité de NO

comparativement aux deux autres isoformes. Conséquement, nous avons mesuré une augmentation

des concentrations de NO dans le milieu d’incubation. De plus, nous avons démontré que l’induction

d’iNOS cause une surexpression de GLUT1 lors de l’incubation ex vivo prolongée du muscle

épitrochléen de rat. L’ajout d’un inhibiteur spécifique d’iNOS, le 1400W, rétablit l’expression de

GLUT1 à des niveaux basaux. Toutefois, l’expression de GLUT4 n’est pas altérée en réponse à une

incubation prolongée du muscle épitrochléen. Ceci dit, nous n’avons détecté aucun défaut au niveau

du transport basal de glucose et de celui stimulé par un traitement à l’insuline à la suite d’une période

de dix heures d’incubation, malgré l’induction d’iNOS.

Afin de tester l’impact d’une exposition à de fortes concentrations de NO sur une plus longue période

de temps, nous avons traité des cellules musculaires L6 avec un donneur de NO, le NOC-15, pour

une période de vingt-quatre heures. Tel qu’observé lors d’une incubation ex vivo de dix heures du

muscle épitrochléen, nous avons observé une augmentation de l’expression de GLUT1, mais aucune

variation de l’expression de GLUT4. Cette surexpression de GLUT1 dans les cellules L6 se traduit

par une augmentation dose-dépendante significative du transport basal de glucose.

L’ensemble de ces résultats suggère que l’incubation ex vivo prolongée du muscle épitrochléen induit

l’expression d’iNOS et par conséquence, accroît la synthèse de NO. La production de NO entraîne

une augmentation de l’expression de GLUT1 sans toutefois, modifier de façon significative le

transport du glucose au cours d’une incubation sur une période de dix heures. Néanmoins, un

traitement de vingt-quatre heures avec un donneur de NO dans les cellules musculaires L6 résulte

en une surexpression de GLUT1 et une augmentation significative du transport basal de glucose. Les

résultats obtenus grâce au modèle cellulaire nous permettent de renforcer le lien causal entre la

synthèse de NO et la régulation de l’expression de GLUT1.

111

Dans notre modèle expérimental, nous observons une induction nette de l’expression d’iNOS dans le

muscle épitrochléen de rat à partir de la quatrième heure d’incubation ex vivo. Des résultats

similaires furent obtenus chez la souris au cours d’une étude subséquente. En effet, nous avons

mesuré une augmentation de l’ARNm d’iNOS dans les muscles EDL et soléaire de souris à la suite

d’une incubation ex vivo d’une durée de quatre heures. À ce jour, les cytokines et les acides gras

sont les deux stimuli connus pour induire iNOS dans la cellule musculaire. Le muscle squelettique

contient plusieurs types de cellules autres que les myocytes dont des cellules immunes résidentes

parmi lesquelles on retrouve des macrophages. Il est possible que ceux-ci puissent libérer des

cytokines en réponse au stress occasionné par l’isolation du muscle (la dénervation, la rupture des

tendons, l’interruption vasculaire) et par conséquent, stimuler l’induction d’iNOS. Des expériences

complémentaires seront nécessaires pour confirmer cette hypothèse. Néanmoins, il demeure que

l’induction d’iNOS stimule la synthèse de NO ce qui résulte en une augmentation de l’expression de

GLUT1 dans le muscle squelettique au cours d’une incubation prolongée ex vivo. L’interaction entre

le NO et l’expression de GLUT1 fut rapportée dans d’autres modèles. Les mécanismes responsables

de cette interaction demandent à être davantage étudiés. Toutefois, il fut récemment démontré que la

protéine ATM (de l’anglais ataxia telangiectasia mutated) régule l’expression de GLUT1 à la

membrane plasmique dans les cellules musculaires L6 [471]. La protéine ATM est une

sérine/thréonine appartenant à la famille des PI3K connue pour son rôle dans la réparation des

dommages au niveau de l’acide désoxyribonucléique (ADN). Son implication dans la régulation du

transport du glucose dans les cellules musculaires fut nouvellement proposée [472, 473]. De plus,

différents modèles cellulaires suggèrent que le NO active la protéine ATM. Il est possible que cette

dernière participe à l’augmentation de l’expression de GLUT1 en réponse à l’accumulation de NO

dans notre étude. Des expériences supplémentaires seront nécessaires afin de valider cette

hypothèse.

Contrairement aux résultats préalablement publiés par notre laboratoire, l’induction d’iNOS dans

notre présent modèle expérimental n’entraîne pas de variations de l’expression de GLUT4. Une

étude a récemment rapporté l’implication du facteur induit par l’hypoxie 1α (HIF-1α, de l’anglais

hypoxia inductible factor 1α) dans la translocation des GLUT4 à la membrane plasmique et dans le

transport du glucose lors d’une stimulation à l’insuline dans les cellules musculaires C2C12. En effet,

l’inhibition de HIF-1α abolit le transport du glucose stimulé par l’insuline ainsi que la translocation des

112

GLUT4. À l’inverse, une forme constitutivement active de HIF-1α entraîne, au contraire, une

translocation des GLUT4 à la membrane plasmique comparable à celle induite par une stimulation à

l’insuline [474]. La protéine HIF-1α est un facteur de transcription activé en réponse à une diminution

d’oxygène à l’intérieur des cellules [475]. Toutefois, il est également suggéré que la protéine HIF-1α

participe à la régulation de diverses fonctions cellulaires en condition de normoxie. Entre autre

chose, il fut démontré que la cytokine TNFα module l’activité de HIF1α dans les cellules épithéliales

alvéolaires en absence d’hypoxie [476]. Des résultats préliminaires de notre laboratoire proposent

une augmentation de l’ARNm de HIF-1α dans le muscle épitrochléen de rat à la suite de dix heures

d’incubation ex vivo. Ainsi, il est concevable que l’activation de la protéine HIF-1α dans notre modèle

expérimental soit responsable du maintien de l’expression de GLUT4 et du transport du glucose

stimulé par l’insuline en dépit de l’induction d’iNOS et de la production de NO. Des expériences

supplémentaires seront nécessaires afin de valider cette hypothèse. De plus, afin de déterminer la

présence ou non d’hypoxie dans notre modèle expérimental, il serait pertinent d’effectuer d’autres

mesures que celle de HIF-1α.

Ainsi, en dépit de l’induction d’iNOS lors d’une incubation ex vivo prolongée du muscle épitrochléen,

la surexpression des GLUT1 ne résulte pas en une augmentation du transport basal de glucose et la

production de NO n’affecte pas l’expression des GLUT4. Toutefois, une exposition de vingt-quatre

heures à un donneur de NO induit une augmentation du transport basal de glucose dans les cellules

musculaires L6. Il est envisageable que l’incubation ex vivo du muscle épitrochléen sur une plus

longue période résulte en une augmentation significative du transport basal de glucose occasionnée

par une accumulation plus importante de NO tel qu’observée dans les cellules musculaires L6

traitées avec le NOC-15.

Finalement, il fut démontré que la résistance à l’insuline observée en situation de stress

postopératoire est proportionnelle à l’intensité du stress initial [477]. Il est également possible que le

stress induit par la technique d’incubation ex vivo d’un muscle squelettique ne soit pas assez

important pour induire des modifications majeures au niveau du métabolisme du glucose malgré la

présence de marqueurs inflammatoires. Il n’en demeure pas moins que la présence possible d’une

réaction inflammatoire doit être prise en considération lors du choix de cette technique.

113

Du point de vue des perspectives, il est concevable que l’augmentation de GLUT1 en présence de

fortes concentrations de NO soit un mécanisme de défense cellulaire au cours d’une réaction

inflammatoire. Entre autre chose, il fut démontré que l’incubation d’un muscle ex vivo induit la

production d’espèces réactives d’oxygène (ROS) dont l’anion superoxyde (O2-) et le peroxyde

d’hydrogène (H2O2) [478]. L’interaction entre l’O2- et le NO forme le peroxynitrite, un puissant

oxydant, capable de nitration sur différentes protéines de la cascade de signalisation de l’insuline

dans le muscle squelettique tel que décrit à la section 4.3.1. Plus encore, il fut récemment démontré

que GLUT1 régule la production de ROS et prévient ainsi la diminution du transport du glucose

stimulé par l’insuline. [479]. À la lumière de ces données nouvelles, il serait pertinent de mesurer les

niveaux de ROS dans notre modèle expérimental, de trouver les conditions optimales d’incubation

pour minimiser la production de ROS et ainsi clarifier l’impact de tels changements sur l’expression

de GLUT1. Ceci dit, il serait également opportun d’identifier la source de production d’iNOS et ainsi

développer de meilleures conditions d’incubation pour de futurs protocoles expérimentaux. Ces

données nous permettraient d’en connaître davantage sur la régulation d’iNOS dans le muscle

squelettique.

En conclusion, le tissu musculaire squelettique est un organe important dans le maintien de

l’homéostasie du glucose. La régulation du métabolisme du glucose dans le muscle squelettique fait

intervenir des nombreux mécanismes. Plusieurs conditions physiologiques et métaboliques

interagissent avec ceux-ci et peuvent engendrer des perturbations métaboliques majeures.

Néanmoins, et heureusement, la pratique régulière d’activité physique permet de prévenir plusieurs

effets métaboliques indésirables et procure, entre autres, de nombreux effets bénéfiques sur la santé

du métabolisme musculaire.

115

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La régulation du transport du glucose dans le muscle ... · CAMKK De l’anglais Ca2+/calmodulin dependent protein kinase kinase CCL2 Chimiokine C-C de type 2 de l’anglais Chemokine