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BERNARD LAROCHELLE
INFECTION PAR LE VIRUS EPSTEIN-BARR DU NEUTROPHILE
HUMAIN ET INDUCTION DE L'APOPTOSE
Mémoire
présenté
à la Facuité des études supérieures
de L'Université Laval
pour l'obtention
du grade de maître ès sciences (M.Sc.)
Microbiologie et Immunologie
FACWLTÉ DE ~ E C I N E
UNIVERS& LAVAL
Q Bernard Larocheiie, 1998
Natiord Library Biblibthèque nationale du Canada
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395 Wellington Street 395. rue Weüington OttawaON K 1 A W OüawaON K l A W Canada canada
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L'interaction des neutrophiles avec le vims Epstein-Barr dans l'issue de ['infection
virale n'est pas connue. L'interruption de la défense initiale pourrait mener à ta propagation
de l'infection. Dans ce mémoire, nous rapportons la pénétration du neutrophile par le virus Epstein-Barr et l'induction de I'apoptose dans les heures suivant la mise en culture.
L'expression des M m viraux EBNA-1, EBNA-2 et ZEBRA n'est pas détectée par RT- PCR ce qui indique que le virus Epstein-Barr ne semble pas établir une infection latente ou
lytique dans 1 e neutrophile. Une apoptose massive des neutrophiles infectés par le virus
Epstein-Barr suit les 10 premières heures en culture, tel que déterminé par cytometrie en flux
Les résultats de nos expériences pourraient expliquer les effets immunosuppresseun du virus
Epstein-Barr observés chez les gens immunosupprimés et la neutropénie observée dans la
majorité des cas de mononucléoses infectieuses.
B emard Laroc hel le, étudiant 1
Jean Gosselin, directeur
a mon épouse, Julie.
AVANT-PROPOS
J'aimerais remercier les gens qui m'ont permis de mener cette maitrise à terme.
Avant tout, j'airnerais remercier tout spécialement le docteur Jean Gosselin, mon directeur de
recherche, pour m'avoir accueilli dans son Iaboratoire et m'avoir initié à la virologie.
J'aimerais également remercie Pierrette Gourdes pour son aide inestimable en microscopie
électronique. Je veux aussi remercier Marie Nadeau, Suzie Arsenault, Diana Geitl et Martin
Savarci, pour leur collaboration. J'aimerais remercier le docteur Charles Roberge avec qui
j'ai eu d'intéressantes discussions, et aussi Pierrette Côté, pour les nombreux services
qu'elle m'a rendus. Merci aux docteurs Louis Flamand et Michel Tremblay qui ont accepté
de corriger ce mémoire. Merci fuialement à mon épouse Julie St-Pierre pour toute l'aide
qu'elle m'a apportée au cours de mes travaux.
. * R É s m .......................................................................................... u
... AVANT-PROPOS IU ................................................................................
TABLE DES MATIERES ........................................................................ iv
LISTE DES ILLUSTRATIONS ................................................................ , ........................................................................ LISTE DES TABLEAUX vii
... LISTE DES ABBRÉVIATIONS ................................................................ WU
1- LES HERPESVIRUS ................................................................ 2
1 ) Généralités nir HerpesWidae .............................................. 2
2) V m Epstein-Barr ........................................................... 2
II- TROPISME CELLULAIRE DU VIRUS EB ..................................... 2
1 ) Lymphocytes B .............................................................. 2
2) Cellules epithe~des .......................................................... 4
3 ) Lymphocytes T ..................... ... .................................. 4
4) Syncytiotrophoblastes ....................................................... 5
5) Kér&ocytes ................................................................. 6
6) Monocytes et Macrophages ................................................. 6
7) Neutrophiles .................................................................. 7
III- GÈNES LYnQUES ET GENES LATENTS DU VIRUS EB ................ 8
1) EBER-1 et .2 ................................................................. 8
2 ) ZEBRA ........................................................................ 9
3) EBNA-1 et autres protéines latentes ....................................... 9 ....................................................................... 4) EBNA-2 10
N- PATHOLOGIES ASSOCIÉES AU VIRUS EB .............................. 10
VI- IMPviUNOSUPPRESSION CAUSÉE PAR L'IMXCTION VIRALE ....... 14
1) Régulation de la présentation d'antigène .................................. 15
2) Les cytokines ................................................................. 16
3) Régulation de l'apoptose .................................................... 16
VII- OBJECTIFS ........................................................................ 19
RESULTATS ..................................................................................... -20 1)Résumé du manuscrit ................................................................. 21
................. 2)Epstein-Barr virus infects and induces apoptosis in neutrophils 23
DISCUSSION .................................................................................... 66
CONCLUSION .................................................................................. 71
LISTE DES ILLUSTRATIONS
................................................ Figure 1 : EBV infection of human neutrophils 37
............................. Figure 2: A: Detection of EBV genome in human neutrophils 39
B: Densitometric analysis of viral DNA levels in EBV-infeaed neutrophils ........................................................................... 40
C: Detection of EBV genome in isolated nuclei .................................. 41
Figure 3 : RT-PCR analysis of viral BZLF-1 and EBNA-2 mRNAs expression ......... - 4 3
Figure 4: PCR analysis of EBV genome in neutrophils from IM patients ........... ....... 45
................................... Figure 5: EBV induces apoptosis in human neutrophils 47
Figure 6: Kinetic of EBV-induced apoptosis in human neutrophils ......... .... ..... 49
Figure 7: Cell-surface expression of Fas/Fas L on EBV-infected neutrophils ............ 51
Figure 8: EBV induced release of soluble Fas L by neutrophils in v i m .............. ..... 54
LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1 : Influence of GM-CSF on EBV-induced apoptosis in neutrophils.. . .. . . . . . .... 53
ADN
ARN CMH CMV
EBNA EB FITC GM-CSF G-CSF HSV- 1
IL
IL-1Ra IFN
kDa LMP LP
LTkr LTB4 M-CSF MIP-la
ml nm NK PCR RE RT-PCR TGF-P TNF-a
VM. ZERRA
acide désoxyribonucléique acide ribonucléique complexe majeur d'histocompatibilité
cytomégalovirus
" E pstein-B arr nuclear antigen"
Epstein-Barr " fluoresceine isothiocy mate" "granulocyte-macrophage colony stimulating factor" "granulocyte colony stimdating factor1' Herpks Simplex virus4 interleukine " interieukin- l receptor antagonist"
interféron kiloDaIton
"latent membrane protein" "latent protein"
teucotriène 4 leucotriène Bq "macrophage colony stimulating factor1' "macrophage inflanmatory protein- 1 a"
millilitre nanométre "naniral M e r cell" " pol ymerase chah reaction"
réticulum endoplasmiqpe "reverse transcription by PCR "transforming growth factor-p " "tumor necrosis fac tord
virus d'immuno-déficience humaine
"BamHI Z EBV replication activator"
INTRODUCTION
1- LES HERPESVIRUS
1 ) Généralités sur Herpesviridae
La famille des herpesvindae est fomée de plus de cent différents virus dont le
tropisme est l'animal et l'homme. À ce jour. huit types d'herpesvirus humains ont été
identifiés. Ce sont des virus à acide désoxyribonucléique (ADN) protégés par une
enveloppe. Le vinis Epstein-Barr (EB), aussi connu sous le nom d'herpesvinis humain 4.
fait partie de cette famille, et plus précisément de la sous-famille des gamma herpewirinae. 11
est associé au genre des lymphocryptovirus.
Bien qu'il n'y ait qu'une faible homologie entre leur séquence d'ADN, les
herpesvirus ont tous la même structure caractéristique. Les partides virales, d'un diamètre
de 150 à 180 m, sont formées d'une enveloppe composée par les membranes nucléaires et
cytoplasmiques d e la cellule infectée dans lesquelles se sont intercalées des glycoprotéines
d'origines virales. A l'intérieur de cette enveloppe, on retrouve le tégumenf formé de
protéines, qui entoure la nucléocapside. Celle-ci, d'un diamètre de 100 am, contient des
protéines ainsi que le génome virai.
2) Virus Epstein-Barr
L'enveloppe du vims EB contient une glycoprotéine majeure. la gp350/220. Son
tégument contient une dizaine de protéines différentes. Sa nucléocapside est fomée par 160
capsomeres. Le génome du virus EB, composé d'ADN double brin linéaire, est long de 172
kilobases. Il contient des extrémités terminales répétées ainsi que plusieurs séquences
internes répétées; une centaine de gènes seraient codés par celui-ci (Liebowitz et Kieff,
1993).
II- TROPISME CELLULAIRE DU VIRUS EB
Les lymphocytes B (Miller, 1990) et les cellules épithéliales de l'oropharynx
(Lemon et al, 1977; Sixbey et al, 1984), constituent les principales cibles du vims dans
l'organisme humain.
1) Lymphocytes B Le tropisme cellulaire a été initialement attribué aux lymphocytes B et aux cellules
épithéliales de l'oropharynx. Le récepteur cellulaire du vims EB sur ces cellules est connu: il
s'agit du CD21, aussi connu sous le nom de CR2 (Sixbey et ai, 1987). U s'agit d'une glycoprotéine d'environ 145 kDa de poids moléculaire, qui appartient à la superfamille des
immunoglobulines. Le rôle physiologique de ce récepteur est de lier le fragment C3d du
complément (Aubry et ai, 1992). Le ligand viral de CD21 est la gp350/220 (Tanner et ai,
1987). Il s'agit des protéines majeures de l'enveloppe virale, les deux protéines étant codées
par le même gène, dans le même cadre de lecture, la gp220 étant épissée, dors que ia gp350
ne l'est pas. Il est possible de bloquer l'infection virale en incubant des lymphocytes avec de
la gp350/220 soluble, ce qui sature les récepteurs CD21 du lymphocyte B (Tanner et al,
1988). Ces expériences ont confirmé le rôle de la gp350/220 comme Ligand Wal. Suite à la liaison du virus EB et du CDZI, le virus entre dans la cellule par l'endocytose du complexe
CD2 1-virus (Nemerow et Cooper, 1984). De récentes expériences semblent indiquer que la
cible initiale du virus dans l'organisme est le lymphocyte B recirculanf et non pas la cellule
épithéliale de l'orophqnx, comme cela avait été originellement proposé, pendant l'infection
primaire dü Wus EB (Karajamis et ai, 1997). Les lymphocytes B constituent également le
site de latence du virus EB.
Un cofacteur serait également utilisé par le virus EB pour infecter les lymphocytes B (Li et ai, 1997). La liaison de la glycoprotéine virale gp350/220 au CD2 1 à la surface de la
cellule serait suivie par la formation d'un complexe de trois glycoprotéines virales moins
abondantes, gH, gL et gp42. Les protéines gH et gL ont des homologues fonctionnels chez
tous les herpesvims étudiés à ce jour, alors qu'il y en a aucun de connu pour la gp42. La gp42 se lie au HLA-DR, une des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité ( C W .
Une interférence dans cette liaison par un anticorps inhibe la fusion des membranes
cellulaires et virales, sans toutefois empêcher la Liaison du virus. Des études récentes avec
d'autres virus tel le virus d'immune-déficience humaine 0, les adénovirus et l'Herpès
Simplex ont montré que la liaison et la pénétration des membranes pouvaient être considérées comme des événements coopératifs séparés faisant appel à des protéines
distinctes. Si aucune autre molécule que le CD21 ne semble impliquée dans la liaison du
virus aux lymphocytes B, la molécule HLA-DR est requise pour permettre la pénétration
efficace du lymphocyte B, ce qui souligne l'adaptation du virus au lymphocyte B. Le fait que
des lignées cellulaires puissent être établies chez des gens souffrant d'un rare syndrome causé
par l'absence d'expression des HLA classe II signifie qu'il existe probablement plus d'un
cofacteur pour faciliter la pénétration du lymphocyte B par le virus EB, ce qui a également été
observé chez le WI (Alkhatib et al, 1996; Feng et al, 1996).
2) Cellules épithéliales Parallèlement à ces études sur les lymphocytes B, le récepteur CD2 1 a également été
mis en évidence sur les cellules épithéliales par analyse de type Northern. Birkenbach et al
ont confirmé que le CD2 1 était bien le récepteur du virus El3 sur les cellules épithéliales, par des expériences bloquant I'infection au moyen d'un anticorps anti-CD21 ou du ligand viral
soluble, la gp3 SO/22O (Birkenbach et al, 1992). L'immunoprécipitation des protéines impliquées a également été réalisée.
3) Lymphocytes T Au cours des dernières années, d'autres études ont démontré que le tropisme
cellulaire du virus ne se limitait pas à ces deux types de cellules; le virus pouvait se lier à
d'autres types de cellules et même les infecter dans certains cas. Les premiers indices en ce sens provenaient d'une étude faite avec une lignée lyrnphocytaire (MOLT 4) ayant les caractéristiques des cellules T et provenant du sang d'un patient souffrant de leucémie
lymphoblastique aiguë (Menezes et al, 1977). Les auteurs ont démontré I'adsorption du virus aux cellules MOLT 4 par immunofluorescence et par microscopie électronique;
cependant, ils n'ont pu détecter ni la pénétration virale, ni la synthèse des antigènes viraux
précoces.
Par la suite, des lymphomes de cellules T contenant le génome du virus El3 furent
décrits (Jones et al, 1988). Les travaux de Sauvageau et al avec des lymphocytes T fraîchement isolés ont révélé qu'une sous-population de ces lymphocytes, les cellules T CD8+, expriment un récepteur différent du CD21 sur leur surface cellulaire (Sauvageau et al, 1990). Ils ont utilisé des techniques de cpométrïe en flux avec double marquage pour
identifier les populations sur lesquelles se fixait le virus. L'intemalisation du virus EB ne put cependant pas être détectée sur ces populations cellulaires CD8+. Les résultats qu'ils ont obtenus suggéraient également que le récepteur identifié était différent de celui des
lymphocytes B. En effet, ils n'ont pu, ni détecter le récepteur CD21 sur ces cellules T, ni
inhiber la liaison virale en pré-incubant les cellules T avec un anticorps monoclonal anti-
CD2 1 (OKB-7). Ces travaux ont soulevé certaines questions quand a la nature du récepteur du virus EB sur ces cellules, c'est-à-dire s'agissait-il d'un récepteur différent ou du même
récepteur dépourvu de certains épitop es?
La présence de CD21 fut observée sur des lymphoblastes de T-ALL prélevés
(chilhood T-ce11 acute lymphoblastic leukemia) chez des enfants dès 1979 (Shore et al, 1979). Ce récepteur a été décrit subséquemment sur plusieurs lignées de cellules T
lyrnphoblastoides (Fingeroth et al, 1988; Sinha et al, 1993), sur des thymocytes (Tsoukas et
Lambris, 1988) et sur des cellules T périphériques normales (Fisher et ai, 1991). Des lignées
telles T-NI, HPB-ALL, CEM, MOLT-3, Jurkat, originant des cellules T, expriment une
molécule de surface qui est immunologiquernent similaire au CD21 des cellules B. La molécule semblable à CD2 1 exprimée par les cellules MOLT4 diffère immunologiquernent
de celles des cellules B, ce qui peut contribuer à l'incapacité du virus EB a infeaer ces
cellules (Paterson et al, 1995). Les différents transcrits de CD21 dans les lymphocytes B et
dans les lignées de cellules B et T sont dus à un épissage alternatif des exons de cette
protéine.
Les thymocytes peuvent aussi être infectés par le virus EB (Watry et al, 199 1).
Selon Kelleher et al, une infection de type lytique s'en suit, c'est-à-dire que les gènes latents
EBER-I et LMP-2 n'ont pu être détectés alors que le gène lytique ZEBM ainsi que la
protéine gp350/220 l'étaient (Kelleher et al, 1995). De plus le génome reste sous forme
linéaire alors que, dans les lymphocytes B, il se circularise dans les premières 24 heures
post-infection. Puisqu'une infection latente peut être distinguée d'une infection lytique par le
spectre de gènes viraux exprimés et par la configuration du génome viral dans la cellule, en
l'occurrence, la circularisation qui est nécessaire pour l'expression de certains gènes de
latence, les auteurs ont conclu que les thymocytes pourraient être un bon modèle pour étudier
la phase lytique du virus 5.
Hedrick et ai ont démontré que le virus EB se liait sur une lignée de cellules T, HSB-2, par un récepteur différent de CD21 (Hedrick et al, 1994). HSB-2 est une lignée
cellulaire CD21-négative. iis ont identifié un récepteur de 70 kDa a la surface de ces cellules
par l'utilisation de gp350 soluble marquée à l'iode-125. Le rôle physiologique de cette
protéine est inconnue; cependant, elle forme un récepteur différent de la protéine CD2 1 de
150 kDa déjà identifiée. Les cellules HSB-2 expriment des sites de liaison de haute et de
basse affinité pour la gp3 5O/22O. L'anticorps monoclonal 72Al, qui reconnaît la gp3 SO/Z2O,
inhibe la liaison du virus EB aux cellules HSB-2. Les deux récepteurs cellulaires connus du
virus EB, CD21 et la protéine de 70 kDa, lient la glycoprotéine virale gp350/220 via des
épitopes distincts, mais cependant reliés entre eux, peut-être par leur structure
conformationnelle ou par leur chevauchement.
4) Syncytiotrophoblastes
La présence du virus EB a également pu être démontrée récemment dans des
syncytiotrophoblastes. Toth et al ont observé que le virus EB pouvait infecter les
syncytiotrophoblastes humains in vitro (Toth et al, 1997). La couche placentaire de syncytiotrophoblastes est en contact intime avec les tissus maternels et les fluides du corps; il
s'agit de la première barrière empêchant la transmission virale de la mère au foetus. Des
infections congénitales au virus EB n'ont jamais été démontrées, ce qu'ils expliquent par l'absence de lymphocyte B dans la population cellulaire sous la bamière placentaire où se
retrouvent principalement des macrophages. Les études in vitro ont montré que l'infection
des syncytiotrophoblastes par le virus EB était de type lytique puisque La présence de
particules virales a pu être détectée dans les sumageants de cultures utilisés pour infecter les lymphocytes B de cordon ombilical. De plus, le gène immortalisant EBNA-2 n'a pu être
détecté, contrairement aux gènes lytiques précoces et aux gènes de la capside. En utilisant de la gp350/220 purifiée, ils ont montré que le virus pénétrait par l'intermédiaire d'un récepteur
viral spécifique puisqu'ils ont bloqué l'infection en saturant ces sites avec le ligand soluble.
Leurs résultats démontrent que ces cellules expriment le récepteur CD2 1; cependant, ce
récepteur est stnicturellement différent de celui exprimé sur les lymphocytes B car la liaison
du virus EB aux syncytiotrophoblastes ne peut être bloquée qu'à environ 30% par les
anticorps monoclonaux 72A1 ou OKB7 qui reconnaissent la gp350/220 et le CD21, respectivement, dors que I'usage d'un seul de ces deux anticorps est sunisant pour bloquer
l'infection des cellules B par le virus. Pour inhiber complètement l'infection, l'usage des
anticorps HB-Sa et OKB7 est nécessaire. L'anticorps monoclonal HB-Sa, qui reconnaît une
portion différente de CD21, bloque l'infection à 70%. Le virus EB pourrait donc se lier a
deux épitopes différents de CD21 à la surface des cellules de syncytiotrophoblastes, ce qui
est supporté par les observations de Birkenbach et al sur la différence de réactivité des
ceiid es épithéliales avec différents anticorps CD2 1 (Birkenbach et ai, 1992) .
5 ) Kératinocytes
On rapporte également l'infection de kératinocytes in vitro avec le virus EB, faisant
suite a l'observation de séquences du vims EB dans des biopsies cutanées (Jumbou et al, 1996). Le virus se lierait à environ 30% des kératinocytes; et, il est possible de détecter les
gènes EBER par hybridation in situ et la protéine LMP par immunohistochimie. Ni la nature
du récepteur, ni la portée biologique d'une telle infection n'ont été soulevées.
6) Monocytes et Macrophages
En étudiant la régulation des cytokines exprimées par les cellules mononucléées du
sang périphérique en réponse au virus EB, Gosseiin et al ont montré que deux cytokines
produites principalement par les monocytes/macrophages étaient modulées (Gosselin et al, 199 1). La transcription du gène codant pour TNFa (turnor necrosis factor*) est fortement
inhibée par le virus EB dors que la transcription du gène codant pour l'interleukine (IL j6 est
augmentée. Le récepteur impliqué est probablement le CD2l. Des études en cytométrie de
flux sur les lignées monocytaires HL-60 et U-937 révèlent qu'environ 20% des cellules de
ces lignées expriment l'antigène CD2 1. Des résultats similaires sont obtenus par la détection
directe du virus EB marqué au FITC (fiuoresceine isothiocyanate) sur ces mêmes lignées
cellulaires. Cependanf aucun antigène viral n'a pu être détecté, ce qui suggère que
I'infection est de type abomf. Cette observation est appuyée par le fait que l'infection semble
sans effet sur la survie ou sur la croissance des cellules. De plus, le virus n'a pas à être infectieux pour moduler la synthèse des cytokines, c'est-à-dire que la transcription des
cytokines est affectée par du virus dont l'ADN a été endommagé par les rayons ultraviolets.
Par contre, l'inactivation du virus à la chaleur abolit cet effet sur la modulation des cytokines,
ce qui suggère que le contact du virus avec son récepteur cellulaire est suffisant pour
déclencher une cascade d'événements (Roberge et al, 1997).
7) Neutrophiles
Le virus EB peut également affecter une autre cellule importante de l'immunité non
spécifique, le neutrophile (Beaulieu et al, 1995). Lon d'études de liaison réalisées par
cytométrie en flux, des neutrophiles, pré-incubés ou non avec des anticorps anti-CD21. ont
été mis en présence de vims liés de façon covalente à un chromatophore, le FITC. Ces
investigations ont révélé que le récepteur CD21 n'était que peu ou pas exprimé sur les
neutrophiles, mais que le virus EB pouvait se lier de façon spécifique sur au moins 30% de
ces cellules, pourcentage qui pouvait monter jusqu'à 50% chez certains donneurs. La
présence diin récepteur spécifique a été mis en évidence en incubant les neutrophiles avec du
virus EB non marqué et en ajoutant par la suite le virus marqué au FITC. La nature de ce
récepteur n'est pas connu, mais comme l'ont démontré les travaux de Tsoukas (Tsoukas et
al, 1 988), plus d'un récepteur cellulaire est associé au virus EB. L'étude initiale de Beaulieu
et al a égaiement démontré que le virus pouvait activer et potentidiser le neutrophile. Suite à
l'incubation avec des particules virales infectieuses, l'agrégation cellulaire fut observée dans
des cultures de neutrophiles, ainsi que l'augmentation du relargage d'anion superoxyde induit
par le peptide fomyl-Méthionine-Leucine-Phénylal&ne (fMLP), le virus EB seul
n'induisant pas cette réaction dans les neutrophiles. Plutôt que de s'attarder à la modulation
de gènes spécifiques, l'effet du virus EB fut étudié sur les événements transcriptionnels
général du neutrophile. La synthèse d'acide ribonucléique (ARN) de novo fut observée par
l'incorporation d'uridine marquée au tritium (53H uridine). La modulation de la production
de protéines (suppression ou activation) fut également observée sur des fluorogrammes
provenant d'électrophorèse sur gel en deux dimensions. Parmi ces protéines, la synthèse
d'IL-lp et d'IL-1Ra (interleukin-1 receptor antagonist) était spécifiquement augmentée. L'IL-IRa est un antagoniste naturel de l'IL- 1 P . Sa production par le virus EB pourrait
représenter un mécanisme utilisé par le virus pour échapper en partie à la réponse
immunitaire.
In- GÈNES LYTIQUES ET GÈNES LATENTS DU VIRUS EB
Sous forme latente, le génome épisomal du virus EB active l'expression d'un répertoire limité a une dizaine de gènes suite à son entrée dans une cellule. Ces genes sont EBER-I et -2, EBNA-1, -2, - 3 4 -3B et -3C, LMP-I, LMP-2A et 2B, et LP. La forme
lytique est causée par l'expression du gène ZEBRA, ce qui entraîne la synthèse des autres
gènes vinuor Les gènes pertinents à nos travaux seront discutés brièvement.
1) EBER-1 et 2
EBER 1 et 2 sont deux ARN d'environ 170 ribonucléotides chacun, non traduits, qui sont présents dans presque toutes Les celluies positives pour le virus EB. Les ARN EBER- 1 et 2 peuvent se Lier à deux protéines différentes: la protéine La et la protéine kinase
PKR induite par l'interféron et activée par I'ARN double brin (Clemens, 1993). Cette
enzyme joue un rôle important dans l'action antivirale de l'interféron en phosphorylant la sous-unité a du facteur d'initiation de La synthèse protéique eIF-2, ce qui inhibe la synthèse
de toutes protéines virales et cellulaires. EBER-1 protège la synthèse protéique en bloquant I'autop hosphoryl ation de PKR nécessaire à son activation. Ce mécanisme pourrait être utilisé par le virus EB pour surmonter l'effet antiviral de PKR. La conséquence de la liaison des gènes EBER-1 et 2 avec la protéine La est inconnue, mais cette liaison pourrait altérer les
niveaux de traduction dans les cellules en séquestrant la protéine La puisqu'elle fait partie du
complexe des protéines nbosomiques (Toczyski et d, 1994). Cependant, l'expression des ARN EBER-1 et 2, pendant l'infection initiale et la transformation primaire des lymphocytes, est retardée jusqutaprès l'expression des gènes LMP et EBNA Cela est incompatible avec
l'hypothèse selon laquelle la fonction des ARN EBER est de bloquer l'action de l'interféron (Swaminathan et al, 1992). De plus un virus EB recombina* dans lequel ces genes ont été inactivés, a été comparé avec la souche sawage utilisée dans Finfection des lymphocytes B in viho: aucune différence n'a pu être remarquée dans la croissance des lymphocytes infectés et
dans la permissivité de ces cellules, pour l'infection de type lytique. Bien que le rôle des ARN EBER ne soit pas clair in vitro, ils peuvent toutefois représenter un avantage indéniable
pour infecter les lymphocytes ou d'autres cibles cellulaires lors de l'établissement de
l'infection in vivo.
2) ZEBRA Occasio~ellernent, le virus entre en phase réplicative, ce qui est initiée par la
transcription du gène précoce-immédiat ZEBEU (Miller, 1990). La protéine Z E B U qui est transcrite au locus BZLF-1, est nécessaire et suffisante pour orchestrer le passage du cycle de
latence au cycle lytique. ZEBRA est un facteur de transcription cellulaire avec un domaine de
liaison à I'ADN identique a ceux de fos et de jun. ZEBRA s'attache au facteur de
transcription cellulaire TFIID, ce qui réduit le taux de dissociation de TRID lié a la séquence
TATA nu l'ADN (Lieberman et Be* 1991). Cela suggère que l'effet de ZEBRA se fait par l'intermédiaire des complexes protéiques se Liant à la séquence TATA. Francis et al ont
découplé l'activité de transcription de l'induction du cycle lytique induite par la protéine
ZEBRA (Francis et al, 1997) . Ces deux fonctions distinctes de Z E B U sont révélées par
une substitution d'acides aminés (sérine 186 par une alanine) qui bloque l'induction du cycle
lytique sans empêcher l'activation de la transcription. Plusieurs hypothèses ont été émises
quand à l'initiation du cycle lytique. Cette fonction implique probablement la
phosphorylation de la sérine 186 de ZEBW ce qui pourrait soit faciliter la réorganisation de
la chromatine du génome viral latent, soit influencer la reconnaissance à l'ADN des
promoteurs lytiques viraux.
3) EBNA- L et autres protéines latentes
La protéine virale EBNA-1 est requise pour l'amplification de l'épisome et sa
partition dans chacune des cellules filles Ion de la mitose. Le génome du virus EB, qui est
linéaire A l'intérieur du virus, se circularise rapidement après l'infection. Plus tard, lors du
processus d'immortaiisation, le génome du virus EB est amplifié et persiste à l'intérieur des
cellules transformées sous forme d'épisomes. EBNA-1 n'a pas d'effet sur la croissance des
cellules B de lymphomes humains (Kieff et Liebowitz, 1990). Les autres gènes latents tels
EBNA-34 -3B, -3C, LMP-1, LMP-2A et -2B, et LP sont impliqués dans le processus de
croissance et de transformation du lymphocyte en activant et en s'associant B différents
facteurs cellulaires (Liebowitz et Kieff, 1993). En utilisant des virus recombinants où
certains de ces gènes ont été inactivés, aucun changement signtficatif n'a pu être détecté dans
l'infection de cellules B in vitm. Puisqu'ils sont immunogéniques, comme EBNA-LP dont
des épitopes sont reconnus par les Lymphocytes T, ils doivent conférer des avantages
essentiels lors de I'infection in vivo.
Le rôle dtEBNA-2 est essentiel à I'immortalisation des lymphocytes puisque les souches virales Daudi et P3H.R-1, dans lesquelles le gène codant pour EBNA-2 est absent, perdent leur habileté à immortaliser les cellules B (Liebowitz et Kieff, 1993). Ces souches virales peuvent quand même induire la réplication lytique du virus. EBNA-2 est synthétisé
dans les 24 premières heures suivant l'infection et atteint un niveau maximal avant même que EBNA-1, - 3 q -3B, -3C ou LMP n'apparaissent (Alfieri et al, 199 1). EBNA-2 est un activateur de la transcription des gènes viraux LMP-1 et LMP-2, et des gènes cellulaires
CD23, CD2 1 et c-fgr, tous impliqués dans la croissance des cellules B.
Environ 90% de la population mondiale est séropositive pour le virus EB. Le vims
EB est surtout cornu comme l'agent étiologique de la mooonucléose infectieuse (Miller, 1990). Il s'agit dune maladie lymphoproliférative bénigne résultant d'une infection primaire
au virus EB. Cette infection est généralement restreinte et est rapidement contrôlée par les lymphocytes T cytotoxiques et par les anticorps sécrétés par les lymphocytes B. Le vins EB est aussi associé à plusieurs types de cancer. II a été formellement identifié dans le
lymphome de Burkitt (Geser et al, 1983), dans le carcinome du nasopharynx (Miller, 1990)
et dans une variété de cancers hématopoïétiques tel que la maladie de Hodgkin (Mueller et al,
l989), différents lymphomes autres que ceux de Burkitt (RocMord et Mosier, 1994) et la leucémie à cellules T chez l'adulte (Harabuchi et al, 1990). Chez les patients
immunosupprimés. le vims EB est associé à certains lymphomes prolifératifs (Joncas et al,
1990). Ainsi, chez les personnes victimes du SIDA, on le retrouve associé à des lymphomes polyclonaw diftis, à des pneumonies lymphocytaires interstitielles et à des leucoplasies de la langue (Hemdier et al, 1992). La réactivation des infections dues au virus EB est
~ i ~ c a t i v e m e n t plus élevée chez ces personnes que dans la population en générale (Sculley et al, 1990). Les patients sous thérapie immunosuppressive (pour éviter le rejet de greffes) sont susceptibles de développer des lymphomes B polymorphes associés au virus EB
(S werdlow, 1 992; Purtilo et al, 1992).
Comme on peut le constater, le virus EB interagit avec plusieurs types cellulaires du système immunitaire. Cette grande diversité de cibles ne peut qu'amoindrir l'efficacité du
système immunitaire à combattre cette infection M e . Les éléments du système immunitaire engagés dans le contrôle des micro-organismes peuvent être divisés en deux grandes lignes
de défense (Abbas et al, 1994). La première ligne comprend les mécanismes de défense de
l'immunité non spécifique, composés par les monocytes/macrophages, les neutrophiles et
autres granulocytes, les cellules NK (natural killer cell), les éléments du complément, les molécules d'interféron et les cytokines d'origine non lymphoïde. La deuxième ligne de défense est composée par les mécanismes de recomaissance spécifique, c'est-à-dire les lymphocytes T cytotoxiques (CD8+) et les cellules B qui produisent les anticorps.
Cette deuxième Ligne de défense, particulièrement l'immunité à médiation ceHulaire, joue un rôle critique dans le contrôle des infections virales. Les cellules T cytotoxiques
reconnaissent et détruisent les cellules infectées lors de l'infection primaire, et contrôlent les infections persistantes, la réactivation des infections iatentes et la croissance de tumeurs associées à des virus. L'identification des cellules infectées se fait par l'intermédiaire du
récepteur de surface des cellules T qui se lie a un antigène peptidique présenté par le CMH de
classe 1 exprimé à la surface de presque toutes les celiules somatiques. Le récepteur des
cellules T est un complexe formé du récepteur comme tel, à savoir un hétérodimère composé d'une chaîne protéique a et d'une chaîne protéique B. A cet hétérodimère s'associent quatre
ou cinq protéines (y, 6, E, et q) qui forment le CD3. Les chaînes a et P reco~aissent le
complexe antighe-CMH de classe 1 alors que le CD3 est impliqué dans la transduction des signaux du récepteur vers l'intérieur de la cellule. La molécule CD8 vient stabiliser
l'adhésion cellule-cellule en se liant à une portion non-polymorphe du CMH de classe 1, et il transmet également des signaux après sa liaison, ce qui pourrait par la suite promouvoir la
réponse fonctio~eiie des cellules T cytotoxiques. Le CMH de classe 1 des cellules infectées présente des antigènes viraux; la reco~aissance de ces antigènes par les cellules T cytotoxiques mène à l'activation des cellules T, ce qui résulte en la lyse des cellules infectées et en l'expansion clonale, au moyen de signaux de croissance appropriés, d'une population
de cellules T spécifique à ce virus.
On peut également distinguer trois phases temporelles dans I'organisation de la défense immunitaire; une phase pré-précoce, une phase immédiate et une phase tardive. La
phase pré-précoce, qui se déroule durant les quatre premières heures suivant l'infection, est
caractérisée par l'immunité non spécifique, c'est-à-dire l'arrivée des neutrophiles et des
monocytes/macrophages sur le site d'infection. La deuxième phase, qui s'étale entre la quatrième heure et la quatre-vingt-seizième heure, est principalement associée à la synthèse de
molécules antivirales tels les interférons de type I et II. La phase tardive consiste finalement en I'activation de la réponse spécifique à partir de la génération de lymphocytes T cytotoxiques et de la produaion d'anticorps par les lymphocytes B. Un virus ou un autre pathogène qui réussit à franchir la première ligne de défense a la possibilité d'initier une infection, particulièrement dans le cas du virus El3 car sa cible principale est le lymphocyte B.
Ce virus perturbe la sécrétion des cytokines des monocytes/macrophages; des expériences montrent qu'il est capable de perturber également les fonctions du neutrophile, la composante cellulaire essentielle de la première ligne de défense de l'organisme. Puisque nos travaux portent sur Pinteraction du neutrophile avec le virus EB, les principales caractéristiques du
neutrophile seront sommairement exposées.
Les neutrophiles font partie des granulocytes, qui sont les cellules les plus nombreuses parmi les leucocytes du sang périphérique (Densen et al, 1995). Les
neutrophiles dérivent de cellules souches pluri potentes localisées dans la moelle osseuse. Morphologiquement, le neutrophile se distingue par son noyau multi-lobé et ses grandes cytoplasmiques. Le neutrophile mature possède peu de ribosomes et de mitochondries, ce qui a laissé croire à l'absence relative de processus de synthèse dans ces cellules. Le site
d'action primaire du neutrophile se trouve au niveau des tissus. La demi-vie intravasculaire de ces cellules est de 6 à 8 heures, alors que leur persistance dans les sites extravasculaires peut s'étendre jusqu'à 14 jours. Le neutrophile joue un rôle très important dans la prévention
des infections. Il possède dans ses granules une grande quantité d'enzymes lytiques; il est aussi capable de synthétiser des métabolites de l'oxygène très toxiques, ce qui fait que cette
cellule est capable de lyser les bactéries et également les virus. Le neutrophile possède
également, a sa surface, des récepteurs qui reconnaissent la partie Fc des immunoglobulines, ce qui facilite la phagocytose des partiailes opsonisées.
En plus de son rôle de principal effecteur cellulaire de l'inflammation aiguë, le neutrophile est également capable de synthétiser et de sécréter un large spectre de lipides bioactifs et de cytokines, ce qui lui permet de moduler la réponse immunitaire au site d'inflammation. Les éicosanoides produits par les neutrophiles sont les leucotriènes & (LTA4) et Bq (LTBq) ainsi que certaines prostaglandines. Les principales cytokines produites sont les IL-la et $, le T N F a , l'IL-6, l'interféron de type I, les M-CSF
(macrophage colony stimulating factor) et G-CSF, le TGF-P (transfotming growth factor-p),
l'IL-8 et l'IL- 1 Ra (McColl et Showell, 1 994).
Les écosanoïdes proviennent du métabolisme de l'acide arachidonique, un acide gras poly-insaturé emmagasiné dans les phospholipides de la membrane cellulaire. Le relargage
de 1 ' acide arachidonique est contrôlé par la phospholipase A2. Deux voies métaboliques
s ' offrent d o n à l'acide arachidonique: la première possibilité est la dioxygénation catalysée par la 5-lipoxygénase qui mène à la production des leucotriènes d o n que la seconde résulte
en la synthèse des prostaglandines catalysées par l'enzyme cié de cette cascade, la
cyclooxygénase. Apres stimuiation, le neutrophile peut produire différents Leucotriènes. Le
plus actif biologiquement est le LTB4. C'est un puissant activateur de la phagocytose, un
facteur chimiotactique pour les phagocytes, un stimulaut de la dégranulation, de l'adhérence
et de la mobilisation de caciurn (Borgeat et Naccache, 1990) .
Le neutrophile pourrait aussi synthétiser des prostaglandines en réponse à certains
stimuli, dont la prostaglandine E2 (Hermann et ai, 1990). Les prostaglandines possèdent une
grande variété d'action biologique locale et systémique dans le processus mflammatoire.
L'IL4 a et P , le TNFa et l'IL-6 agissent sur un grand nombre de cellules, stimulant une grande variété de fonctions. Le TNFa joue un rôle important dans la défense
de l'hôte contre les infections en activant et en potentialisant directement l'action des
neutrophiles. L'IL-6 stimule l'activation des cellules B et T et la production d'anticorps par
les cellules B. L'IL-6 stimule aussi le relâchement de protéines de phase aiguë de
l'inflammation par les hépatocytes. Le neutrophile sécrète également des cytokines chimiotactiques comme le TGF-P et l'IL-8. L'IL-8 est un membre de la famille des
chimiokines. Les membres de cette famille sont des cytokines inflammatoires de petit poids
moléculaire caractérisés par un motif conservé de quatre cy stéines. L'importance de cette
famille de molécules, dans la régulation immunitaire, vient du fait qu'ils sont chimiotactiques
pour les leucocytes à diffërents degrés de spécificité. Ainsi, l'IL-8 est plus spécifiquement
dirigée vers le recrutement et I'activation des neutrophiles.
Finalement, le neutrophile est une source importante de synthèse de l'IL-IRa, antagoniste naturel du récepteur de l'IL- 1 a et B: il se lie au récepteur de L'IL- 1, sans
l'activer. L'IL-IRa et le TGF-P sont les seules cytokines a être préformées et emmagasinées
dans le neutrophile. Apres stimulation par des agonistes appropriés comme le GM-CSF et le TNFs, l'IL-I Ra est la principale protéine sécrétée par le neutrophile. Le neutrophile peut
produire jusqu'à LOO fois plus d'IL-1Ra que d'IL-1, ce qui est nécessaire pour abolir l'activité pro-inflammatoire de l ' L I .
En conclusion, le neutrophile est capable de synthétiser plusieurs cytokines différentes en réponse à une variété d'agonistes parmi lesquels on retrouve des bactéries, des virus, des activateurs de la phagocytose ou des cytokines comme le GM-CSF et le TNFa.
La production de ces cytokines, prise sur une base comparative cellule-cellule avec celle des monocytes/macrophages, peut sembler modeste, mais lonqu'on reporte cette contribution dans le contexte général de I'infiammation aiguë, où le nmbre de neutrophiles dépasse de
beaucoup celui des monocytes et des macrophages, l'impact de cette production doit être
significative, physiologiquement et pathophysiologiquement
VI-IMMUNOSUPPRESSION CAUSÉE PAR L'INFECTION VLRALE
Les pressions de sélection causées par le système immunitaire ont entraîné différents types de stratégies d'évasion par les virus: latence, évasion par mutations ou encore évasion par intelférence au moyen de mécanismes spécifiques.
La latence correspond à l'absence de réplication; eile est partielle car elle ne touche qu'une partie de la population virale. il s'agit également d'un phénomène dynamique puisqu'il y a une alternance de cycle de latence et de réplication. Les virus latents pour de longues périodes de temps, qui sont intégrés aux chromosomes cellulaires ou qui se maintiennent sous forme épisornique dans le noyau ceildaire, et dont le fonctionnement des
gènes viraux est arrêté, constituent des endroits sanctuaires. Ces endroits sont par conséquent inaccessibles à la destruction immunologique (Chun et ai, 1997; Perelson et al,
1997). Cette première tactique est utilisée principalement par les rétroviridae et les
herpesviridae.
La deuxième méthode est employée par de petits virus, souvent des virus à ARN, comme le WH. Des mutations des protéines virales vont prévenir la reconnaissance diin épitope par les cellules T cytotoxiques ou la présentation d'un épitope par le CMH de classe 1.
La troisième stratégie, utilisée particulièrement par les virus à ADN possédant de grand génome, va impliquer des immunornodulateun spécifiques. On va donc retrouver,
parmi ces modulateurs, des protéines qui régulent la présentation d'antigènes, qui interrompent la cascade du complément, qui agissent comme cytokines ou comme antagonistes de cytokines, qui inhibent l'apoptose ou qui l'induisent (Spriggs, 1996).
L'emploi de ces différentes stratégies est bien documenté, quelques exemples d'immunosuppression virale étant présentés ci-dessous.
1) Régulation de la présentation d'antigène Les ARNm viraux utilisent les éléments cellulaires pour produire leurs protéines
(FNh et al, 1 997). Comme les autres protéines de la cellule, les gènes viraux sont dégradés par les mécanismes habituels de la cellule, c'est-à-dire par des protéases, en particulier celles du protéasome. La dégradation des protéines virales dans le cytosol mène à la formation de
polypeptides qui peuvent par la suite être transportés dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE) par un transporteur hétérodimérique formé par TAP 1 et TAP 2
(transporter associated with antigen presentation). Dans le RE, les peptides se conjuguent avec la chaîne lourde du MHC de classe 1 et avec la chaîne légère, la P2 microgiobuline. Le
complexe formé est transporté vers l'appareil de Golgi et la membrane plasmique où il devient accessible à la surveillance par les cellules T cytotoxiques. Si elle est reconnue par
les cellules T, la cellule infectée est lysée.
Les protéines virales peuvent intervenir à différents niveaux pour bloquer la
présentation de leurs antigènes. La protéine E 1 A 1 9K d'adénovirus retient le CMH de classe 1 dans le RE, la protéine ICP47 d'Herpès Simplex virus (HSV) inhibe la liaison du peptide
au transporteur T M , la protéine US 1 1 du cytomégalovirus (CMV) humain exporte la chaîne lourde du CMH de classe 1 dans le cytosol où elle est dégradée, la protéine US2 du CMV dégrade la chaîne lourde alors que les protéines US3 du CMV humain et m l 52 du CMV murin retiennent le CMH de classe 1 dans le RE (Wiertz et al, 1997). On pense également
que la protéine EBNA-1, la seule protéine exprimée par le virus EB dans certaines cellules infectées, contient des répétitions d'acides aminés qui peuvent prévenir la présentation de l'antigène (Levitskaya et al, 1995). On croit que de telles répétitions empêchent la génération d'épitopes par les protéasomes. Des cellules T cytotoxiques spécifiques sont générées contre
les huit autres protéines latentes du virus EB, ce qui signifie qu'une réponse antivirale vigoureuse existe. Cela a mené a l'hypothèse de l'existence d'un résemoir virai dans lequel le virus peut persister sans être détecté. La pro the EBNA-1 peut êae exprimée seule et ainsi
échapper à la réponse immunitaire des cellules T cytotoxiques par le mécanisme exposé ci-
dessus.
2) Les cytokines
Les cytokines sont des protéines solubles qui ont un rôle clé dans l'induction et le maintien de l'inflammation et de la réponse immunitaire. Plusieurs gènes sont régulés par ce système. Les virus synthétisent des agonistes pour faciliter leur réplication ou échapper à la réponse immunitaire. Par exemple, le virus EB synthétise un analogue de l'IL- l O tôt dans le
processus de transformation des lymphocytes B (Miyazaki et al, 1993). Les fonctions de l ' L I O sont conséquentes avec la suMe et la réplication d'un virus infectant les lymphocytes B puisqu'elle interfère avec la production d'IL-2 et d'EN de type II, qui sont les principaux agents favorisant une réponse à médiation cellulaire (1 es 1 ymp hocytes T) plutôt qu'humorale (les lymphocytes B), en plus d'agir comme facteur de croissance pour les lymphocytes B, ce
qui constitue vraisemblablement le principal avantage de cette acquisition par le virus. En plus de l'IL-IO, le virus EB module la synthèse des cytokines suivantes dans différentes cellules du système immunitaire: le GM-CSF (Roberge et al, 1997), le RIF-a (Gosselin et
al, 199 l), l'IL- 1 et L'IL- 1 Ra (Roberge et al, 1 996), l'IL-2 et les EN de type 1 et II (Lotz et al, 1986a et 1986b), l'IL-6 (Gosselin et al, 1992a et 1992b), L'IL-8 et le MIP-la (macrophage idammatory protein- t a) (McCoii et al, 1997).
L'utilisation d'antagonistes des cytokines est aussi employée; plusieurs virus
produisent des récepteurs solubles des cytokines qui bloquent la liaison de la cytokine à son
récepteur de surface cellulaire. Les molécules dIFN sont induites par presque tous les vims;
il s'agit de la principale cytokine antivirale. Les poxvirus, comme Vaccinia virus, codent un récepteur soluble de l'EN de type 1. Ils codent également des récepteurs solubles pour I'IFN de type II, le TNF a et B et I'IL-1 P (Alcarni et Smith, 1995).
3) Régulation de l'apoptose L'apoptose ou la mort cellulaire programmée est un processus par lequel une cellule
meun en réponse a certains stimuli internes ou externes. Morphologiquement, la ceilule subissant l'apoptose montre des altérations de sa membrane plasmatique et de sa structure nucléaire, avec un clivage de l'ADN chromosomique en petits fragments. C'es un processus essentiel pour le développement de l'organisme et pour le maintien de l'homéostasie entre les différentes populations de cellules. L'apoptose peut être induite par les cellules T cytotoxiques, mais elle peut aussi survenir directement suivant l'apparition d'une infection virale. Les mécanismes moléculaires menant a l'apoptose ne sont pas bien connus même si
certains gènes importants de ce processus ont été identifiés. Par contre, certaines protéines virales sont connues pour retarder I'apoptose des cellules. Les adénovirus expriment le gène
EIB 19K tôt dans le déroulement de l'infection. L'expression de cette protéine suffit a
empêcher la fragmentation de l'ADN observée lors de I'apoptose alors que les adénovirus
mutants dans lesquels cette protéine a été supprimée ne peuvent l'empêcher (White et al,
1992). Cette protéine protège aussi la cellule contre la cytolyse causée par le TNF et
l'apoptose induite par l'activation de Fas. Fas est un récepteur tran~membranaire~ membre de
la famille de TNF, qui est exprimé constitutivement sur plusieurs types de cellules, et qui,
suivant sa liaison à son ligand naturel, Fas Ligand, transmet un signai menant à l'apoptose.
L'inhibition de I'apoptose, induite par la protéine EIB 19K, est similaire a celle observée
lorsque la protéine celiulaire bcl-2 est exprimée. Cette protéine protège la cellule de
I'apoptose induite par différents stimuli in vitro et in vivo. Le virus EB induit l'expression de
cette protéine lors de I'infection latente des lymphocytes B. ce qui augmente la survie des
cellules (Gregory et al, 1991). L'apoptose joue en effet un rôle important dans le
développement des cellules B, en limitant la durée de vie de la plupart des lymphocytes. Le virus EB exprime une protéine homologue à 25% avec bcl-2, codée par le segment BHRF-1, qui pourrait protéger les cellules pendant l'infection lytique assez longtemps pour permettre la
production de virions.
D'autre part, plusieurs virus pewent induire l'apoptose des cellules qu'ils infectent:
c'est le cas pour les virus Sendai et HSV-1 lorsqu'ils infectent des cellules mononuclées du
sang périphérique in vitro (Tropea et aly 1995). Le VIH, les virus influenza A et B, les
adénovirus, les virus de l'hépatite B et C, le rotavinis, le virus de la leucémie féline peuvent
tous induire l'apoptose de leur cellule hôte (Collins, 1995). Les gènes viraux impliqués dans
ce mécanisme ont été caractérisés pour certains de ces virus. Par exemple, la gp 120, la
protéine de l'enveloppe virale chi VIH, peut induire l'apoptose lorsqu'elie se lie au récepteur
CD4 et qu'un signai est transmis par l'intermédiaire de la portion cytoplasmique du CD4 (Banda et al, 1992; Laurent-Crawford et al, 1991). La gp70, une glycoprotéine de
I'enveloppe virale du virus de la leucémie féline, est cytopathique pour les cellules
hémolymphatiques (Rojko et al, 1996). La protéine E 1 A est impliquée daos la mort cellulaire
programmée causée par les adénovirus (Rao et al, 1992). Dans le cas du virus de l'hépatite
B, la protéine HBx sensibilise les hépatocytes a I'apoptose (Chirillo et al, 1997; Su et
Schneider, 1997). C'est une protéine multi-fonctionneiie qui affecte la transcription et la
croissance cellulaire. Dans le cas des autres virus cités, les gènes viraux impliqués n'ont pas encore été identifiés. L'apoptose observée pourrait aussi être due a un mécanisme cellulaire
induit par 1 ' ARN viml double brin, qui active la protéine kinase P m qui elle même active la
synthèse de L'EN de type 1 (Takizawa et ai, 1995). Le système PKRlIM régule l'activation
du gène Fas dans les cellules infectées. L'apoptose peut ainsi être considérée comme un
mécanisme de défense cellulaire utiiisé pour contrer l'établissement de l'infection ou bien comme une stratégie virale destinée à Limiter la réponse immune contre les cellules infectées.
L'apoptose est donc un élément commun à la plupart des infections virales où virus et cellules hôtes peuvent utiliser des stratégies apoptotiques ou anti-apoptotiques pour accomplir leur but.
vn- OBJECTIFS
J'ai revu ci-dessus les principales caractéristiques du virus EB et des infections
causées par ce dernier sur différentes cellules. h i également exposé l'organisation générale
de la défense de l'organisme humain contre les infections et certaines stratégies utilisées par
les virus pour contrecarrer cette défense. Les objectifs de mes études sont les suivants:
1' Détecter la pénétration du virus EB dans le neutruphile;
2" Déterminer l'activation de certains gènes viraux importants;
3" Évaluer la survie des neutrophiies Ùifectés par le virus EB; 4' Corréler ces observations chez des patients en phase aiguë de mononucléose
infectieuse.
La caractérisation de l'interaction entre le virus EB et le neutrophile a nécessité
l'empioi de différentes techniques. La microscopie électronique a été utilisée pour observer
l'adsorption du virus au neutrophile. Différentes techniques de biologie moléculaire ont
permis de déterminer s'il y avait réplication des gènes viraux: la présence du génome viral a
été recherchée par analyse de type Southem alors que l'étude des ARNm viraux était
accomplie par une technique très sensible, la RT-PCR. La viabilité des cellules a été vénfiée
par coloration différentielle à l'aide de la cytométrie en flw. Les techniques et les résultats
obtenus dans le cadre de mes travaux sont présentés au chapître suivant
EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTS AND INDUCES APOPTOSIS IN HUMAN NEUTROPHILS.
Accepté: BLOOD (1998), 92:29 1.
1- Le virus Epstein-Barr irifecte et induit l'apoptose dans les neutrophiles humains.
Résumé du manuscrit:
La défense antivirale fait intervenir les cellules de l'immunité spécifiques et non-
spécifiques. Les macrophages et les neutrophiles sont les principaux effecteurs cellulaires de
la défense non-spécifique. Le neutrophile, à cause de son importante population et de sa distribution corporelle étendue, est l'agent le plus susceptible d'établir le premier contact entre les pathogènes et la défense immunitaire. Son interaction avec le virus EB dans l'issue de
I'infection v i d e n'est pas connue. L'interruption de cette défense initiale pourrait mener à la propagation de l'infection virale. Nous avons récemment montré que le virus EB interagissait avec les neutrophiles humains et modulait la synthèse de certaines protéines.
Dans cette étude, nous avons premièrement observé les trois phases de l'entrée du
virus EB dans le neutrophile et la localisation subséquente du Wus dans le noyau cellulaire au moyen de la microscopie électronique. En effet, l'adsorption, la fusion et la pénétration du virus ont pu être observées. Le génome viral a également été détecté dans le noyau des
neutrophiles infectés. Par la suite, nous nous sommes intéressés à l'activation de certains gènes viraux dans le neutrophile. L'expression des ARNm viraux EBNA-1, EBNA-2 et
ZEBRA ne fut pas détectée par RT-PCR, ce qui indique qutEB ne semble pas établir une infection latente ou lytique dans le neutrophile puisque la protéine EBNA-I est la seule impliquée dans certain stade de latence alors que ZEBRA est un gène précoce de la réplication. Puisque l'infection semblait abortive, nous avons regardé ce qu'il advenait du
neutrophile. Après 20 heures d'infection, 77% des cellules étaient apoptotiques
comparativement à 2240 dans danses cultures de cellules non infectées, ce qui a été démontré par
cytométrie en flux et confinné en observant les changements structuraux caractéristiques de I'apoptose que sont la kgmentation de I'ADN et la condensation des noyaux de neutrophile.
L'ajout de GM-CSF dans le milieu de culture cellulaire a supprimé l'apoptose induite par le virus EB. Dans les neutophiles, les mécanismes menant à l'apoptose ne sont pas connus.
Nous proposons toutefois qu'elle est causée par l'activation du système FaslFas Ligand.
L'expression du récepteur Fas et de son ligand sur les neutrophiles traités par le virus EB est augmentée de 19% et de 93%, respectivement. Finalement, nous avons ajouté une
corrélation clinique à nos observations puisque le génome du virus EB a pu être détecté à
l'aide de la PCR dans les neutrophiles de patients soufnant de mononucléose infectieuse.
Les résultats présentés ici pourraient expliquer les effets immunosuppresseurs du virus EB observés chez les gens immunosupprimés, ainsi que la neutropénie observée dans plus de 50% des cas de malades atteints de mononucléose infectieuse.
EPSTEIN-BARR VIRUS INFECTS AND INDUCES APOPTOSIS
IN HUMAN NEUTROPHILS.
Bernard LAROCBELLE*, Louis FLAMAND*, Pierrette GOURDET,
Denis BEAU CHAMP^ and Jean GOSSELIN*l
'~aboratory of Viral Immunology, t Laboratory of Virology, Centre de recherche en
Rhumatologie et Immunologie, aaboratory of Mectiology, Centre de Recherche du CHUL,
Université Laval, Québec, Canada.
This work was supported by a grant from the Medical Research Council of Canada to J.G.
J.G. is the recipient of a Scholarship nom the Medical Research Council of Canada. L.F.
currently holds a Scholarship from the Fonds de la Recherche en Santé du Québec.
Corresponding author: Dr. Jean Gossefin
Labontory of Virai Immun01ogy
Centre de recherche en RhumatoIogie et Immunologie
CHUQ, Pavillon CHLIL, Room T 1-49
2705 boul. Laurier
Sainte-Foy (Québec), GIV 4G2, Canada
Tel.: (418) 654-2772 Fax: (418) 654-2127
ABSTRACT
The role of neutrophils during Epstein-Barr virus (EBV) infection is not known.
Dismption of the initial and non specific immune response may favor the spread of EBV
infection. We have previously shown that EBV interacts with human neutrophils and
modulates protein expression. In this study, we have investigated the ability of EBV to infect
neutrophils. Electron rnicroscopy studies showed penetration of virus and its subsequent
localization to the nucleus. The presence of virai genomes in isolated nuclei from neutrophils
was also shown by PCR Expression of viral transcripts like EBNA-2 (Epstein-Barr nuclear
antigen-2) and ZEBRA (BamHI Z EBV repiication activator) were not detected by RT-PCR
suggesting that EBV does not seem to establish a latent nor a lytic infection in neutrophils.
However, at 20 hours post-EBV infection, 77% of ceiis were apoptotic as compared to 22%
in uninfected ce11 cultures, as evaluated by flow cytometry. This EBV-induced apoptosis was
prevented by the addition of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) to
the ceil cultures. Apoptotic ce11 death seems to impiicate the Fas/Fas Ligand (L) pathway, as
reflected by an increase of Fas/Fas L expression on neutrophils treated with EBV and an
increase of soluble Pas L which may function in an autocrine/paracrine pathway to mediate
ce11 death. Lastiy, EBV genome was detected from neutrophils of infectious mononucleosis
(IM) patients in contrast to neutrophils obtained from healthy EBV-seropositive donors. Our
findings on the interactions of EBV with neutrophils wiil then provide new insights on the
immunosuppressive effects associated with EBV infection.
INTRODUCTION
Immune response generated against viral infections involves both nonspecific and
antigen-specific mechanisms. Nonspecific defense mechanisms. delivered by macrophages
and neutrophils, are rapidly inducible and play a crucial role during the early phase of viral
infections. In fact, the number and distribution of neutrophils throughout the body ensures
that they are often the first Ieukocytes to encounter invading organisms. The immune
fûnctions of neutrophils in the control of infectious agents are mainly associated with
phagocytosis and the production of degradative enzymes and oxygen-free radicals.
Neutrophils can dso sy nthesize and release severd immunoregul atory proteins following
stimulation with different agonists (for review see l y 2 ) . Impairment of these fundons may
therefore partidly suppress the immune response. The role of neutrophils in the control of
virai infection is not well documented. It was previously reported that human
irnmunodeficiency virus, cytomegdovirus and influenza virus can interact with phagocytes,
resulting in a decrease in naniral immunity 3-7. However, the outcorne of an interaction
between EBV and neutrophils has yet to be studied.
EBV. which belongs to the family of "Herpesviridae", is known to infect hurnan B
lymphocytes and epithelial cells of the oropharynx through the CD21 receptor (review in *).
However, growing evidence suggests that EBV may interact with a wider range of cells than
previously b elieved. For example, sever al reports have describ ed patients wi th EBV-genome-
positive T c d lymphoma (review in *). EBV was also found to bind and infect human
thymocytes and T cell lines HSB-2, iurkat and KPB-ALL 9-12. Furthemore, it was
observed that EBV can bind to and activate CD$+ peripheral T lymphocytes and monocytes
without however, penetratïng the cells 3-1 These studies demonstrated that EBV binding
involved a ligand distinct nom CD2 1, suggesting the existence of an additional EBV receptor
as previously proposed by others 11J6
We have recently reported that EBV cm bind to neutrophils and cause cellular
aggregation and protein synthesis ' 9 1 8 . Hm, we report the penetration of EBV into
neutrophils and its subsequent localization to the nucleus. While no evidence are supportive
of the establishment of a latent or a lytic infection, we observed that EBV induces apoptosis
in human neutrophils. This effect of EBV on neutrophils may represent an alternative
mechanism by which the virus suppresses the immune response.
MATERIALS AND METHODS
Neutrophii isolation
Neutrophils were isolated from venous blood obtained from normal healthy
volunteers using Ficoll-Hypaque deosity centnfùgation as previously described * . Al1
neutrophil preparations contained fewer than 1% monocytes as determined by monoesterase
staining and less than 0.3% of B and T lymphocytes, as evaluated by cytometry using
anti-CDZ, anti-CD3 and anti-CD19 monodonal antibodies (Becton Dickinson, San Jose,
CA). Viability, estimated by the trypan blue-dye exclusion procedure, was greater than 99%
in d prepmtions.
General incubation conditions
Neutrophifs were incubated in Hank's bdanced saline solution (IIBSS) (Gibco
BRL, Burlington, Ont., Canada) supplemented with 1% of heat-inactivated autologous
plasma and 10 m M of HEPES buffer for al1 experirnents, except for studies of apoptotic
cells which were perfonned in RPMI- 1 640 supplemented with 1 0% of heat-inactivated fetal
bovine serum (FBS) . Culture medium tested for the presence of endotoxin by the limulus
amebocyte assays (Sigma, St. Louis, MO, USA) contained less than 10 pg/ml of
contaminating endotoxins. Neutrophils were incubated at specified cells densities with either
infectious EBV or 3 nM recombinant humm GM-CSF (provided by Genetics Institute,
Boston, MA) for the indicated tirnes.
Virus preparations
Viral preparatioos of EBV strain B 95-8 were produced as previously described 8.
Briefly, B95-8 cells (which were mycoplasma-free tested) were grown in WMI-1640
medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS. When the viability of ce11 cultures
reached 20% or less, as determined by trypan blue-dye exclusion, cell-free culture
supematants were harvested and filtered &ou& a 0.45-mm pore size filter, and viral
particles were punfied by differentiai ultracentrifugation. Vims stocks were resuspended in
RPMI-1640, aiiquoted and stored at -80°C untii use. Virai titen were rneanired and evaluated
at 107 transfodng units (TFUhl).
Electron Microscopy
Neutrophils were resuspended in cold HBSS and incubated with EBV at 4OC for 5
to 15 minutes to allow binding to the ce11 d a c e . Virus-bound cells were then cultured at
37°C for varying time periods and processed for electron microscopy examination as
described 9,20. Briefly , cells were fixed for 1 hour in 1.5% glutaraidehyde in O. 1 M
cacodylate b u f k pH 7.3. M e r fixation, cells were pelleted and pre-embedded in 20% B S 4
polymenzed with 25% glutaraldehyde and nit in mm? The blocks were nnsed with buffer,
post-fixed in 1% buffered osmium tetroxyde, treated with 0.1% buffered tannic acid and
stained in bloc with 2% ethanolic uranyl acetate. The neutrophils were dehydrated through a
graded series of ethanol and propylene oxide, and embedded in Epon 8 12 (JBem services
Inc., Quebec, Canada). Ultrathin sections were cut with a diamond knife on an Ultracut S
ultramicrotome (Leica Canada Inc., Montreai, Canada) and mounted on 200 mesh copper
grids. The sections were stained with 2% uranyl acetate and 0,5% Iead citrate and examined
with a Jeoi 1010 electron microscope (Jeol Canada Inc., St-Hubert, Canada)
DNA isolation and southern blot analysis
Neutrophils were incubated for various periods of time in the presence or absence of
EBV and then washed 3 times with HBSS to remove residual virus. For Southem blotting
analysis, DNA was extracted as described 21. RNA was removed by RNASE ONE
(Promega, Madison, WI) treatment and DNA was digested with BamHI. Ten mg of DNA
cells were loaded onto a 0.6% agarose gel and size-fntctionated b y electrophoresis. Transfer
onto HYBOND-N membrane (Amersham Canada Limiteci, Oakville, Ontario, Canada) was
performed by capillary difision in I O x SSC overnight. M e r pre-hybridization, the
membranes were hybridized with random-primed 32P-labeled probes in 50% formamide
ovemight at 42°C- The membranes were then washed and exposed to Kodak X-OMAT füms
(Eastman Kodak, Rochester, NY) with an intensikng screen at -70°C. The BamHI W probe
was a 400 pb polymerase chain reaction (PCR) amplicon located in the B m H I W region of
the EBV genome (primer 1 : 5' GCAGTAACAGGTAATCTCTG 3', positi~ûs 2 Ü 12420 143
and primer 2: 5' ACCAGAAATAGCTGCAGGAC 3', positions 20523-20504' 22. The
glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) cDNA probe was used as control to
demonstrate equal loading of DNA in each lane. For each sample, the amount of viral DNA
was quantitated relatively to their respective levels of GAPDH. The given ratio was compared
to that obtained in unstimulated celis, using this formula: (OD of DNA of the sample / OD of
GAPDH of thc sample) / (OD of DNA of unstimulated c e k / OD of GAPDH of unstimulateci
celIs).
Preparation of nuclei
Neutrophils (1 0 x 106) ceiislml) were pretreated with cytochaiasin B (an inhibitor of
p hagocytosis) (Sigma, Oakviiie, Ont., Canada) at 10 m M and infected with EBV. M e r 10
hours of culture, cells were washed and resuspended in ice-cold buffer containing sucrose
0.25 M, HEPES IO mM, EGTA 1 mM, and protease inhibitors, PMSF 1 mM, aprotinin
and leupeptin 100 mg/ml. Nuclei were then extracted as previously described 23. Bnefly,
neutrophils were sonicated on ice (3 x 20 sec, at a power s e t h g of 2 and 60% duty cycle)
in a Branson Ultrasonic Processor (WVRlCanlab, Montreai, Quebec, Canada). Sonicates
were centrifuged at 12,000 x g, 10 min, 4OC. The corresponding pellets referred to nuclei of
neutrophils and the supematants referred to cellular membranes and cytosols. Nuclei were
resuspended in HBSS in DNA was extracted as described above. The presence of EBV
genome was evaluated by PCR using the BamHI W primers detailed in the previous section.
Detection of EBV geoome in neutrophils from IM patients
Neutrophils from iM patients were isolated and DNA was extracted as described
above. Neutrophils obtained from healthy EBV-seropositive donors were also used as
negative controls- The presence of EBV genorne was evaluated by PCR anaiysis using the
BamHI-W prirners detailed in the previous section. PCR was carrïed out in Perkin Elmer
Gene Amp 9600 (Cetus, Emeryville, CA) for 35 cycles (denaturation: 60 sec at 9S°C, ramp
60 sec, annealing: 30 sec at W C , ramp 30 sec and extension: 30 sec at 72OC. ramp 60 sec).
Amplified product was detected by hybdimtion to an 3*P-end-labeled oligonucleotide probe:
5'-TATCmAGAGGGGAAAAGAGGAATAAG-3, positions 203 13-20340.
RNA isolation and RT-PCR amplification
Unstimulated cells and EBV treated neutrophiis (50 x 106 cellslml) were cultured for
various time periods before RNA extraction. Total RNA was extracted by the TRIzol Reagent
(Gibco BRL, Burlingtoa, Ontario, Canada) method according to the manufacturer. First
strand cDNA was made using Moloney-murine leukemia virus (M-MLV) reverse
transcriptase using downstream primer. For EBNA-2 detection, the downstream primer was:
5' TGACGGGTTTCCAAGACTATCC 3', exon Y3/P, positions 48583 to 48562 and the
upstream primer was: 5' AGAGGAGGTGGTAAGCGGTTC 3', exon W2, positions
14802 to 14822. The PCR fragments were separated on a 2% agarose gel and traasferred to a
nylon membrane (Hybond N, Amersham) using 10 x SSC. Amplified EBNA-2 products
were detected by hybridization to an end-labeled oligonucleotide probe
(5' GAGAGTGGCTGCTACGCATT 3', Y2 exon, positions 4788547904)- cDNA fiom
Raji ce11 Lines was used as positive controls. For BZLF-1 detection, the downstrearn primer
used was: 5'-GGCAGCAGCCA CCTCACGGT-3', exon 213 splice, positions 102330-
10234 VlO2426- 102433, and the upstream primer was: 5'-TTCCACAGCCTGCACCAG
TG-3', exon 1, positions 1027 19-102700. Amplified BZLF-1 products were detected by
hybridization to an end-labeled oligonucleotide probe (S'CTTAAACmGGCCCGGATT-3',
exon 2, positions 102450402469). cDNA from B95-8 ce11 lines were used as positive
connols. The sequences of EBV PCR primers and probes used to detect BZLF-I and
EBNA-2 transcnpt have been validated in another study 24. The P-actin cDNA was used as
intemal control to demonstrate equal concentration of RNA in each sample. Sequences of
primers used have been previwsly reported 25.
Analysis of apoptotic cells by fiow cytometry
Following EBV treatment, we identifiai living, apoptotic and necrotic cells, based
on the differences in their stainabiiity with propidium iodide (PI) and Hoechst (HO) 33342.
Analyses were done by flow cytometry based on previously described procedures 26,27.
Briefly, human neutrophils (2 x 106/ml) were cultured in RPMI-1640 containhg 10% FBS
in the presence or absence of EBV and harvested at specified tirnes. Cells were washed in
PBS (pH 7.4), and 50 pl of PI (20 pg/ml) was added to the pellet. Tubes were mixed and
kept on ice for 30 min. After this incubation time, 950 pl of 25% ethanol and 25 pi of HO
33342 (1 12 m g M ) were added to each tube. Samples were vortexed and kept at 4OC in the
dark for 4 hours. CeUs were analyzed by cytofluoromevy (EPICS ELITE ESP, Coulter
Hialeah, FL) with the following settings: the fluorescence emission was first filtered through
a 488-nm dichroic filter with the < 488-nm fluorescence fütered through a 450-nm long-pass
filter (HO33342 fluorescence). The > 488-am fluorescence was filtered through a 5 15-m
long-pass filter and a 560-nm dichroic filter with the > 560-nm fluorescence filtered through
6 10-nm long-pass Nters (PI fluorescence). Analyses were performed from the samples of
1 0000 ceils. When indicated, cells were pretreated with GM-CSF (3 nM) for 3 hours before
EBV infection.
Detection of Fas and Fas L expression
Neutrophils (3 x106 cellslml) were cultured in the presence or absence of EBV
during 20 hours and harvested for immunofluorescence staining. Ce11 surface expression of
Fas and Fas L was assayed by flow cytometry using murine monoclonal antibodies anti-
human Fas UB2 (Immunotech, Burlington, Ont., Canada) and anti-human Fas L NOK4
(PharMingen, Mississauga, Ont., Canada) for primary straining and revealed with FITC - conjugated purified F(ab')2 goat anti-mouse IgG (Cappel, Durham, NC) for secondary
staining. Negative control staining was perfonned with irrelevant murine IgG. Cells were
stained with specific antibodies for 30 minutes at 4OC, washed with PBS and fixed with
0.5% parafomaldehyde in PBS before cytometric analysis.
Detection of soluble Fas L
Ceii-free supernatants from unstimulated and EBV-treated neutrophils (1 0 x 106
cells/d) were harvested at indicated Mies and tested for the release of soluble Fas L using
an EUSA kit (Medicorp, Montreai, Canada).
Statistical analysis
Statistical analyses were performed using Student's paired (two-tailed) t test, and
si@ came was attained at p < 0.05.
RESULTS
EB Vpenetration in neutrophiil.
We have previously reported that EBV binds to human neutrophils (approximately
30%) and recognizes a receptor distinct fiom the CD21 antigen 17. Such interactions remit in
cellular aggregation and in de novo protein synthesis by neutrophiis. Here we have examined
the association between neutrophils and EBV by electron microscopy. Viral particles were
incubated with neutrophils at 4OC to allow binding and then at 37OC for various penods of
time. EBV adsorption to the outer ce11 membrane of neutrophils could be observed (Fig. 1A
and insert). Fully mature virions, with electron dense core and bilayer membrane, were
found associated to the cells. In Figure 1B, a virion is engaged in internalization, as seen by
the fusion of the viral envelope with the cellular membrane. Nucleocapsids of EBV were
observed later in the cytoplasma and in the nuclei of neutrophils (Fig. 1C and D). Chromatin
was condensed following EBV localization to the nucleus and this process was obsemed
between 5 to 15 minutes of incubation. Some EBV particles were also observed in cellular
vacuoles, showing that viral particles were also phagocytized by neutrophils (data not
shown). Virions within the neutrophils were identical to those seen in the cytoplasma of
B95-8 ce11 line. The percentage of EBV-infected neutrophils evaluated by electron
microscopy was similar to the one obsemed in binding assay 17.
Defection of EBV genonre in isolnted nuclei obtained fiom neutrophils.
TG M e r confïrm the results obtained by electron microscopy, we first examined
the presence of EBV genome in neutrophils by southeru bloteing analysis (Fig. 2A). We used
a BamHI W fragment fmm the intemal repeats of EBV genome. Neutrophiis were treated
with EBV for different periods of time (fiom 15 minutes to 24 hours). Expression of EBV
fragments was detectable at 2 hours post-infection and increased at 24 hours post-infection,
suggesting that the number of copies of viral genome or the nurnba of iafected neutrophils is
increasing with time. Because virai intemalization can occur by phagocytosis, we perfomed
an additional experiment to confinn the presence of EBV in the nuclei of neutrophils. Cells
were first pretreated with cytochalasin B, an inhibitor of phagocytosis, then treated with
EBV. At 10 hours post-infection, DNA was extracted from isolated ouclei and tested for
EBV genomic DNA by PCR As shown in Figure 2C, EBV genome was detected in isolated
nuclei from neutrophils treated with EBV, niggesting that EBV can penetrate neutrophils
independently of phagocytosis. As negative control, when P8 15 cells (munne mastocytoma
exerting phagocytosis) were pretreated with cytochalasin B before EBV treatment, no
specific amplification of EBV DNA was detected in isolated nuclei under the same
experimental conditions (data not shown).
Trmcription of EBNA-2 or B U - I w m nor &tected in EBV-Ïnf cted neutrophik.
We next investigated the expression of two viral transcnpts in neutrophils. First, we
arnplified by PCR the early lytic BZLF-1 gene which encodes the Zebra protein and second,
the EBNA-2 transcript which is associated with EBV immortalization. in both cases, no
transcnpts were detected in EBV-infected neutrophils in contrast to the positive controls
B95-8 and Raji cells (Fig. 3).
Neu@ophiisfrom Mpa~ients me znfcted by EBK
Because EBV was found to infect human neutrophils in vitro, we tested for the
presence of EBV genome in neutrophils from IM patients. This was perfomed by PCR
amplification of a specific region of the EBV genome using DNA isolated from neutrophils of
EBV patients. Interestingiy, EBV genome was detected in neutrophils from EBV patients in
contrast to healthy seropositive donors (Fig. 4).
EBV induces apoptaris in neutrophiilr.
Because EBV can induce or inhibit apoptosis in rnononuclear cells 28729 and the fact
that neutropenia is observed in the majority of iM patients, we next investigated the effects of
EBV on neutrophil viability. This was performed by fiow cytometric analysis using the dye
Hoechst 33342 and DNA intercalating dye propidium iodine. This technique allows the
discrimination between necrotic, apoptotic and viable cells. cells can be divided into
three subpopulations, VI, V2 and Vj, based on their degree of permeability to propidium
iodine (PI). Cells in VI are less permeable to PI than cells in V2, and cells in V2 are less
permeable to PI than cells in V3. Penneability is uiversely proportional to cellular viability.
ï h e more permeable cells, found in the V3 area, are thus closer to death than cells located in
the VI or V2 regions. In one representative expenment, after 20 hours of culture, neutrophils
treated with EBV showed 77% apoptotic cells as compared to 22% for unstimulated cells
(Fig. 5). Necrotic neutrophils were not detected at 20 hours posinfection, suggesting that
EBV causes neutrophil death by apoptosis rather than necrosis. In addition, cells in V3 area
were oniy detected in EBV-treated cultures, indicating a decrease in cellular viability. These
results were consistently observed throughout several experiments. The apoptotic process
induced by EBV in neutrophils was confirmed by two other techniques, e-g. condensation of
chromatin (% of apoptotic cells: control, 3 1 k 6; EBV-treated cells, 59 +_ 10; p < 0.05;
n = 3) and DNA fragmentation shidies (data not shown).
Kinetics of neubophil cell dath d c e d by EB Y.
Human neutrophils were incubated with or without EBV for increasing period of
time and apoptosis was assessed by flow cytometnc method (Fig. 6). The number of
apoptotic cells significantly increased after 20 hours in EBV-infected cell cultures as
compared to unstimuiated naitrophils.
GMCSFprotecu neutrophik aguimt apoptmzs mcfuced by EBV:
GM-CSF is known to prolong survival of human neutrophils in vitro 30. To
determine if this effect was also protective on EBV-treated neutrophils, we incubated
unstirnulated and EBV-infected neutrophils with or without GM-CSF. After 20 hours of
incubation, the percentage of apoptotic cells was evduated by flow cytometry. As shown in
Table 1, treaûnent with GM-CSF strongly suppressed the ability of EBV to induce neutrophii
apoptosis. In fact, the number of apoptotic cells in EBV-treated cultures was similar to that
from unstimuiated cell cultures.
EBV increclses the expression ofFm mid Far L on neufmplds.
The Fas/Fas L system is an important cellular pathway mediating apoptosis in
neutrophils l . We therefore evduated the effects of EBV on the expression of FaslFas L
antigens on neutrophils. As shown in figure 7, the expression of Fas and Fas L was
signincantly increased on neutrophils infected by EBV (93% and 19%, respectively). The
time course of appearance of Fas and Fas L antigens was similar to the icinetics of neutrophil
death induced by EBV. Furthemore, the release of soluble Pas L was also increased in
culture supernatants of EBV-treated neutrophils (Fig. 8). These results suggest that EBV
may induce apoptosis in neutrophils via the Fas/Fas L systern and that soluble Fas L may
function in an autonine/paracrine pathway to mediate ceii death.
FIGURE 1:
EBV infection of human neutrophiis. Neutrophils were incubated with EBV for 5 to
15 minutes to ailow binding to the cell d a c e . Mrus-bound ceils were then cultured at 37°C
for varying time periods. A: Virus was in contact with the cell membrane
(magnification x 76,000), insert: at higher maWcation, characteristic EBV virion in
contact with cell membrane, showing its electron dense core representing viral DNA
(magnification x 90,000). B: Fusion of virai and cellular membranes was found
(rnagnification x 80,000). C and D: Internalization and presence of viral capsids were
observed within the cytoplasm and the nucleus of neutrophils (rnagmfication x 3 9,000).
N = nucleus. These resdts are represenative of six other experiments. Approximately one
third of the celis were fauid to be infecteci by EBV.
EBV 10 hm
* b EBV 24 hrs
FIGURE 2B
control 15 min 2 hrs 10 hrs 24 hrs
FIGURE 2C
FIGURE 2:
A: Deteetion of EBV genome in human neutropbils. Cells were incubated for
increasing time periods before DNA isolation and Southem blot analysis. EBV DNA was
detected by hybridization with a Ba- W probe. Raji ce11 line was used as positive control.
Neutrophils were either niltured in absence (control) or in presence of EBV (1 5 minutes, 2,
5, 10 and 24 hours). The experiment is representative of two other expenrnents.
B: Densitometric analysis of viral DNA levels in EBV-infected
neutro phils. Results are the mean of three experiments.
C: Detectioa of EBV genome in Uolated nuclei. Neutrophils from two healthy
donors were preincubated with the phagocytosis inhibitor cytochalasin B (10 mM) for
15 minutes and then treated with EBV or culture medium (rnock) for 10 hours. Cells were
harvested and genomic DNA was extracted from pded nuclei. EBV ~ n o m i c DNA was
detected by PCR as described in Materials cmd Meth&. B95-8 cells were used as positive
control. M represents a 100 bp molecuiar weight marker.
... - Control
EBV 15 min EBV 5 hrs EBV 10 hrs EBV 20 hrs
Raji
Control
EBV 15 min
EBV 5 hrs
EBV 10 hrs
FIGURE 3:
RT-PCR analysis of viral BZLF-1 and EBNA-2 mRNAs espression.
Neutrophils were incubated in absence (control) or in presence of EBV for various times
(1 5 minutes, 5, 10 and 20 hours). Total RNA was reverse transcribed and amplified using
specific BZLF-1 and EBNA-2 primes as described in Materials and Methods. Control cells
were the EBV-positive B95-8 ceils line for BZLF-1 analysis and the EBV-positive Raji cells
line for EBNA-2 anaiysis. Amplification were Southem blotted and probed as described in
Materials and Methodr. The size of PCR produas are 182 bp for BZLF-1 and 38 1 bp for
EBNA-2. Results are representative of three different donors.
FIGURE 4
FIGURE 4:
PCR analysis of EBV genome in neutrophils from IM patients. P C R
amplification was performed with DNA isolated from neutrophils obtained from EBV
patients and from healthy EBV-seiopositive donors (negative control). Amplification was
performed using BamHI-W primers as descnbed in Materiais mdMethods. DNA extracted
from Raji cells was used as positive control.
FIGURE 5
O 64 t = 10 hrs
. .
O 64 t = 20 hrs
Hoechst 33342
FIGURE 5:
EBV ioduces apoptosis in human neutrophüs. Cells were cultured in the presence or
absence of EBV and were harvested at 4, 10 and 20 houn post-treamient for DNA staining
as described in Malerials and Methads. Uptake of dyes was evduated by flow cytometry.
Paneis a, b and c: unstirnulated cells cultured for 4, 10 and 20 houn, respectively.
Panels d, e and T: EBV-treated neutrophils culnired for 4, 10 and 20 hours, respectively.
N: necrotic cells, V: viable cells, VI, V2, V3, t h e srnalier groups of viable cells, from the
more viable to the less viable cells, respectively, A: apoptotic celis. Nurnbers indicate the
percentage of positive ceils. The results displayed in each histogram are representative of
seven experiments. M e r 20 hours of culture, the percentages of apoptotic cells in controls
and in EBV-treated cells are 26 +_ 8 and 68 + 14 (n = 7), respectively. Values are
signifïcantly different at p < O -05.
FIGURE 6
Incubation time (hm)
FIGURE 6:
Kinetic o f EBV-induced apoptosis in human neutrophils. Neutrophils were
incubated with or without EBV for increasing penods of time at 37°C. Cells were harvested
and DNA was stained as described in Maierials und Methods. The results presented in thi s
figure represent the mean f SD of experiments performed in triplkate on neutrophils from
four individuals. * significantly different from unstimulated control value at p< 0.05;
** significantiy different from unstimulated control value at p < 0.0 1.
FIGURE 7
FIGURE 7:
CeII-surface expression of FaslFas L on EBV-infected neutrophils.
Imrnunofiuorescence flow cytometry was performed on unstimulated neutrophils (white
surface) and on EBV-infected neutrophils (black d a c e ) after 20 hours of culture. Analyses
were performed on 10,000 ceiis per sample and data are representative of four independent
expriments. The averages for the controls are: Fas, 84 t 8; Fas L, 6 + 3; and for EBV-
treated cells: Fas, 93 f 4; Fas L, 15 + 5 .
Table 1. Influence of GM-CSF on EBV-induced apoptosis in neutrophils.
TREATMENTS
CONTROL GM-CSF EBV EBV + CM-CSF
Donor 1 26 15 65 25
apoptotic cells ,+ SD 29 + 7
PMN (2 x 106/ml) were incubated with EBV, GM-CSF (3 nM), or with both agonists for 20
hours. Cells were then stained and the number of apoptotic cells was evaluated by flow
cytometry, as described in Materials and Meth&. Resdts are expressed in percentage (%)
of apoptotic cells for each culture performed in duplicate. The mean of apoptotic ceiis from
GM-CSF-treated cells was compared to that obtained from control cells, and the mean of
apoptotic cells from EBV+GM-CSF-treated cells was compared to that obtained from EBV-
treated cells. * Significantly different at p < 0.0 1.
FIGURE 8
10 24
Tirne of incubation (hrs)
FIGURE 8:
EBV induced release o f soluble Fas L by neutrophils in viiro. Neutrophils
( 10 x 1 06 cells/mI) were incubated with or without EBV during 24 hours. At indicated
hmes, cell-free supematants were tested for the presence of Fas L. Results (pg/rnl) presented
in this figure represent the mean + SD of experiments performed in triplkate on neutrophils
from five different individuais. Values simcantly different from unstimulated controls are
indicated by astensks (p < 0.05).
DISCUSSION
As a key element in the nonspecific defense mechanisrn, neutrophils are likely to
encounter invading agents such as vimses. Two of the major functions of neutrophils are
phagocytosis and the release of infiammatory mediators. Growing evidences dernonstrate the
ability of neutmphils to induce idammatory response by releasing sever ai immunoregulatory
cytokines upon stimulation L,2. In this study, we show that EBV infects and induces
apoptosis of human neutrophils, which could disrupt the initial defense against EBV
infection. Electron microscopy studies show contact between EBV and neutrophils, as well
as fusion between cellular and viral membranes. These results support a previous study l 7
demonstrating that EBV binds to a d a c e membrane antigen on neutrophil via a receptor
different from CD21. This is also in agreement with other studies using T ceIl lines 1 T 16-
The increased expression of EBV fragments in neutrophils over time either may suggest that
EBV can replicate in these ceils, or that more neutrophils get infected over tirne. However,
we can not overlook that a number of viral particles can also enter into neutrophils by
phagocytosis. In this regard, the resdts obtained with isolated nuclei from EBV-infected
neutrophils are of particdar interest. In fa& the presence of EBV genome in these nuclei
indicates that EBV c m penetrate into neutrophils without being phagocytosed since al1 ce11
cultures were treated with cytochalasin B, an inhibitor of phagocytosis. Taken together, the
results indicate that dthough some EBV particles are phagocytosed, others penetrate into
neutrophils via an alternate route. Since EBV can penetrate neutrophils, we looked for the
synthesis of viral transcnpts EBNA-2 and ZEBRA. EBNA-2, readily detectable in the first
24 hous of infection 32, is recpked for the initiation of lymphocyte immortaiization and is an
essential transactivator of viral gene expression 33,34. ZEBRA is a key immediate-early
protein essential for lytic ce11 induction and is synthesized during the first hours post-
infection 35,36. None of these two genes were found to be expressed in EBV-infected
neutrophils, suggesting an abortive type of infection. However, since EBV can encode
several other genes, further mdies are required to identiQ viral genes expressed in EBV-
infected neutrophils.
Death of neutrophils may represent a strategy of host cells to abort the infectious
process. Indeed, after 20 houn of culture, neutrophils treated with EBV showed more than
70% of apoptotic cells which rnay significantly affect the establishment of productive
infection. Such a cellular defense, named apoptosis or programmed cell death, has been
reported with Sinbis virus 37 and with influenza A and B virus 38-40- It was previously
demonstrated that the expression of the EBV latent membrane protein 1 (LMP-1) protects
infected B ceils from apoptosis and that this effect is mediated, at least in part, by the
upregulation of the bcl-2 proto-oncogene 28,41. EBNA-2, another EBV latent protein, can
increase the effea of LMP-1 on bcl-2 expression, thus improving the protection against
apoptosis. This mechanism does not seem to be used by EBV with regard to neutrophils,
especidy as EBNA-2 protein was not detected in neutrophils, and moreover bcI-2 and bcl-x
expression is likely to be absent in this ceii type 42743. However, we evaiuated the regdation
of the human bfl-1 gene, a bcl-2 homologue, in EBV-treated neutrophils. Unfortunately, no
significant ciifference was observed between UIlStimulated and EBV-infected neutrophils a f k
20 hours of culture.
It was recently reported that apoptosis in neutrophiis may be regulated, at least in
part, by the CO-expression of cell-surface Fas and Pas L. ln the present sîudy, our results
suggest that the Fas/Fas L system may be involved in neutrophil death induced by EBV. The
presence of EBV in ce11 cultures significantly increased the expression of Fas and Fas L on
the membrane surface of nartrophils, as compared to unstimulated ceils. Similady, EBV was
found to induce the release of soluble Fas L by neutrophils. However, treatment of fieshly
isolated neutrophils with supernatants obtained from EBV-treated neutrophils did not
siwcantty rnodify the rate of spontaneous apoptosis ob served in unstimulated neutrop hils.
At present we can not exclude the involvement of the F a n a s L system in the apoptotic
process induced by EBV. Other soluble mediaton induced by EBV in addition to virally-
encoded proteins (still unidentified) may act in synergy with the FasEas L to induce
apoptosis of neutrophils. EBV-induced apoptosis of neutrophils is a complex phenornenon
necessitating multiple events. In fact, viral entry is necessary but not suficient to induce
apoptosis. This statement is supported by the fact that UV-irradiated particles do not cause
apoptosis of neutrophils even though viwes enter the cells (data not shown).
That EBV infects and induces apoptosis in neutrophils in vitro and that we detect
EBV genome in neutrophils from IM patients are in accordance with some clinical
observations made in IM and imrnunocompromised patients. In 60 to 90% of IM patients, an
absolute neutropenia has been detected between the third and fourth week of illness 44-48
This was also observed in severe chronic EBV infection where the number of circulating
oeutrophils was found to decrease. Moreover, anti-neutrophil antibodies have been detected
in sera of a high proportion of patients with active idedous mononucleosis 49,50, a process
possibly associated to death of neutrophils.
In conclusion, we showed that EBV penetrates and causes apoptosis of neutrophiis.
Interactions of EBV with phagocytes may alter the primary immune response and favor the
spread of EBV infection. Further studies on the mechaaisms of EBV-induced apoptosis in
neutrophils should give us new insights on the interactions between EBV and this ceil type.
59
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Mrs. Pierrette Côté for her excellent semetarial assistance. We dso wish
to thank Dr- Robert Delage who provided blwd samples from IM patients.
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DISCUSSION
Deux des principales fonctions des neutrophiles sont la phagocytose et le relargage de médiateurs inflammatoires. Des évidences grandissantes démontrent la capacité des neutrophiles à induire une réponse inflammatoire en libérant plusieurs cytokines imrnuno- régulatrices après activation (Lloyd et Oppenheim, 1992). Au cours de notre étude, nous avons montré qu'EB infecte et induit l'apoptose des neutrophiles humains, ce qui pourrait atténuer la défense initiale contre l'infection causée par le virus EB. Les études en microscopie électronique montrent le contact entre le virus EB et les neutrophiles, ainsi que la
fusion des membranes cellulaires et virales. Ces résultats supportent une précédente étude (Beaulieu et al, 1995) démontrant que le virus EB se lie à un antigène membranaire sur les neutrophiles qui est différent du récepteur CD2 1. La nature de ce récepteur n'est pas encore cornu. U s'agit d'un des prochains points à étudier pour comprendre les mécanismes de I'infection du neutrophile.
Deux récepteurs cellulaires différents ont déjà été identifiés pour le virus EB; nos résultats indiquent que le neutrophile possède probablement un récepteur distinct pour
permettre l'entrée du virus. Cette multiplicité de récepteun cellulaires n'est pas en désaccord avec nos connaissance actuelles des virus. Il existe d'autres exemples de virus pénétrant par
plus d'un récepteur ou par des moyens non-spécifiques, comme la phagocytose, ce qui leur permet d'infecter plus d'un type d'hôte cellulaire. Le WH, par exemple, infecte les cellules T C W et les macrophages avec l'aide de cofacteurs cellulaires distincts (Alkhatib et al., 1996;
Feng et al., 1996). Les souches virales T-tropiques utilisent le CO-récepteur CXCR4, une
protéine appartenant à la famille des récepteurs des CXC-chirniokines couplées aux protéines
G. Le CO-récepteur des souches macrophage-tropiques est un récepteur des CC-chimiokines, le CCR5. Quant au Vaccinia virus, il pénètre dans le neutrophile par la phagocytose (West et
al, 1987).
L'augmentation de l'expression des fragments du génome du virus EB dans les neutrophiles en fonction du temps peut suggérer que le virus EB se réplique dans ces cellules, ou bien, que plus de neutrophiles deviennent infecter avec le temps. Cependant. nous ne pouvons pas exdure le fait qu'un certain nombre de particules virales peuvent aussi
entrer dans les neutrophiles par phagocytose. C'est pourquoi les résultats obtenus sur des
noyaux cellulaires isolés de neutrophiles infectés par le virus EB sont d'un intérêt particulier. En fait, la présence du génome du virus EB dans ces noyaux indiquent que le virus EB peut pénétrer dans les neutrophiles sans être phagocyté puisque toutes les cellules en culture furent
traitées avec de la cytocholasine B, un inhibiteur de la phagocytose. Considéré dans leur ensemble, ces résultats indiquent que, bien que certaines particules du virus EB soient
phagocytées, d'actres pénètrent les neutrophiles par une autre voie. Puisque le virus EB peut
pénétrer dans les neutrophiles, nous avons recherché la synthèse des transcrits viraux EBNA-
2 et ZEBRA. La protéine EBNA-2, qui est facilement détectable dans les 24 premières
heures de 1' infection ( M e n et al, 199 1 ), est requise pour 1' initiation de 1 'immortalisation des
lymphocytes et est un transactivateur essentiel de l'expression des gènes viraux
(Hammerschmidt et Sugden, 1989; Wang et al, 1990)- ZEBRA est une protéine précoce
essentielle lors de l'induction du cycle lytique et elle est synthétisée durant les première
heures post-infection (Countryman et Miller, 1985; Kelleher et al, 1995). Aucun de ces deux
gènes n'a été détecté dans les neutrophiles infectés par le virus EB, suggéraut que I'infection
est de type abortif. EBNA- 1, la seule protéine virale exprimée dans certaine infection latente
(Rowe et aï, 1987), n'a égaiement pas été détectée (résultats non montrés). Cependant,
puisque le virus EB peut synthétiser plusieurs autres gènes, de futures études seraient
requises pour identifier des gènes viraux exprimés dans les neutrophiles infectés par le virus
EB .
Deux mécanismes peuvent possiblement faire avorter l'infection virale.
Premièremen< le virus EB peut requérir la présence de facteurs de transcription cellulaires qui
sont absents des neutrophiles pour initier la synthèse de gènes viraux essentiels. L'absence
de ces facteurs pourrait résulter en une infection abortive. Deuxièmement, pour résister aux
infections virales, le système immunitaire de l'hôte a développé plusieurs stratégies de
défense. L'apoptose des neutrophiles peut représenter une stratégie utilisée par les cel:des
hôtes pour faire avorter le processus infectieux. Dans les faits, après 20 heures de culture,
les neutrophiles traités par le virus EB ont montré plus de 70% de cellules apoptotiques, ce
qui peut affecter ~ i ~ c a t i v e m e n t l'établissement d'une infection productive. Une telle
défense cellulaire, nommée apoptose ou mort cellulaire programmée, a été rapportée avec le virus Sindbis (Levine et cd, 1993) et les virus de l'intluenza de types A et B (Fesq et ai, 1994;
Hinshaw et al, 1994; Takizawa et aï, 1993). Il a été précédemment démontré que
l'expression de la protéine LMP-I protège les cellules B infectées de l'apoptose, et que cet
effet est causé, en partie, par La surproduction du proto-oncogène bel-2 (Gregory et al, 199 1 ;
Henderson et al, 199 1). EBNA-2, une autre protéine latente du virus EB peut augmenter
l'effet de LMP-1 sur 17expression de bcl-2, en améliorant ainsi la protection contre
l'apoptose. Ce mécanisme ne semble pas utilisé par le virus EB en ce qui concerne les
neutrophiles, surtout que la protéine EBNA-2 n'est pas détectée dans les neutrophiles, et de
plus, l'expression des protéines bcl-2 et bcl-x est probablement absente de ce type de cellules
(Delia et al, 1992; Hockenbery et al, 1991). Nous avons cependant évaiué la régulation du
gène humain bfl-1, un homologue de bcl-2, dans des neutrophiles infeaés par le virus EB.
Malheureusement, aucune différence significative ne fut observée entre les neutrophiles infectés par le virus EB et les neutrophiies non-stimulés après 20 heures de dture .
Le virus EB fait partie des virus ayant le plus de succès avec un taux de séroconversion d'environ 90% d a m la population humaine. Ii utilise une variété de stratégies qui lui permettent d'établir une infection latente avec d 'occas io~e~~es réactivations qui
assurent sa perpétuation efficace à l'intérieur d'une population; il existe d'ailleurs en relative harmonie avec son hôte mais les pathologies graves qui y sont associées maintient l'intérêt de mieux le connaître. Le virus EX3 est un maître de l'évasion du système immunitaire de l'hôte. Par exemple, il peut réguler sélectivement la synthèse de cytokines, ce qui désorganise l'hémostase du système immunitaire. Nous avons récemment démontré que le neutrophile synthétise de l'IL8 et du M I P - l a en réponse au virus EB (McColl et al, 1997). Ces deux
chimiokines sont respectivement cornus pour attirer d'autres neutrophiles et lymphocytes aux sites d'infection. On se trouve donc potentiellement en présence d'une boucle d1amplification où de plus en plus de neutrophiles sont attirés sur le site d'uifection sans pourtant être capable de se défendre contre l'agresseur, tout en attirant rapidement les lymphocytes cibles. Ce
phénomène serait toutefois compensé par la sécrétion de GM-CSF par les monocytes, les neutrophiles ne synthétisant pas cette cytokine en réponse au virus EB (Roberge et al, 1997).
GM-CSF favorise la synthèse d'TL-1 f! par les neutrophiles infectés par le vims EB, ce qui réduit le ratio d'IL-IRa versus IL-IP, et donc favorise l'inflammation. De plus, GM-CSF a
également un rôle protecteur en bloquant I'apoptose induite par le virus EB. On pourrait
donc se trouver en présence d'un équilibre précaire, qui en fonction des concentrations des différentes cytokines, pourrait influencer le devenu de l'infection virale. Notons que ceci pourrait égaiement expliquer pourquoi la neutropénie rapportée dans la majorité des cas de
mononucléose infectieuse est légère plutôt que grave. Ces différentes hypothèses devront évidemment être étudiées pour s'assurer de leur concordance.
Il a été récemment rapporté que l'apoptose des neutrophiles peut être régulée, au
moins en partie, par la co-expression à la surface cellulaire des protéines Fas et Fas-L. Dans cette étude, nos résultats suggèrent que le système FasFas-L peut être impliqué dans la mort
des neutrophiles induite par le virus EB. La présence du virus EB dans des cellules en
culture a augmenté significativement l'expression de Fas et de Fas-L sur la surface membranaire des neutrophiles, comparativement aux cellules non stimulées. De façon similaire, le virus EB induit le relargage de Fas-L soluble par les neutrophiies. Cependant, le traitement de neutrophiles fraîchement isolés avec les sumageants obtenus de neutro philes infectés par le virus EB n'a pas modifié significativement le taux d'apoptose spontané
observé dans des neutrophiles non-stimulés. A l'heure actuelle, nous ne pouvons pas
exclure l'implication du système FasEas-L dans le processus induit par le virus EB. Les
données présentement disponibles ne permettent également pas de préciser si GM-CSF affecte négativement la produaion de FasRas-L pour expliquer la protection face à I'apoptose conférée par GM-CSF (Liles et al, 1996). D'autres médiateurs solubles induits par le virus
EB en plus de protéines virales (encore non-identifiées) pourraient agir en synergie avec Fas et Fas-L pour induire I'apoptose des neutrophiles. L'apoptose induite par le virus EB est un
phénomène complexe qui nécessite de multiples éléments. En faic la pénétration virale est
nécessaire mais non suffisante pour induire l'apoptose. Cette affirmation est appuyée par le
fait que des particules virales irradiées aux ultraviolets ne causent pas I'apoptose des
neutrophiles quoique le virus pénètre quand même les cellules (résultats non montrés). Le
fait que le virus EB infecte et induise I'apoptose de neutrophiles in vitro et que nous
détections le génome du virus EB dans les neutrophiles de patients souffrant de
mononucléose infectieuse est en accord avec des observations cliniques faites chez des
patients immunocompromis ou souffrant de mononucléose infectieuse. Dans 60 a 90% de ces patients, une neutropénie absolue a été détectée entre la troisième et la quatrième semaine
de la maladie (Eriksson et al, 1979; Habib et al, 1973; Hammond et ai7 1979; Neel, 1 976;
Wulff, 1965). Les précurseurs des granulocytes dans la moelle osseuse ne sont pas réduits,
ce qui signifie qu'il se produit une destruction des granulocytes circulants. Il a aussi été
observé dans les infections chroniques sévères au virus El3 que le nombre de neutrophiles
circulants décroissaient De plus, des anticorps anti-neutrophiles ont été détectés dans les
sérums d'une grande proportion de patients souffrant de mononucléoses infectieuse
(Schooley et al, 1984; Stevens et ai, 1979), un processus possiblement associé avec la mort
des neutrophiles.
CONCLUSION
Le virus EB peut infecter différents types de cellules; la plupart de ces cibles ont été trouvées lors d'études in vitro. L'absence de modèles animaux adéquats ne permet cependant
pas d'établir la pertinence de ces observations. Chaque type cellulaire représente donc théoriquement autant d'opportunité pour le virus EB de persister et de se répliquer il faudrait entreprendre des études sur ces infections in viuo pour déterminer lesquels de ces événements sont réellement significatifs au point de vue biologique. En ce qui a trait aux
neutrophiles, la détection du génome viral dans les neutrophiles de patients en phase aiguë de mononuciéose infectieuse montre qu'il ne s'agit pas d'un artefact de laboratoire, mais que
nous sommes bien en présence d'un élément incontournable, susceptible de faciliter t'infection virale.
La principale conclusion de cette étude est I'apoptose induite dans le neutrophile par
le virus EB. L'apoptose ou la mort cellulaire programmée est un mécanisme naturel de
l'élimination des cellules. Les mécanismes moléculaires menant a cet état chez le neutrophile
sont encore inconnus. Ii n'utilise pas les médiateurs connus de l'apoptose que sont les poly(ADP-ribose)polymerases (PARP), puisque ces enzymes n'ont pu être détectées dans cette cellule (Bhatia et al, 1995). Nous proposons un mécanisme pour expliquer I'apoptose induite par le virus: elle se ferait par l'intermédiaire de l'activation de Fas et Fas Ligand
soluble, qui ont déjà été impliquées dans la régulation de l'apoptose dans le neutrophile (Liles et al, 1996). Ces facteurs ouvrent la voie à deux grandes perspectives. La première consiste en l'étude des étapes menant a l'apoptose chez le neutrophile. Les mécanismes expliquant
l'apoptose et la phagocytose des neutrophiles sénescents par les macrophages ont un intérêt clinique incontestable. Ces événements sont impliqués dans la résolution de l'inflammation aiguë. LI arrive parfois que I'inflarnmation, qui est supposée être protectrice et réparatrice, cause plus de dommages aux tissus que l'agent pathogène lui-même (Stevens et Lowe, 1995). Par exemple, la méningite aiguë peut être causée par des bactéries faiblement
pathogéniques qui induisent peu de dommage aux tissus, cependant la réponse inflammatoire amène la destruction des vaisseaux sanguins locaux et empêche ainsi la perfusion du cortex cérébral, ce qui entraîne des lésions cérébrales sévères. La régulation de cet aspect de la
réponse immunitaire poumit donc constituer une able thérapeutique. La seconde perspective consiste en l'étude de l'apoptose dans le contexte de l'infection au virus EB. Il faudrait évaluer s'il s'agit d'un événement directement lié à l'infection ou d'un sous-produit de ceile- ci, et si elle favorise la progression de l'infection.
En conclusion, le naitrophile est une cellule dont la survie n'excède pas une semaine dans les tissus et dont le métabolisme est faible, puisque la plupart de ses protéines sont
préformées. En tenant compte de son rôle particulier dans la défense de l'organisme et de
son potentiel antiviral important, le schéma d'infection du oeutrophile par le virus EB,
présenté dans ce mémoire, est donc plausible. Le virus EB détourne premièrement les éléments cellulaires du neutrophile à son avantage avant de provoquer, dans un deuxième
temps, la destruction du neutrophile par apoptose, pour supprimer, en partie, la première
ligne de défense. Bien que l'infection soit rapidement circonscrite par l'immunité spécifique
par la suite, l'envahisseur s'est néanmoins installé et peut e v e d l e m e n t resurgir. Le virus EB est intimement lié au système immunitaire humain. Les éléments présentés ici, ainsi que
ceux rapportés précédemment, montrent comment ce virus ubiquitaire peut dérégler le
système de défense de l'hôte pour atteindre les lymphocytes avant d'être à nouveau sous
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