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Les Milieux de Culture en Bactériologie

Les Milieux de Culture

Gélose au Cétrimide - milieu sélectif

Composition

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone

Glucide et dérivés : /

Autres molécules carbonées : /

Indicateurs S2- : /

Inhibiteurs : cétrimide (antiseptique), acide nalidixique

Divers : /

Indicateurs de pH : /

Ions minéraux : chlorure de magnésium MgCl2, sulfate de potassium K2PO4, hydrogénophosphate de potassium

Agar : oui

Eau : oui

Caractéristiques

Milieu proche du King A, favorise la production de pyocyanide.

Milieu relativement pauvre.

Acide nalixidique : inhibiteur des Gram –

Cétrimide : inhibiteur des Grams + donc des Gram – par extension.

Ensemencement en cadran.

Usage

Recherche des Pseudomonas, notamment Pseudomonas earuginosa.

Lecture

Incubation 24h à 37°C : Développement Pseudomonas aeruginosa et éventuellement Pseudomonas putida, Pseudomonas stutzeri et Pseudomonas maltophilia.

Incubation 24h à 42°C : Développement presque exclusif de Pseudomonas aeruginosa.

Pyocyanine : milieu bleu

Pyoverdine : milieu jaune-vert indicateur de la présence de Pseudomonas

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Gélose de Chapman – milieu sélectif

Composition

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extrait de viande

Glucides et dérivés : /

Autres molécules carbonées : mannitol

Indicateur S2- : /

Inhibiteurs : NaCl à 75g/L

Divers : /

Indicateurs de pH : rouge de phénol

Ions minéraux : NaCl

Agar : oui

Eau : oui

Caractéristiques

Permet la croissance des bactéries halophiles.

Très forte concentration en NaCl permettant l’inhibition des Gram-

Permet l’étude de l’attaque du mannitol (si baisse du pH, alors teinte jaune)

Ensemencer richement en stries ou cadran.

Incubation : 24-48h

Usage

Isolement de Staphylococcus aureus.

Numération des staphylocoques.

Lecture

Si Staphylococcus aureus : colonie jaunes avec halo clair. Mannitol + Les autres colonies sont Mannitol -. Contamination possible par Enterococcus et certains Bacillus.

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Drigalski – milieu sélectif

Composition

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extraits de viande et levure

Glucide et dérivés : Lactose

Autres molécules carbonées : /

Indicateurs S2- : /

Inhibiteurs : Cristal violet, Désoxycholate de sodium

Divers : /

Indicateurs de pH : Bleu de Bromothymol

Ions minéraux : Thiosulfate de sodium

Agar : oui

Eau : oui

Caractéristiques

Cristal violet : inhibe les bactéries Gram +

Désoxycholate de sodium : inhibe les bactéries Gram +

Sélectionne les bactéries Gram –

Inoculation en cadran.

Usage

Isolement des entérobactéries.

Lecture

Bactéries lactose + : colonies jaunes (utilisation du lactose)

Bactéries lactose - : colonies bleu-vert

Lexique

Mannitol : utilisé pour étudier sa voie d’attaque par les bactéries (fermentation…). Bleu de Bromothymol : vert (basique) et jaune (acide) Entérobactéries : bactéries se trouvant dans les cavités internes des êtres vivants comme

l’appareil digestif. Rouge de phénol : rouge (basique) à jaune (acide)

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Hektoen – milieu sélectif

Composition

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : Peptones, extraits de levure

Glucide et dérivés : salicine, lactose, saccharose

Autres molécules carbonées : /

Indicateurs S2- : citrate de fer

Inhibiteurs : sels biliaires

Divers : /

Indicateurs de pH : Bleu de bromothymol, fuschine acide

Ions minéraux : Thiosulfate de sodium, NaCl

Agar : oui

Eau : oui

Caractéristiques

Sels biliaires : limitent le développement des Gram +

Fuschine : vire au rose s’il y a production d’aldéhyde.

Favorise Salmonelle et Shigella du fait des peptones.

Mise en évidence de la production d’H2S

Usage

Isolement des entérobactéries pathogènes : principalement pour vérifier la présence de Shigella et Salmonella.

Lecture

Aspect des colonies :

H2S

Attaque glucide

Production aldéhyde

Saumon - + +

Saumon et centre noir

+ + +

Bleu-vert - - -

Bleu-vert et centre noir

+ - -

Interprétation : o Saumon : Escherichia, Levinea, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia,

Yersinia. o Saumon et centre noir : Proteus vulgaris. o Bleu-vert : suspicion de Shigella ou Salmonella. o Bleu-vert et centre noir : suspicion de Salmonella.

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Hugh et Leifson – milieu différentiel

Composition

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones, extrait de levures

Glucide et dérivés : glucose

Autres molécules carbonées : /

Indicateurs S2- : /

Inhibiteurs : /

Divers : /

Indicateurs de pH : bleu de bromothymol

Ions minéraux : NaCl, K2HPO4

Agar : oui

Eau : oui

Usage

Détermination de la voie d’attaque des Glucides, utilisés comme principale source d’énergie par les bactéries. L’utilisation du glucose acidifie le milieu, le BBT va alors virer au jaune.

Technique

Régénérer les 2 tubes : création gradient d’oxygène.

Les ramener à 45°C.

Ajouter aseptiquement quelques gouttes d’une solution de glucose stérile. Concentration finale dans le tube environ 10g/L.

Agiter le tout pour répartir le glucose dans tout le tube.

Solidifier les deux tubes en les plongeant dans l’eau froide.

Ensemencer chaque tube par piqûre centrale avec la pipette Pasteur.

Recouvrir l’un des deux tubes de paraffine ou vaseline stérile.

Incubation 24h à 37°C. Tube recouvert = tube fermé

Tube non recouvert = tube ouvert NE PAS REVISSER A FOND LES BOUCHONS.

Lecture

Il peut y avoir formation de gaz par les bactéries.

Résultats après cultures 24h à 37°C

Interprétation

Le glucose est dégradé en

aérobiose et en anaérobiose :

bactérie fermentative du

glucose.

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Le glucose est dégradé en anaérobiose

uniquement : bactérie

fermentative du glucose.

Utilisation du glucose

uniquement en aérobiose :

bactérie oxydative.

La bactérie n’utilise pas le

glucose : elle est inerte vis-à-vis du

glucose.

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King A et King B – milieu différentiel

Composition King A

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone

Glucide et dérivés : glycérol

Autres molécules carbonées : /

Indicateurs S2- : /

Inhibiteurs : /

Divers : /

Indicateurs de pH : /

Ions minéraux : MgCl2 (chlorure de magnésium), K2SO4 (sulfate de potasssium)

Agar : oui

Eau : oui

Composition King B

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : polypeptone

Glucide et dérivés : glycérol

Autres molécules carbonées : /

Indicateurs S2- : /

Inhibiteurs : /

Divers : /

Indicateurs de pH : /

Ions minéraux : MgSO4 (sulfate de magnésium), K2HPO4 (hydrogénophosphate de potassium)

Agar : oui

Eau : oui

Caractéristiques

La gélose est inclinée dans un tube.

Ensemencement en stries.

Le chlorure de magnésium et le sulfate de potassium favorisent la production de pyocyanine.

Le sulfate de magnésium et le phosphate bipotassique favorisent la production de pyoverdine.

King A : recherche de production de pyocyanine.

King B : recherche de production de pyoverdine.

Usage

Identification des Pseudomonas par la présence de pyocyanine ou de pyoverdine.

Technique

Inoculer un tube de milieu A et un tube de milieu B en faisant une strie médiane à la surface de la gélose avec une anse de culture prise dans un bouillon ou sur une gélose.

Replacer la capsule sur chaque tube sans la reviser.

Lecture

Aspect après 24h minimum à 30°C : o King A : culture colorée en bleu-vert (pyocyanine +) et parfois en brun-rose

(pyoverdine +).

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En cas de doute, prélever l’eau de condensation à la pipette Paster et verser 0,5mL de chloroforme sur la pente du milieu. Laisser 5 à 10min en position inclinée. La pyocyanine colore le chloroforme en bleu.

o King B : culture colorée en vert fluorescent (pyoverdine +).

Interprétation : o Pyocyanine + : présence de Pseudomonas aeruginosa. o Pyoverdine + : présence de Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens

et Pseudomonas putida.

Gélose de Mac Conkey – milieu sélectif

Composition

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptone

Glucide et dérivés : lactose

Autres molécules carbonées : /

Indicateurs S2- : /

Inhibiteurs : Cristal violet, sels biliaires

Divers : /

Indicateurs de pH : Rouge neutre

Ions minéraux : NaCl

Agar : oui

Eau : non

Caractéristiques

Sels biliaires : inhibiteur des Gram +

Cristal violet : inhibiteur des Gram +

Si la bactérie fermente le lactose, le milieu devient rouge du fait de l’acidification du milieu.

Ensemencement en cadrans.

Incubation 18 à 24h à 37°C

Usage

Détermine si la bactérie fermente le lactose ou pas. Utilisé pour Shigella et Salmonella.

Lecture

Lactose + : colonies rouges entourées d’un halo opaque de la même couleur dû à la précipitation des sels biliaires.

Lactose - : colonies jaunes ou incolores.

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Mannitol - Mobilité - Nitrate – milieu différentiel

Composition

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : peptones trypsiques de viande

Glucide et dérivés : /

Autres molécules carbonées : mannitol

Indicateurs S2- : /

Inhibiteurs : /

Divers : /

Indicateurs de pH : rouge de phénol

Ions minéraux : KNO3

Agar : oui

Eau : oui

Caractéristiques

Utilisable uniquement pour les bactéries fermentives.

Ensemencement par piqûre centrale au fil droit par pipette Pasteur.

Ne pas oublier de régénérer le milieu et de le laisser refroidir.

Usage

Recherche de la dégradation du mannitol

Recherche de la mobilité de la bactérie.

Recherche de mobilité par présence d’une Nitrate réductase.

Lecture

Aspect après 24h à 37°C

Interprétation

Mannitol - Mobilité -

Mannitol - Mobilité +

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Mannitol + Mobilité -

Mannitol + Mobilité +

Dégradation des Nitrates :

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Urée Indole – milieu synthétique

Composition

Mélanges d’acides aminés, facteurs de croissance : /

Glucide et dérivés :

Autres molécules carbonées : L-triptophane (noyau indole), éthanol

Indicateurs S2- : /

Inhibiteurs : /

Divers : /

Indicateurs de pH : rouge de phénol

Ions minéraux : NaCl, K2HPO4 hydrogénophosphate de potassium, KH2PO4 dihydrogénophosphate de potassium

Agar : /

Eau : eau distillée

Caractéristiques

Il n’y a pas de source de carbone : les bactéries ne se multiplient pas. Il faut donc l’ensemencer abondamment. Absence de peptones : alcalinisation du milieu due à l’hydrolyse de l’urée.

Milieu complexe synthétique.

Fournit un ensemble de données permettant l’identification des entérobactéries et autres bactéries.

Usage

Permet la recherche de 3 activités enzymatiques : o L’uréase o La tryptophane désaminase (TDA) o La production d’indole grâce à une tryptophanase.

Technique

Recherche d’une Uréase

Ensemencement riche à partir de cultures solides.

Aspect après 24h à 37°C :

Interprétation :

Toutes les bactéries hydrolysent l’urée : O=C(NH2)2 + H2O H2N-COOH + NH3 Seules les bactéries ayant une uréase très active arrivent à : H2N-COOH CO2 + NH3 Le CO2 et le NH3 se combinent pour former du carbonate d’ammonium : CO2 + NH3 2NH4

+ + CO32-.

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Le carbonate d’ammonium est très alcalin : la recherche de l’uréase constituera à tester l’alcalinisation du milieu.

o Uréase constitutive : uréase + très rapidement, 10min pour Proteus et Yersinia. o Uréase induite : uréase + en plusieurs heures, pour Klebsiella.

Recherche d’une Tryptophane Désaminase (TDA)

Ensemencement : o Classique : ensemencer richement le milieu urée-indole à partir de culture en

milieu solide et incuber 24h à 37°C. o Rapide : faire une suspension dense dans 10 gouttes de milieu urée-indole.

Agiter 10min à l’agitateur de Kahn.

Aspect après 24h à 37°C :

Interprétation :

En présence de TDA, le tryptophane donne de l’acide β-indole peruvique. Ce dernier, en présence de perchlorure de fer donne une coloration brune.

o TDA + : coloration brune. Proteus, Providencia, Morganella… o TDA - : coloration jaune-orangée.

Recherche de la Production d’Indole

Ensemencement : Ensemencer richement le milieu urée-indole à partir de culture en milieu solide et incuber 24h à 37°C.

Aspect après 24h à 37°C :

Interprétation :

Grâce à une tryptophanase, les bactéries peuvent dégrader le tryptophane en indole, acide pyruvique et NH3.

o Indole + : anneau rouge o Indole - : anneau brûnatre.