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Universit Ferhat ABBAS Stif
Facult des Sciences de la Nature et de la Vie
Dpartement de Microbiologie N /SNV/2012
THSE
Prsente par: Mme MEZAACHE Samia
Pour obtenir le diplme de Doctorat en Sciences
Option : Microbiologie
THME LOCALISATION DES DTERMINANTS DE LA SUPPRESSION DE
QUELQUES SOUCHES DE PSEUDOMONAS ISOLES DE LA
RHIZOSPHRE DE LA POMME DE TERRE.
Soutenue le 04 /07/2012
Devant le Jury
Prsident: HARZALLAH, D. Professeur Universit Ferhat ABBAS de
Stif
Rapporteur: GUECHI, A. Professeur Universit Ferhat ABBAS de
Stif
Examinatrice: YAHIAOUI, R. Professeur Universit Abderrahmane
MIRA de Bejaia
Examinateur: MAAMACHE, B. Professeur Universit Hadj LAKHDHAR de
Batna
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SOMMAIRE Remerciements
Liste des abbrviations
Liste des Figures et Tableaux
INTRODUCTION GENERALE 1
CHAPITRE PREMIER : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE 6
1. CARACTERISTIQUES DU GENRE PSEUDOMONAS 6
1.1. CARACTERISTIQUES METABOLIQUES 6
1.2. CLASSIFICATION DU GENRE 8
1.2.1. Etapes de la classification 8
1.2.2. Classification contemporaine 10
2. DISTRIBUTION ECOLOGIQUE ET ROLE DU GENRE PSEUDOMONAS 14
2.1. DISTRIBUTION ECOLOGIQUE 14
2.2. LES PSEUDOMONAS SPP. FLUORESCENTS AGENTS DE BIOCONTROLE ET
DE CROISSANCE DES PLANTES 15
2.2.1. Stimulation de la croissance des plantes 16
2.2.2. Mcanismes dantagonisme 18
2.2.3. Quorum Sensing(QS) 22
3. BIOLOGIE DU FER CHEZ LES BACTERIES 22
3.1. PROPRIETES CHIMIQUES 22
3.2. PROPRIETES BIOLOGIQUES 23
3.3. LHOMEOSTASIE DU FER 24
3.3.1. La protine FUR 24
3.3.2. Les facteurs -ECF 25
3.3.3. Petits ARN non-codants 26
3.4. LES SIDEROPHORES 26
3.4.1. Dfinition 26
3.4.2. Caractristiques 27
3.4.3. Classification des sidrophores 27
DEUXIME CHAPITRE : ISOLEMENT ET IDENTIFICATION DES
PSEUDOMONAS 29
1. INTRODUCTION 29
2. MATERIELS ET METHODES 31
2.1. PRELEVEMENT DES ECHANTILLONS 31
2.2. DETERMINATION DES ISOLATS BACTERIENS 31
2.2.1. MTHODE DISOLEMENT 31
2.2.2. CONSERVATION DES ISOLATS 32
2.2.3. IDENTIFICATION PHENOTYPIQUE DES ISOLATS 32
2.2.4. TAXONOMIE NUMERIQUE 36
2.2.5. IDENTIFICATION GNOTYPIQUE DES ISOLATS 37
3. RESULTATS 42
3.1. ISOLEMENT DES PSEUDOMONAS FLUORESCENTS 42
3.2. IDENTIFICATION SPECIFIQUE DES PSEUDOMONAS FLUORESCENTS
42
3.3. IDENTIFICATION INFRASPECIFIQUE DE PSEUDOMONAS FLUORESCENTS
43
3.4. DISTRIBUTION DES ISOLATS 44
3.5. IDENTIFICATION DES ISOLATS PHYTOPATHOGENES 46
3.6. TAXONOMIE .NUMERIQUE 46
3.6.1. BIOTOPE CULTIVE 47
3.6.2. BIOTOPE NON CULTIV 50
3.7. SEQUENAGE r RNA 16S ET ANALYSE PHYLOGENETIQUE 51
3.8. PROFILS PLASMIDIQUES 51
-
4. DISCUSSION 53
5. CONCLUSION 61
TROISIME CHAPITRE : MTABOLITES IMPLIQUES DANS LA
SUPPRESSION 62
1. INTRODUCTION 62
2. MATERIELS ET METHODES 64
2.1. MATERIEL BIOLOGIQUE 64
2.2. PRODUCTION DE METABOLITES SECONDAIRES 64
2.2.1. SYNTHESE DES SIDEROPHORES 64
2.2.1.1. Electrophorse des sidrophores 65
2.2.1.2. Dtermination de la nature chimique des sidrophores
65
2.2.1.3. Synthse des IRCP (Iron Repressed Cytoplasmic Proteins)
66
2.2.2. SYNTHESE DE LACIDE INDOLE ACETIQUE (AIA) 67
2.2.2.1. Estimation de la production dAIA 67
2.2.2.2. Quantification de lAIA 67
2.3. PRODUCTION DENZYMES 67
2.3.1. PHOSPHATASES 67
2.3.2. CELLULASES 68
2.3.3. LIPASES 68
2.3.4. LES ENZYMES DEGRADANT LES PAROIS CELLULAIRES 68
2.4. SYNTHESE DANTIBIOTIQUES 68
2.4.1. PRODUCTION DE SUBSTANCES VOLATILES (HCN) 68
2.4.2. PRODUCTION DE SUBSTANCES DIFFUSIBLES: Phenazines. 69
2.4.2.1. Slection des souches antagonistes in vitro 69
2.4.2.2. Dtection et extraction des mtabolites effet
antibiotique 70
2.4.2.3. Quantification des phnazines 70
2.4.2.4. Analyse des composs effet antibiotique : phnaziniques
70
3. RESULTATS 73
3.1. PRODUCTION DE SIDEROPHORES 73
3.2. PRODUCTION DE LACIDE SALYCILIQUE 77
3.3. PRODUCTION DE LACIDE-INDOLE-ACETIQUE 77
3.4. PRODUCTION DENZYMES 79
3.5. CYANOGENESE 79
3.6. PRODUCTION DES COMPOSES A EFFET ANTIBIOTIQUE 79
3.6.1. CARACTERISATION DES PHENAZINES 80
3.6.1.1. Extraction 80
3.6.1.2. Bio autographie et rvlation chimique 81
3.6.1.3. Spectres UV-Visible 81
3.5.1.4. Analyse HPLC 82
3.5.1.5. Analyse GC/MS 83
4. DISCUSSION 85
5. CONCLUSION 93
QUATRIME CHAPITRE : COMPTITION RHIZOSPHRIQUE 94
1. INTRODUCTION 94
2. MATERIELS ET METHODES 96
2.1. MATERIEL BIOLOGIQUE 96
2.2. DETECTION DE LA PRODUCTION DE BACTERIOCINES 96
2.3. PRODUCTION DE BACTERIOCINES PAR INDUCTION 96
2.4. ACTIVITE BACTERICIDE DES LYSATS 97
2.5. DETERMINATION DU TYPE DE BACTERIOCINE 97
2.5.1. DIGESTION TRYPIQUE 97
2.5.2. FILTRATION 97
-
2.5.3. CONGELATION 98
2.5.4. TRAITEMENT THERMIQUE 98
3. RESULTATS 99
3.1. DETECTION DE BACTERIOCINES 99
3.2. DETERMINATION DU TYPE DE BACTERIOCINE 99
4. DISCUSSION 102
5. CONCLUSION 106
CINQUIME CHAPITRE : CAPACITS DANTAGONISME ET
STIMULATION DE LA CROISSANCE 107
1. INTRODUCTION 107
2. MATERIELS ET METHODES 109
2.1. MATERIEL BIOLOGIQUE 109
2.2. ANTAGONISME IN VITRO 110
2.2.1. INHIBITION DE LA CROISSANCE MICROBIENNE 110
2.2.2.2. Activit antifongique 111
2.2.1.2. Activit antibactrienne 112
2.2.2. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES SURNAGEANTS 112
2.2.2.1. Activit antibactrienne 112
2.2.2.2. Activit antifongique 113
2.2.3. UTILISATION DES SIDEROPHORES 113
2.2.3.1. valuation de la capacit dutilisation des sidrophores
113
2.2.3.2. Utilisation des sidrophores htrologues 114
2.2.4. TESTS DENROBAGE DES TUBERCULES 114
2.3. TESTS DANTAGONISME IN SITU 115
2.3.1. PREPARATION DES TERREAUX 115
2.3.2. TRAITEMENT DES TUBERCULES 115
3. RESULTATS 116
3.1. ANTAGONISME IN VITRO 116
3.1.1. INHIBITION DE LA CROISSANCE MICROBIENNE 116
3.1.2. UTILISATION DES SIDEROPHORES 119
3.1.3. ENROBAGE DES TUBERCULES 120
3.2. ANTAGONISME IN PLANTA 121
3.2.1. STIMULATION DE LA CROISSANCE DES PLANTES 121
3.2.2. POUVOIR PATHOGENE DES ISOLATS DE PSEUDOMONAS 10 ET 12
122
3.2.3. ANTAGONISME IN PLANTA: INHIBITION DE FUSARIUM OXYSPORUM
SP. 122 4. DISCUSSION 124
5. CONCLUSION 128
DISCUSSION GNRALE 129
CONCLUSION GNRALE 139
RFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 141
ANNEXES
-
Je ddie cette thse ma Famille qui a fait de moi ce que je
suis,
-
Remerciements Je tiens tout dabord remercier Le Pr. GUECHI
Abdelhadi, doyen de la facult
des sciences de la nature et de la vie pour mavoir accueillie au
sein de son laboratoire. Vous
avez rendu possible la ralisation de ce travail. Au-del de votre
rle de directeur de thse, le
temps que vous mavez consacr, vos critiques pertinentes et votre
esprit de synthse ont t
des lments dterminants dans la valorisation de cette thse.
Un ENORME merci tous ceux qui mont aid, mont conseill, mont
ouvert leurs portes, parfois mme avec un sourire, et qui se
reconnatront sans que je nai citer leurs
noms. Tous le corps technique et enseignant de la facult, chacun
dentre vous a particip activement au bon droulement de ce travail
de thse et sans vous, certaines tudes
exprimentales n'auraient pu tre ralisables.
Merci aux membres du jury, les Professeurs D. HARZALLAH, R.
YAHIAOUI et B. MAAMACHE davoir accept de juger mon travail. Je suis
convaincue que votre savoir me permettra davancer encore plus loin
dans ce sujet qui ma passionn
pendant trs longtemps.
Je souhaite remercier toutes les personnes qui ont particip
troitement l'avance de mes
recherches et la ralisation des tudes exprimentales. Le Dr.
Djamel DRIDER et Dr.
Herv PREVOST lENITIAA (Nantes), Dr. Jane NICKLIN et Dr. Richard
STRANGE,
Birkbeck college University of London. Melle Safia ZOUBIRI
(Moubydal, Alger).
L'un des cts agrables du domaine de la recherche est la
possibilit de faire de
nombreuses rencontres, plus ou moins phmres, toutes diffrentes
les unes des autres.
Je finirai par remercier ma trs chre mre Saida et mon regrett et
dfunt pre, pour mavoir permis daller jusquau bout.
Je remercie Salim, pour avoir t l tout simplement au quotidien
et avoir relev tous les dfis. Enfin, toute ma famille mes surs
Fouzia, Nadia et Nina ; mes frres Samir et Hichem ; mes filles
Nihel, Chaima et Wihed, sans oublier toutes mes amies et mes
collgues.
-
LISTE des ABRVIATIONS
2-OH-PCA: le 2-hydroxy-phnazine1 carboxylate.
2-OH-PZ : le 2-hydroxy-phnazine.
30-84 : P. chlororaphis 30-84 (P. aurofaciens 30-84).
ACC dsaminase : La 1-Amino-cyclopropane-1-carboxylate.
ACN : actonitrile.
AHL: N-acyl-hornoserine lactone.
AIA : acide indole actique.
AMPc : adnosine monophosphate cyclique.
AS : acide salicylique.
ATB : antibiotique.
ATP : adnosine tri-phosphate.
B.subtilis: Bacillus subtilis.
BPB : Bromo-Phenol-Bleu.
bv : biovar.
CAA : Casamino-Acids.
CAS: chrome azurol S.
Ccd : coefficient de capacit de diagnostique.
CCM : chromatographie sur couche mince.
CHAO : P. fluorescens CHAO.
CWDE : enzymes ayant une activit protolytique et chitinases.
DAPG : 2,4-diacetylphloroglucinol.
DO : densit optique.
E.coli MC 4100: Escheichia coli MC 4100.
E.P.S : exo-polysaccharide.
EDDA: Ethylenediamine di (o-hydroxyphenyl) acetic acid.
Fo: Fusarium oxysporum.
Foa: Fusarium oxysporum f.sp. albedinis.
Fol: Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.
Fr: Fusarium roseum sp.
Fs: Fusarium solani sp.
Fsc: Fusarium solani var. coeruleum.
Fsul18: Fusarium sulphereum 18 (sambucinum).
FUR: Ferric Uptake Regulator.
G+C: guanine + cytosine.
-
GC/MS : chromatographie en phase gazeuse couple une
spectroscopie de masse.
gyrB : sous unit de lADN gyrase.
H2O2 : eau oxygne.
H2S : hydrogne sulfur.
HMW: High Molecular Weight.
HPLC: high performance liquid chromatographie.
HR: hypersensitive reaction.
HSL: homo srines lactones.
IRCP: Iron Repressed Cytoplasmic Proteins.
ISR: induced systemic resistance.
ITS: intergenic spacer.
KB: milieu B de King.
kDa : kilo Daltons.
KNO3: nitrates de potassium.
LIpA: La lectine-like putidacine-A.
LB : Luria Bertani.
LIpA : lectin-like putidacin-A.
LOPAT : Levane Oxydase, , Potato rotting, hydrolyse de
lArginine, Tobacco.
M. luteus : Micrococcus luteus ;
MALDI-TOF-MS: matrix-assisted laser desorption ionization-time
of flight mass spectrometry.
MHB: mycorrhiza helper bacteria.
MS: milieu au succinate.
NA: nutrient agar.
NBY: nutrient broth yeast extract.
NYA /NAY: nutrient yeast extract agar.
O-CAS: overlayed chrome azurol S.
P.diminutus : Pseudomonas diminutus.
Pa. paratrophus: Paracoccus paratrophus.
PAO1 : P.aeruginosa1.
PCA : phnazine-1-carboxylate.
PCN : phnazine-1-carboxamide.
PCR: polymerase chain reaction.
PDA: potato dextrose agar.
PDB: Potato Dextrose Broth.
PGPR : Plant Growth Promoting Rhizobacteria.
Pi: Phytophtora infestans.
-
PLT: Pyolutorine.
PM: Poids molculaire.
PRN: pyrrolnitrine.
Pu: Pytium ultimum.
PVDs: pyoverdines.
QS: Quorum Sensing.
recA: recombinase A.
Rf: rapport frontal.
rhyB : ARN non-codant.
rpm: Rotation par minute.
rpoB : sous unit de lARN polymerase.
rpoD : facteur 70 de lARN polymrase.
Rs: Rhizoctonia solani.
S.enteridis : Salmonella enteridis.
SA : sucrose/asparagine.
SAR : systemic acquired resistance
SDS-PAGE : sodium dodcyl sulfate polyacrylamide gel
electrophoresis.
SOS : Save Our Selves.
TFA: tri-fluoro-acetic acid.
TLC: thin layer chromatography.
tr : le temps de rtention du compose.
TSA : Tryptic-soy-agar.
TSB : tryptic-soy-broth.
U.F.C: unity forming colony.
UPGMA: unweighted pairgroup method with averages.
-ECF : facteur sigma de fonctions extra-cytoplasmiques.
-
LISTE DE FIGURES ET TABLEAUX
Chapitre I
Figure 1. Relations phylogntiques entre les diffrents groupes
des protobactries 6
Figure 2. Reprsentation schmatique dcrivant les interactions
plantes-
microoganismes dans la rhizosphre
17
Figure 3. Les principaux antibiotiques produits par les souches
de biocontrle jouent
un rle central entre les lments impliqus dans les interactions
:
Pseudomonas de biocontrle, plantes, pathognes, prdateurs,
cooprateurs
et sol
20
Figure 4. Oxydation et rduction du fer 23
Figure 5. Raction de Fenton 24
Figure 6. Exemples de Sidrophores classs selon leurs groupements
fonctionnels 28
Chapitre II
Figure 7. Schma gnral de caractrisation du groupe Pseudomonas
fluorescens-
putida 33
Figure 8. Cl dichotomique pour lidentification des souches
appartenant aux espces
P. fluorescens et P. putida
34
Figure 9. Dendrogramme des 14 isolats du site Dirou 47
Figure 10. Dendrogramme des neufs isolats du site Ras el oued
50
Figure 11. Dendrogramme de 17 isolats de sols non cultivs 50
Figure 12. Arbre phylogntique bas sur lanalyse des squences de
lADNr 16S, et
montrant la relation des isolats 2 et 10 avec les espces type du
genre
Pseudomonas 52
Chapitre III
Figure 13. Production de sidrophores sur milieu au succinate
O-CAS 74
Figure 14. Electrophorse SDS-PAGE des protines cytoplasmiques
solubles 76
Figure 15. Production dacide indole actique 78
Figure 16. Production de protases 79
Figure 17. Production dHCN sur milieu la glycine 80
Figure 18. Bioautographie des extraits C/A cellulaires de
lisolatP2 82
Figure 19. Superposition des spectres UV/Visible du Standard
(PCA) et des isolats
Pseudomonas P2 et 30-84
82
Figure 20. Superposition des chromatogrammes de lextrait actif
de P2 (rouge), et du
standard PCA (bleu) 84
Figure 21. Profil chromatographique de lextrait mthanolique pour
un m/z = 180 84
-
Chapitre IV
Figure 22. Production de bactriocines par les isolats de
Pseudomonas 99
Figure 23. Activit bactricide des surnageants 100
Chapitre V
Figure 24. Confrontations A : quidistante par contact direct sur
PDA, B : distance 111
Figure 25. Utilisation des sidrophores htrologues 113
Figure 26. Antagonisme fongique in vitro 118
Figure 27. Antagonisme bactrien indirect par lextrait brut de P2
118
Figure 28. Antagonisme par production de substances volatiles
prsence de FeCl3 119
Figure 29. Utilisation des sidrophores htrologues sur
Sucrose/Asparagine 120
Figure 30. Utilisation de sidrophores semi purifis 120
Figure 31. Pouvoir protecteur des isolats de Pseudomonas 121
Figure 32. Effet de la bactrisation sur la croissance des
plantes 121
Figure 33. Effet de la bactrisation par les isolats 10 et 12
aprs 8 semaines
dinoculation 123
Figure 34. Ncroses foliaires aprs 20 jours dinoculation 123
Figure 35. Effet de la bactrisation sur le dveloppement de la
maladie 123
-
Chapitre I
Tableau I. Les espces appartenant actuellement au genre
Pseudomonas 11
Chapitre II
TableauII. Rpartition des isolats de Pseudomonas spp.
fluorescents selon les
biotopes 43
Tableau III. Identification spcifique des isolats de Pseudomonas
spp. fluorescents 44
TableauIV. Spectres de rponses aux tests didentification
spcifique et infraspcifique selon les cls A, B et C
45
Tableau V. Rpartition des souches slectionnes dans les taxons
46
Tableau VI. Principales caractristiques des souches
phytopathognes 47
Tableau VII. Rsultats des caractres mtaboliques 48
TableauVIII. Classes et isolats du dendrogramme Dirou 49
Tableau IX. Classe et isolats du dendrogramme Ras el oued 49
Tableau X. Classes et isolats du dendrogramme sol non cultiv
51
Chapitre III
Tableau XI. Nombre et taux des souches de Pseudomonas spp.
fluorescents
producteurs de mtabolites secondaires 73
Tableau XII. Influence des milieux de culture sur la production
de sidrophores 74
TableauXIII. Production de sidrophores sur milieu au Succinate
en absence et en
prsence de Fer 75
Tableau XIV. Dtection de la nature chimique des sidrophores
produits par les
Pseudomonas spp. 76
Tableau XV. Dtection de la production dacide salicylique 77
TableauXVI. Production qualitative et quantitative dAcide Indole
Actique en
prsence et en absence de tryptophane. 78
TableauXVII. Composs phnaziniques rvls par GC/MS 83
Chapitre IV
TableauXVIII. Antagonisme in Vitro entre les Pseudomonas spp.
fluorescents
par production de substances antibactriennes 100
Tableau XIX. Activit bactricide des surnageants traits 101
Chapitre V
Tableau XX. Isolats de Pseudomonas fluorescents tests 109
Tableau XXI. Origine des microorganismes utiliss dans
lantagonisme 110
TableauXXII. Taux dinhibition de la croissance myclienne 116
TableauXXIII. Quantits dextrait requises pour linhibition
fongique 117
-
INTRODUCTION GNRALE
-
INTRODUCTION GENERALE
La qute constante de lhomme pour lamlioration de la productivit
et la rduction des
cots des produits agricoles ont eu des incidences ngatives et
plusieurs niveaux. La qualit de
lenvironnement a t particulirement touche : contamination de
leau par une utilisation
intensive de produits phytosanitaires et dengrais de synthse,
prsence dans les aliments de
rsidus nocifs pour la sant, appauvrissement des sols, rduction
de la biodiversit du fait de la
prsence de mono cultures de masse, et particulirement la
perturbation de la vie microbienne.
Dans le sol, les microorganismes reprsentent la majorit des
organismes vivants et
constituent une importante part de la diversit gntique de la
plante. Il a t estim quun gramme
de sol contenait de 1010
1011
bactries (Horner-Devine et al., 2003), de 6000 50000 espces
bactriennes (Curtis et al., 2002) et jusqu 200 milles hyphes
fongiques (Leake et al., 2004). De
plus, les microorganismes jouent un rle cl et influencent un
grand nombre des processus des
diffrents cosystmes incluant lacquisition des lments nutritifs
pour les plantes (Pivato et al.,
2009), les cycles gochimiques comme celui de lazote (Kowalchuk
et Stephen, 2001) ou du
carbone (Hgberg et al., 2001) et la structure du sol (Rillig et
Mummey, 2006). Cependant, leur
impact sur la productivit et la diversit des plantes est encore
mal compris.
Depuis plus dun sicle, la comprhension des interactions
plantes-microorganismes
dans la rhizosphre a suscit lintrt de nombreux chercheurs. La
rhizosphre est dfinie
comme tant la zone de sol entourant la racine qui est
directement ou indirectement
influence par cette dernire et qui prsente une forte activit
microbienne.
Une partie significative des photo-synthtats de la plante est
directement libre dans le
sol sous forme de molcules organiques appeles rhizodpts. Ces
rhizodpts reprsentent
de 5 40% des produits de la photosynthse (Nguyen, 2009). La
plante modifie donc
lenvironnement rhizosphrique en librant divers composs dans les
rhizodpts.
La densit des populations de la microflore associe aux racines
est significativement plus
leve dans la rhizosphre que dans le sol nu (van Loon, 2007). Ces
modifications quantitatives
de la microflore, ou effet rhizosphre, saccompagnent galement de
modifications qualitatives.
La diversit et la structure des communauts microbiennes dans la
rhizosphre (Latour et al.,
2009; Kowalchuk et al., 2010) et leur activit mtabolique
(Nannipieri et al., 2008) diffrent de
celles du sol nu. Les populations aptes percevoir les variations
de lenvironnement rhizosphrique
et adapter leur physiologie, sont favorises et tirent profit de
cette perturbation.
-
Les composs organiques exsuds par les plantes dans la rhizosphre
activent diffrents groupes de
microorganismes et augmentent leur prolifration (Bais et al.,
2006).
Les rhizodpts constituent donc un lment majeur de perturbation
de la microflore
tellurique qui en retour, influence la croissance et la sant des
plantes et donc, nouveau, lmission
des rhizodpts. La microflore rhizosphrique est naturellement
constitue dun assemblage
complexe de microorganismes procaryotes et eucaryotes (Cardon et
Gage, 2006). Parmi ces
microorganismes, certains sont prsents dans la rhizosphre sans
que leur influence sur le
dveloppement des vgtaux ne soit connue (microorganismes
commensaux), certains sont
favorables aux plantes (mutualistes) alors que dautres ont des
effets dltres sur les plantes
(parasites et phytopathognes). La croissance, la sant des
plantes et leur diversit sont donc
influences par la diversit des populations microbiennes prsentes
dans la rhizosphre (Lemanceau,
1992; Bloemberg et Lugtenberg, 2001; Whipps, 2001; Weller et
al., 2002; van der Heijden et al.,
2008). Les rhizodpts jouent un rle actif dans la rgulation des
interactions mutualistes et
parasites/pathognes, entre les plantes et les microbes du sol
(Hirsch et al., 2003).
La variabilit des rsultats obtenue par lutilisation dorganismes
vivants est souvent
suprieure celle obtenue par lapplication de produits de synthse.
De meilleures connaissances
des mcanismes dinteraction plantes-microorganismes permettent de
favoriser des populations
dj prsentes dans la rhizosphre et qui sont bnfiques pour les
plantes, et de dvelopper des
pratiques autres que lutilisation dinoculants (Elhassan et al.,
2010).
Deux catgories deffets bnfiques des microorganismes sur les
plantes peuvent tre
distingues (van der Heijden et al., 2008) : (i) les effets
directs via les organismes microbiens
associs la racine qui mettent en place des relations mutualistes
avec les plantes et (ii) les
effets indirects via laction des microorganismes vivant
librement dans la rhizosphre qui
modifient les taux dapprovisionnement en lments nutritifs et la
rpartition des ressources.
Les microorganismes vivant librement dans la rhizosphre peuvent
galement avoir un
effet bnfique indirect sur la plante. Dune manire gnrale, le
processus de minralisation
est une voie importante par laquelle les microorganismes vivant
librement influencent la
disponibilit des lments nutritifs et donc la productivit, la
sant et la diversit des plantes.
Par ce processus, les microorganismes du sol dcomposent la
matire organique soluble et
insoluble et librent ensuite des lments minraux disponibles pour
les plantes.
Parmi les microorganismes effets bnfiques indirects, il existe
notamment des bactries
dont leffet global favorise la croissance de la plante
(Lemanceau, 1992).
-
Le terme PGPR (plant growth-promoting rhizobacteria) dsignant
ces bactries a t introduit par
Kloepper et Schroth (1978). Diffrents mcanismes sont lorigine
des effets PGPR des bactries
rhizosphriques.
Certaines bactries PGPR sont utilises en tant quinoculants pour
amliorer le
dveloppement des racines via la production de certaines
phytohormones (Bloemberg et
Lugtenberg, 2001), telles que des auxines dont lacide indole
actique (AIA), des cytokinines
et des gibbrellines (Vessey, 2003).
Par ailleurs, de nombreuses bactries sont capables damliorer la
sant des plantes en
limitant la croissance saprophyte des microorganismes
phytopathognes. Certaines sont
utilises en agriculture comme agents de lutte biologique
(Bloemberg et Lugtenberg, 2001;
Whipps, 2001).
Les microorganismes pathognes sont connus pour pouvoir induire
chez les plantes des
mcanismes de dfense, par lintermdiaire de:
*La rsistance systmique acquise (SAR) qui protge les plantes
contre les attaques
ultrieures dautres pathognes.
*Certaines bactries peuvent avoir un effet protecteur en
induisant elles aussi, des mcanismes de
dfense des plantes via la rsistance systmique induite (ISR)
permettant aux plantes de mieux se
protger contre lattaque ventuelle de pathognes (van Loon,
2007).
*Dautres bactries peuvent contrler la croissance des pathognes
par la comptition pour les
lments nutritifs, comme par exemple, la comptition pour le
carbone (Lemanceau et al., 1988) et
la comptition pour le fer dont la biodisponibilit dans le sol
est trs faible (Lemanceau et al., 2009).
*Lantagonisme microbien, li la production de mtabolites ayant
des proprits antibiotiques, est
galement un mcanisme par lequel les bactries rhizosphriques
protgent les plantes contre les
microorganismes phytopathognes (van Loon, 2007; Mazurier et al.,
2009).
Les Pseudomonas ont une capacit leve coloniser la rhizosphre
ainsi que les racines
des plantes et sont capables de former des associations intimes
avec leurs htes. Ces associations
peuvent mener une maladie chez les plantes htes sensibles, comme
par exemple de nombreux
pathovars de Pseudomonas syringae qui mettent en place des
interactions pathognes avec les
plantes (Hfte et de Vos, 2006). P. syringae, comme beaucoup
dautres Pseudomonas
phytopathognes, est capable dinduire chez les plantes rsistantes
non htes, une raction
hypersensible (HR) lorigine de la SAR (Alfano et Collmer,
1997).
-
La HR est une raction rapide de dfense des plantes correspondant
une mort programme des
cellules aux sites dinvasion, qui bloque la progression du
pathogne (Klement, 1982).
Nanmoins, dautres espces de Pseudomonas sont capables de mettre
en place des
interactions mutualistes. Elles sont trs largement reprsentes
parmi les bactries effet PGPR qui
promouvoient la croissance des plantes. Ces bactries sont aussi
largement retrouves parmi les
agents potentiels de lutte biologique qui ont pour effet
damliorer la sant des plantes et sont
notamment connues pour leur effet antagoniste avec les
phytopathognes. La grande diversit des
mcanismes daction de ces Pseudomonas est principalement lie leur
grande capacit produire
une large gamme de mtabolites secondaires et induire lISR chez
les plantes (Bloemberg et
Lugtenberg, 2001 ; Whipps, 2001; van Loon, 2007; Weller et al.,
2002, 2007).
Les Pseudomonas produisent notamment, de nombreux mtabolites
antifongiques (Weller et
al., 2002, 2007). En effet, la plupart des Pseudomonas
produisent des antifongiques tels que des
phnazines, la pyolutorine, la pyrrolnitrine et le DAPG
(2,4-diacetylphloroglucinol) qui sont les
antifongiques les plus frquemment dtects (Haas et Dfago, 2005).
Ces bactries sont galement
capables de synthtiser des sidrophores appels pyoverdines ou
pseudobactines. Ces molcules
sont impliques dans lamlioration de la croissance et de la sant
des plantes (Lemanceau et al.,
2009) et contribuent lacquisition du fer par les vgtaux (Vansuyt
et al., 2007).
Elles licitent les ractions de dfenses des plantes et, de par
leur forte affinit pour le fer,
elles limitent la croissance saprophyte de certains
microorganismes phytopathognes
(Lemanceau et al., 2009).
OBJECTIFS DU TRAVAIL
Lobjectif de ce travail est dapporter un plus dans la lutte
biologique par la mise en
vidence de bactries indignes bnfiques pour les plantes. En
valuant leurs contributions
dans la croissance et la sant des plantes, par la mise en
vidence des principaux dterminants
de la suppression ou de la pathognicit (si elle existe).
La stratgie dtude de ce travail consiste (i) isoler et
caractriser, partir de la rhizosphre,
une population bactrienne spcifique, en loccurrence des
Pseudomonas spp. fluorescents. (ii)
dterminer les principaux mtabolites synthtiss par ces
microorganismes, qui auraient un impact
bnfique sur les plantes. (iii) explorer les capacits comptitives
des isolats bnfiques. Et enfin (iv)
tester in vitro les mtabolites produits sur des phytopathognes
telluriques.
Pour cela, une synthse bibliographique relative aux Pseudomonas
spp. fluorescents a
t ralise, et plusieurs approches exprimentales ont ensuite t
retenues.
-
Chapitre I
Revue bibliographique
-
1. CARACTERISTIQUES DU GENRE PSEUDOMONAS
Le genre Pseudomonas est un grand groupe bactrien
particulirement important qui
appartient la sous-classe des protobactries et comprend plus
d'une centaine d'espces
ubiquitaires (Bossis et al., 2000 ; Palleroni et Moore, 2004).
Cependant, depuis la dcouverte
du genre Pseudomonas (Migula, 1894), beaucoup de noms despces
lui ont t assigns. Le
nombre despces a subi de nombreuses variations principalement
dues la description de
nouvelles espces et divers changements de la dfinition du genre
(Fig.1). Nanmoins, 188
espces sont actuellement rpertories sur le site internet
http://www.
bacterio.cict.fr/p/pseudomonas.html.
Figure 1. Relations phylogntiques entre les diffrents groupes
des
protobactries contenant les genres bactriens actuellement ou
anciennement (en gras)
associs aux Pseudomonas (Bossis et al., 2000).
1.1. CARACTERISTIQUES METABOLIQUES
Le genre Pseudomonas est caractris par un mtabolisme oxydatif et
non fermentatif,
utilisant loxygne comme accepteur final d'lectrons, et mme
quelques souches utilisent la
dnitrification (les nitrates sont parfois utiliss comme
accepteur d'lectrons ce qui permet une
croissance en anarobiose).
-
Les Pseudomonas spp. fluorescents saprophytes possdent tous une
cytochrome
oxydase c ayant un maximum dabsorption caractristique 552/554
nm, qui peut tre mise
en vidence par loxalate de N, N-dimthyl-paraphenylne-diainine
(Lelliot et al., 1966).
Elles sont aussi catalase positive, msophile chimio-organotrophe
puisquelles peuvent
crotre dans un milieu minral ne contenant quune seule source de
carbone. Toutefois,
certaines sont chimio organotrophes facultatives et peuvent
utiliser lhydrogne comme
source dnergie et nont pas besoin de facteurs de croissance pour
se multiplier. Elles
peuvent utiliser des sources de carbones variables (versatilit
nutritionnelle), et certaines ont
la capacit de crotre mme dans leau (Stanier et al., 1966). La
plupart tant saprophytes
(Bossis et al., 2000 ; Ramalho et al., 2002). Quelques espces
comme P. syringea, sont
phytopathognes (Stanier et al., 1966), et certaines peuvent
causer des infections chez
lhomme. Particulirement P. aeruginosa, reconnu comme pathogne
opportuniste et causant des
infectons pulmonaires mortelles chez les patients atteints de
fibrose kystique (Mavrodi et al., 2001).
Les tempratures cardinales aux quelles les espces se multiplient
varient de 4
42C, cette dernire est caractristique de lespce P. aeruginosa,
alors que la temprature
optimale pour la croissance des espces saprophytes est situe
entre 28C et 30C. Toutes
les espces de ce genre ne peuvent crotre pH infrieur 4.5, ni
mtaboliser le lactose sur
Mc Conkey, lexamen au rouge de mthyle et celui de Voges
Proskauer sont ngatifs
(Palleroni, 1984).
Ces bactries ont la capacit de dgrader des composs complexes,
tel que les protines et les
polysaccharides complexes comme lamidon, la cellulose
(Palleroni, 1984), certaines seulement
comme P. pseudoalcaligenes peuvent dgrader le poly
-hydroxybutyrate; (Palleroni, 1993).
Laptitude de certains isolats dgrader des substances
xnobiotiques a galement retenu
lattention de diffrents chercheurs (Latour et lemanceau, 1997 ;
Bossis et al., 2000). De
nombreux isolats de P. fluorescens et P. putida ont t cits en
exemple comme souches
capables de dgrader des molcules aromatiques plus ou moins
complexes. Lassimilation de
composs aromatiques semble par contre moins courante chez les
isolats provenant de sols
non contamins ou de la rhizosphre (Campbell et al., 1995 ;
Latour et al., 1996).
Le catabolisme des xnobiotiques par les Pseudomonas spp
fluorescents se caractrise en
effet par la varit et la plurifonctionnalit des enzymes
dgradatives. Il prsente de multiples
voies priphriques permettant les premires attaques dune gamme
importante de composs
(Golovleva et al., 1992). Enfin, certaines populations de
Pseudomonas spp fluorescents ont la
possibilit de dissimiler lazote (Clays-Josserand et al., 1995).
Cette dissimilation est plus ou moins
complte selon le groupe taxinomique considr (Matsubara et Zumft,
1982).
-
Ces bactries contribuent donc, de faon significative, la
rduction des nitrates et des
nitrites qui constituent des polluants des nappes phratiques
(Latour et Lemanceau, 1997).
En raison de la richesse de leurs voies mtaboliques, elles sont
souvent capables de rsister
de nombreux antiseptiques ou antibiotiques ce qui explique leur
prsence de plus en plus
frquente en milieu hospitalier o elles peuvent tre isoles de
l'environnement humide
(Euzeby, 2008).
Les espces du genre Pseudomonas produisent une couche dexopoly-
saccharide entourant
leurs cellules, la protgent de la phagocytose par les
macrophages chez les mammifres. Cette
couche dexo-polysaccharide (E.P.S) leur permet de former des bio
films, grce aux quels elles
peuvent rester colles aux surfaces, de telle manire quil est
difficile de les dloger (Visca et al.,
2007). Ce genre produit beaucoup de poly hydroxy alcanoates et
dalginates ainsi que dautres
substances mtaboliques. Ce qui les rend dun grand intrt
biotechnologique (Holloway, 1992).
1.2. CLASSIFICATION DU GENRE PSEUDOMONAS
Par dfinition, les bactries du genre Pseudomonas sont des
bacilles Gram ngatif,
non sporuls, gnralement mobiles grce une ou plusieurs flagelles
polaires, arobies
mtabolisme strictement respiratoire et chimio-organotrophes.
Mais cette dfinition ne permet
pas de les diffrencier des autres bactries Gram ngatifs, et doit
tre complte par dautres
caractristiques phnotypiques (Palleroni, 2008).
1.2.1. tapes de la classification
En 1960 Stanier et al., dans une approche de clarification de la
taxonomie du genre, ont
publi un travail reportant les caractristiques nutritionnelles
de 267 isolats du genre ; bas sur
lutilisation de 146 composs organiques, en plus dautres tests
considrs comme
dterminants dans la classification du genre. Dans la mme
dcennie, la dcouverte du
caractre de renaturation de lADN par Marmur, a permi de
confirmer la classification
phnotypique des Pseudomonas, par les essais dhybridation ADN/ADN
(Colwell et Mandel,
1964; Colwell et al., 1965; Johnson et Ordal, 1968).
Le plus grand succs de la classification des Pseudomonas, selon
les caractres gnotypiques
ft atteint par Palleroni et ses collaborateurs. Qui ont
classifis ce groupe bactrien en cinq sous-
groupes dARNr, sur la base dhomologies ARN/ADN (Palleroni et
al., 1973).Toutefois ces sous
classes dARNr sont phylogntiquement trop loigns, et finalement
seules les bactries
appartenant au groupe ARNr I sont retenues dans le genre
Pseudomonas (Peix et al., 2009).
-
Pourtant dans ldition de 1974 du Bergeys Manual, ces bactries
sont incluses dans la
famille des Pseudomonadaceae. Leur classification repose sur des
caractristiques
phnotypiques, seules la composition en G+C ft rajout comme
caractristique gntique.
Dans la premire dition du Bergeys Manual, la classification base
sur les cette homologie
ARN/ADN ft incluse, mais le nombre despces et les
caractristiques phnotypiques ont
t maintenu (Palleroni, 1984).
Les principaux changements dans la taxonomie viennent de Woese,
qui proposa de les
classifier et de les identifier en fonction de leurs ARN
ribosomaux (Woese et al., 1984).
Toutefois ce nouveau schma didentification na pas t pris en
considration dans ldition
1994 du Bergeys Manual. Pourtant, cest la classification
phylogntique base sur les gnes
codant lARNr 16S, tablie par Woese et al, (1984), qui a permis
plus tard la subdivision par
Kersters et al. (1996) des protobactries en 15 genres
appartenant aux classes , et
propos par Stackebrandt et al. (1987).
En mme temps, Pseudomonas acidovorans et P. testosteroni inclus
dans le groupe
ARNr III sont reclassifis en 1987 dans le genre Comamonas
(Tamaoka et al., 1987), alors
que les espces P. flava, P. palleroni, P. taeniospiralis, P.
pseudoflava et P. carboxydoflava
seront reclassifis deux ans plus tard dans le genre
Hydrogenophaga (Willems et al., 1989).
Depuis 1990, le squenage du gne codant ARNr 16S a dbut, et est
appliqu pour
toutes les bactries connus. Partiel au dbut, mais plus tard des
gnomes entiers ont t
squencs et dposs dans les banques de donnes. Le squenage du gne
codant lARNr
16S et le dveloppement des modles mathmatiques des arbres
reprsentant les similitudes
des squences ont permis une classification phylogntique des
procaryotes (Peix et al., 2009). Et
depuis, la reclassification des espces initialement incluses
dans les groupes ARNr de
Palleroni continue.
Les espces du groupe ARNr III comme P.facilis, P. delafieldii et
dautres isolats
cliniques sont dsormais reclassifies dans le genre Acidovorax
(Willems et al., 1990), des espces
phytopathognes comme P. avenae et P. catleyae ont aussi t
reclassifis dans ce genre
(Willems et al., 1992). En effet, ces nouveaux genres sont
inclus dans la classe des beta-
Proteobacteria, au mme titre que Burkholderia (Yabuuchi et al.,
1992) et Ralstonia (Yabuuchi
et al., 1995). Ces deux derniers genres proviennent de la
reclassification des espces du
groupe ARNrII comme P. cepacia (designe comme espce type du
genre Burkholderia)
P. mallei, P. pseudomallei, P. caryophylli, P. gladioli, P.
pickettii et P.solanacearum
(Yabuuchi et al., 1992, 1995).
-
Le groupe ARNr V, est phylogntiquement le plus proche des vrais
Pseudomonas
(ARNr groupe I), Xanthomonas maltophilia reclassifi dans le
genre Stenotrophomonas en
1993, mais appartenant la classe des gamma-Proteobacteria
(Palleroni et Bradbury, 1993).
Dans la premire dcennie du nouveau millnaire, la rvision
taxonomique la plus
dtaille du genre Pseudomonas base sur le squenage du gne codant
lARNr 16S, ft
entreprise par Anzai et al. (2000). En analysant les squences de
128 espces de
Pseudomonas (certaines sont des souches de rfrences), ils ont
conclu que 57 seulement
appartenaient aux groupe des Pseudomonas sensu stricto; la
comparaison de 1073
nuclotides les a subdivises en 7 classes :
-Le groupe des P. syringae.
-Le groupe des P. chlororaphis.
-Le groupe des P. fluorescens.
-Le groupe des P. putida.
-Le groupe des P. stutzeri.
-Le groupe des P. aeruginosa.
et le groupe des P. pertucinogena.
Depuis lan 2000, la reclassification continue toujours (Tableau
I). Plusieurs espces
tant mal classes comme P. aureofaciens et P. aurantiaca qui sont
dsormais des sous
espces du groupe P. chlororaphis (Johnson et Palleroni, 1989;
Peix et al., 2007), qui compte
actuellement trois sous espces: P. chlororaphis subsp.
chlororaphis subsp. nov.;
Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca subsp. nov., comb.
nov. et P. chlororaphis
subsp. aureofaciens subsp. nov., comb. nov. (Peix et al.,
2007).
1.2.2. Classification contemporaine
Ldition actuelle du Bergeys (Palleroni, 2005) compte de
nombreuses mthodes
utilises dans la classification des Pseudomonas. Ces mthodes
rvlent les efforts fournis
pour la caractrisation des espces de Pseudomonas, incluant la
sensibilit certains
composs, les caractristiques gntiques et cologiques, le pouvoir
pathogne et la structure
antignique (Peix et al., 2009).
1.2.2.1. Caractristiques phnotypiques
Comprennent les tests tels que : la forme cellulaire, le type de
flagelle, lutilisation des
sources de carbones tel que : les acides organiques, les
polyols, les acides amins, la capacit
de croissance dans des conditions de culture variables, la
synthse dexo-enzymes et la
production dantibiotiques (Palleroni, 2005).
-
Tableau I: Les espces appartenant actuellement au genre
Pseudomonas (daprs Euzeby, 2008 in Peix et al., 2009).
a: espces incluses dans le Bergeys Manual (Palleroni, 2005); b:
espces dcrites aprs la publication du Bergeys Manual (2005) ; c:
espces dcrites avant la publication du
Bergeys Manual (2005) qui nont pas t incluses dans cette dition
mais dont les noms sont valids (daprs Euzeby, 2008 in Peix et al.,
2009).
Re
vu
e b
iblio
gr
ap
hiq
ue
10
-
1.2.2.2. tudes chmo-taxonomiques
Parmi les caractristiques utilises dans la taxonomie des
Pseudomonas, lutilit des
tudes chmo-taxonomiques a t prouve maintes reprises, dans la
reclassification des
espces (Peix et al., 2009).
La prsence de certains lipides polaires comme le
phosphatidyl-glycerol,
diphosphatidyl-glycerol et la phosphatidyl-thanolamine (Camara
et al., 2007), les ARN
stable (5S rRNA et tRNA) de faible poids molculaire (Hfle, 1988,
1990), les systmes
quinones, en plus dautres marqueurs ont t utiliss dans la
reclassification de certains genres
de Pseudomonas dans dautres genres (Kampfer et al., 2008).
Auling et al. (1991) ont contribu differentier les espces de ce
groupe en tudiant la
composition en polyamine chez les Protobacteria. Janse et al.
(1992), avaient analys les
acides gras dune collection de phytopathognes opportunistes,
pour clarifier la position
taxonomique de souches de P. marginalis incluses dans le groupe
de P. fluorescens.
Jean-Marie Meyer et ses collaborateurs, ont utilis le
sidrotypage pour les
Pseudomonas spp. fluorescents dabord, et ensuite pour les non
fluorescents. Cette approche
taxonomique, est base sur la caractrisation iso-lectrophortique
des sidrophores et
pyoverdines; et la dtermination de la spcificit des pyoverdines
pour les souches
productrices. Ceci a permis la caractrisation des espces de
Pseudomonas par la mise en
vidence de pyoverdines spcifiques aux espces (Meyer et al.,
2002, 2007).
Delorme et al., (2002) et Ramette et al. (2011), lont utilis
pour la classification et
reclassification des espces de Pseudomonas. Le pouvoir de
rsolution et lexactitude de
cette nouvelle technique taxonomique a t amliore par la
dtermination de la masse
molculaire des pyoverdines par spectroscopie de masse (Meyer et
al., 2008).
Actuellement, les techniques les plus modernes danalyse des
biomolcules sont appliques
pour la taxonomie des Pseudomonas. En effet, lempreinte gntique
par spectroscopie
fluorescence (spectres dmission de fuorophores intrinsques:
NADH, tryptophane et un
complexe dacides amins aromatiques et dacides nucliques), a
permi une discrimination entre
les genres Pseudomonas, Burkholderia, Xanthomonas ou
Stenotrophomonas avec une grande
sensibilit. Mais aussi, entre les espces de P. chlororaphis, P.
lundensis, P. fragi, P. taetrolens et
P. stutzeri group sparment de P. putida P. pseudoalcaligenes et
P. fluorescens, correspondant
aux classes phylogntiques obtenues par Anzai et al. (2000) et
Tourkya et al. (2009).
-
Malgr la pertinence de ces approches chmo-taxonomique avec les
tudes
phnotypiques et cologiques, toutefois cest le squenage des gnes
qui a permis des
avances majeures dans la taxonomie des bactries, et par la mme
celle des Pseudomonas.
1.2.2.3. Caractrisations gntiques
Les gnes ribosomaux sont prsents chez tous les organismes, et
possdent la mme
fonction vitale : la synthse protique. Ces caractristiques font
des ribosomes dexcellents
candidats dtudes pour les taxonomistes. En effet ces molcules
possdent un niveau
dvolution assez lev pour assurer une variabilit entre les
diffrentes espces ; mais avec
un degr de conservation suffisant pour assurer que ces
diffrences correspondent des
catgories taxonomiques stables comme les genres et les
espces.
Parmi tout les ARN ribosomaux seul le gne ARNr16S remplis ces
deux
caractristiques, le gne ARNr23S est extrmement conserv alors que
le gne ARNr5S est
trop petit (Peix et al., 2009). Cest pour cela que le gne
ARNr16S est devenu la molcule cl
sur laquelle est base la classification des procaryotes,
incluant celle des Pseudomonas
(Anzai et al., 2000; Palleroni, 2005).
Parfois lanalyse du gne ARNr16S ne permet pas la diffrenciation
entre des espces trs
proche. Dautres gnes ayant dmontr leur importance pour la
diffrenciation entre les espces ont
t analys. Ces gnes nomms gnes de mnage : recA (recombinase A),
rpoD (facteur 70
de
lARN polymrase), gyrB (sous unit de lADN gyrase), rpoB (sous
unit de lARN
polymrase), ont permis la diffrentiation des espces de
Pseudomonas (Hilario et al., 2004). En
effet, la discrimination entre des espces trs proches de
Pseudomonas est obtenue par lanalyse du
gne rpoB.
Larbre phylogntique obtenu avec ce gne donne une rsolution 3
fois plus importante que
celui obtenu avec le gne ARNr16S (Ait-Tayeb et al., 2005). Et
pourtant cest le gne ARNr16S, qui
a permis la diffrenciation des sous espces de P. chlororaphis
(Peix et al., 2007). Cependant,
lanalyse des gnes de mnage nest pas communment utilise dans la
description des espces de
Pseudomonas. Et seulement, la description des gnes rpoD, gyrB,
rpoB a t incluse dans des
descriptions rcentes de Pseudomonas: chez P. xiamenensis (Lai et
Shao, 2008), chez 107 espces
de rfrence de Pseudomonas (Mulet et al., 2010), et chez P.
syringae, P. fluorescens et
P. chlororaphis (Ramette et al., 2011).
Un autre marqueur phylogntique a t utilis dans les tudes
taxonomiques, il sagit
des ITS (intergenic spacer), rgion situe entre ADNr 16S-23S.
Cette squence prsente une
grande variabilit tant du point de vue taille que squence,
permettent ainsi une distinction
entre des espces trs proches (Gurtler et Stanisich, 1996).
-
Des protocoles spcifiques utilisant des amorces universelles,
ont t dsign pour analyser
cette squence chez les Pseudomonas environnementaux (Locatelli
et al., 2002).
Une mthode prometteuse pour lidentification des microorganismes,
et qui peut analyser
jusqu' 300 chantillons en une seule fois est le MALDI-TOF-MS
(matrix-assisted laser desorption
ionization-time of flight mass spectrometry), par lanalyse des
protines ribosomiques (Pineda et al.,
2003). En effet, les rsultats didentification des isolats de
Pseudomonas sont excellents, jusqu'
100% de rsultats corrects (Dieckmann et al., 2005; Degand et
al., 2008).
2. DISTRIBUTION ECOLOGIQUE ET ROLE DU GENRE
PSEUDOMONAS
2.1. DISTRIBUTION ECOLOGIQUE
Les espces de Pseudomonas dcrites durant la dernire dcennie
montrent que cest lun
des genres bactriens les plus ubiquistes dans le monde, et
diffrents espces ont t isoles de
niches cologiques diverse. En effet, P. plecoglossicida est un
pathogne de poissons
(Nishimori et al., 2000) ); P. salomonii et P. palleroniana sont
des espces phytopathognes
(Gardan et al., 2002); P. simiae a t isol dun chantillon
clinique de singe (Vela et al., 2006) et
P. costantinii est un pathogne de champignons comestibles
(Munsch et al., 2002).
Dautres sont des bactries associes aux racines, et ont t isols
de diffrentes plantes
P. brassicacearum et P. thivervalensis isols respectivement de
plants dail et de riz
(Achouak et al., 2000). P. rhizosphaerae, P. lutea et P.
argentinensis isol de la rhizosphre
de lherbe (Peix et al., 2003, 2004, 2005).
Certaines ont t isols de la phyllosphre des plantes, cest le cas
de P. lurida de la
phyllosphre de lherbe (Behrendt et al., 2007). Quelques espces
ont t isoles
dcosystmes marins comme cest le cas de P. marincola (Romanenko
et al., 2008), ou
encore dcosystmes dsertiques P. duriflava (Liu et al., 2008), P.
guineae, une bactrie
psychro-tolrante du sol de lantarctique (Bozal et al., 2007), P.
thermotolerans, qui peut
croitre 55C isole dchantillons animaux (Manaia et Moore,
2002).
Cette distribution mondiale semble tre due une adaptabilit
physiologique et
gntique leve (Spiers et al., 2000). La cl de cette adaptabilit
de souches individuelles
de tels environnements, est la prsence chez ce genre bactrien de
nombreux ilots
gnomiques, cest le cas de la souche P. aeruginosa PSE9 (Battle
et al., 2009).
-
2.2. LES PSEUDOMONAS SPP. FLUORESCENTS AGENTS DE
BIOCONTROLE ET DE CROISSANCE DES PLANTES
La plupart des substances chimiques utilises pour combattre les
maladies en plus dtre
dangereux pour lhomme, les animaux et les organismes bnfiques ;
persistent dans les
cosystmes naturels. Durant les trois dernires dcennies, les
bactries appartenant au genre
Pseudomonas ont t identifis comme agents potentiels de
biocontrle, lencontre des
phytopathognes.
Les Pseudomonas spp. fluorescents saprophyte sont les habitants
type des sols agricoles et la
rhizosphre des plantes, et sont impliqus dans de nombreuses
interactions avec les plantes (Schroth
et al., 1992). Ces bactries sont considres comme des composs
biologiques du sol agricole, et
sont responsable de la suppression des maladies fongiques dans
les cultures. Ces Pseudomonas
diminuent la svrit de la maladie et stimulent la croissance des
plantes comme le riz (Sakthivel et
Gnanamanickam, 1987), le bl (Weller et Cook 1983), la pomme de
terre (Kloepper et al.,
1980b), la canne sucre (Suslow et Schroth 1982), le radis
(Kloepper et Schroth 1978), le coton
(Howell et Stipanovic 1980) et le manioc (Hernandez et al.,
1986).
Diffrentes espces de Pseudomonas spp. fluorescents ont t
rapports la fois
comme PGPR (plant growth promoting rhizobactria), et comme
souches de biocontrle des
champignons phytopathognes (de Salmone et al., 2001). P. putida
(Scher et Baker, 1980),
P. aeruginosa (Bano et Musarrat, 2003), P. chlororaphis
(Chin-A-Woeng et al., 1998) et
P. cepacia (Cattelan et al., 1999). Toutefois, les Pseudomonas
spp. fluorescents ne sont pas
tous des antagonistes.
Les bactries appartenant au groupe des Pseudomonas spp.
fluorescents sont parmi
les plus abondantes dans la rhizosphre. Dans certains cas, elles
reprsentent plus de 60% de
la microflore bactrienne totale du sol (Digat et Gardan, 1987).
Do leur application comme
agents de contrle biologique grce leurs abondance dans les sols
naturels et les racines des
plantes (Sands et Rovira, 1971). Ces bactries sont d'excellents
comptiteurs vis--vis de la
microflore fongique et bactrienne du sol par leur temps de
gnration in situ relativement court
(Garbaye, 1994), leur capacit utiliser les exsudats de plantes
comme nutriments (Lugtenberg et
al., 2002), et chlater les ions ferriques (Garbaye, 1994).
Les Pseudomonas spp. fluorescents sont connus pour leurs
aptitude dadhsion aux particules
du sol et au rhizoplan, mais sont aussi mobiles et prototrophes
(de Weger et al. 1994), produisent
des antibiotiques (Garbaye, 1994 ; Natsch et al., 1994), et des
enzymes hydrolytiques (Lim et
al., 1991; Neilsen et al., 1998; Neilsen et Sorensen, 1999).
-
Ces capacits antagonistes et PGPR, sont dues des mcanismes
directs et indirects
(Fig.2). Les mcanismes indirects utiliss par ces Pseudomonas
spp. fluorescents, comprennent la
production dantibiotiques contre des bactries pathognes
(Thomashow et al., 1990), la rduction
de fer disponible pour les phytopathognes prsents dans la
rhizosphre (Scher et Baker,
1982), la synthse denzymes dgradant les paroi cellulaires
fongiques et la comptition avec
les microorganismes dltres pour les niches sur la plante.
Les mcanismes directs concernent, la squestration du fer pour
les plantes par les
sidrophores. la production de phytohormones ou encore par
solubilisation de formes de
phosphore insolubles, rendant ainsi le phosphore biodisponible
(Salisbury, 1994), et diminuer les
taux dthylne produits par la plante (Glick, 1995; Glick et al.,
1999). Ces bactries sont capable
dinduire une rsistance systmique contre un pathogne donn, et
porte le nom dISR (van Loon
et al., 1998; Pieterse et al., 2001). I1 est galement reconnu
que des bactries de la
mycorhizosphre, encore appeles bactries auxilliaires de la
mycorhization, stimulent
slectivement l'tablissement de la symbiose ectomycorhizienne
(Garbaye, 1994).
Figure 2. Reprsentation schmatique dcrivant les interactions
plantes-
microoganismes dans la rhizosphre (Lemanceau et al., 2006).
-
2.2.1. Stimulation de la croissance des plantes
2.2.1.1. Solubilisation des phosphates par les Pseudomonas spp.
fluorescents
Les bactries solubilisant le phosphate sont communes dans la
rhizosphre, cette
dernire tant le sige de nombreuses interactions entre les
plantes et les divers
microorganismes associs. La scrtion dacides organiques et de
phosphatases facilitent
la conversion de formes insolubles de phosphore en formes
disponibles pour les plantes
(Kim et al., 1998; Richardson, 2001). Les espces de Pseudomonas
spp. fluorescents comme
P. chlororaphis, P. putida et P. aeruginosa ont t identifis
comme rhizobacteries
solubilisant le phosphate (Cattelan et al., 1999; Bano et
Musarat, 2003).
2.2.1.2. Synthse de phyto-hormones
a. Acide Indole-3-acetique (AIA)
Cette phytohormone est implique dans linitiation de la division
des cellules au niveau
des racines, et de leurs largissements (Salisbury, 1994).
Communment produite par les
rhizobactries (Barazani et Friedman, 1999). Les rhizobactries
produisant lAIA sont
connues pour leurs capacits augmenter la croissance et la
longueur des racines. Cet effet
rsulte en une surface racinaire plus grande, et une accessibilit
pour plus de nutriments pour
la plante. Patten et Glick (2002), ont rapport le rle de lAIA
produit par P. putida, chez la
plante hte, dans le dveloppement de son systme racinaire.
b. Cytokinines
Les cytokinines forment une classe de phytohormones qui
stimulant les divisions cellulaires,
llargissement et le dveloppement des tissus (Salisbury, 1994).
Ce sont des signaux impliqus
dans la mdiation du stress environnemental des racines vers les
parties suprieurs de la plante. La
production de cytokinines a t rapporte chez P. fluorescens
(Garcia et al., 2001) .
c. La 1-Amino-cyclopropane-1-carboxylate (ACC) dsaminase
Lthylne est la seule phytohormone gazeuse. Il est connu pour tre
lhormone des
blessures, parceque sa production dans la plante peut tre
induite par nimporte quel
perturbation physique ou chimique des tissus (Salisbury, 1994).
Parmi ses nombreux effets
sur la croissance et le dveloppement de la plante, la production
dthylne peut causer
linhibition de la croissance des racines. Glick et al. (1998)
ont emit, une thorie selon laquelle
le mode daction de certains PGPR serait par lintermdiaire dune
AAC-dsaminase. Cette enzyme
clive lAAC prcurseur immdiat de lthylne. LAAC-dsaminase
diminuerait la production
dthylne au niveau des racines de la plante hte et rsulterait en
leurs allongements.
-
Les Pseudomonas spp. fluorescents sont des producteurs
dAAC-dsaminase (Glick et al.,
1994). La transformation des Pseudomonas spp. par des gnes
codant cette enzyme, permet
celles-ci de croitre sur un milieu dont la seule source de
carbone et dazote est le AAC, et de
stimuler llongation des racine (Shah et al., 1998). Cette
stimulation de la croissance est aussi
exprime dans des situations de stress, tels que les inondations
(Grichko et Glick, 2001), ou
encore dans les sols contamins par les mtaux lourds (Burd et
al., 1998; Belimov et al., 2001).
2.2.1.3. Dnitrification
La dnitrification est un processus microbien dans lequel les
oxydes dazote sont utiliss
comme accepteurs finaux dlectrons, pour la production dnergie en
absence doxygne. La
dnitrification est compose de quatre ractions par lesquelles les
nitrates sont rduits en di
nitrogne (N2), par des mtallo-enzymes comme la nitrate rductase,
nitrite rductase, oxyde
nitrique rductase, et loxyde nitreux rductase. Les Pseudomonas
spp. fluorescents sont les
dnitrifiants les plus communs des sols des rgions tempres
(Gamble et al., 1977). Les
Pseudomonas spp. fluorescents sont capable de sadapter aux
manque doxygne par lutilisation
des oxydes dazote comme accepteurs alternatifs dlectrons
(Stewart, 1988). La respiration sur
nitrate et la rduction des nitrites sont impliques dans la
comptition des souches modles de
Pseudomonas spp. fluorescents dans le sol (Philippot et al.,
1995; Ghiglione, 2000).
2.2.1.4. Les mdiateurs de labsorption de fer par les Pseudomonas
spp.
fluorescents
La majorit des espces de Pseudomonas spp. fluorescents
produisent des sidrophores.
Un nombre important despces de plantes peuvent assimiler les
complexes Fe3+
- sidrophore
bactriens (Becker et Cook, 1988; Loper, 1988; Bitter et al.,
1991). Les sidrophores
jaunes-verts sont noms pyoverdines (PVDs) ou pseudobactines
(Budzikiewicz, 1993, 1997).
A ct de la PVD, P. aeruginosa produit un autre sidrophore nomm
pyocheline avec une
affinit plus faible pour le Fe3+
(Cox et al., 1981). Les espces de Pseudomonas spp.
fluorescents produisent aussi la pseudomonine (isoxazolidone)
comme P. fluorescens, P.
stutzeri et P. putida (Lewis et al., 2000; Mossialos et al.,
2000; Mercado-Blanco et al., 2001).
2.2.2. Mcanismes dantagonisme
Les Pseudomonas spp. fluorescents produisent une gamme
importante de mtabolites
secondaires, en plus denzymes dgradant les paroi cellulaires.
Les plus caractrises de ces
mtabolites secondaires sont les: phnazines, phloroglucinols,
pyolutorine, pyrrolnitrine,
lipopeptides, et le cyanure dhydrogne. Ces mtabolites
secondaires sont actifs vis vis
dune large gamme de bactries et de champignons (Fig.3).
-
Figure 3. Les principaux antibiotiques produits par les souches
de biocontrle jouent
un rle central entre les lments impliqus dans les interactions :
Pseudomonas de
biocontrle, plantes, pathognes, prdateurs, cooprateurs et sol
(Dubuis et al., 2007). PCA : phnazine-1-carboxylate, PYO :
pyocianine, PCN : phnazine-1-carboxamide, DAPG : 2-4, diactyl
phloroglucinol, PLT : pyolutorine.
2.2.2.1. Mtabolites Secondaires possdant des proprits de
biocontrle
a. Les phnazines
Les phnazines sont des pigments htrocycliques azots intensment
colors, produits
par diffrentes souches bactriennes (Leisinger et Margraff 1979;
Budzikiewicz, 1993;
Stevans et al., 1994). Ces htrocycles expriment un large spectre
dactivit sur les bactries
et les champignons (Smirnov et Kiprianova, 1990). Les phnazines
jouent aussi un rle
dans la comptition rhizosphrique, incluant la survie et la
comptence des bactries
productrices (Mazzola el al., 1992).
La phnazine-1-carboxylate (PCA), a t rapport chez les
Pseudomonas spp.
fluorescents, comme P. fluorescens (Gurusiddaiah et al., 1986),
P. chlororaphis (Pierson et
Thamashow, 1992) et P. aeruginosa (Anjaiah et al., 1998).
-
Lefficacit de la PCA a t dmontr contre un nombre de champignons
phytopathognes
comme Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium sp.,
Polyporus sp., Rhizoctonia
solani, et les bactries pathognes comme Actinomyces viscosus,
Bacillus subtilis, Erwinia
amylovora (Gurusiddaiah et al., 1986; Thomashow et al.,
1990).
La phnazine-1-carboxamide (PCN), a aussi t rapporte chez les
Pseudomonas spp.
fluorescents, tel que P. aeruginosa et P. chlororaphis
(Chin-A-Woeng et al., 1998; Mavrodi
et al., 2001). La PCN diffre du PCA par la prsence du groupement
carboxamide (CONH)
au lieu du groupement hydroxyle sur le carbone 1 du noyau
phnazine. Cette molcule est
plus stable que la PCA, et exprime ses activits antifongiques
mme pH alcalin (Chin-A-
Woeng et al., 1998).
La pyocyanine (1-hydroxy-5methyl-phnazine), est prdominante chez
P. aeruginosa
(Demange et al., 1989). Cette phnazine de couleur bleue est
toxique pour une large gamme
de bactries et champignons (Hassan et Fridovich, 1980). Mais
cest aussi un facteur de
virulence dans les infections opportunistes humaines
(Price-Whelan et al., 2006).
b. Phloroglucinols
Les phloroglucinols sont des antibiotiques large spectre,
produits par une large varit
de souches bactriennes. Le 2,4-diactyl phloroglucinol (DAPG) est
aussi un antibiotique
phnolique large spectre daction produit par P. fluorescens Pf-5
(Howell et Stipanovic,
1979), P. fluorescens F113 (Fenton et al., 1992), P. fluorescens
CHAO (Keel et al., 1992)
et P. fluorescens Q2-87 (Bangera et Thomashow, 1996).
Cet antibiotique possde aussi une activit herbicide, ressemblant
lacide 2, 4-
dichlorophnoxyactique (2, 4-D) un herbicide de post-mergence,
pour le contrle des
mauvaises herbes des crales, de la canne sucre et dautres
plantations. Le DAPG induit
aussi la rsistance systmique chez les plantes, et joue donc le
rle dun liciteur des
phytoalxines (Dwivedi et Johri 2003).
c. Pyrolnitrine (PRN)
La pyrrolnitrine (PRN) (3-chloro-4-(2'-nitro-3'-chlorophenyl) un
compos pyrrole, est
produite par les Pseudomonas spp. fluorescents comme P.
fluorescens (Kirner et al., 1998) et
P. chlororaphis (Elander et al., 1968). La pyrrolnitrine a trouv
son application comme
compos usage clinique pour le traitement des mycoses cutanes
plutt que fongicide
agricole (Hammer et al. 1997, McSpadden Gardener et Fravel,
2002).
-
La production de ce compos par P. fluorescens est implique dans
le contrle de certains
agents pathognes racianires comme R. solani, Verticilium
dahliae, G. graminis et Fusarium
oxysporum (Howell et Stipatovic1979, Homma et al., 1989).
d. Pyolutorine (PLT)
La pyolutorine, un autre antibiotique produit par diffrents
Pseudomonas. Les souches
produisant la PLT sont lorigine de la suppression de nombreuses
maladies telluriques
(Howell et Stipanovic 1980; Dfago et al., 1990; Maurhofer et
al., 1994). Cette molcule,
isole pour la premire chez P. aeruginosa, est compose dun anneau
rsocrinol synthtis par la
voie de polyctide, reli une partie pyrolle bichlore
(Nowak-Thompson et al., 1997, 1999),
possdant un pouvoir fongitoxique efficace contre les oomyctes,
notamment Pythium ultimun
(Maurhofer et al., 1992).
e. Mupirocine
Plus connu comme lacide pseudomonique, est un antibiotique
polyctide naturellemnt
prsent chez les Pseudomonas spp. fluorescents. La mupirocine
produite par P. fluorescens
NCIMB 10586, est dune activit leve contre Staphylococcus aureus
et dautres bactries
Gram positif (El-sayed et al., 2001). Cest un antibiotique
largement utilis dans les
maladies tropicales (Carcanague , 1997).
f. Antibiotiques peptidique
Les antibiotiques peptidiques sont aussi bien produits par les
bactries Gram positif
(Katz et Demain, 1977) que celles Gram-ngatif (Dowling et
O'Gara, 1994), par une
synthse multienzymatique non-ribosomique (Kleinkauf et Dohren,
1996). Rcemment, il a
t dmontr que des Pseudomonas spp. fluorescents produisent des
lipopeptides cycliques
(CLPs). La tensine produite par P. fluorescens 96.578, a montr
un effet potentiel sur le
basidiomycte R. solani (Nielsen et al., 2000). La Viscosinamide
un autre lipopeptide
cyclique produit par P. fluorescens DR54 (Nielsen et al., 1999),
est aussi actif sur R. solani
par la rduction de la biomasse myclienne et donc la formation de
sclrotes (Thane et al.,
2000). LOomycin A est un antibiotique produit par P. fluorescens
HV37a, est lorigine de
la suppression du damping-off du coton caus par P. ultimurn
(Gutterson et al., 1988).
g. Enzymes dgradant les parois fongiques
Lexcrtion denzymes qui dgradent les parois cellulaires fongiques
est frquemment
impliqu dans les attaques des champignons phytopathognes (Martin
et Loper 1999;
Nielsen et Sorensen, 1998; Picard et al., 2000).
-
La lyse des parois cellulaires, par les enzymes dgradatives
excrtes par les microorganismes
est une fonction bien connue du mycoparasitisme. La Chitinase,
la -1,3 glucanase et la
cellulase sont dimportantes enzymes spcialement dans le contrle
fongique, par leurs
activits dgradatives des composs des parois cellulaires tels que
: la chitine, le 1-6
glucane et les ponts glucosidiques (Schroth et Hancock, 1981;
Chet, 1987; Lorito et al.,
1996). Les microorganismes excrtant la chitinase ont t rapports
comme des agents de
biocontrle efficaces (Ordentlich et al., 1988; Inbar et Chet,
1991). Le contrle biologique
de Fusarium solani, se fait essentiellement via les activits des
laminarinase et chitinase chez
P. stutzeri YPL-1 (Lim et al., 1991). P. cepacia produisant la
-1,3 glucanase, rduit
lincidence des maladies causes par R. solani, P. ultimurn et
Sclerotium rolfsii (Fridlender et
al.,1993). Nielson et al. (1998) ont rapport que dans la
rhizosphre de la betterave sucre,
les Pseudomonas spp. fluorescents inhibaient R. solani par
production dendochitinase.
2.2.3. Quorum Sensing(QS)
La production dantibiotiques chez les Pseudomonas spp.
fluorescents est soumise
une rgulation complexe. Les facteurs cls dans cette rgulation
sont des facteurs globaux et
le QS (communication cellulaire). La rgulation globale est mdie
par les gnes gacS et
gacA qui codent pour un systme rgulateur deux composs. Le QS
implique la production
de molcules signales de N-acyl-hornoserine lactone (AHL). Le
systme rgulateur gacS et
gacA contrle aussi le QS, illustrant ainsi la complxit de la
rgulation de la production
des antibiotiques chez les Pseudomonas spp. fluorescents
(Bassler, 1999). La molecule AHL
du QS, est implique dans la regulation de la production
dantibiotiques chez: P. fluorescens,
P. aeruginosa et P. chlororaphis (Pessi et Haas, 2001). Les gnes
des facteurs sigrna, rpoD
et rpoS sont aussi impliqus dans le contrle de la production de
tels antibiotiques, et
augmentent les activits antagonistes des Pseudomonas spp.
fluorescents. Des doses leves
du produit du gne rpoD peuvent stimuler directement ou
indirectement la production
dantibiotiques chez P. fluorescens (Whistler et al., 2000).
Dautres formes de rgulation
globale ont t rapport: le rpresseur transrationnel phlF (Delany
et al., 2000) et le rgulateur
de lARN (PrrB) sur la production de mtabolites secondaires
(Aarons et al., 2000).
3. BIOLOGIE DU FER CHEZ LES BACTERIES
3.1. PROPRIETES CHIMIQUES
Le fer est le quatrime lment le plus abondant dans la crote
terrestre. Parmi les mtaux de
transition ayant une relevance biologique (fer, zinc, cuivre,
manganse, cobalt, nickel, tungstne et
le molybdne), le fer est le plus important des mtaux dans le
mtabolisme cellulaire.
-
Cette prdominance peut tre explique par la grande ractivit
chimique de cet lment. Dans les
systmes biologiques, incorpor dans les protines, le fer joue
principalement le rle de
biocatalyseur ou de donneur dlctrons (Johnson, 2008). Les
proprits doxydo-rduction du fer
lui permettent dexister sous diffrents degrs doxydation (Fig 4)
; Fe2+
(ferreuse) et Fe3+
(ferrique)
respectivement comme donneur et accepteurs dlectrons (Yeterian
et al., 2009).
Figure 4. Oxydation et rduction du fer.
En dpit de son abondance, sa biodisponibilit est relativement
faible dans les
conditions darobiose. En effet, en prsence doxygne et pH neutre,
les ions ferreux sont
rapidement oxyds en ions ferriques, qui prcipitent sous forme
doxy-hydroxydes
polymriques insolubles (Ratledge et Dover, 2000). La solubilit
de cet hydroxyde ferrique
est relativement basse (de lordre de 10-18
M), la biodisponibilit du fer est donc limite par la
haute insolubilit du Fe3+
pH physiologique (Lindsay, 1979).
Les ions ferriques possdent six sites de coordination, qui
permettent la formation de
complexes Fe3+
octadriques hxadents. En conditions physiologiques, le fer
existe dans un des
deux tats redox facilement convertible, sa forme rduite ferreuse
ou sa forme oxyde ferrique.
La capacit de transfert dlectrons est modifie par lenvironnement
ligand dans lequel le fer est
incorpor. En effet une large gamme de potentiels redox des
composants contenant du fer allant de
+300mV -500mV. Ces proprits font du fer un composant prosthtique
extrmement versatile,
particulirement utile dans les systmes biologiques (Guerinot,
1994).
3.2. PROPRIETES BIOLOGIQUES
Le fer est un micronutriment indispensable pour pratiquement
tous les organismes vivants
(sauf les bactries lactiques qui utilisent le cobalt et le
manganse ; Weinberg, 1997). En effet, le
fer est un constituant essentiel des enzymes, cruciales pour de
nombreux processus biologiques
tels que : la photosynthse, la respiration, le transfert
dlectrons, le cycle tri-carboxylique, le
transport et le mtabolisme de loxygne, la rgulation gnique, et
la biosynthse dacides
nucliques (Braun, 1997 ; Andrews et al., 2003). Seul ou
incorpor, le fer sert de centre
catalytique ou de cofacteur essentiel denzymes pour des ractions
redox.
-
Ainsi, il est communment admis que de nombreuses bactries
requirent une concentration
minimale de fer bio disponible, suprieur 10-6
M, pour une croissance optimale (Guerinot,
1994). La concentration en fer libre dans les environnements
terrestres et aqueux, en
conditions arobies et pH neutre, sont situs approximativement
entre 10-9
et 10-18
selon le
milieu (Chipperfield et Ratledge, 2000 ; Ratledge et Dover,
2000). En consquence les
concentrations environnementales en ion ferrique sont trs basses
pour que les
microorganismes puissent survivre en utilisant seulement le fer
libre. Pour rcuprer le fer
ncessaire leur croissance, les bactries ont dvelopp de
nombreuses stratgies pour
rcuprer le fer de sources diffrentes. Notamment, la rduction du
fer ferrique en fer ferreux, ou
le transport du fer de lenvironnement par les sidrophores
(Wandersman et Delepelaire, 2004).
3.3. LHOMEOSTASIE DU FER
Lhomostasie du fer est maintenue par une balance dlicate. Cest
pourquoi, une
supplmentation suffisante en fer permet de prvenir sa
cyto-toxicit. Des stratgies de
rgulation pour un contrle minutieux de la fixation, lutilisation
et le stockage de fer ont t
retrouves chez des organismes diversifis (Expert, 1999).
A linverse, lexcs de fer pourrait tre dltre. En effet, et selon
Halliwell et Gutteridge
(1992) la forme libre (ferreuse) catalyse la dcomposition du
peroxyde dhydrogne, gnrant
des hydroxyles hautement ractifs, via la raction de Fenton (Fig.
5).
Les radicaux hydroxyles ainsi produits attaquent les membranes
et lADN, pouvant
entrainer la mort de la cellule (Storz et Imlay, 1999 ; Hantke
et Braun, 2000).
Figure 5. Raction de Fenton
Lhomostasie du fer est finement contrle, assurant son
acquisition, stockage et sa
disponibilit, pour que les concentrations intracellulaires
natteignent pas des niveaux
toxiques (Andrews et al., 2003). Pour cela, il existe chez les
bactries et diffrents niveaux
des processus biologiques cellulaires, des systmes de rgulation
(Mass et Arguin, 2005).
3.3.1. La protine FUR
Chez les bactries Gram ngatifs, le facteur de rgulation FUR
(Ferric Uptake
Regulator) joue un rle central dans le contrle de lacquisition
du fer, par une rgulation
gnique la fois positive et ngative (Hantke, 2001).
-
Lorsque le fer intracellulaire atteint un niveau trop lev, FUR
rprime plusieurs gnes
impliqus dans lacquisition du fer. En effet, la protine FUR lie
son corpresseur le Fe2+
,
peut se fixer une squence cible (boite FUR) situe dans une rgion
promotrice des gnes
cibles et rprimer ainsi leurs transcription (Escolar et al.,
1999). Le fer ferreux est ncessaire
la dimrisation de la protine FUR puis sa liaison la squence
consensus. Lorsque cet ion
tend manquer, FUR se trouve sous une forme dapoprotine, qui ne
peut plus tre dimrise,
ne pouvant se fixer lADN, permettant ainsi la transcription des
gnes cibles (Jacquamet et
al., 1998; Althaus et al., 1999). Par ce mcanisme FUR peut
moduler lexpression de
nombreux gnes (Hantke, 2001).
Plus de 90 gnes diffrents dcrits chez des espces dEscherichia
coli sont contrls,
par FUR et par le fer. Parmi ces gnes : 60 sont impliqus dans la
synthse et le transport des
sidrophores ; 18 gnes codent des protines cytoplasmiques
impliqus dans le mtabolisme
(exemple : aconitase), protine du mtabolisme du fer (bactrio
ferritine), protine du stress
(superoxyde dismutase [SodB]) ; et 13 pour des facteurs de
virulence, comme les colicines et
hmolysines. Lexpression de certains de ces gnes est positivement
rgule par FUR
(Hantke, 2001).
Dans certains cas, FUR va aussi pouvoir contrler indirectement
les systmes
dassimilation du fer via la rgulation de lexpression de trois
types dactivateurs : deux
composs cl du systme de transduction, le rgulateur AraC-like de
la synthse de
sidrophores et leurs systmes de capture, et le facteur sigma
(-ECF) de fonction
extracytoplasmique (Hantke, 2001 ; Michel et al., 2005 ; Braun
et al ., 2006).
Dans le gnome de la souche PAO1 de P.aeruginosa, parmi les 19
gnes codant pour
les facteurs -ECF (Llamas et al., 2008 ; Potvin et al., 2008),
10 sont peuvent tre rguls
par FUR (van Oeffelen et al., 2008).
De nombreux gnes sont aussi rguls positivement par FUR, par un
contrle post
transcriptionnel de leurs ARN messagers via de petits ARN non
codant (Mass et al., 2003b).
La protine FUR est autorgule par FUR et le Fe2+
. Un site de liaison pour la protine
rpresseur cAMP-catabolite dans la rgion promotrice de fur,
permet de lier lexpression de
fur au mtabolisme cellulaire (Escolar et al., 1999). Zheng et
al. (1999) furent les premiers
rapporter la rgulation de FUR par le stress oxydatif.
3.3.2. Les facteurs -ECF
Les facteurs alternatifs, se lient au cur de lARN polymrase,
fournissent un moyens de
rgulation de lexpression des gnes, en rponse aux variations
extracellulaires (Potvin et al., 2008).
-
Lune des classes de ces facteurs , contrle plusieurs fonctions
incluant la capture de fer chez E.
coli et Pseudomonas spp., lefflux de cobalt et de nickel chez
Alcaligenes europhus (renomm
actuellement Cupriavidus necator), phytopathognse chez P.
syringae et la synthse de protines
extra-membranaires chez Photobacterium sp. souche SS9 (Missiakas
et Raina, 1998). Toutes ces
fonctions sont en accord avec le facteur -ECF. La plupart sinon
tous les gnes codant le facteur -
ECF sont eux-mmes contrls par un gne anti-, et de plus sont
frquemment lis aux gnes
contrlant les rcepteurs protiques extracellulaires impliqus dans
le transport des complexes ferri-
sidrophore. Parmi ces -ECF, deux ont t tudi en dtail il sagit
des facteurs de virulence
(HrpL et AlgT) de P. syringae (Oguiza et al., 2005).
En conditions de carence en fer, la liaison du ferri-sidrophore
son rcepteur de
membrane externe dclenche une cascade de signalisation qui
permet de dissocier le facteur
-ECF de son facteur anti-, et lactivation des gnes impliqus dans
la synthse et
lacquisition de sidrophores (Ochsner et al., 2002). Alors que
dans des conditions suffisantes
en fer, la transcription de ces -ECF est rprime (Leoni et al.,
1996).
3.3.3. Petits ARN non-codants
De nouvelles voies, permettant un contrle du mtabolisme du fer
chez les bactries,
ont t rcemment lucides (Mass et al., 2007). Ainsi un petit ARN
non-codant appel
rhyB, a t impliqu dans la rgulation post transcriptionnelle e
gnes de protines utilisant le
fer chez E. coli (Mass et Arguin, 2005). rhyB va sapparier aux
ARN messagers de gnes
positivement rguls par FUR et empcher leur traduction par
attnuation (Mass et al., 2003a). Ce
mcanisme permet dassurer que, en conditions de carence, les
rares ressources de fer soient
alloues aux fonctions cellulaires cruciales (Jacques et al.,
2006). Chez P. aeruginosa, une
approche bioinformatique a permis didentifier deux tandems de
petits ARN non codants,
candidats pour tre des homologues fonctionnels de rhyB
(Wilderman et al., 2004).
3.4. LES SIDEROPHORES
Le mot sidrophore, issu du grec, signifie sidros : fer et phore
: porteur. Lutilisation
des sidrophores reprsente chez les bactries lun des systmes les
plus efficaces pour
lacquisition du fer.
3.4.1. Dfinition
Les sidrophores sont des mtabolites secondaires de faible poids
molculaire, compris
entre 200 et 2000 daltons, dont le rle set de solubiliser, de
chlater et dextraire le fer
ferrique de nombreux complexes minraux ou organiques et de le
rendre ainsi accessible aux
microorganismes (Neilands, 1995).
-
3.4.2. Caractristiques
La caractristique majeure des sidrophores est leur trs haute
affinit pour les ions
frriques. En effet, lentrobactine a une constante daffinit de
10-49
M. Cette chlation se fait
par des htroatomes oxygns et azots, hautement lectrongatifs,
susceptibles dentrer en
interaction avec des ions mtalliques (Hay et al., 2001).
Les sidrophores sont synthtiss et scrts pour la solubilisation
dions ferriques par
des microorganismes arobies, tels que les bactries, certains
champignons mais aussi
organismes suprieurs (certaines plantes monocotyldones) en
rponse des conditions de
carence en fer (Ratledge et Dover, 2000).
Les quelques exceptions sont les bactries anarobies et quelques
levures comme
Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, et Cryptococcus
neoformans (Neilands et al., 1987;
Lesuisse et Labbe, 1989; Howard, 1999). Toutefois, ces levures
peuvent utiliser les sidrophores
produits par dautres organismes (Neilands, 1995).
Les sidrophores sont trs importants pour la croissance et la
survie des bactries dans le
sol et les environnements acqueux (Guerinot, 1994). Dans la
rhizosphre, la concentration des
sidrophores est estime de quelques micro molaires quelques milli
molaires (Hersman et
al., 1995). Les sidrophores sont aussi importants pour la
virulence de nombreux pathognes
dans les modles animaux des maladies (Ratledge et Dover, 2000).
Ils servent de molcules
signal contrlant lexpression pour la production du sidrophore
lui-mme, mais aussi pour la
production dautres facteurs de virulence (Lamont et al., 2002;
Visca et al., 2002).
Aprs scrtion par la bactrie, les sidrophores chlatent avec une
haute affinit le fer
dans lenvironnement extracellulaire, et le transportent via des
voies dassimilation
spcifiques (Krewulak et Vogel, 2008).
3.4.3. Classification des sidrophores
Actuellement plus de 500 composs de structures chimiques
diffrentes ont t dfinis
comme sidrophores. Ils sont toujours caractriss par un, deux ou
trois groupes chlatants
bidents, gnralement oxygns, cruciaux pour la formation de
complexes octdriques
hxacoordonns trs stables entre le sidrophore et le fer ferrique,
qui permettront de capter le
fer. Par contre la nature des groupements chimmiques chlatant le
fer est assez restreinte
(Winkelmann, 2002).
Ainsi les sidrophores peuvent tre classifis selon les groupes
fonctionnels quils
utilisent comme ligands du fer (Winkelmann, 2002 ; Miethke et
Marahiel, 2007).
-
Ces groupes peuvent tre des : cathcolates, hydroxamates,
carboxylates ou des phnolates
(Fig. 6). On trouve plus rarement des hydroxyacides comme la
rhizobactine. Du fait de la
forte oxygnation des groupes chlatants, le Fe3+
, est plus oxophile que le Fe2+
, reste la forme
de fer pour laquelle le sidrophore a gnralement la plus grande
affinit. Les sidrophores
peuvent tre composs de groupes chlatant identiques, mais sont
plus frquemment mixtes.
La stchiomtrie sidrophore : fer est variable, et est fonction du
nombre de groupes
chlatant ports par le sidrophore (Miethke et Marahiel,
2007).
Figure 6. Exemples de Sidrophores classs selon leurs groupements
fonctionnels
(daprs Miethke et Marahiel, 2007). En rouge: catecholates; en
orange: phenolates; en jaune ple : hydroxamates;
-hydroxy-carboxylates (derivant des
units citrate) : en vert clair ; - cto-carboxylates (derivant
des units 2-oxo-glutarate) : bleu-vert.
-
Chapitre II Isolement et identification
des pseudomonas
-
1. INTRODUCTION
Les Pseudomonas spp. fluorescents forment un groupe diversifi de
bactries qui
peuvent gnralement tre distingues visuellement des autres
Pseudomonas par leur aptitude
produire un pigment jaune vert soluble dans leau (Palleroni et
al., 1973) qui sont les
pyoverdines produites dans des milieux pauvres en fer
(Palleroni, 1984). Ce sont des bacilles
Gram ngatifs typiques, chimiohtrotrophes mobiles avec un
flagelle polaire et sont
regroups au sein dun mme groupe dhomologie rRNA I (Palleroni et
al., 1973). Le groupe
inclus des espces importantes pour la biodgradation de divers
composs (Johnsen et al., 1996 ;
Heinaru et al., 2000), la production de mtabolites utiles
(Palleroni, 1992). Quelques espces sont
des agents pathognes des animaux et vgtaux (Gardan et al., 1992
), par contre dautres
peuvent stimuler la croissance des plantes (Kloepper et al.,
1980b) et contrler les maladies
telluriques (Weller, 1988). Le groupe auquel on sintresse
appartient cette dernire catgorie.
P. fluorescens est communment retrouv dans le sol et dans leau,
associ aux plantes,
certains spcimens sont cliniques, ces espces peuvent tre
subdivises en 5 biovars : I II III
IV et V (Stanier et al., 1966). P. putida communment isol du sol
et de leau, est divise en 3
biovars A, B (Stanier et al., 1966 ; Palleroni, 1984, 2005), un
dimportance mineur C
(Barrett et al., 1986). Ces travaux conduits sur la taxonomie de
P. fluorescens et de P. putida
montrent que la dfinition de ces espces est obsolte, et qu'elles
devraient tre divises en
plusieurs nomenspecies (Bossis et al., 2000). La clarification
de la taxonomie de P.
fluorescens (Couillerot et al., 2009; Palleroni, 2010) et de P.
putida requiert des recherches
complmentaires qui associent des mthodes phnotypiques rcentes,
et gnotypiques
(Palleroni, 2010).
P. chlororaphis est retrouv dans le sol, leau ou associ aux
plantes, les souches de
cette bactrie ont t historiquement subdiviss en deux espces : P.
chlororaphis et P.
aureofaciens, mais sont actuellement classes dans le mme groupe
despces (Johnson et
Palleroni, 1989). P. aurantiaca qui ft rattach par Palleroni
(1984) au groupe rRNA V, est
en fait un synonyme htrotypique loign de P. chlororaphis
(Hilario et al., 2004). Peix et
al. (2007) ont regroups ces bactries dans le mme groupe despces
de P. chlororaphis.
Dsormais, ces bactries en seraient respectivement les sous
espces: P. chlororaphis sp.
chlororaphis, P. chlororaphis sp. aureofaciens sp. nov.,
comb.nov. et P. chlororaphis sp.
aurantiaca sp. nov., comb.nov.
-
Les cellules de Pseudomonas spp. se divisent en moyenne toutes
les 5 h dans la
rhizosphre de Pinus radiata et uniquement toutes les 77 h dans
le sol non rhizosphrique
(Bowen et Rovira, 1976). Cette diffrence conduit un dveloppement
des Pseudomonas
spp. fluorescents significativement plus lev dans la rhizosphre
que dans le sol nu. Ces
microorganismes sont donc considrs comme des rhizobactries
(Schroth et al.,1992).
La diversit des populations de Pseudomonas spp. fluorescents en
milieu riche en matire
organique permet de compenser le handicap li labsence de formes
de conservation developpes
par dautres groupes bactriens tels que les Bacillus par exemple
(Latour et Lemanceau, 1997). Les
bactries appartenant ces espces prsentent en effet un intrt
potentiel pour l'environnement, et
contribuent rduire l'utilis
