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Élucidation du mécanisme d’action des immunoglobulines intraveineuses menant à l’inhibition
des lymphocytes T cytotoxiques.
Mémoire
Dominique Chabot
Programme de maîtrise en biochimie Maître ès sciences (M. Sc.)
Québec, Canada
© Dominique Chabot, 2014
iii
Résumé
Les immunoglobulines intraveineuses (IgIV) sont une préparation thérapeutique
utilisée dans le traitement de certains désordres auto-immuns. L’utilisation accrue
des IgIV expose les patients ainsi que les fournisseurs à un risque de pénurie. Le
but de nos travaux était donc d’élucider les mécanismes d’action des IgIV menant
à une inhibition des fonctions des lymphocytes T CD8 suite à la présentation
croisée d’antigènes et ce, afin d’aider au développement d’un bio-équivalent qui
pourrait mimer les effets des IgIV. Nos résultats ont permis de mettre en évidence
qu’un traitement aux IgIV affecte l’expression de la sélectine CD62L chez les
lymphocytes T CD8 et stimule l’expression de l’enzyme Indoleamine 2,3-
dioxygenase (IDO) et du récepteur intracellulaire NLRP10 ( « nucleotide-binding
oligomerization domain receptor family pyrin domain containing 10 ») chez les
monocytes, améliorant ainsi notre compréhension des mécanismes produisant des
effets immunomodulateurs en plus d’identifier de nouvelles cibles pour le
développement de bio-équivalents aux IgIV.
v
Table des Matières
Résumé ................................................................................................................... iii Table des Matières ................................................................................................... v
Liste des tableaux ................................................................................................... ix
Liste des figures ...................................................................................................... xi Liste des abréviations ........................................................................................... xiii Avant-propos .......................................................................................................... xv
1. Introduction ......................................................................................................... 1
1.1 Concepts de base en immunologie ................................................................ 1
1.1.1 Hématopoïèse ......................................................................................... 1
1.1.2 Immunité innée ........................................................................................ 2
1.1.3 Immunité adaptative ................................................................................ 4
1.1.4 Le développement des lymphocytes T .................................................... 4
1.1.5 Les cellules présentatrices d’antigènes tolérogènes ............................... 6
1.1.6 La cellule dendritique et la présentation antigénique ............................... 7
1.2 La présentation par le complexe majeur d’histocompatibilité I ..................... 10
1.2.1 Présentation d’antigènes intracellulaires ............................................... 11
1.2.2 Présentation d’antigènes extracellulaires .............................................. 12
1.2.3 La réponse lymphocytaire cytotoxique (CD8) ........................................ 13
1.2.4 CD62L et la régulation de la cytotoxicité ................................................ 15
1.3 L’auto-immunité ........................................................................................... 16
1.3.1 Les lymphocytes T cytotoxiques dans l’auto-immunité .......................... 16
1.3.2 Traitement de l’auto-immunité ............................................................... 17
1.3.3 Les immunoglobulines intraveineuses et l’auto-immunité ...................... 18
1.3.4 Mécanismes d’action des immunoglobulines intraveineuses dans l’auto-immunité ......................................................................................................... 18
1.4 Résultats antérieurs ..................................................................................... 20
1.5 Problématique, hypothèse et objectifs ......................................................... 21
2. Matériel et Méthodes ......................................................................................... 23
2.1 Isolement des cellules .................................................................................. 23
2.1.1 Cellules murines .................................................................................... 23
2.1.2 Cellules humaines ................................................................................. 24
vi
2.2 Culture cellulaire ........................................................................................... 26
2.2.1 Cellules murines..................................................................................... 26
2.2.2 Cellules humaines .................................................................................. 28
2.3 Cytométrie en flux ........................................................................................ 29
2.3.1 Cibles extracellulaires ............................................................................ 29
2.3.2 Cibles intracellulaires ............................................................................. 31
2.3.3 Mesure de la prolifération des lymphocytes T OT-I ................................ 32
2.3.4 Évaluation d’un possible blocage des marqueurs de surface par les IgIV ........................................................................................................................ 33
2.4 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) .............................................. 33
2.4.1 Transcriptase inverse ............................................................................. 33
2.4.2 PCR en temps réel ................................................................................. 34
2.5 Dosage de facteurs solubles par ELISA ....................................................... 35
2.6 Immunobuvardage de type western ............................................................. 36
2.6.1 Électrophorèse SDS-PAGE ................................................................... 36
2.6.2 Transfert de protéines ............................................................................ 36
2.6.3 Détection ................................................................................................ 37
2.7 Évaluation de l’activité enzymatique de l’enzyme IDO ................................. 37
2.8 Dosage des endotoxines présentes dans l’ovalbumine ................................ 38
3. Résultats ............................................................................................................ 39
3.1 Caractérisation des cellules dendritiques ..................................................... 39
3.1.1 Différenciation des cellules de moelle osseuse murines en cellules dendritiques .................................................................................................... 39
3.1.2 Activation des cellules dendritiques ....................................................... 42
3.2.3 Effet des IgIV sur l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité I ........................................................................................................................ 44
3.2.4 Effet des IgIV sur l’expression de l’intégrine CD11c : réel ou blocage ? 48
3.3 Effet des IgIV sur la dégradation de l’antigène par les cellules dendritiques 49
3.4 Effet des IgIV sur les lymphocytes T OT-I .................................................... 54
3.4.1 CD62L .................................................................................................... 54
3.4.2 Effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T CD8 humains .......................................................................................................... 59
3.5 Effet des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes .............................. 62
3.5.1 Indoleamine 2,3-dioxygenase ................................................................ 62
3.5.2 Récepteurs NOD .................................................................................... 66
vii
4. Discussion ......................................................................................................... 69
4.1 Effet des IgIV sur l’activation des cellules dendritiques ................................ 69
4.1.1 Complexe majeur d’histocompatibilité I ................................................. 69
4.1.2 CD11c .................................................................................................... 71
4.2 Effet des IgIV sur les lymphocytes T OT-I .................................................... 73
4.2.1 Effet des IgIV sur CD62L ....................................................................... 73
4.3 Effet des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes .............................. 75
4.3.1 Indoleamine 2,3-dioxygenase ................................................................ 75
4.3.2 NLRP6 et NLRP10................................................................................. 76
5. Conclusion ........................................................................................................ 77
6. Bibliographie ..................................................................................................... 79
ix
Liste des tableaux
Tableau 2.1: Détails des anticorps (cibles extracellulaires) utilisés pour la cytométrie en flux. ................................................................................................. 29 Tableau 2.2: Détails des amorces utilisées pour les expériences de PCR en temps réel. ....................................................................................................................... 34 Tableau 2.3: Détails des cycles d’amplification effectués lors des expériences de PCR en temps réel. ............................................................................................... 35
xi
Liste des figures
Figure 1.1 Éléments cellulaires du sang ................................................................. 2 Figure 1.2 Effets immunosuppresseurs de l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase sur certaines cellules du système immunitaire. ....................................................... 7 Figure 1.3 Synapse immunologique ...................................................................... 10 Figure 1.4 Présentation antigénique ..................................................................... 13 Figure 1.5 Réponse lymphocytaire cytotoxique..................................................... 15 Figure 1.6 Inhibition de l’activation des lymphocytes T OT-I par les IgIV. ............ 21 Figure 3.1 : Stratégie de caractérisation des cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 au terme du protocole de différenciation en cellules dendritiques par cytométrie en flux. ................................................................................................. 40 Figure 3.2 : Pourcentage d’expression des marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205 par les cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 au terme du protocole de différenciation. ....................................................................................................... 41 Figure 3.3 : Pourcentage d’expression des marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205 par les cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 suite au protocole de différenciation et à une stimulation avec LPS........................................................ 43 Figure 3.4 : Diminution de l’expression du CMH I en surface des cellules dendritiques en présence d’IgIV: neutralisation des endotoxines présentes dans l’ovalbumine. ......................................................................................................... 46 Figure 3.5 : Comparaison de l’inhibition de l’activation des lymphocytes T OT-I par les IgIV avec une utilisation de l’ovalbumine non-exempte ou exempte d’endotoxines. ....................................................................................................... 47 Figure 3.6 : Blocage des sites de liaison de l’anti-CD11c par les IgIV. ................. 48 Figure 3.7 : Effet des IgIV à différents stades de la présentation croisée mesuré par l’activation des lymphocytes T OT-I. ............................................................... 52 Figure 3.8 : Effet des IgIV sur les différents stades de présentation croisée mesuré par inhibition de la prolifération. ............................................................................ 53 Figure 3.9 : Effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T OT-I non-activés. ........................................................................................................... 55 Figure 3.10 : Cinétique de l’effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T OT-I activés en présence ou en absence d’IgIV............................ 57 Figure 3.11 : Effet des IgIV sur l’expression relative de l’ARNm codant pour la sélectine CD62L au temps T= 24 h par des lymphocytes T OT-I activés. ............. 58 Figure 3.12 : Cinétique de l’expression de CD62L par les lymphocytes T CD8 humains provenant de PBMC incubés en présence ou en absence d’IgIV pendant 48 h. ...................................................................................................................... 60 Figure 3.13 : Effet des IgIV sur l’expression relative de l’ARNm codant pour la sélectine CD62L par des PBMC humains après 10 h et 24 h d’incubation. .......... 61 Figure 3.14 : Effet des IgIV sur l’expression de l’enzyme Indoleamine 2,3-dioxygenase par des monocytes purifiés à partir de PBMC. ................................. 63 Figure 3.15: Effet des IgIV sur l’activité enzymatique de l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase exprimé par des monocytes purifiés à partir de PBMC. ................... 64 Figure 3.16 : Effet des IgIV sur l’expression des cytokines TNF-α et TGF-β. ....... 65
xii
Figure 3.17 : Effet des IgIV sur l’expression des récepteurs NOD NLRP6 et NLRP10. ................................................................................................................ 67
xiii
Liste des abréviations
ADN: Acide désoxyribonucléique
ADNc: ADN complémentaire
AGE: Advanced glycation end-product
CPA: Allophycocyanin
ARN: Acide ribonucléique
ARNm: ARN messager
BSA : Albumine de sérum bovin
CMH I: CMH de classe I
CMH II: CMH de classe II
CMH: Complexe majeur d'histocompatibilité
CPA: Cellule présentatrice d'antigène
DC : Cellules dendritiques
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
ENDO-: Ne contenant peu ou pas d'endotoxines (≤ 0,1 EU/ml)
FBS: Sérum bovin fétal
Fc: Fragment cristallisable
FITC: Fluorescéine isothiocyanate
GM-CSF: Granulocyte/macrophage colony stimulating factor
HPLC : Chromatographie liquide à haute performance
HSA : Albumine de sérum humain
IDO: Indoleamine 2,3-dioxygenase
IFN: Interféron
IgG : Immunoglobuline G
IgIV : Immunoglobulines intra-veineuses
IL : Interleukine
LPS : Lipopolysaccharide
LRR : Séquence répétée riche en leucine
MFI : Intensité de fluorescence moyenne
NF-kB : Facteur nucléaire kappa B
xiv
NK : Natural killer cells
NLR : Récepteur de type NOD
NLRP: Récepteur NLR ayant un domaine pyridine
NOD : Nucleotide-binding oligomerization domain
PAMP : Motifs moléculaires associés aux pathogènes
PBMC : Cellules mononuclées du sang
PBS: Solution saline tamponnée au phosphate
PCR : Réaction de polymérase en chaîne
PE: Phycoérythrine
PRR : Récepteur de reconnaissance de PAMP
PTI : Thrombocytopénie immune
PVDF: Polyvinylidene fluoride
RE : Réticulum endoplasmique
SDS-Page: Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis
TAP: Transporteur de peptides
Tc: Lymphocyte T CD8 cytotoxique
TCR: Récepteur d’antigène des lymphocytes T
TGF: Facteur de croissance de transformation
TLR : Récepteur de type Toll
TMB : 3,3,5,5-tétraméthylbenzidine
TNF: Facteur de nécrose tumorale
TP : Température pièce
Treg: Lymphocyte T régulateur
Trp: Tryptophane
TTBS: Tris-buffered saline and tween 20
xv
Avant-propos
Je tiens à exprimer toute ma gratitude à ma directrice de maîtrise, Dre Renée
Bazin, de nous avoir accueillis dans son équipe, moi et Louis-Félix. Quelle chance
j’ai eu d’avoir une directrice aussi humaine et empathique à ce moment précis où
la vie a décidé que j’allais bientôt devenir une maman. Je veux également
souligner l’attitude toujours positive de Renée et son aptitude à encadrer ses
étudiants de façon stricte et rigoureuse tout en laissant une certaine latitude qui fait
place à la créativité. Je n’aurais pu souhaiter meilleur encadrement.
Je veux également remercier les membres de mon comité d’encadrement, Dr
André Darveau, Dre Sonia Néron et Dre Caroline Gilbert pour leurs précieux
conseils et leur disponibilité. Merci aux dirigeants d’Héma-Québec d’encourager la
formation scientifique d’étudiants dans un environnement aussi stimulant et
valorisant. Merci à l’ensemble de mes collègues du département de R&D, plus
particulièrement à Patrick Trépanier pour sa bonne humeur et pour l’accès à ses
connaissances qui semblent sans borne. Merci particulier également à Lionel
Loubaki de m’avoir encadrée pendant la dernière année et d’avoir toujours réagi
de la même façon à chacune de mes gaffes : en riant !
Merci à mes parents pour leur support moral, leur appui financier, mais surtout
pour la confiance qu’ils ont en moi et qui me poussent à ne jamais abandonner.
Merci à ma marraine Sonia et à mon parrain Mario ainsi qu’à mes beaux-parents
pour leurs encouragements, leur confiance et leur soutien. Merci à mes sœurs,
Audrey et Marie-Christine ainsi qu’à toutes mes précieuses amies, particulièrement
Corinne et Lee-Ann, pour avoir si soigneusement pris soin de mon moral. Merci à
mon petit Louis-Félix pour la force qu’il m’apporte et pour avoir fini par me laisser
dormir la nuit. Enfin, merci à Jimmy, mon amour, de m’avoir endurée et de m’avoir
encouragée dans la poursuite de mes réalisations professionnelles remplies de
défis. Merci pour ces précieux moments de décrochage et de fous rires. Tu es en
quelque sorte présent dans chaque parcelle de ces travaux.
1. Introduction
1.1 Concepts de base en immunologie
Le système immunitaire est constitué de l'ensemble des mécanismes de défense
de l'organisme contre les infections. Les cellules impliquées dans les réponses
immunes proviennent de la moelle osseuse où elles se développent à partir d’un
progéniteur commun.
1.1.1 Hématopoïèse
Tous les éléments cellulaires du sang proviennent de cellules souches
hématopoïétiques de la moelle osseuse [1]. Ces cellules pluripotentes ont la
particularité de pouvoir se différencier en tous les types de cellules sanguines de
l’organisme (figure 1.1). Elles se divisent d’abord pour donner naissance à deux
types de progéniteurs : lymphoïde ou myéloïde commun. Les cellules tueuses
naturelles (NK), les lymphocytes B et les lymphocytes T proviennent du
progéniteur lymphoïde commun alors que les granulocytes (neutrophiles,
éosinophiles et basophiles) et les monocytes dérivent du progéniteur myéloïde
commun [1]. Les macrophages et les cellules dendritiques (DC) sont issus de la
différenciation des monocytes. Les cellules formées dans la moelle osseuse
migrent alors vers les organes lymphoïdes secondaires ou circulent dans les
systèmes sanguin et lymphatique afin d’assurer la protection de l’organisme. Bien
qu’exerçant des fonctions très différentes et spécifiques, les cellules de l’immunité
ont à interagir ensemble et sont parfois même dépendantes l’une de l’autre dans
l’établissement d’une réponse immunitaire adéquate et efficace.
2
Figure 1.1 Éléments cellulaires du sang
Les leucocytes du système immunitaire adaptatif proviennent de cellules souches hématopoïétiques pluripotentes de la moelle osseuse.
Étant entouré de micro-organismes, dont plusieurs sont à l’origine de maladies,
l’organisme se doit d’être doté de moyens de défense afin de résister et d’éliminer
les pathogènes. Le corps humain possède deux types d’immunité. Le premier, soit
l’immunité innée, est toujours prêt à s’opposer rapidement à une multitude de
germes, mais n’est pas spécifique à aucun pathogène particulier [2] Le second,
soit l’immunité adaptative, est celui qui assure une protection immunitaire à long
terme contre toute seconde infection par un même pathogène [3].
1.1.2 Immunité innée
3
Plusieurs cellules sont impliquées dans la réponse immunitaire innée, mais ce sont
principalement les neutrophiles, les macrophages et les DC qui assurent ce rôle.
Leur capacité à distinguer le soi du non soi est par contre limitée à un répertoire
étroit et invariable de récepteurs de reconnaissance (PRR) qui peuvent reconnaître
et lier quelques molécules appartenant aux micro-organismes [4]. Les PRR
reconnaissent en fait des motifs structuraux répétés associés aux pathogènes
(PAMP) qui ont été conservés par les micro-organismes au cours de l’évolution et
qui sont absents des cellules de notre organisme [5]. Les lipopolysaccharides
(LPS), les flagelles bactériens ainsi que l’acide ribonucléique (ARN) double brin
sont de bons exemples de ces motifs. Les PRR se divisent en quatre grandes
familles, soit les récepteurs liant le mannose, les récepteurs « éboueurs », les
récepteurs de type Toll (TLR) [6] et les récepteurs de type NOD («Nucleotide-
binding oligomerization domain») (NLR). La grande famille des NLR reconnaît les
LPS et ces récepteurs se distinguent par l’expression d’un domaine composé de
séquences répétées riches en leucine à leur extrémité C-terminale (Leucine-Rich
Repeats, LRR). Deux sous-familles composent les NLR, soit les NLR-PYR et les
NLR-CARD, et celles-ci se différencient par la structure de l’extrémité N-terminale
des récepteurs qui leur sont associées. La présence d’un domaine pyridine à
l’extrémité N-terminale de ceux-ci leur a valu cette appellation. Les NLRP (NRLP1
à NLRP14) font majoritairement partie de l’inflammasome qui est un complexe
protéique formé suite à la captation d’un signal de danger par les NLRP [7]. En
plus des NLRP, l’inflammasome comprend également la caspase-1 (parfois la
caspase-5) et peut contenir d’autres effecteurs selon le type de molécules qui aura
déclenché sa formation [8]. La principale fonction reconnue de l’inflammasome est
d’activer les cytokines inflammatoires interleukine(IL)-18 et IL-1β via un clivage de
ces pro-cytokines par l’activité de la caspase-1, celle-ci étant contrôlée par la
présence de NF-κB [8]. Le NLRP6 fait partie de cette catégorie de récepteurs NOD
ayant un impact pro-inflammatoire sur la cellule [9, 10]. Cependant, le NLRP10 a
récemment été caractérisé comme ayant des fonctions anti-inflammatoires. En
effet, il a été mis en évidence que le NLRP10 était un régulateur négatif de
4
l’activation du facteur nucléaire kappa B (NF-κB), de l’apoptose et de l’activation de
l’IL-1β [11, 12].
1.1.3 Immunité adaptative
Les pathogènes évoluant plus rapidement que leurs hôtes, une ligne de défense
diversifiée et spécifique est indispensable pour l’organisme. L’immunité adaptative
assure ce rôle et les principaux acteurs impliqués sont les lymphocytes T.
L’activation spécifique des lymphocytes T mène à l’initiation de deux principaux
types de réponse, soit la réponse humorale (CD4) et la réponse cellulaire (CD8).
Les lymphocytes T sont donc divisés en deux grandes classes exerçant des
fonctions effectrices différentes et se distinguent par leurs protéines de surface,
soit CD4 ou CD8. La réponse des lymphocytes T CD4 mène au recrutement de
plusieurs cellules impliquées dans la réponse immune, dont font partie les
lymphocytes B qui produisent alors des anticorps spécifiques suite aux signaux
transmis par les lymphocytes T CD4 [13]. La réponse des lymphocytes T CD8
implique quant à elle l’acquisition d’un pouvoir cytotoxique dirigé contre les
antigènes responsables du déclenchement de la réponse immunitaire [14]. Au
cours d’une réponse contre un antigène, certains lymphocytes B et lymphocytes T
activés vont se différencier en cellules mémoire afin de permettre une immunité de
longue durée qui viendra atténuer ou même supprimer le délai entre la réponse
immunitaire innée et adaptative lors d’une seconde infection par le même
pathogène [15, 16]. Le développement des lymphocytes T est hautement régulé
afin de fournir à l’organisme toutes les sous-populations de lymphocytes T
requises dans l’élaboration d’une réponse immune adéquate.
1.1.4 Le développement des lymphocytes T
5
Les lymphocytes se développent dans la moelle osseuse, mais seuls les
lymphocytes B s’y différencient. Les lymphocytes T immatures (thymocytes), quant
à eux, migrent et viennent à maturité dans le thymus [17]. La reconnaissance d’un
antigène par un lymphocyte T se fait via l’exposition de fragments peptidiques
(antigènes) provenant de l’étranger exposés par des cellules présentatrices (CPA)
en association avec des complexes majeurs d’histocompatibilité (CMH) pour
former le complexe CMH-peptide [18-20]. Ce complexe est reconnu par le
récepteur d’antigène des lymphocytes T (TCR). À leur arrivée dans le thymus, les
thymocytes sont « double négatifs », c’est-à-dire qu’ils n’expriment aucun des trois
marqueurs de surface qui définissent les lymphocytes T matures, soit le TCR et les
corécepteurs CD4 et CD8 [21]. L’assemblage subséquent du complexe TCR et
l’expression des corécepteurs est sous le contrôle d’interactions des thymocytes
avec le stroma thymique. Par la suite, les thymocytes subissent une sélection
positive où seules les cellules capables de lier un complexe CMH-peptide avec
suffisamment d’affinité reçoivent un signal de survie. Selon la nature du CMH que
leur TCR a pu lier, les thymocytes doubles positifs (CD4+CD8+) perdent l'un des
deux corécepteurs. Les cellules dont le TCR peut lier des molécules du CMH de
classe I (CMH I) gardent le CD8 et perdent le CD4; celles dont le TCR peut lier une
molécule de classe II (CMH II) perdent le CD8 et gardent le CD4 [21]. Les cellules
qui ont survécu à cette sélection positive sont alors mises en présence d’auto-
antigènes, c’est-à-dire en présence de peptides qui proviennent du soi et qui ne
devraient pas déclencher de réaction immunitaire. Les lymphocytes T dont le TCR
interagit fortement avec un peptide du soi sont supprimés, éliminant ainsi des
cellules qui se voudraient réactives à leurs propres antigènes [22]. Le thymus
génère également une population minoritaire de lymphocytes T qui exprime CD4,
CD25, CTLA-4 et le facteur de transcription Forkhead FoxP3 et qui se distinguent
par leur capacité à contrôler les réponses immunitaires [23]. Cette sous-population
de lymphocytes T régulatrices (Treg) générés dans le thymus est nommée
cellules T régulatrices naturelles par opposition aux cellules T régulatrices induites
qui sont générées à partir de lymphocytes T naïfs [24]. Suite à leur
développement, les lymphocytes T sont ensuite exportés pour former un répertoire
6
périphérique et sont dit naïfs jusqu’à ce qu’ils rencontrent l’antigène pour lequel ils
sont spécifiques. Cependant, comme mentionné, les lymphocytes T ne
reconnaissent pas directement ce qui est étranger au soi. Leur activation est
dépendante des CPA qui sont responsables de présenter les complexes CMH-
peptides aux lymphocytes T [25]. Les macrophages [19], les lymphocytes B [20]
ainsi que les DC [26] peuvent assurer ce rôle. Cependant, les DC se distinguent
par leur efficacité et leur spécialisation dans l’exercice de cette fonction [26].
1.1.5 Les cellules présentatrices d’antigènes tolérogènes
Suite à une infection, les monocytes et les DC sont rapidement recrutés au lieu
d’inflammation et vont adapter leur phénotype fonctionnel selon l’environnement et
les signaux qu’ils reçoivent [27]. Comme mentionné précédemment, ces cellules
jouent un rôle fondamental de par leur habileté à détruire les pathogènes, mais
également de par leur capacité à instruire les autres cellules effectrices du
système immunitaire. Elles exercent également des fonctions moins connues, mais
fondamentales, dans l’induction de la tolérance et dans la résorption d’une réponse
immunitaire devenue superflue. Les CPA qui exercent ces rôles sont dites
tolérogènes et un important mécanisme d’action est une augmentation marquée de
l’expression de l’enzyme Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) [28] (figure 1.2) [29].
IDO est une enzyme qui catalyse la dégradation du tryptophane (Trp), un acide
aminé essentiel pour plusieurs cellules. Bien qu’il existe une forte corrélation entre
la présence d’interféron (IFN)γ et l’expression de IDO [30], d’autres facteurs
solubles peuvent participer à son induction, tels que le LPS [31, 32] et le facteur de
nécrose tumorale (TNF)α [32, 33]. L’activité enzymatique d’IDO et la diminution de
la quantité de Trp disponible qui en résulte entrainent un manque nutritif et ainsi,
une suppression majeure de l’activation des lymphocytes T [28]. En revanche,
l’activité catalytique de l’enzyme ne semble pas être la seule façon d’inhiber la
prolifération cellulaire. En effet, une étude récente a montré qu’une expression
intracellulaire accrue d’IDO en la présence de facteur de croissance de
transformation (TGF)β dans l’environnement extracellulaire suffisait à conférer aux
7
DC des fonctions immunosuppressives telle que la génération de lymphocytes T
régulateurs et ce, sans être associé à une diminution du Trp disponible dans le
milieu [34].
Figure 1.2 Effets immunosuppresseurs de l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase sur certaines cellules du système immunitaire.
Indoleamine 2,3-dioxygenase est une enzyme hautement impliquée dans le pouvoir
tolérogène des cellules dendritiques à long terme. Bien que l’induction d’un manque de Trp soit le mécanisme menant à l’inhibition de la prolifération des lymphocytes T le plus détaillé, un mécanisme indépendant de l’activité enzymatique est également impliqué.
Figure modifiée à partir de Löb et al. [29].
1.1.6 La cellule dendritique et la présentation antigénique
8
En présentant des antigènes à des lymphocytes T naïfs, les DC forment un lien
crucial entre l’immunité innée et l’immunité adaptative [26]. Les DC se retrouvent
partout dans l’organisme et agissent comme des sentinelles pour les lymphocytes
T en parcourant continuellement les différents tissus à la recherche de pathogènes
potentiels. La DC se charge donc d’ingérer des antigènes présents dans
l’organisme, de les dégrader en plusieurs peptides et de charger ceux-ci sur des
molécules CMH dans le réticulum endoplasmique (RE) pour enfin former des
complexes CMH-peptides qui sont envoyés à la surface de la cellule [35]. Une fois
que la DC exprime en sa surface des complexes CMH-peptides, elle quitte le tissu
de résidence et migre dans les organes lymphoïdes secondaires où nichent les
lymphocytes T. Le seul contact entre le TCR et le complexe CMH-peptide n’est par
contre toujours pas suffisant pour activer un lymphocyte T. La DC doit exprimer les
molécules de costimulation CD80 et CD86, lesquelles se lient à la protéine CD28
sur le lymphocyte T, et elle doit sécréter des cytokines qui auront pour rôle la
modulation des fonctions effectrices des lymphocytes T suite à leur activation [25].
La capacité des DC à phagocyter et à activer les lymphocytes T peut être
fortement augmentée si ces cellules détectent la présence de PAMP [36]. Il devient
alors possible d’observer en leur surface une expression accrue du CMH I et du
CMH II ainsi qu’une augmentation de l’expression des molécules de costimulation
CD80 et CD86 [36]. On note également une augmentation de leurs capacités
migratoires et des modifications du cytosquelette de la DC et du lymphocyte T [37].
Le cytosquelette est constitué de polymères biologiques de protéines qui sont
classées en trois différentes catégories: les filaments d’actine, les filaments
intermédiaires et les microtubules. Les filaments d’actine et les filaments
intermédiaires servent respectivement au maintien de la structure du cytosol et à
l’ancrage des différents organites [38]. Les microtubules, quant à eux, sont les
constituants les plus rigides du cytosquelette et ils sont également extrêmement
polarisés, c’est-à-dire que l’une des extrémités de ceux-ci polymérise plus
rapidement que l’autre [39]. Ainsi, il existe une instabilité dynamique qui peut
conduire à un raccourcissement très brutal d'un microtubule, ce qui peut être à
l'origine d’une force assez élevée pour permettre une déformation de la membrane
9
cellulaire [39]. Les DC et les lymphocytes T subissent donc des transformations
mécaniques afin de potentialiser la stabilité de la synapse immunologique et
d’améliorer la présentation du complexe CMH-peptide (figure 1.3) [37]. Enfin, il
revient aux molécules d’adhésion telles que les intégrines et les sélectines
(protéines transmembranaires) de capter l’information concernant l’environnement
physique et chimique extracellulaire et de transmettre les renseignements recueillis
vers l’intérieur de la cellule [40]. Ce phénomène de communication est
extrêmement important dans l’établissement d’une liaison stable entre une cellule
et une autre cellule ou alors entre une cellule et son environnement [40]. Les
intégrines, comparativement aux sélectines, sont une grande famille de récepteurs
d’adhésion dont les fonctions (adhésion, communication extérieur-intérieur et
modulation du cytosquelette) sont plutôt bien comprises et détaillées à ce jour [41].
Par exemple le récepteur d’adhésion LFA-1, exprimé par les CPA, va lier son
ligand ICAM-1 exprimé par les lymphocytes T et cette liaison viendra stabiliser et
potentialiser les interactions lors de la synapse immunologique [42]. Le rôle exact
des sélectines est encore méconnu, mais elles participent également à l’adhésion
cellulaire en plus de jouer un rôle dans la régulation de l’activation des
lymphocytes et des granulocytes [43]. Dans le cadre du présent travail, seule la
présentation de peptides en association avec des CMH I à des lymphocytes T CD8
sera détaillée.
10
Figure 1.3 Synapse immunologique
La mise en place d’une interaction cellulaire prolongée et d’un dialogue entre les lymphocytes T et les cellules dendritiques lors de la présentation antigénique est cruciale
et est assurée par la formation de la synapse immunologique. Tirée de Huppa et al. [44]
1.2 La présentation par le complexe majeur d’histocompatibilité I
La présentation par le CMH I comprend deux voies principales qui se distinguent
par l’emplacement initial de l’antigène, c’est-à-dire à l’intérieur de la cellule
présentatrice ou alors dans l’environnement extracellulaire. Les complexes CMH I-
peptides sont reconnus par des lymphocytes T CD8. Les détails concernant
l’activation ainsi que les fonctions effectrices de ceux-ci seront décrits dans la
section 1.2.3.
11
1.2.1 Présentation d’antigènes intracellulaires
Les virus peuvent se répliquer directement dans le compartiment cytosolique d’une
cellule infectée. La cellule infectée présente alors des fragments antigéniques
provenant de l’hydrolyse des protéines pathogéniques présentes dans le cytosol. Il
en est de même pour les cellules tumorales [45]. Les protéines virales et tumorales
sont hydrolysées dans le cytosol par les protéasomes [46]. Ceux-ci peuvent être
décrits comme des complexes enzymatiques ayant pour rôle l’hydrolyse des
protéines dénaturées ou mal repliées par des protéases. Les polypeptides qui en
résultent sont ensuite transportés au RE par des transporteurs de peptides (TAP 1
et TAP 2) où ils sont transformés en peptides de huit à dix acides aminés par des
aminopeptidases (ERAP1 et IRAP) [46, 47]. Ces dernières permettent le clivage
terminal requis pour le chargement des peptides sur les molécules du CMH I. Les
peptides sont ensuite insérés dans des complexes CMH I par un complexe
d’apprêtement composé de tapasine, de calréticuline, de calnexine et de ERp57
[48, 49]. La tapasine est une protéine associée au complexe TAP qui forme un
pont entre le CMH I et celui-ci. Elle joue donc un rôle central dans la capacité des
peptides à être chargés sur les CMH I. La calréticuline et la calnexine sont des
protéines chaperonnes qui retiennent la molécule CMH I dans un état partiellement
replié dans le RE en attente d’un peptide à être chargé. Enfin, ERp57 joue un rôle
dans la révision et le contrôle du peptide à charger. Les vésicules contenant le
complexe CMH I et le peptide sont ensuite acheminés vers la membrane
plasmique où elles fusionnent et exposent leur contenu à la surface de la cellule.
Le lymphocyte T CD8 spécifique à cette combinaison reconnaîtra le complexe
CMH I-peptide et s’activera que si celui-ci est présenté par une CPA
professionnelle en raison de la présence obligatoire de signaux de co-stimulation
[25, 50]. Si la cellule infectée est une CPA professionnelle, l’activation du
lymphocyte T CD8 se fera via cette voie. Par contre, advenant le cas où la cellule
infectée ne possède pas les molécules de costimulation requises pour activer un
lymphocyte T naïf, une seconde voie de présentation par le CMH I doit être
utilisée.
12
1.2.2 Présentation d’antigènes extracellulaires
De récentes études ont démontré que des peptides provenant du milieu
extracellulaire pouvaient être présentés par une voie impliquant des CMH I,
processus maintenant nommé présentation croisée (figure 1.4) [50] [46]. Les DC
sont les seules CPA capables de ce type de présentation [51]. Autrefois inconnue,
la présentation croisée est maintenant reconnue comme un mécanisme majeur par
lequel l’organisme contrôle la présence d’éventuels intrus pathogènes [50]. Les
antigènes internalisés pour la présentation croisée subissent quelques
transformations et peuvent ensuite emprunter la voie classique (décrite à la section
1.3.1) ou une autre voie dite vacuolaire. Cette dernière voie ne nécessite pas la
collaboration du complexe TAP et est donc également nommée TAP-indépendante
pour cette raison [52]. Elle est méconnue comparativement à la voie classique,
mais de récentes études ont démontré que cette voie n’est pas inhibée par des
inhibiteurs de protéasome [52], contrairement à la voie classique, indiquant qu’il
s’agit bel et bien de deux avenues distinctes. Cette voie de présentation implique
que les antigènes sont internalisés par phagocytose ou par le biais d’une
membrane altérée. Ils sont ensuite hydrolysés en oligopeptides au sein de
compartiments d’endocytose et non directement dans le cytosol. Les protéases
endosomales impliquées dans ce processus sont méconnues à ce jour mais les
cathepsines, et plus spécifiquement la cathepsine S, joueraient un rôle
fondamental [53]. Les peptides sont ensuite chargés dans des molécules CMH I
directement dans les endosomes et exposés à la surface de la CD qui devient
alors apte à jouer son rôle de présentation antigénique. Le récepteur d’endocytose
DEC-205 est reconnu pour diriger efficacement ses ligands vers les sentiers de la
présentation antigénique croisée [54]. Ce récepteur appartient à la famille des
lectines (protéines qui se lient spécifiquement et de façon réversible à certains
glucides) et possède dix domaines de liaison spécifiques et réversibles aux
glucides. Une étude récente a permis de démontrer que les capacités des DC à
effectuer la présentation croisée d’antigènes étaient augmentées de 100 fois si une
13
petite quantité de polypeptides (provenant d’un antigène) était couplée à un anti-
DEC-205 [54].
Figure 1.4 Présentation antigénique
Alors que la présentation par le CMH II se produit seulement suite à la capture d’un antigène extracellulaire, la présentation par le CMH I comprend deux voies distinctes qui se distinguent par l’emplacement initial de l’antigène, c’est-à-dire à l’intérieur de la cellule
présentatrice ou alors dans l’environnement extracellulaire. Tirée de Burgdorf et al. [46].
1.2.3 La réponse lymphocytaire cytotoxique (CD8)
L’activation des lymphocytes T CD8 par les CPA mène ceux-ci à acquérir des
propriétés cytotoxiques. Les lymphocytes T CD8, une fois activés, peuvent prendre
deux chemins distincts : soit ils deviennent des lymphocytes T CD8 à mémoire qui
survivront même lorsque l‘infection sera résorbée ou alors ils se différencient en
14
lymphocytes T CD8 cytotoxiques effecteurs (Tc) à courte vie [55]. Ces derniers
vont acquérir des capacités cytotoxiques, caractérisée par l’’expression du
marqueur CD107a (LAMP-1) [56], et vont proliférer pour former une armée de
clones qui détruira ensuite les cellules infectées ou cancéreuses via la sécrétion de
vésicules contenant toujours au moins deux effecteurs cytotoxiques, soit la
perforine et les granzymes [57]. La perforine, une protéine capable de créer des
pores transmembranaires dans la cellule cible, est larguée afin de créer un chemin
pour l’entrée des secondes protéines, les granzymes (A et B). Il existe cependant
un mécanisme qui n’est pas encore clairement expliqué à ce jour et qui permet aux
granzymes de pénétrer les cellules cibles sans l’aide de la perforine [58]. Une fois
à l’intérieur de la cellule cible, la granzyme B entraine une cascade de signalisation
impliquant les caspases qui aboutit à la mort cellulaire programmée (apoptose) de
la cellule infectée [59]. Le rôle de la granzyme A est moins bien détaillé, mais son
action est indépendante de la granzyme B et l’induction de l’apoptose des cellules
cibles par celle-ci passe par une voie de signalisation qui n’implique pas les
caspases [60]. D’autres mécanismes peuvent également être employés par les Tc
pour détruire leurs cibles. Parmi ceux-ci, la liaison du ligand Fas (FasL) exprimé
sur les Tc activés au récepteur Fas sur la cellule cible semble être un mécanisme
considérablement important dans la mesure où il en résulte une activation de
caspases à l’intérieur de la cellule visée qui mène finalement à l’apoptose (figure
1.5) [61]. Enfin, les Tc libèrent également des cytokines pro-inflammatoires telles
que l’IFNγ et le TNFα. Une question fondamentale demeure; comment des
granules cytotoxiques, qui n’ont aucune spécificité contre l’antigène cible et qui
sont larguées dans l’environnement extracellulaire, parviennent à détruire les
cellules infectées seulement ? Une partie de la réponse pourrait provenir de la
capacité des Tc à modifier leur cytosquelette de façon à contrôler leurs contacts
avec les cellules cibles [44] (voir section 1.1.4). En effet, des travaux suggèrent
que les Tc pourraient, par un modelage de leur cytosquelette, contrôler où seront
larguées les granules, mais contrôleraient également la distance et la durée du
contact [62]. D’autres effecteurs sont également impliqués dans la régulation de la
cytotoxicité des Tc.
15
Figure 1.5 Réponse lymphocytaire cytotoxique
Induction de l’apoptose chez une celle cible par un lymphocyte T cytotoxique via la
sécrétion de perforine et des granzymes et via la liaison FasL-Fas. Tirée de Thomas et al. [61]
1.2.4 CD62L et la régulation de la cytotoxicité
La sélectine CD62L est présente de façon constitutive sur les lymphocytes T naïfs.
Suivant l’activation des lymphocytes T via le TCR, la cinétique d’expression de
CD62L suit un modèle « triphasique » [63, 64]. Dans la phase précoce, entre 2 h et
4 h après l’activation, il est possible d’observer un clivage rapide de la sélectine.
Dans la phase intermédiaire, environ 24 h suivant l’activation, une resynthèse de
celle-ci est observée. Enfin, dans la phase tardive, soit après 48 h, il est possible
d’observer une seconde diminution de l’expression de CD62L, mais de façon
moins importante que dans la phase précoce. La sélectine CD62L a récemment
été associée à la régulation des capacités lytiques des Tc [65]. En effet, des
chercheurs ont mis en évidence un lien de dépendance entre le clivage de CD62L
et l’acquisition des capacités lytiques des Tc [65]. Dans le même ordre d’idées,
d’autres chercheurs ont effectué une étude à l’aide de souris mutantes résistantes
16
au clivage de la sélectine pour répondre aux questions suivantes : est-ce que le
clivage de CD62L est nécessaire pour que les Tc puissent migrer vers les tissus
infectés; est-il nécessaire de cliver la sélectine L sur les Tc à mémoire pour qu’ils
puissent se rendre dans les organes non-lymphoïdes et est-ce que l’expression de
CD62L régule la fonction antivirale des Tc [66]. Les auteurs ont démontré que,
contrairement à ce qu’ils pensaient observer, une résistance au clivage de CD62L
chez les souris mutantes n’affectait pas significativement la distribution des Tc
activés, mais diminuaient fortement l’efficacité de l’immunité antivirale [66]. Via un
mécanisme toujours inconnu, la sélectine CD62L semble jouer un rôle clé dans la
régulation de l’activité lytique des Tc.
1.3 L’auto-immunité
Il importe que les réponses immunitaires soient hautement régulées afin de ne pas
détruire des éléments du soi, de tolérer des éléments externes qui ne constituent
pas un réel danger (nourriture) et de mettre fin à la réponse immune adverse
lorsque l’infection est résorbée. Ces capacités sont introduites par le mécanisme
d’induction de la tolérance centrale [23] et sont ensuite maintenues par l’induction
de tolérance périphérique. Comme mentionné précédemment, l’induction de la
tolérance centrale se fait lors du développement des lymphocytes T dans le
thymus via les sélections positives et négatives. Lorsque des lymphocytes T
échappent à cette sélection, ils peuvent être détruits ultérieurement par des
mécanismes qui impliquent les CPA tolérogènes [34] et les lymphocytes T
régulateurs [67]. Une maladie auto-immune survient quand les mécanismes de
tolérance au soi deviennent défaillants, permettant alors aux lymphocytes auto-
réactifs de détruire des constituants du soi. Malheureusement, l’origine de cette
défaillance est souvent extrêmement difficile à identifier et multifactorielle.
1.3.1 Les lymphocytes T cytotoxiques dans l’auto-immunité
17
Les maladies auto-immunes causent des lésions qui se développent à partir d’un
seul ou de plusieurs des mécanismes pathologiques. Les Tc autoréactifs induisent
des dommages cellulaires considérables en appliquant chacun des mécanismes
cytotoxiques qu’ils possèdent contre les cellules exprimant des constituants du soi,
soit la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires, la libération de granules
cytotoxiques et l’induction de l’apoptose. La contribution des Tc dans le
développement et le maintien de certaines maladies auto-immunes est maintenant
reconnue, notamment dans certains désordres neurologiques [68] et dans le lupus
[69]. Une composante CD8 a également été associée à d’autres désordres auto-
immuns comme la sclérose multiple [70] et le diabète [71] .
1.3.2 Traitement de l’auto-immunité
Il existe à ce jour quelques traitements possibles qui soulagent les symptômes de
l’auto-immunité et ralentissent ou freinent totalement la progression de la maladie.
Parmi ceux-ci, les glucocorticostéroïdes sont les plus couramment utilisés en
raison de leur efficacité et de leur prix. Ceux-ci lient différents facteurs de
transcription tel le NF-κB dont la principale fonction est la régulation de l’activation
des cellules phagocytaires [72]. La prise de cette médication peut par contre
engendrer des problèmes de santé telle l’obésité [73]. Des anticorps monoclonaux
peuvent également être utilisés. Des anticorps dirigés contre le TNF-α permettent
le traitement de l’arthrite rhumatoïde [74]et des anticorps anti-CD20
(commercialisés sous le nom de Rituximab) lient la molécule de surface CD20
exprimée par les lymphocytes B et permet de diminuer de façon substantielle le
nombre de ces cellules par un effet toxique direct sur celles-ci [75]. Certaines
thérapies anti-inflammatoires alternatives sont parfois prescrites lorsque les
traitements décrits plus hauts s’avèrent non efficaces.
18
1.3.3 Les immunoglobulines intraveineuses et l’auto-immunité
Les IgIV sont utilisées depuis plusieurs années en tant que traitement pour un très
large spectre de maladies auto-immunes et inflammatoires [76]. Ce sont des
préparations thérapeutiques d’immunoglobulines G (IgG) humaines obtenues à
partir du fractionnement d’un ensemble de plasmas sanguins provenant de
plusieurs milliers de donneurs en santé. Les IgG sont séparées du reste du plasma
par une précipitation des protéines plasmatiques à l’éthanol froid où le pH, la force
ionique, la température et la concentration de protéines sont minutieusement
contrôlés. Les fractions de plasma sont séparées de façon séquentielle et, à
chaque étape, le culot et/ou le surnageant est utilisé pour l’étape suivante. À la fin
du processus, on récolte presque exclusivement des IgG intactes et pures (98%),
bien que des traces d’IgA et d’IgM puissent s’y retrouver [77]. Les IgG sont des
glycoprotéines dotées d’une fonction anticorps. Sécrétées par les Lymphocytes B,
elles sont formées de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères (κ ou λ) et
représentent 75% des anticorps sériques du plasma. La principale fonction des
IgG est de reconnaître et de se lier spécifiquement à un antigène. Les IgG peuvent
également bloquer des sites spécifiques sur les exotoxines bactériennes et les
virus, les empêchant ainsi d’endommager les cellules de l’organisme. Les IgIV ont
donc d’abord été utilisées comme substitut de défense immunitaire chez des
patients souffrant d’immunodéficience [78]. Cependant, plusieurs études ont
permis d’étendre les applications thérapeutiques des IgIV jusqu’aux maladies auto-
immunes. Depuis maintenant près de trente ans, les IgIV sont utilisées dans le
traitement de la thrombocytopénie immune (PTI), dans la maladie de Kawasaki et
dans le traitement non approuvé de nombreux autres désordres auto-immuns [79].
1.3.4 Mécanismes d’action des immunoglobulines intraveineuses dans l’auto-
immunité
19
Bien que les IgIV soient connues depuis quelques décennies pour leurs propriétés
anti-inflammatoires, leurs mécanismes d’action ne sont toujours pas clairement
définis. Dans le passé, plusieurs hypothèses ont été émises quant à l’origine des
effets thérapeutiques des IgIV dans les maladies auto-immunes. Les mécanismes
d’action ont été investigués de façon importante dans le contexte de la PTI. La PTI,
qui se caractérise par une destruction auto-immune massive des plaquettes, a été
soignée pour la première fois par un traitement aux IgIV en 1981 [80]. Certains
chercheurs ont proposé que le pouvoir immunosuppresseur des IgIV dans la PTI
pourrait provenir d’un blocage de l’activité phagocytaire des plaquettes par les
macrophages [81]. Selon eux, les IgG contenues dans les préparations pourraient
reconnaître et lier des antigènes de surface chez les globules rouges et ainsi
bloquer l’accessibilité aux auto-anticorps pour les récepteurs FcγR impliqués dans
la phagocytose des plaquettes [81]. Découlant de ces travaux, une thérapie
utilisant un anticorps monoclonal anti-D dans le traitement de la PTI a fait l’objet
d’une étude qui a eu bien peu de succès [82], suggérant que d’autres mécanismes
d’action soient impliqués dans les bienfaits des IgIV dans cette maladie. D’autres
études ont mis en évidence un effet bénéfique des IgIV sur la PTI via un blocage
direct des récepteurs FcγR [83, 84]. L’application de ces découvertes dans le
cadre d’un traitement de la PTI a encore une fois eu un succès mitigé. Il a
également été suggéré que les IgIV réduisaient la présence d’auto-anticorps
antiplaquettaires en neutralisant ceux-ci par la formation de complexes idiotypes
anti-idiotypes [85]. Des recherches plus approfondies seront sans doute
nécessaire pour déterminer avec certitude quels sont les mécanismes d’action des
IgIV dans le traitement de la PTI. Dans un autre ordre d’idée, des études ont
également mis en évidence que les IgIV avaient un pouvoir inhibiteur in vivo et in
vitro sur l’expression de certaines cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α
[86], l’IL-2 [87, 88] et l’IFN-γ [88]. À l’opposé, il a été montré que les IgIV entrainent
une augmentation de la synthèse de l’IL-8 et de l’IL-1RA par les monocytes in vitro
[89]. Il est également rapporté que les IgIV entrainent une inhibition de l’expansion
des lymphocytes B [90] et des effets sur la prolifération et l’apoptose des
lymphocytes T [91-93]. Enfin, certaines études ont plutôt montré des effets des
20
IgIV en agissant sur la maturation ainsi que les fonctions des DC. Allant dans ce
sens, Bayry et al. ont montré que les IgIV avaient un pouvoir inhibiteur sur
l’expression des molécules de costimulation CD80, CD86 et CD40 et sur
l’expression de l’intégrine CD11c et du CMH II dans un modèle in vitro d’activation
des DC [94]. Ces mêmes auteurs ont également montré que les IgIV pouvaient
bloquer la maturation des DC et inhiber la sécrétion d’IL-12 par les DC lorsque
celles-ci étaient prétraitées aux IgIV [94].
1.4 Résultats antérieurs
Les travaux de l’équipe du Dre Renée Bazin ont permis de mettre en évidence un
nouveau mécanisme d’action des IgIV menant à l’inhibition des lymphocytes T
CD4 en agissant directement sur les CPA. Il a été démontré que l’inhibition de la
réponse CD4, observable dans des modèles in vivo et in vitro, est due à l’inhibition
de l’internalisation de l’antigène par un blocage des récepteurs Fc (fragment
cristallisable) à la surface des CPA [95] et à une compétition intracellulaire des IgIV
avec l’antigène pour la formation de complexes CMH II-peptides [96]. Dans cette
même voie, les travaux de Padet et al. ont permis de montrer que les IgIV
diminuaient l’expression du CMH II et de certaines molécules de cotimulation
(CD80, CD86 et ICOSL) en plus d’entrainer une augmentation de la molécule
inhibitrice PD-L1 sur des monocytes dans un contexte de réaction lymphocytaire
mixte [97, 98]. D’autres travaux effectués par l’équipe ont permis de démontrer un
effet inhibiteur des IgIV sur l’activation des lymphocytes T CD8 par les CPA [99].
Une diminution du pouvoir cytotoxique des lymphocytes T CD8 à la suite d’un
traitement aux IgIV a également été mise en évidence par la suite [100]. La figure
1.6, sélectionnée dans l’article de Trépanier et al. (2012) [99], montre l’effet
inhibiteur des IgIV sur l’activation des lymphocytes T cytotoxiques. En effet, suite à
un essai de présentation antigénique impliquant des DC et des lymphocytes T OT-
I, le marqueur d’activation précoce CD69 est absent sur les lymphocytes T non-
activés, présent sur 29% des lymphocytes T activés et quasi absent (1.8%) sur les
21
lymphocytes T activés en présence d’IgIV (10 mg/ml). La recherche du ou des
mécanisme(s) d’action responsable(s) de l’effet observé a été le point de départ de
mes travaux de maîtrise.
Figure 1.6 Inhibition de l’activation des lymphocytes T OT-I par les IgIV. L’expression du marqueur CD69 a été mesurée à la surface des Lymphocytes T OT-I CD8b+ par
cytométrie en flux suite à une incubation de 72 h avec des DC dans un ratio 1 :1 avec ou sans
ovalbumine (1 mg/ml) et ce, en présence ou en absence d’IgIV. La figure A représente la condition
sans ovalbumine, la figure B représente la condition avec ovalbumine et la figure C représente la
condition avec ovalbumine et IgIV. Figure tirée de Trépanier et Bazin, [99].
1.5 Problématique, hypothèse et objectifs
Alors que les mécanismes d’action des IgIV dans le traitement des maladies auto-
immunes n’ont pas encore été complètement élucidés, le nombre de maladies
traitées par celles-ci augmente annuellement et les doses thérapeutiques utilisées
sont souvent très élevées. Cependant, la quantité de dons de plasma desquels on
extrait les IgG ne connaît pas une croissance annuelle aussi élevée. Le
développement d’un substitut aux IgIV est donc très souhaitable et deviendrait
même essentiel dans le cas d’une éventuelle pénurie. Dans cette optique, l’équipe
du Dre Bazin tente donc de découvrir quels sont les mécanismes d’action de cette
22
avenue thérapeutique afin d’aider au développement d’un bio-équivalent. Dans un
monde idéal, celui-ci pourrait mimer l’action des IgIV et sa fabrication serait
indépendante des dons de plasma. Par ailleurs, toute avancée scientifique qui
permet de potentialiser le rendement thérapeutique des IgIV est bénéfique. Nous
avons émis l’hypothèse que les IgIV agissaient sur la réponse des lymphocytes T
CD8 en produisant un effet immunomodulateur sur les CPA, diminuant ainsi leur
capacité à activer les lymphocytes T CD8 et à générer des Tc. Pour étudier cette
hypothèse, nous avons défini les objectifs ci-dessous, lesquels ont été divisés en
deux volets distincts, chacun comportant des expériences réalisées à la fois avec
des cellules d’origine murine et humaine. Le premier volet comprend les objectifs
en lien avec un effet direct des IgIV sur les CPA (DC murines et monocytes
humains).
1. Évaluer l’effet des IgIV sur la maturation des cellules dendritiques.
2. Déterminer l’effet des IgIV sur l’internalisation des antigènes par les cellules
dendritiques.
3. Évaluer l’effet des IgIV sur la dégradation de l’antigène par les cellules
dendritiques.
4. Évaluer l’effet des IgIV sur l’expression de l’enzyme indoleamine 2,3-
dioxygenase par des monocytes.
5. Évaluer l’effet des IgIV sur l’expression de certains récepteurs NOD (NLRP6
et NLRP10) à la surface des monocytes.
Par contre, nous avons également abordé un second volet qui comprend un
objectif en lien avec un effet potentiel des IgIV sur les lymphocytes T CD8 qui
pourrait influencer la formation de la synapse immunologique et la réponse
cytotoxique.
6. Évaluer l’effet des IgIV sur la sélectine CD62L.
23
2. Matériel et Méthodes
Les sections concernant l’isolement et la culture des différentes cellules du
système immunitaire sont chacune divisée en deux parties, soit un volet
concernant la culture des cellules murines et un autre concernant la culture des
cellules humaines. Les détails concernant les anticorps et les protocoles utilisés
pour la cytométrie en flux sont détaillés dans la section 2.2.
2.1 Isolement des cellules
2.1.1 Cellules murines
2.1.1.1 Isolement des cellules de la moelle osseuse de souris C57BL/6
Afin d’extraire les cellules de la moelle osseuse de souris C57BL/6 (Charles River,
Montréal, Canada), les fémurs de 12 souris ont été récupérés et coupés aux
extrémités. Une fine aiguille a ensuite été fixée au bout d’une seringue contenant
du milieu RPMI-1640 supplémenté de 10% de sérum bovin fétal (FBS) (Invitrogen
Canada Inc., Burlington, Canada), 100 unités/ml de pénicilline et de streptomycine
(Sigma-Aldrich, Canada Ltd, Toronto, Canada). Le contenu de la seringue a été
injecté dans la lumière du fémur afin d’en extraire la moelle osseuse qui a été
recueilli dans le mélange décrit précédemment. La suspension obtenue a ensuite
été transférée dans un falcon 15 ml et une solution saline tamponnée au
phosphate (PBS) (Invitrogen Canada Inc.) contenant 2% de FBS et de l’EDTA
(1mM) a été ajoutée pour compléter le volume jusqu’à 14 ml. La suspension
cellulaire a été lavée (1000g, 6 minutes) et le culot récolté a été remis en
suspension dans 5 ml de tampon de lyse NKC (10 mM NAHCO3, 187 mM NH4Cl et
0.1 mM EDTA) afin de lyser les globules rouges présents dans le mélange. Les
cellules ont été lavées et remises en suspension dans 5 ml de PBS 2% FBS et
EDTA (1mM), filtrées (30 µm cell separation pre-filter, Miltenyi Biotecs, Cambridge,
MA) et lavées une dernière fois. Elles ont finalement été dénombrées
24
manuellement à l’aide d’un hématimètre. Les cellules extraites de la moelle
osseuse des 12 souris ont été mélangées ensemble avant d’être remises en
suspension dans du milieu de congélation (milieu IMDM contenant 40% de FBS et
10% de diméthylsulfoxide (Sigma)) et congelées dans l’azote liquide pour une
utilisation ultérieure.
2.1.1.2 Purification des lymphocytes T CD8 de souris transgéniques OT-1
Les lymphocytes T CD8 ont été isolés des cellules de la rate de souris
transgéniques C57BL/6 -Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-I) achetées chez The
Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Suite au sacrifice de 12 souris, les rates ont
été prélevées stérilement, perfusées avec une solution de collagénase 100U/mL
(Sigma) puis incubées 30 minutes dans une solution de collagénase 400U/mL
(Sigma). Les rates ont été écrasées puis la suspension cellulaire a été filtrée et
centrifugée (6 minutes, 200g et 4°C). Le culot a ensuite été remis en suspension et
les lymphocytes T CD8 ont été extraits de la suspension cellulaire via une
sélection négative (EasySep Negative Selection Monocyte Enrichment Kit,
StemCell Technologies, Vancouver, Canada) selon les instructions du
manufacturier. Les cellules purifiées provenant des 12 souris ont été mélangées
ensemble avant d’être remises en suspension dans du milieu de congélation
(IMDM contenant 40% de FBS et 10% de diméthylsulfoxide (Sigma)) et congelées
dans l’azote liquide pour une utilisation ultérieure. La pureté et la viabilité ont été
évaluées par cytométrie en flux (Partec North America Inc., Swedesboro, NJ) à
l’aide d’un anti-CD8b couplé à un fluorochrome (phycoerythrine(PE))
(eBiosciences, Mississauga, Canada) et de Sytox Blue à une concentration finale
de 1/2000 (Invitrogen).
2.1.2 Cellules humaines
2.1.2.1 Isolement des cellules mononuclées du sang
25
Chaque donneur ayant participé à l’étude a d’abord lu et signé un formulaire de
consentement éclairé. Les chambres de leucoréduction (LRS) ont été utilisées
comme source de cellules mononuclées du sang (PBMC) [101]. Le sang extrait
des chambres LRS a d’abord été dilué (1:1) dans du PBS supplémenté de 10
mmol par litre (l) de glucose (Sigma) (PBS-glucose). La suspension cellulaire a
ensuite été déposée sur un coussin de Ficoll-Paque (GE Healthcare, Baie d’Urfé,
Canada) et centrifugée à 500g pendant 30 minutes sans les freins (AllegraTM X-12
Centrifuge, Beckman Coulter Canada Inc., Mississauga, Canada). À l’aide d’une
pipette stérile, la couche du dessus a été retirée (plasma et plaquettes) pour
permettre l’accès aux PBMC situées à l’interface Ficoll/plasma. Les PBMC
récoltées ont été lavées trois fois dans du PBS-glucose contenant 10% (v/v)
d’anticoagulant citrate-dextrose (Baxter Healthcare Inc., Mississauga, Canada)
jusqu’à l’obtention d’un surnageant clair, signe de l’élimination des plaquettes. Les
PBMC ont été comptées en présence d’acide acétique 3% (permet l’éclatement
des globules rouges pouvant contaminer la suspension cellulaire), centrifugées 10
minutes à 1000g et congelées dans un milieu composé d’IMDM contenant 40% de
FBS et 10% de diméthylsulfoxide (Sigma). Les cellules ont été conservées dans
l’azote liquide jusqu’à leur utilisation.
2.1.2.2 Isolement des monocytes à partir de PBMC
Les monocytes ont été isolés à partir des PBMC via une sélection négative
(EasySep Negative Selection Monocyte Enrichment Kit, StemCell Technologies)
selon les instructions du manufacturier. La pureté et la viabilité des cellules
récoltées ont été vérifiées par cytométrie en flux avec un anticorps anti-CD14
couplé à un fluorochrome (allophycocyanine, CPA) (eBiosciences) et le colorant
Sytox Blue (dilution 1/2000).
26
2.2 Culture cellulaire
2.2.1 Cellules murines
2.2.1.1 Différenciation des cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 en
cellules dendritiques
Les cellules extraites de la moelle osseuse des fémurs ont d’abord été remises en
suspension dans du milieu de culture composé de RPMI 1640 (Life technologies
Inc., Invitrogen Canada Inc.) supplémenté de 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 1X
penicillin-streptomycin, 1 mM sodium pyruvate (Sigma) à une concentration finale
de 5 x 105 cellules/ml dans des plaques à 6 puits (Corning, Fisher Scientific
Company, Ottawa, Canada) et dans un volume final de 2 ml par puits. Une
cytokine nommée GM-CSF (granulocyte/macrophage colony stimulating factor,
PeproTech inc., Rocky Hill, NJ) a été ajoutée aux cellules à une concentration
finale de 20 ng/ml afin de stimuler la différenciation des cellules souches
hématopoïétiques en cellules dendritiques. Les cellules ont été incubées pendant
48 h à 37 °C dans une atmosphère humide contenant 5% de CO2 (Sanyo
Scientific, San Diego, CA). Au terme de 48 h, du milieu frais contenant du GM-CSF
(20 ng/ml) a été ajouté pour atteindre un volume de 4 ml par puits. Les cellules
légèrement adhérentes ont été récoltées 72 h plus tard et remises dans du milieu
frais contenant du GM-CSF (20 ng/ml) pour 48 h supplémentaires. Seules les
cellules légèrement adhérées aux parois des plaques de plastique ont été
sélectionnées et les cellules fortement adhérées ont été rejetées. L’analyse de
l’expression du marqueur CD11c-PE (Miltenyi Biotecs) en cytométrie en flux a
permis de mesurer la proportion de cellules de la moelle osseuse qui s’est
différenciée en DC matures [102]. Les cellules CD11c+ ont également été
marquées avec d’autres marqueurs caractéristiques de CPA, soit avec un anti-
CMH I CPA, un anti-CMH II CPA et un anti-DEC-205 PE-Cy7 (eBiosciences, San
Diego, CA).
27
2.2.1.2 Caractérisation de la maturation des cellules dendritiques
Environ 1 x 106 cellules ont été incubées pendant 24 h dans des plaques à 6 puits
dans le milieu de culture décrit précédemment et ce, avec ou sans LPS à une
concentration finale de 1 µg/ml (sérotype 0111:B4, Sigma). Des IgIV ont été
ajoutées dans certains puits à une concentration finale de 15 mg/ml. Les IVIg
(Gamunex, 10%), obtenues de Talecris Biotherapeutics Ltd. (Mississauga,
Canada), ont été dialysées dans du milieu RPMI, stérilisées par filtration et
conservées à -20°C jusqu’à leur utilisation. L’expression du marqueur CD11c-PE
(Miltenyi Biotecs) en cytométrie en flux a d’abord été mesurée. Les cellules
CD11c+ ont ensuite été marquées avec d’autres marqueurs caractéristiques de
CPA, soit avec un anti-CMH I CPA, un anti-CMH II CPA et un anti-DEC-205 PE-
Cy7 (eBiosciences, San Diego, CA).
2.2.1.3 Essais de présentation antigénique in vitro
Les essais de présentation antigénique ont été effectués dans des tubes stériles
de 5 ml en polystyrène (BD Biosciences). L’ovalbumine (Fisher Scientific
Company), utilisée à titre d’antigène, a été préalablement dissoute dans du PBS
stérile et la concentration d’endotoxines dans la préparation a été dosée avec un
appareil provenant des laboratoires Charles River (Endosafe-PTS Portable LAL
Test System, détails section 2.7). Lorsque nécessaire, de l’ovalbumine exempte
d’endotoxines (Hyglos GmbH, Am Neuland, Allemagne) a été utilisée. Les DC
(activées par l’ovalbumine 1 mg/ml ou non-activées) ont été incubées avec ou
sans IgIV pendant 24 h (concentration finale de 15 mg/ml). Les DC ont ensuite été
lavées extensivement dans du milieu de culture stérile préalablement chauffé et
ont ensuite été incubées à nouveau pendant 24 ou 48 h avec un mélange
contenant les lymphocytes T OT-I purifiés. Après 24 h, l’activation des lymphocytes
T OT-I CD8b+ (PE, eBiosciences) a été mesurée par cytométrie en flux à l’aide
d’un anti-CD69 CPA acheté chez BD Biosciences. Après 48 h, la prolifération a été
28
mesurée par cytométrie en flux à l’aide du Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell
Labelling (eBioscience).
2.2.1.4 Effet des IgIV sur la dégradation de l’antigène par les cellules dendritiques
Les DC ont été incubées pendant 24 h à 37°C et 5% de CO2 avec le peptide
SIINFEKL (American Peptide Company, Sunnyvale, CA) (0,1 µM) et ce, avec ou
sans IgIV (15 mg/ml). Les DC ont ensuite été ajoutées aux lymphocytes T OT-I et
l’activation de ces derniers a été mesurée par cytométrie en flux (expression du
CD69) tel que décrit dans la section précédente.
2.2.2 Cellules humaines
2.2.2.1 Culture et analyse des monocytes
Les monocytes CD14+ ont été mis en culture à une concentration finale de 1X106
cellules/ml dans des plaques à 6 puits (Fisher Scientific). Ils ont ensuite été
incubés 3 h à 37°C et 5% CO2 afin de permettre leur adhésion au plastique. La
moitié des puits ont été supplémentés de LPS sérotype 0111:B4 (Sigma) et
l’incubation s’est poursuivie pendant 4h. Le surnageant a ensuite été retiré de
chacun des puits, ne laissant ainsi que les monocytes fortement adhérés dans les
plaques. Du milieu frais contenant ou non des IgIV ou de l’albumine de sérum
humain (HSA) (Talecris Biotherapeutics Ltd) à une concentration finale de 15
mg/ml a été ajouté suite au lavage intensif des puits avec du PBS stérile
préalablement chauffé. Les cellules ont finalement été incubées pendant 24, 48, 72
ou 96 h à 37°C et 5% CO2. Au terme des différents temps d’incubation, le
surnageant a été récolté et conservé à -20°C pour l’analyse des facteurs solubles
à l’aide d’un test ELISA et les monocytes adhérés ont été lavés avec du PBS. Du
tampon de lyse RIPA (Tris-Cl 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1mM, NaDe 0,05%,
SDS 0,1%, Triton X-100 1%, glycérol 10%) et des inhibiteurs de protéase et de
phosphatase (Fisher Scientific) ont été ajoutés à la moitié des cellules de la culture
29
et les suspensions ont été conservées à -20°C suite à une incubation d’au moins
20 minutes à 4°C dans le tampon de lyse. La seconde moitié des cellules a été
incubée à 37°C pendant 10 minutes dans une solution (TrypLE™ Express
recombinant enzyme, Life Technologies Inc.) et l’expression intracellulaire de
NLRP6, NLRP10 et de IDO a ensuite été analysée par cytométrie en flux. Les
détails concernant les anticorps et les stratégies d’analyse sont décrits dans la
section 2.3.2.
2.3 Cytométrie en flux
Toutes les données obtenues sur le cytomètre Partec Cyflow ML ont été acquises
avec le logiciel FloMax 3.0 et ré-analysées à l’aide du logiciel FCS express 4 (De
novo software, Los Angeles, CA).
2.3.1 Cibles extracellulaires
2.3.1.1 Viabilité et anticorps
Les analyses de cibles extracellulaires ont été faites sur les cellules vivantes. Le
colorant Sytox Blue a été utilisé à une dilution finale de 1/2000 et les cellules
mortes ont été exclues lors de l’analyse. Les détails concernant les anticorps
utilisés dans le présent travail sont résumés dans le tableau 2.1. Les combinaisons
d’anticorps (maximum de deux anticorps par tube) utilisées lors des expériences
sont écrites dans les sections concernant chaque protocole.
Tableau 2.1: Détails des anticorps (cibles extracellulaires) utilisés pour la cytométrie en flux.
Anticorps Hôte Isotype Cible Fluorochrome Compagnie Anti-CD8b Rat IgG2b Murin PE eBiosciences Anti-CD11c Hamster IgG Murin PE Miltenyi
30
Biotecs Anti-CMH I Murin IgG2a Murin CPA eBiosciences
Anti-DEC-205
Rat IgG2a Murin PE-Cy7 eBiosciences
Anti-CD69 Hamster IgG1 Murin CPA BD Biosciences
Anti-CD62L Rat IgG2a Murin PCP-Cy5.5 eBiosciences Anti-CD14 Mouse IgG1 Humain CPA eBiosciences
Anti-CD62L Mouse IgG1 Humain FITC eBiosciences Anti-CD8 Mouse IgG1 Humain APC-H7 eBiosciences
2.3.1.2 Préparation des cellules pour les analyses en cytométrie
Suite à l’incubation, les cellules destinées à être analysées par cytométrie (environ
100 000 cellules par tube) ont été lavées trois fois dans du PBS 1% FBS (1000g, 5
minutes) et incubées pendant 10 minutes à 4°C en présence de 2% d’anticorps
monoclonal 2.4 G2 afin de bloquer les récepteurs Fc murins. Les cellules ont
ensuite été lavées à nouveau et incubées avec des anticorps déjà couplés à des
fluorochromes pendant 30 minutes à 4°C à la noirceur selon les recommandations
des manufacturiers. Les cellules ont été lavées et remises en suspension dans du
PBS 1% FBS contenant du Sytox Blue (1/2000) et analysées immédiatement au
cytomètre.
2.3.1.3 Stratégies d’analyse
Le cytomètre a d’abord été ajusté en utilisant des cellules non-colorées ou
colorées avec un seul anticorps et positives pour cet anticorps afin de déterminer
les gains à utiliser pour l’analyse des échantillons. Avant de débuter les
acquisitions, afin d’éliminer la plupart des débris cellulaires, une première région a
été établie en fonction de la taille et de la granularité en utilisant un tube qui
contenait des cellules non-colorées seulement. L’appareil a été ajusté afin qu’il
fasse l’acquisition d’environ 30 000 évènements par tube dans cette région. Le
31
logiciel d’analyse a été utilisé pour établir une seconde région ne contenant que les
cellules non-colorées par le marqueur de viabilité. Pour l’analyse des cibles
extracellulaires, l’emplacement des quadrants délimitant les cellules positives et
les cellules négatives pour chaque marqueur a été établi selon deux stratégies
différentes. Lorsqu’un seul anticorps était utilisé, des cellules non-colorées ont été
utilisées pour établir les limites. Lorsque deux anticorps étaient utilisés, des
cellules contenant l’anticorps non-analysé seulement ont été utilisées pour établir
les limites. Ces contrôles ont permis d’éliminer des biais qui peuvent survenir en
raison de l’auto-fluorescence des cellules ou par l’émission non-spécifique de
fluorescence dans un canal du fluorochrome voisin. Sur le logiciel FCS Express 4,
les analyses ont été effectuées sur des populations variant entre 5000 et 30 000
évènements.
2.3.2 Cibles intracellulaires
2.3.2.1 Anticorps
Trois anticorps intracellulaires ont été utilisés. Ceux-ci ont tous été générés chez le
lapin et étaient non-couplés à des fluorochromes. L’anticorps anti-IDO a été acheté
chez Cell Signaling Technology (Danvers, MA) et les anticorps anti-NLRP6 et anti-
NLRP10 ont été acheté chez Sigma. L’anticorps de détection utilisé a été généré
chez la chèvre, était dirigé contre les IgG du lapin et était couplé à l’Alexa Fluor
488 (Life Technologies).
2.3.2.2 Préparation des cellules pour les analyses en cytométrie
Les cellules destinées à être analysées en cytométrie (environ 300 000 cellules par
tube) ont été lavées trois fois dans du PBS 1% FBS (1000g, 5 minutes) et
incubées pendant 10 minutes à 4°C en présence de 2% d’un agent bloquant les
récepteurs Fc humains (FcR Bock, Miltenyi Biotec). Les cellules ont ensuite été
32
lavées et incubées 30 minutes à 4°C dans du PBS 0,05% saponine (Sigma)
contenant un seul anticorps par tube parmi les trois énumérés. Les cellules ont
ensuite été lavées et incubées à nouveau 30 minutes à 4°C dans du PBS 0,05%
saponine avec l’anticorps de détection. Toutes les cellules ont subi un dernier
lavage et ont été remises en suspension dans du PBS et analysées par cytométrie
en flux.
2.3.2.3 Stratégies d’analyse
Comme mentionné précédemment, le cytomètre a d’abord été ajusté avant de
débuter les acquisitions. Afin d’éliminer la plupart des débris cellulaires, une
première région a été établie en fonction de la taille et de la granularité en utilisant
un tube qui contenait des cellules non-colorées seulement. L’appareil a été ajusté
afin qu’il fasse l’acquisition d’environ 30 000 évènements par tube dans cette
région. Afin d’établir les limites des quadrants séparant les cellules positives des
cellules négatives lors de l’analyse avec le logiciel FCS Express 4 et afin de vérifier
que les anticorps conjugués à l’Alexa 488 ne donnaient pas une réactivité non-
spécifique, des cellules marquées avec l’anticorps de détection seulement ont été
utilisées. Sur le logiciel FCS Express 4, les analyses ont été effectuées sur des
populations variant entre 10 000 et 30 000 évènements.
2.3.3 Mesure de la prolifération des lymphocytes T OT-I
Les lymphocytes T OT-I ont été marqués au début de certains essais à l’aide du
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 Cell Labelling (eBioscience) afin de mesurer la
prolifération de ceux-ci. Les lymphocytes T OT-I ont été lavés deux fois dans du
PBS et ont ensuite été remis en suspension dans du PBS à une concentration
finale deux fois plus élevée que celle utilisée dans les essais. Le marqueur de
prolifération a ensuite été dilué à une concentration de 20 µM dans du PBS et le
mélange a été ajouté aux cellules T (ratio 1:1) et incubé pendant 10 minutes à
37°C à la noirceur. La réaction a été arrêtée en transférant le tube sur glace
33
pendant 5 minutes et, suite à deux lavage dans du PBS (1000g et 5 minutes) les
cellules ont été utilisées dans les essais selon le protocole décrit à la section
2.2.1.3. La fluorescence émise par le marqueur de prolifération était maximale au
début de l’expérience et a été mesurée par cytométrie en flux.
2.3.4 Évaluation d’un possible blocage des marqueurs de surface par les IgIV
Lorsque nécessaire, la possibilité d’un blocage des sites de liaison des anticorps
utilisés par les IgIV a été vérifiée. Les cellules ont été incubées pendant 30
minutes sur glace avec ou sans IgIV (15 mg/ml) et l’expression des marqueurs de
surface a ensuite été analysée en cytométrie en flux.
2.4 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
2.4.1 Transcriptase inverse
Au terme des cultures, certaines cellules ont été sélectionnées pour l’analyse
quantitative de l’ARN messager (ARNm) de deux protéines, soit la L-sélectine par
les lymphocytes T CD8 et le récepteur DEC-205 par les DC murines. Une trousse
complète de mirVana (miRNA isolation kit, Life Technologies) a été utilisée pour
l’extraction des ARN totaux. Les cellules ont d’abord été remises en suspension
dans du Lysis Binding Buffer (Life Technologies), agitées vigoureusement au
vortex et l’ARN a été isolée par une extraction phénol-chloroforme en conditions
acides. Les ARNm totaux ont ensuite été dosées par spectrophométrie (NanoDrop
ND-1000, Thermo Scientific,) et 250 ng d’ARN total par échantillon ont été
linéarisés par un chauffage à 65°C pendant 10 minutes et ont ensuite été incubés
à 37°C pendant 60 minutes avec le mélange de réactifs suivant : 0.5 mM dNTP
(Amersham, GE Healthcare, Baie d’Urfe, Canada), des amorces universelles
(oligosDT, 0.25 µg/ml) (Amersham), 200U RT-MMLV (Invitrogen) et du tampon 1X
(Invitrogen) afin de convertir les ARNm en ADN complémentaire (ADNc).
34
2.4.2 PCR en temps réel
L’ADNc a été ajouté à un mélange réactionnel comprenant du SybrGreen 1X
(Qiagen Inc.,Mississauga, Canada), des amorces sens et anti-sens (20 µM) et de
l’eau sans nucléase (Sigma) pour compléter à un volume final de 25 µL par tube.
Le gène de contrôle utilisé était la GAPDH. Les niveaux d’expression ont été
calculées à l’aide de la méthode comparative ΔΔCt [103]. Les amorces utilisées et
leur orientation (sens (S) ou anti-sens (AS)) sont détaillées dans le tableau 2.1.
Les amorces utilisées pour cibler les amplicons codant pour la GAPDH humain et
murin ont été commandées de façon manuelle chez IDT à partir de séquences
trouvées dans la littérature. Les amorces utilisées pour cibler les amplicons codant
pour CD62L humain et murin ont été commandées respectivement chez Fisher et
IDT. Dans les deux cas, les séquences des amorces étaient fournies par les
fabricants.
Tableau 2.2: Détails des amorces utilisées pour les expériences de PCR en temps réel.
Cible Sens Séquence 5’ --- 3’
Taille amplicon
(pb)
Fabricant
CD62L S - - Fisher (humain) AS - - Fisher GAPDH S TGGTGAAGACGCCAGTGGA 138 IDT
(humain)[104] AS GCACCGTCAAGGCTGAGAAC 138 IDT CD62L S CCATCCTTTCTTGAGATTTCTTGC - IDT (murin) AS CTTCATTCCTGTAGCCGTCAT - IDT GAPDH S TGTCTCCTGCGACTTCAACAGC 300 IDT
(murin)[105] AS TGTAGGCCATGAGGTCCACCAC 300 IDT
L’expression de CD62L et de la GAPDH a été quantifiée avec un thermocycleur
Stratagene 3005p (Agilent technologies, Mississauga, Canada). Les détails des
cycles utilisés sont décrits dans le tableau 2.2.
35
Tableau 2.3: Détails des cycles d’amplification effectués lors des expériences de PCR en temps réel.
Temps Température Activation initiale 15 minutes 95°C
30 s 95°C Cycle en 3 étapes 30 s 60°C
(40 cycles) 60 s 70°C
2.5 Dosage de facteurs solubles par ELISA
Afin de doser l’expression des cytokines TGF-β et TNF-α, des plateaux Immulon
96 puits (Dynatech Laboratories) ont été remplis avec 50 µL/puits de tampon
carbonate (NaN3 0,02%, NaHCO3 7,1 g/l et Na2CO3 3,28 g/l) (Sigma) contenant un
anticorps anti-TGF-β ou un anti-TNF-α (Peprotech) à une concentration finale de 1
µg/ml. Les plaques ont été incubées toute la nuit à 4°C et lavées six fois dans une
solution de lavage PBS-Tween (Tampon PO4 1M, NaCl 8,5 g/l et Tween20-10%
5ml/l) le lendemain avant l’ajout de la solution de blocage (PBS contenant 1%
d’albumine de sérum bovin (BSA) (Fisher Scientific) filtré 0.22µm) pour une heure
à température de la pièce (TP). Les plateaux ont ensuite été lavés et les
échantillons à tester ont été ajoutés dans les puits contenant les anticorps. Les
plateaux ont ensuite été incubés à nouveau pendant 2 h à TP. Suite à une autre
série de six lavages, un premier anticorps de détection biotinylé (Peprotech) a été
ajouté à une concentration prédéfinie par le fabricant (Peprotech) et les plateaux
ont été incubés pendant 2 heures à TP. Les plateaux ont ensuite été lavés et un
second anticorps (streptavidine) dirigé contre la biotine et couplé à la HRP
(Peprotech) a été ajouté pour 2 h à TP à une concentration prédéfinie par le
fabricant. Enfin, les plateaux ont été lavés et du 3,3',5,5’-tetramethylbenzidine
(TMB) (MP Biomedicals, Montréal, Canada) a été ajouté à raison de 50 µL par
puits suivi d’une incubation de 15 minutes à l’abri de la lumière. La réaction a été
36
arrêtée par l’ajout de 50 µL de H2SO4 (1N) (Fisher Scientific) et l’analyse a été
effectuée à l’aide du lecteur de plaques ELISA (SpectraMax Plus384 Absorbance
Microplate Reader, Molecular Devices, Sunnyvale, CA).
2.6 Immunobuvardage de type western
2.6.1 Électrophorèse SDS-PAGE
Les lysats cellulaires pour analyses en immunobuvardage ont été dosés par la
méthode de Bradford (réactif de Bradford, Bio-Rad, Mississauga, Canada) afin
d’approximer leur concentration en protéines totales. Une fois la concentration des
échantillons connue, ceux-ci ont été déposés sur gel de polyacrylamide 10% [106]
à raison de 20 µg de protéines par puits et ont migré dans du tampon
d’électrophorèse (Tris 15 g/l, glycine 72 g/let SDS 5 g/l) pendant 2 h sous
l’influence d’un courant de 130 volts (Bio-Rad).
2.6.2 Transfert de protéines
Suite à leur séparation, les protéines sont transférées depuis le gel sur une
membrane de polyvinylidene fluoride (PVDF) (Millipore, Billerica, MA)
préalablement trempée dans le méthanol 100% pendant 15 secondes. . Les
protéines sont transférées depuis le gel vers la membrane pendant 1 h à 4°C et
sous un courant de 100 volts dans une solution contenant du Tris 25mM, de la
glycine 192 mM et du méthanol 10% à l’aide d’un appareil Transblot (Bio-Rad). Le
transfert des protéines à la membrane a été vérifié par l’application de Rouge
Ponceau pendant 5 minutes à TP. Les protéines chargées ont migré depuis le gel
vers la membrane pendant 1 h à 4°C et 100 volts dans une solution contenant du
Tris 25mM, de la glycine 192 mM et du méthanol 10% à l’aide d’un appareil
Transblot (Bio-Rad) tout en conservant l'organisation relative qu'elles avaient dans
37
le gel. La fixation des protéines à la membrane a été vérifiée par l’application de
Rouge Ponceau pendant 5 minutes à TP.
2.6.3 Détection
Le blocage des sites d'interaction non spécifique entre la membrane et les
anticorps a été réalisé en plongeant la membrane dans une solution de tampon
salin-Tris (Tris 10 mM, NaCl 100 mM) supplémenté de Tween-20 0,1%) (TTBS)
contenant 5% d’albumine de sérum bovin pendant une heure à TP sous agitation.
L’anticorps anti-IDO humain a été généré chez le lapin et acheté chez Cell
Signaling Technology. Après le blocage, la membrane a été incubée sous agitation
dans une solution contenant l'anticorps primaire dilué (1/5000) dans du TTBS 1%
BSA toute la nuit à 4°C. Après rinçage de la membrane, celle-ci a été exposée à
un anticorps dilué dans du TTBS 1% BSA (1/10 000) généré chez la chèvre et
dirigé contre une portion espèce-spécifique de l'anticorps primaire (anti-IgG du
lapin, Life Technologies) et couplé à la biotine. L'anticorps secondaire
(streptavidine) étant couplé à la HRP, l'identification visuelle de la protéine étudiée
sur la membrane a été possible suite à l’ajout d’une solution cheminluminescente
ECL (GE Healthcare).
2.7 Évaluation de l’activité enzymatique de l’enzyme IDO
L’activité enzymatique de l’enzyme a été déterminée en mesurant la quantité de
Trp et de kynurénine retrouvée dans les surnageants de culture par
chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC, INAF, Université
Laval). Brièvement, le Trp a été détecté par son émission de fluorescence naturelle
à 366 nm suite à une excitation à 286 nm. Le 3-Nitro-L-tyrosine, utilisé comme
standard interne, ainsi que la kynurénine ont été dosés par spectroscopie
ultraviolet-visible. Un mélange composé de Trp (50 µM) et de kynurénine (10 µM)
(tous deux provenant de Sigma-Aldrich) et de sérum à base d’albumine a été
38
utilisé comme standard externe. Les concentrations de l’acide aminé et de son
métabolite ont été mesurées par HPLC suivant leur précipitation à l’acide
trichloroacétique (ajout de 25 µL d’une solution à 2 M) en comparant les pics
obtenus dans le chromatogramme.
2.8 Dosage des endotoxines présentes dans l’ovalbumine
Les endotoxines ont été dosées avec un appareil spécialement conçu à cet effet
par les laboratoires Charles River (Endosafe-PTS Portable LAL Test System). Ce
dernier utilise la technologie LAL chromogénique pour relier directement une
densité optique à une concentration d’endotoxines dans l’échantillon testé. Chaque
plaquette utilisé contient un réactif LAL, un substrat chromogénique et un standard
qui sert de contrôle. Toutes les plaquettes sont certifiées et sont prêtes à utiliser
dès la réception. Avant de déposer 25 µL d’échantillon sur la plaquette et de
l’insérer dans l’appareil pour l’analyse, celui-ci est dilué dans du β-bloquant et de
l’eau certifiée sans endotoxine fourni par le fabricant. Les embouts stériles utilisés
doivent être autoclavés et ne contenir aucune trace d’endotoxines (<0.1 EU/ml).
L’appareil mélange les échantillons aux réactifs contenus dans les plaquettes et
mesure ensuite la densité optique. Celle-ci est transférée dans un logiciel Excel et
ajoutée à l’équation d’une courbe standard pour finalement arriver à un résultat se
situant entre 0,1 et 1000 EU/ml.
39
3. Résultats
3.1 Caractérisation des cellules dendritiques
3.1.1 Différenciation des cellules de moelle osseuse murines en cellules
dendritiques
Des cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 ont été extraites des fémurs
d’un groupe de douze souris, mélangées ensemble et congelées jusqu’à
l’application des différents protocoles. Pour le protocole de différenciation, environ
5 x 105 cellules ont été mises en culture pendant sept jours avec du GM-CSF (20
ng/ml) tel que décrit précédemment (section 2.2.1.1). Afin de valider le protocole
de différenciation, l’expression de certains marqueurs par les cellules a été
mesurée par cytométrie en flux au terme de la culture. Les cellules totales ont
d’abord été sélectionnées selon leur taille et leur granularité (voir figure 3.1 A) afin
d’en extraire les débris cellulaires. La viabilité a ensuite été déterminée grâce à un
marqueur fluorescent (Sytox Blue) qui pénètre les cellules mortes seulement et lie
les acides nucléiques à l’intérieur du noyau de celles-ci. Une émission de
fluorescence autour de 470 nm indique que les cellules ne sont pas viables et elles
sont alors exclues des analyses (voir figure 3.1 B). Les cellules résiduelles ont été
analysées selon leur expression du marqueur de DC matures chez les cellules
murines CD11c [102, 107], mais également selon leur expression des marqueurs
CMH I et DEC-205. La figure 3.1 C montre un résultat représentatif des marqueurs
exprimés par les cellules totales vivantes au terme d’un protocole de
différenciation.
40
Figure 3.1 : Stratégie de caractérisation des cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 au terme du protocole de différenciation en cellules
dendritiques par cytométrie en flux.
Des cellules de moelle osseuse extraites des fémurs d’un groupe de douze souris C57BL/6 ont été
différenciées avec ajout de GM-CSF (20 ng/ml) tel que décrit dans la section 2.2.1.1. Environ 5 x
105 cellules ont été incubées dans un volume final de 2 ml. (A) Sélection des cellules totales selon
leur taille et leur granularité. (B) Sélection des cellules totales vivantes. (C) Expression des
marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205 sur les cellules totales vivantes sélectionnées selon (A) et
(B).
Les données compilées, tel qu’illustré dans la figure 3.2 A, indiquent que, en
moyenne, environ 60% des cellules totales expriment CD11c au terme de la
41
culture alors que 42% et 25% des cellules expriment les marqueurs CMH I et DEC-
205. Les cellules CD11c+, considérées dans le cadre de ce projet comme étant
des DC matures [102], expriment quant à elles plus fortement les marqueurs CMH
I et DEC-205, soit dans respectivement 59% et 34% des cas (figure 3.2 B).
Figure 3.2 : Pourcentage d’expression des marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205 par les cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 au terme du protocole de
différenciation.
Des cellules de moelle osseuse extraites des fémurs d’un groupe de douze souris C57BL/6 ont été
différenciées avec ajout de GM-CSF (20 ng/ml) tel que décrit dans la section 2.2.1.1. Environ 5 x
42
105 cellules ont été incubées dans un volume final de 2 ml. (A) Compilation du pourcentage de
cellules totales vivantes qui expriment les marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205. (B) Compilation
du pourcentage de cellules totales vivantes CD11c+ qui expriment les marqueurs CMH I et DEC-
205. Les résultats ont été compilés à la suite de neuf cultures indépendantes pour l’analyse des
marqueurs CD11c et CMH I et de trois cultures indépendantes pour l’analyse du marqueur DEC-
205.
3.1.2 Activation des cellules dendritiques
Comme mentionné précédemment, les DC réagissent à certains stimuli, tel que du
LPS, et modifient leurs caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles. Afin de
mesurer l’impact des IgIV sur l’activation des DC, les variations dans l’expression
de certains marqueurs (CMH I et DEC-205) ont d’abord été mesurées suite à une
stimulation. Environ 1 x 106 cellules totales différentiées à partir de la moelle
osseuse extraite des fémurs d’un groupe de 12 souris ont été mises en culture
avec ou sans LPS (1 µg/ml) pendant 24 h afin d’induire leur activation. Leur
phénotype a ensuite été caractérisé par cytométrie en flux selon la stratégie décrite
à la figure 3.1. Tel qu’illustré à la figure 3.3 A, une fois les cellules stimulées, le
pourcentage des cellules vivantes totales qui expriment CD11c, CMH I et DEC-205
est respectivement de 61%, 58% et 31%. Tel qu’illustré à la figure 3.3 B, le
pourcentage de cellules vivantes CD11c+ qui expriment les molécules de surface
CMH I et DEC-205 augmente respectivement de 20% et de 13% pour atteindre
79% et 47%.
43
Figure 3.3 : Pourcentage d’expression des marqueurs CD11c, CMH I et DEC-205
par les cellules de moelle osseuse de souris C57BL/6 suite au protocole de différenciation et à une stimulation avec LPS.
Les cellules de moelle osseuse extraites des fémurs d’un groupe de douze souris C57BL/6 ont été
différenciées avec ajout de GM-CSF (20 ng/ml) tel que décrit dans la section 2.2.1.1. Environ 1 x
106 cellules ayant subi le protocole de différenciation ont été incubées pendant 24 h avec des LPS
(1 μg/ml). (A) Compilation du pourcentage de cellules totales vivantes qui expriment les marqueurs
CD11c, CMH I et DEC-205 suite à l’activation avec LPS. (B) Compilation du pourcentage de
cellules totales vivantes CD11c+ qui expriment les marqueurs CMH I et DEC-205 suite à l’activation
aux LPS. Les résultats ont été compilés à la suite de neuf cultures indépendantes pour l’analyse
des marqueurs CD11c et CMH I et de trois cultures indépendantes pour l’analyse du marqueur
DEC-205.
44
3.2.3 Effet des IgIV sur l’expression du complexe majeur d’histocompatibilité I
Afin de déterminer si l’effet des IgIV sur l’inhibition de l’activation des lymphocytes
T OT-I était la conséquence d’un impact sur l’activation des DC et sur leur capacité
à présenter efficacement un antigène, l’activation de celles-ci a été comparée dans
des conditions avec ou sans IgIV et l’expression du marqueur CMH I a été
analysée. Les DC ont été incubées avec ou sans ovalbumine et avec ou sans IgIV
pendant 24 h à 37°C. Il est à noter que la plupart des préparations commerciales
d’ovalbumine, incluant celle utilisée, contiennent des concentrations non-
négligeables d’endotoxines (≥850 EU/ml) qui stimulent les DC de façon
équivalente au LPS. Les cellules ont ensuite été caractérisées par cytométrie en
flux. Comme mentionné précédemment, les cellules ont d’abord été sélectionnées
selon leur taille et leur granularité afin d’exclure les débris cellulaires. Les cellules
mortes ont ensuite été exclues et des cellules non-colorées ont permis d’établir les
limites des quadrants délimitant les cellules positives et négatives pour le
marqueur CD11c. Les cellules CD11c+ ont ensuite été analysées quant à
l’intensité de fluorescence émise via l’anti-CMH I en utilisant des cellules colorées
avec l’anti-CD11c seulement pour établir les limites des quadrants. Tel que montré
dans la figure 3.4 A, la fluorescence émise via l’anti-CMH I est diminuée en
présence d’IgIV. La compilation des moyennes d’intensité de fluorescence
obtenues lors de six expériences indépendantes a permis de mettre en évidence
une diminution significative de la MFI pour l’anti-CMH I en présence d’IgIV
(diminution d’environ 20%). Cependant, avant de conclure que les IgIV pouvaient
diminuer l’expression du CMH I sur les DC activées, nous avons considéré la
possibilité que les IgIV pouvaient lier les endotoxines et inhiber les effets
activateurs que celles-ci ont normalement sur les DC [108]. Les DC ont donc été
stimulées avec une préparation commerciale d’ovalbumine exempte d’endotoxines
(endo -) (≤0,1 EU/ml) afin d’éviter de confondre un effet direct des IgIV sur
l’expression du CMH I à une neutralisation des endotoxines. Avec de l’ovalbumine
endo-, les courbes correspondant à l’intensité de fluorescence de l’anti-CMH I suite
45
à une incubation des DC activées pendant 24 h à 37°C sont identiques avec ou
sans IgIV (figure 3.4 B). Cette expérience a été réalisée deux fois et des résultats
similaires ont été obtenus, c’est-à-dire une émission de fluorescence similaire via
l’anti-CMH I dans des conditions avec ou sans IgIV (voir les résultats pour les deux
expériences dans la figure 3.4 B). Afin de confirmer les résultats obtenus, des LPS
ont été ajoutés à l’ovalbumine endo- afin qu’elle atteigne une concentration en
endotoxines d’environ 1000 EU/ml et l’essai a été répété deux fois. Comme le
démontrent les résultats de la figure 3.4 C, l’ajout de LPS à l’ovalbumine endo-
permet aux IgIV de retrouver un effet inhibiteur apparent sur l’expression de CMH
I.
46
Figure 3.4 : Diminution de l’expression du CMH I en surface des cellules dendritiques en présence d’IgIV: neutralisation des endotoxines présentes dans
l’ovalbumine. Les DC ont été activées par une incubation de 24 h avec (A) de l’ovalbumine (1 mg/ml, 850 EU/ml)
avec ou sans IgIV (15 mg/ml), (B) de l’ovalbumine sans endotoxines (1 mg/ml, ≤0,1 EU/ml) avec ou
sans IgIV (15 mg/ml) ou (C) de ovalbumine sans endotoxines + LPS (1 mg/ml, 850 EU/ml) avec ou
sans IgIV (15 mg/ml). L’intensité de fluorescence émise via l’anti-CMH I a été déterminée sur les
cellules CD11c+ vivantes. Les résultats sont représentatifs de (A) six et (B) (C) deux expériences
indépendantes (cumul des données présenté à côté de chaque histogramme).
Ces résultats nous ont incité à vérifier si les IgIV conservaient un effet inhibiteur
sur l’activation des lymphocytes T OT-I même si de l’ovalbumine endo- était
utilisée pour activer les DC. Les DC ont donc été incubées pendant 24 h avec de
l’ovalbumine (1 mg/ml) contenant ou non des endotoxines (850 EU/ml). Les
cellules ont été lavées et ajoutées aux lymphocytes T OT-I (ratio 1 :1) pour une
incubation de 24 h à 37°C. L’expression du marqueur d’activation précoce CD69 a
été mesurée par cytométrie en flux. Les cellules ont d’abord été sélectionnées
selon leur taille et leur granularité. Des cellules non-colorées ont ensuite été
utilisées pour cibler les cellules positives pour l’expression du marqueur de
lymphocytes T CD8b. Les cellules CD8b+ ont ensuite été analysées quant à leur
intensité de fluorescence émise pour le marqueur CD69 en utilisant des cellules
colorées avec l’anti-CD8b seulement pour établir les quadrants délimitant les
cellules positives et négatives pour le marqueur CD69. Les résultats de la figure
3.5 montrent que la fluorescence émise par les cellules marquées avec l’anti-CD69
est diminuée d’environ 20% en présence d’IgIV lorsque l’ovalbumine utilisée est
certifiée endo-. Cette tendance a été observée lors de deux expériences
indépendantes. L’hypothèse d’une interférence entre les IgIV et les sites de liaison
de l’anti-CD69 a été évaluée. Pour ce faire, des cellules T OT-I ont été incubées
avec des DC préalablement activées avec de l’ovalbumine pendant 24 h à 37°C.
Environ trente minutes avant la lecture au cytomètre, des IgIV ont été ajoutées
dans un des tubes qui a ensuite été déposé sur glace avant d’effectuer le protocole
de coloration et d’analyse des cellules tel que décrit précédemment. Comme
illustré à la figure 3.5 B, le pourcentage de cellules positives pour l’expression de
47
CD69 et l’intensité de fluorescence sont hautement similaires dans des conditions
sans IgIV ou avec IgIV pendant 30 minutes sur glace, suggérant que les IgIV ne
lient pas les sites de liaison de l’anti-CD69 utilisé. Ainsi, bien que moins important
dans la condition avec de l’ovalbumine endo-, l’effet d’inhibition des IgIV sur
l’activation des lymphocytes T CD8 demeure considérable et l’investigation a donc
été poursuivie.
Figure 3.5 : Comparaison de l’inhibition de l’activation des lymphocytes T OT-I
par les IgIV avec une utilisation de l’ovalbumine non-exempte ou exempte d’endotoxines.
(A) Les DC ont été incubées pendant 24 h avec de l’ovalbumine (1 mg/ml) contenant ou non des
endotoxines (850 EU/ml). Les cellules ont été lavées et ajoutées aux lymphocytes T OT-I (ratio
1 :1) pour une incubation de 24 h à 37°C. L’expression du marqueur d’activation précoce CD69 a
été mesurée par cytométrie en flux sur les cellules T CD8b+. Les résultats sont représentatifs de
deux expériences indépendantes. (B) Intensité de fluorescence et pourcentage de cellules T OT-I
CD8b+ positives pour l’anti-CD69-CPA suite à une incubation avec ovalbumine (1 mg/ml) pendant
24 h sans IgIV ou avec IgIV pendant 30 minutes sur glace.
48
3.2.4 Effet des IgIV sur l’expression de l’intégrine CD11c : réel ou blocage ?
L’expression du marqueur CD11c par les DC dans des conditions avec ou sans
IgIV a ensuite été investiguée. Nous avons vérifié l’hypothèse d’une interférence
entre les IgIV et l’anti-CD11c pour la liaison à la surface des cellules (protocole
section 2.3.3). Les cellules totales ont été sélectionnées selon leur taille et leur
granularité et les cellules mortes ont été exclues des analyses grâce à l’utilisation
du marqueur de viabilité Sytox Blue. L’expression de CD11c sur les cellules
résiduelles a ensuite été analysée par cytométrie en flux en utilisant des cellules
non-colorées pour définir les quadrants nécessaires. L’expérience a été réalisée à
deux reprises. Les résultats (figure 3.6) montrent que les IgIV ont un effet inhibiteur
sur l’expression du marqueur CD11c (détectée via la fluorescence émise par l’anti-
CD11c par cytométrie en flux) par les DC suite à une incubation de 30 minutes sur
glace. En effet, dans les deux expériences, il est possible d’observer que plus de
10% des cellules cessent d’émettre de la fluorescence via l’anti-CD11c lorsque
celles-ci sont traitées aux IgIV et que la MFI diminue d’environ 20%.
Figure 3.6 : Blocage des sites de liaison de l’anti-CD11c par les IgIV.
49
Des DC ont été incubées pendant 24 h à 37°C avec de l’ovalbumine (1 mg/ml). Trente minutes
avant la lecture au cytomètre, des IgIV (15 mg/ml) ont été ajoutées à la moitié des cellules et celles-
ci ont été incubées sur glace pendant 30 minutes. L’expression de CD11c par les cellules vivantes
a été analysée par cytométrie en flux. Les résultats proviennent de deux expériences
indépendantes.
3.3 Effet des IgIV sur la dégradation de l’antigène par les cellules dendritiques
Des essais de présentation croisée ont été effectués directement avec le peptide
SIINFEKL (peptide immunodominant reconnu par les lymphocytes T OT-I). En
utilisant directement le peptide au lieu de l’ovalbumine soluble, l’antigène n’a pas à
être dégradé et peut directement être chargé sur des CMH. Ces essais ont été
réalisés avec ou sans ajout d’IgIV. Quelques difficultés ont alors été rencontrées
puisque le modèle ne permettait pas d’observer à chaque fois une inhibition de la
réponse des lymphocytes T OT-I (mesurée par CD69), peu importe si les DC
étaient incubées avec le peptide ou avec l’ovalbumine soluble (résultats non
montrés). Un effet des IgIV était certes visible, mais généralement plus faible que
ce qui était attendu. Il importait donc de revoir les bases du modèle expérimental
puisque, sans l’observation d’une inhibition significative et constante de l’activation
des lymphocytes T OT-I par le peptide SIINFEKL ou par l’ovalbumine soluble en
présence d’IgIV, l’hypothèse de départ s’en trouvait invalidée.
Un des atouts de notre approche expérimentale est que celle-ci permet d’avoir une
vision globale de l’effet des IgIV, tant sur les DC que sur les lymphocytes T. En
effet, il est possible d’ajouter les IgIV en pré-incubation soit avec les DC [95] ou
alors au moment du contact entre les deux types de cellules (synapse
immunologique). Cet atout a été utilisé pour tenter de déterminer quel était le type
cellulaire le plus affecté par les IgIV lors de la présentation croisée. Les essais de
présentation ont donc été effectués en ajoutant les IgIV à deux moments différents,
soit seulement avec les DC en pré-incubation ou au moment du contact entre les
50
deux cellules. L’activation des cellules T a été mesurée via leur expression de
CD69 en cytométrie en flux. Comme le montre les figures 3.7 A et B, les cellules
totales ont d’abord été sélectionnées afin d’extraire les débris cellulaires des
analyses. Une région a ensuite été fixée pour sélectionner les cellules CD8b+ en
utilisant des cellules non-colorées pour établir les limites des quadrants.
L’expression de CD69 sur les cellules CD8b+ a ensuite été analysée en utilisant
des cellules colorées avec l’anti-CD8b seulement pour établir les quadrants
nécessaires. La figure 3.7 C illustre un résultat représentatif de huit expériences
indépendantes. À des fins de statistique, l’index d’expression de CD69 a été
calculé pour chaque condition et dans chaque expérience en multipliant l’intensité
de fluorescence moyenne émise via l’anti-CD69 par le pourcentage de cellules
positives pour le marqueur. L’analyse des index d’expression (figure 3.7 D) nous a
permis de conclure que les IgIV avaient un effet inhibiteur significatif sur l’activation
des cellules T CD8 seulement lorsque les IgIV étaient ajoutées au moment du
contact entre les DC et les lymphocytes T. Il est possible d’observer une diminution
de l’expression de CD69 par les cellules T lorsque les DC sont incubées avec des
IgIV, mais celle-ci est non-significative.
51
52
Figure 3.7 : Effet des IgIV à différents stades de la présentation croisée mesuré par l’activation des lymphocytes T OT-I.
Les lymphocytes T OT-I ont été incubés pendant 24 h à 37°C avec des DC préalablement incubées
avec ou sans ovalbumine soluble (1 mg/ml) pendant 24 h à 37°C et ce, dans un ratio 1 :1. Des IgIV
(15 mg/ml) ont été ajoutées pendant la pré-incubation des DC ou au moment du contact entre les
deux types de cellules. L’analyse de l’expression du marqueur CD69 a été effectuée par cytométrie
en flux sur les lymphocytes T CD8b+. (A) Sélection des cellules totales. (B) Sélection des cellules
CD8b+. (C) Expression du marqueur CD69 sur les cellules totales CD8b+ dans les différentes
conditions. (D) Index d’expression du marqueur CD69 dans les différentes conditions. N=8, * P˂0,05 (ANOVA).
Comme ces résultats suggéraient davantage un impact des IgIV lors de la
formation de la synapse immunologique que directement sur les DC, la
prolifération des lymphocytes T OT-I a été mesurée pour confirmer les résultats
obtenus avec le marqueur CD69. L’index de prolifération illustré à la figure 3.8
indique le nombre moyen de cellules-filles auxquelles les cellules-mères initiales
ont donné naissance. Dans la condition sans activation des lymphocytes T (DC
sans ovalbumine), celui-ci est de 1,95 et augmente à 4,75 dans la condition où les
lymphocytes T sont activés. Il diminue à 3,37 dans la condition où les IgIV sont
ajoutées en pré-incubation avec les DC et n’atteint que 2,22 dans la condition où
les IgIV sont ajoutées au moment du contact entre les deux types de cellules, en
accord avec nos observations basées sur l’expression du CD69.
53
Figure 3.8 : Effet des IgIV sur les différents stades de présentation croisée mesuré par inhibition de la prolifération.
Les conditions expérimentales sont similaires à celles décrites à la figure 3.9, sauf que les
Lymphocytes T OT-I ont été colorées avec le marqueur de prolifération Cell Proliferation Dye-
eFluor© 450 Cell Labelling (eBiosciences) avant le début de l’expérience. Les lymphocytes T
CD8b+ ont été analysés après 48 h par cytométrie en flux. Les intensités de fluorescence moyenne
(MFI) sont écrites au-dessus des courbes de chaque condition analysée. Les index de prolifération
ont été calculés à l’aide du logiciel FCS Express 4.
Ainsi, nos résultats suggèrent que les IgIV inhibent l’activation des lymphocytes T
OT-I par la présentation antigénique croisée en affectant en partie les DC mais
probablement de façon plus importante la synapse immunologique qui se forme
entre la DC et le lymphocyte T.
Ces résultats nous ont donc mené à nous questionner sur un effet potentiel des
IgIV directement sur les lymphocytes T CD8, lequel a été exploré dans la section
suivante.
54
3.4 Effet des IgIV sur les lymphocytes T OT-I
3.4.1 CD62L
Les lymphocytes T OT-I ont été incubés avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 24
h à 37°C et l’expression de CD62L a été mesurée par cytométrie en flux. Les
cellules totales ont d’abord été sélectionnées via leur taille et leur granularité. Les
cellules mortes ont été exclues des analyses et des cellules non-colorées ont
permis d’établir les quadrants délimitant les cellules négatives et les cellules
positives pour l’expression du marqueur CD8b. Les cellules vivantes CD8b+ ont
ensuite été analysées quant à leur expression de la sélectine CD62L; des cellules
colorées avec l’anti-CD8b seulement ont été utilisées pour délimiter les quadrants
nécessaires. La figure 3.9 A illustre un résultat représentatif de quatre expériences
indépendantes. L’expression de CD62L est maximale au début de l’expérience. La
sélectine est clivée dans les heures suivantes pour ensuite être re-synthétisée
après environ 24 h, tel que décrit dans la section 1.2.4. L’expression de CD62L est
similaire dans des conditions avec ou sans IgIV dans les premières heures, mais
on note une resynthèse accrue dans la condition avec IgIV après 24 h. Afin
d’appuyer les résultats par des données statistiques, l’index d’expression de
CD62L a été calculé pour chaque expérience en multipliant l’intensité de
fluorescence moyenne émise via l’anti-CD62L par le pourcentage de cellules
positives. Tel que montré dans la figure 3.9 B, aucune différence significative n’a
été observée quant à l’index d’expression de CD62L dans des conditions avec ou
sans IgIV après 4 h d’incubation. Cependant, après 24 h, on note une expression
significativement plus importante de CD62L dans la condition avec IgIV.
55
Figure 3.9 : Effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T OT-I non-activés.
56
Les lymphocytes T OT-I ont été incubés avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 24 h. L’expression
de CD62L a été mesurée après 4 h et 24 h d’incubation par cytométrie en flux sur les cellules
vivantes CD8b+. (A) Résultat représentatif de quatre expériences indépendantes. (B) Index
d’expression du marqueur CD62L après 4 h et 24 h d’incubation avec ou sans IgIV. N=4, *P<0,05
(Test T apparié).
Nous avons poussé plus loin l’analyse de l’expression de CD62L en présence
d’IgIV en effectuant une cinétique sur 48 heures et ce, en incubant les lymphocytes
T OT-I en présence de DC préalablement activées afin de déterminer la cinétique
de l’expression dans un contexte de présentation croisée. Les résultats illustrés à
la figure 3.10 A sont représentatifs de quatre expériences indépendantes. L’index
d’expression de CD62L a été calculé comme décrit précédemment et les résultats
sont montrés à la figure 3.10 B. Les niveaux de CD62L sont maximaux au début
de l’expérience et la sélectine est rapidement clivée suite à l’ajout des DC
préalablement activées avec de l’obalbumine. Les résultats suggèrent que les IgIV
n’ont pas d’effet significatif sur le clivage de la molécule puisque les niveaux
d’expression sont presque identiques avec ou sans IgIV après 4 h d’incubation.
Cependant, après 24 h, au moment de la resynthèse de la molécule, on note un
index d’expression significativement plus élevé dans la condition avec IgIV.
57
Figure 3.10 : Cinétique de l’effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T OT-I activés en présence ou en absence d’IgIV.
Les lymphocytes T OT-I ont été activés par des DC (préalablement incubés pendant 24 h avec de
l’ovalbumine (1 mg/ml)) avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 48 h. L’expression de CD62L a été
mesurée par cytométrie en flux sur les cellules vivantes CD8b+ après 4 h, 24 h et 48 h. (A) Résultat
58
représentatif de quatre expériences indépendantes. (B) Index d’expression du marqueur CD62L
après 4 h et 24 h d’incubation avec ou sans IgIV. N=4, *P<0,05 (Test T apparié).
Ces résultats suggérant que les IgIV agissent en induisant une synthèse de novo
de CD62L chez les lymphocytes T CD8, l’ARNm de CD62L a été dosée par PCR
en temps réel à l’aide d’extraits nucléiques prélevés après 24 h d’incubation.
Comme le démontrent les résultats de la figure 3.11, la quantité d’ARNm codant
pour la sélectine est environ sept fois plus élevée dans la condition avec IgIV après
24 h d’incubation, signe d’une synthèse accrue du messager et en accord avec
l’augmentation d’expression de la protéine à la surface des cellules OT-I après 24
h.
Figure 3.11 : Effet des IgIV sur l’expression relative de l’ARNm codant pour la
sélectine CD62L au temps T= 24 h par des lymphocytes T OT-I activés. Les lymphocytes T OT-I ont été activés par des DC (préalablement incubées pendant 24 h avec de
l’ovalbumine (1 mg/ml)) avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 24 h. Des extraits nucléiques ont été
prélevés après 24 h et l’expression relative de l’ARNm codant pour CD62L a été mesurée par PCR
en temps réel.
59
3.4.2 Effet des IgIV sur l’expression de CD62L par des lymphocytes T CD8
humains
Afin d’analyser l’expression de CD62L sur des lymphocytes T CD8 humains, les
PBMC récoltés des filtres de leuco-réduction ont été mis en culture avec ou sans
IgIV ou HSA pendant 48 h et l’expression de la sélectine et de son ARNm par les
cellules CD8+ ont été respectivement quantifiées par cytométrie en flux et par PCR
en temps réel à différents temps durant l’incubation. Les cellules totales ont
d’abord été sélectionnées via leur taille et leur granularité et les cellules mortes ont
été exclues des analyses. Des cellules non-colorées ont été utilisées pour
sélectionner les cellules positives pour l’expression de CD8. Les cellules vivantes
CD8+ ont ensuite été analysées quant à leur expression de CD62L; des cellules
colorées avec l’anti-CD8 seulement ont été utilisées pour fixer les quadrants
délimitant les cellules positives et les cellules négatives pour l’expression du
marqueur. Tel que décrit précédemment, l’index d’expression a été calculé pour
les quatre temps de la cinétique. Les résultats obtenus sont illustrés à la figure
3.12 et confirment une expression de CD62L significativement plus élevée sur les
lymphocytes T CD8 provenant des PBMC ayant été incubés avec des IgIV
pendant 48 h. La différence est presque significative après 24 h. Un traitement à la
HSA dans les mêmes conditions n’entraine aucune modulation significative de
l’expression de CD62L, ce qui démontre la spécificité de l’effet des IgIV.
60
Figure 3.12 : Cinétique de l’expression de CD62L par les lymphocytes T CD8
humains provenant de PBMC incubés en présence ou en absence d’IgIV pendant 48 h.
Les PBMC ont été incubés avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 48 h. L’expression de CD62L a
été mesurée par cytométrie en flux à différents temps sur les cellules CD8+. Les résultats
représentent une compilation des données obtenues suite à l’analyse des lymphocytes T CD8 de
quatre donneurs différents. * P<0,05 (ANOVA)
L’analyse de l’ARNm codant pour CD62L a ensuite été réalisée par PCR en temps
réel. Les résultats de la figure 3.13 démontrent que, tout comme dans le modèle
murin, il y a une présence significativement plus élevée de l’ARNm codant pour la
protéine dans la condition avec IgIV comparativement à la condition contrôle. Cette
différence n’est présente qu’au temps T= 10 h.
61
Figure 3.13 : Effet des IgIV sur l’expression relative de l’ARNm codant pour la
sélectine CD62L par des PBMC humains après 10 h et 24 h d’incubation. Les PBMC ont été incubés avec ou sans IgIV (15 mg/ml) pendant 24 h et des extraits nucléiques
ont été prélevés après 10 h et 24 h d’incubation. L’expression relative de l’ARNm codant pour
CD62L a été mesurée à différents temps par PCR en temps réel. Les résultats représentent une
compilation des données obtenues suite à l’analyse des PBMC de quatre donneurs différents. ***
P<0.001 (Test T apparié).
Ainsi, nos résultats ont permis de mettre en évidence un effet des IgIV directement
sur les lymphocytes T CD8 murins et humains, au niveau de l’expression de la
sélectine CD62L. Par contre, notre hypothèse de départ voulait que les IgIV
produisent un effet direct sur les CPA. Bien que cet effet ne soit pas prononcé
dans le contexte de la présentation croisée chez la souris, nous nous sommes tout
de même intéressés aux effets des IgIV sur les monocytes humains, qui sont les
précurseurs des DC. Plus particulièrement, nous avons analysé l’effet des IgIV sur
le pouvoir tolérogène des monocytes en étudiant leur impact sur l’expression de
molécules telles que l’enzyme IDO et certains récepteurs NOD, afin de mieux
comprendre les effets immunomodulateurs des IgIV dans les maladies auto-
immunes et inflammatoires. .
***
62
3.5 Effet des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes
3.5.1 Indoleamine 2,3-dioxygenase
IDO est une enzyme qui catalyse la dégradation du Trp un acide aminé essentiel
et est désormais reconnue pour son implication majeure dans la régulation des
réponses immunes. Afin de déterminer les IgIV avaient un effet sur l’expression de
IDO par les monocytes humains, ceux-ci ont été purifiés (≥95% cellules CD14+
vivantes) à partir des PBMC de quatre différents donneurs et mis en culture
pendant 96 h avec ou sans IgIV ou HSA. Les cellules ont été récoltées toutes les
24 h et l’expression intracellulaire de l’enzyme a été évaluée par cytométrie en flux.
Les cellules totales ont d’abord été sélectionnées via leur taille et leur granularité
afin d’en extraire les débris cellulaires. Des cellules colorées avec l’anticorps
secondaire seulement ont été utilisées afin d’établir les quadrants qui délimitent les
cellules positives et les cellules négatives pour l’anticorps primaire (anti-IDO). Les
résultats de la figure 3.14 indiquent que cinq à six fois plus de monocytes
expriment l’enzyme s’ils ont été traités aux IgIV. Une forte augmentation
significative du nombre de cellules exprimant IDO est observée à partir de T=48 h
et se maintient jusqu’à T=96 h. L’expression de la protéine a également été
quantifiée par immunobuvardage de type western au temps T=96 h et la même
tendance a été observée (résultat non montré).
63
Figure 3.14 : Effet des IgIV sur l’expression de l’enzyme Indoleamine 2,3-
dioxygenase par des monocytes purifiés à partir de PBMC. Les monocytes purifiés ont été incubés avec ou sans IgIV ou HSA (15 mg/ml) pendant 96 h.
L’expression intracellulaire de l’enzyme par les cellules a été mesurée par cytométrie en flux. Les
résultats représentent une compilation des données obtenues suite à l’analyse des monocytes de
quatre donneurs différents. *** P˂0.001, n.s, non-significatif (ANOVA)
Afin de déterminer si l’augmentation de l’expression de l’enzyme par les
monocytes entrainait également un accroissement de la dégradation du Trp, cet
acide aminé a été quantifié par chromatographie en phase liquide à haute
performance. Les résultats illustrés à la figure 3.15 montrent les résultats obtenus
pour le dosage du Trp. Comparativement aux résultats précédents, aucune
différence significative (ANOVA) n’est observée quant à la quantité de Trp
présente dans le milieu entre les conditions avec ou sans IgIV.
64
Figure 3.15: Effet des IgIV sur l’activité enzymatique de l’enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase exprimé par des monocytes purifiés à partir de PBMC.
Les monocytes purifiés ont été incubés avec ou sans IgIV ou HSA (15 mg/ml) pendant 96 h. La
quantité de Trp a été mesurée par chromatographie en phase liquide à haute performance et est
exprimée de façon relative au standard 3-nitro-tyrosine. Les résultats représentent une compilation
des données obtenues suite à l’analyse des surnageants provenant de la culture de monocytes de
quatre donneurs différents.
Comme mentionné, l’enzyme étudiée peut exercer ses fonctions
immunomodulatrices en dégradant le Trp, ce qui ne semble pas être le cas ici. Par
contre, il a également été démontré qu’elle peut agir en induisant une cascade de
signalisation intracellulaire qui confère aux cellules qui l’expriment un pouvoir
tolérogène stable, indépendamment de son action sur le Trp. En présence de
TGF-β et de TNF-α, l’expression accrue de l’enzyme permet aux cellules de
réguler les réponses immunes à long terme en participant à la génération de Treg.
Comme l’activité enzymatique de IDO n’est pas altérée par les IgIV, mais que la
présence de l’enzyme est accrue, il a été supposé que ce second mécanisme via
le TGF-β et le TNF-α pouvait être induit et/ou amplifié par les IgIV dans les
65
conditions étudiées. La concentration de TNF-α a été dosée à l’aide d’un test
ELISA et l’ARNm codant pour la cytokine TGF-β a été mesuré par PCR en temps
réel. La figure 3.16 illustre les résultats obtenus. Tel qu’attendu, les IgIV semblent
induire une augmentation significative de la sécrétion du TNF-α et de l’expression
du TGF-β par les monocytes après 24 h d’incubation. En effet, la
sécrétion/expression des deux cytokines est environ trois fois plus importante dans
la condition avec IgIV qu’elle ne l’est dans la condition contrôle ou dans la
condition avec HSA.
Figure 3.16 : Effet des IgIV sur l’expression des cytokines TNF-α et TGF-β. Les monocytes purifiés ont été incubés avec ou sans IgIV ou HSA (15 mg/ml) pendant 24 h. La
sécrétion du (A) TNF-α a été dosée par ELISA à partir des surnageants de culture. L’ARNm codant
pour la (B) cytokine TGF-β a été quantifiée par PCR en temps réel. Les résultats représentent une
compilation des données obtenues suite à l’analyse des monocytes de quatre donneurs différents. *
P˂0.05 (ANOVA)
Ces résultats combinés suggèrent un mécanisme d’action potentiel des IgIV en
agissant sur la voie TNF-α/TGF-β/IDO menant à l’induction de la tolérance. Nous
66
avons poussé plus loin l’étude des effets des IgIV sur le pouvoir tolérogène des
monocytes en étudiant l’expression de certains récepteurs de type NOD.
3.5.2 Récepteurs NOD
Des résultats antérieurs obtenus par des membres de l’équipe ont mis en évidence
un rôle pour les IgIV dans l’inhibition de l’activation du facteur de transcription NF-
κB (L. Loubaki et al, en préparation). Comme le NLRP6 et NLRP10 sont connus
pour leur rôle dans la régulation (positive et négative respectivement) de
l’activation de NK-κB, l’hypothèse d’un effet des IgIV sur ceux-ci s’avérait plausible.
Les monocytes purifiés (≥95% CD14+ vivants) de PBMC provenant de quatre
donneurs ont été activés par une incubation de quatre heures à 37°C avec du LPS
(1µg/ml), ce qui permet de simuler un contact avec un pathogène bactérien, et ont
été lavés extensivement avant d’être incubés à nouveau pendant 96 h à 37°C,
cette fois-ci, en présence ou en absence d’IgIV. L’expression de NLRP6 et de
NLRP10 a été analysée par cytométrie en flux. Les cellules totales ont d’abord été
sélectionnées via leur taille et leur granularité afin d’en extraire les débris
cellulaires. Des cellules colorées avec l’anticorps secondaire seulement ont été
utilisées afin d’établir les quadrants qui délimitent les cellules positives et les
cellules négatives pour l’anticorps primaire (anti-NLRP6 et anti-NLRP10). Comme
le démontrent les résultats d’analyse par cytométrie en flux de la figure 3.17 A, les
IgIV ne semblent avoir aucun effet sur l’expression de NLRP6 par les monocytes
purifiés et ce à tous les temps analysés. En effet, le pourcentage des cellules qui
expriment NLRP6 est sensiblement le même dans chacune des conditions pour un
temps donné. Par contre, il est possible de noter une différence significative quant
à l’expression de NLRP10 par les monocytes ayant été incubés en présence d’IgIV
au temps T=48 h et T=72 h (figure 3.17 B). Bien que la différence d’expression ne
soit pas significative aux temps T= 24 h et T=96 h en raison du grand écart-type
entre les données recueillies, les résultats démontrent que la tendance se
maintient tout au long de l’expérience. Alors que plus de 50% des monocytes
activés expriment NLRP10 au temps T=48 h dans la condition avec IgIV,
67
seulement 15% expriment le récepteur dans la condition sans IgIV ou avec HSA.
L’effet est également du même ordre (35% contre 5%) au temps T= 72 h.
Figure 3.17 : Effet des IgIV sur l’expression des récepteurs NOD NLRP6 et NLRP10.
Les monocytes purifiés ont été activés aux LPS et incubés avec ou sans IgIV ou HSA (15 mg/ml)
pendant 96 h. L’expression intracellulaire des récepteurs (A) NLRP6 et (B) NLRP10 par les
monocytes a été mesurée par cytométrie en flux. Les résultats représentent une compilation des
données obtenues suite à l’analyse des monocytes de quatre donneurs différents. ***P˂0.001,
**P˂0.01, n.s, non-significatif (ANOVA)
69
4. Discussion
Des travaux récents de notre équipe ont permis de mettre en évidence une
inhibition de l’activation (CD69, prolifération et sécrétion de cytokines pro-
inflammatoires) des lymphocytes T CD8 in vitro [99] ainsi qu’une atteinte aux
capacités lytiques de ceux-ci in vitro et in vivo [100] suite à un traitement aux IgIV.
L’objectif de cette étude était donc de déterminer les mécanismes d’action qui
pouvaient expliquer ces effets inhibiteurs afin d’aider au développement d’un bio-
équivalent aux IgIV. Nous avons émis l’hypothèse que les IgIV agissaient en
produisant un effet immunomodulateur sur les CPA, diminuant ainsi leur capacité à
activer les lymphocytes T CD8 et à générer des Tc. Les résultats de ce projet ont
permis l’identification de cibles potentielles des IgIV, soit l’intégrine CD11c, la
sélectine CD62L, l’enzyme IDO et le récepteur NLRP10.
4.1 Effet des IgIV sur l’activation des cellules dendritiques
Dans le cadre de ce mémoire, nous avons établi les effets des IgIV sur
l’expression de certaines molécules exprimées à la surface des DC pour tenter
d’expliquer l’inhibition de l’activation des lymphocytes T CD8 par présentation
antigénique croisée.
4.1.1 Complexe majeur d’histocompatibilité I
Il a été démontré quelques années plus tôt que les IgIV inhibent l’augmentation de
l’expression du CMH II qui survient normalement à la surface des DC suite à une
stimulation au LPS [94]. Nous avons vérifié si cet effet était également présent sur
l’expression du CMH I. L’ovalbumine commerciale utilisée pour activer les DC
contient une concentration importante d’endotoxines qui peuvent stimuler les DC
de façon similaire au LPS [109, 110]. Par contre, comme les IgIV peuvent inhiber
70
le pouvoir activateur des endotoxines [111-113], le protocole a également été
effectué avec de l’ovalbumine exempte d’endotoxines (endo -) afin d’éviter de
confondre un effet direct des IgIV sur l’expression du CMH I à une neutralisation
des effets pro-inflammatoires normalement induits par les endotoxines. Nous
avons démontré qu’avec une préparation régulière d’ovalbumine, les IgIV
réduisaient significativement l’expression du CMH I à la surface des DC. Par
contre, lorsqu’une préparation d’ovalbumine endo- était utilisée, les IgIV perdaient
leur effet inhibiteur apparent, suggérant que les IgIV neutralisent les endotoxines
présentes dans l’ovalbumine et empêche l’activation des DC. L’ovalbumine endo-
active moins fortement les DC en raison de sa concentration nulle en endotoxines
(signaux de danger). Les variations dans l’expression du CMH I deviennent alors
plus difficiles à détecter. Cependant, malgré des variations plus modestes dans
l’expression du CMH I en présence d’ovalbumine endo-, aucune baisse n’a pu être
observée dans l’expression de celles-ci en surface des DC en présence d’IgIV.
Dans des travaux subséquents, nous avons démontré que lorsque du LPS était
ajouté aux préparations d’ovalbumine endo- pour atteindre une concentration en
endotoxines équivalente à celle dans les préparations d’ovalbumine commerciales,
les IgIV retrouvaient leur pouvoir inhibiteur apparent sur l’expression du CMH I.
Ces résultats ont permis de conclure que dans le modèle utilisé, les IgIV ont un
pouvoir inhibiteur sur l’expression du CMH I par les DC qui s’explique par une
neutralisation des endotoxines présentes dans les préparations d’ovalbumine
commerciales. Cette capacité qu’a les IgIV à cibler et à inhiber les effets pro-
inflammatoires des endotoxines a d’ailleurs été exploité dans le passé dans le
traitement de certaines infections bactériennes [114-117].
Est-ce que l’inhibition de l’expression du CMH II par les IgIV à la surface des DC
décrite par Bayry et al. [94] pourrait également s’expliquer par une neutralisation
des endotoxines ? Un élément du protocole utilisé par ces auteurs peut être
questionné, soit le contact possible entre les endotoxines et les IgIV. En effet, les
auteurs ne mentionnent pas qu’ils s’assurent de laver entièrement les DC
prétraitées aux IgIV avant d’ajouter le LPS pour stimuler leur activation. Ce faisant,
71
il est très plausible que l’effet observé dans ce modèle soit également un effet de
neutralisation des propriétés pro-inflammatoires du LPS, tel que nous l’avons
montré dans nos travaux. Le rôle essentiel des endotoxines dans l’activation des
DC a fait l’objet de plusieurs études. Un article publié en 2002 par Bausinger et al.
a permis de mettre en évidence que les protéines de choc thermique (Hsp) de la
sous-classe HSP70 (constituante majeure des protéines Hsp [118]) perdaient leurs
effets pro-inflammatoires dans l’induction de la maturation des DC si celles-ci ne
contenaient pas d’endotoxines [119]. Dans le même ordre d’idées, il fut également
démontré que certaines protéines AGEs (Advanced glycation end-product),
normalement reconnues pour leur activation de plusieurs cellules immunes telles
que les DC et les monocytes [120], perdaient leurs propriétés pro-inflammatoires si
les préparations utilisées étaient exemptes d’endotoxines [121]. Ensemble, ces
résultats suggèrent une dépendance des endotoxines dans certaines voies
d’activation des CPA et laissent penser que les effets observés sur l’expression du
CMH I dans la présente étude ainsi que les effets observés par Bayry et al. sur
l’expression du CMH II pourraient découler d’un impact des IgIV sur l’activation
normalement induite par le LPS. Des études ayant mis en évidence des effets
bénéfiques des IgIV dans le traitement des chocs septiques en diminuant la
concentration d’endotoxines présentes dans le sang des patients traités vont
également dans ce sens [122-124]. Ces études ont certainement été bénéfiques
dans le développement d’anticorps monoclonaux anti-LPS qui sont maintenant
parfois utilisés dans le traitement des chocs septiques [125, 126]. Par contre, l’effet
des IgIV sur le LPS ayant grandement été étudié et n’ayant pas mené à
l’élaboration d’un substitut qui mimerait adéquatement les impacts bénéfiques de
la préparation thérapeutique dans le traitement de l’auto-immunité, les travaux
dans cette voie n’ont pas été approfondis.
4.1.2 CD11c
Dans le passé, il a également été démontré que les IgIV inhibent l’augmentation de
l’expression de l’intégrine CD11c qui survient normalement suite à une stimulation
au LPS [94]. Comme les IgG contenues dans les préparations thérapeutiques
72
d’IgIV peuvent lier différentes molécules, l’hypothèse d’un blocage des sites de
liaison de l’anti-CD11c par les IgIV a été vérifiée. En effet, les préparations d'IgIV
contiennent une grande variété d’anticorps anti-idiotypes dirigés contre les auto-
anticorps. Il importe donc de ne pas négliger la possibilité que les IgG contenues
dans les IgIV puissent également lier des paratopes présents sur les sites de
liaison des anticorps anti-CD11c utilisés. Allant dans ce sens, des études ont mis
en évidence qu’il y avait des anticorps anti-CD4 [127] et anti-CD5 [128] présents
dans les IgIV, ce qui laisse supposer que ces préparations pourraient également
contenir des anti-CD11c qui pourraient bloquer la liaison des anti-CD11c
fluorescents servant à détecter l’expression du marqueur CD11c à la surface des
DC. Pour déterminer si les IgIV pouvaient interférer avec la détection du CD11c,
des DC activées ont été incubées pendant 30 minutes sur glace en présence ou
en absence d’IgIV. Comme les DC sont sur glace pendant seulement 30 minutes
avec IgIV, il est peu probable que celles-ci aient la capacité et le temps de modifier
l’expression du CD11c en réponse aux IgIV. Grâce à ce contrôle, nous avons
démontré une diminution de la fluorescence émise via l’anti-CD11c lorsque les DC
étaient incubées pendant 30 minutes sur glace avec des IgIV (diminution de 10%
des cellules positives et de 20% de la MFI). La molécule de surface CD11c est
légèrement exprimée sur les monocytes et les macrophages [129], mais elle est
généralement utilisée pour cibler spécifiquement les DC qui expriment fortement
celle-ci [102, 130]. Elle fait partie de la grande famille des intégrines et, via son
interaction avec ICAM-1 [131, 132] exprimé sur les lymphocytes T, elle est
impliquée dans le contact DC-lymphocytes T. Dans une étude menée par Garnotel
et al. [133], les auteurs ont démontré que l’ajout d’un anticorps anti-CD11c dans
une culture de monocytes humains purifiés entrainait des difficultés d’adhésion
chez les monocytes traités. Un blocage de cette intégrine par les IgIV pourrait donc
inhiber la formation d’une synapse immunologique fonctionnelle et ainsi inhiber
l’activation des lymphocytes T CD8 qui en résulte. Des études plus approfondies
seraient nécessaires afin de déterminer si le blocage de CD11c par les IgIV
entraine réellement des répercussions sur la formation de la synapse
immunologique.
73
4.2 Effet des IgIV sur les lymphocytes T OT-I
Un des atouts de notre approche expérimentale est que celle-ci permet d’avoir une
vision globale de l’effet des IgIV, tant sur les DC que sur les lymphocytes T. En
effet, il est possible d’ajouter les IgIV en pré-incubation soit avec les DC [95] ou
alors au moment du contact entre les deux types de cellules (synapse
immunologique). Cet atout a été utilisé pour tenter de déterminer quel était le type
cellulaire le plus affecté par les IgIV lors de la présentation croisée. Les essais de
présentation ont donc été effectués en ajoutant les IgIV à deux moments différents,
soit seulement avec les DC en pré-incubation ou au moment du contact entre les
deux cellules. Nos résultats ont permis de démontrer que les IgIV avaient un
pouvoir inhibiteur significatif sur l’activation des lymphocytes T OT-I (déterminé via
l’expression de CD69) seulement lorsque celles-ci étaient ajoutées au moment de
la synapse immunologique.
4.2.1 Effet des IgIV sur CD62L
Nous avons mis en évidence un effet des IgIV sur l’expression de la sélectine
CD62L par les lymphocytes T CD8, laquelle est principalement impliquée dans
l’adhésion des cellules à leur environnement extracellulaire [134, 135]. Nos
résultats suggèrent que les IgIV agissent en induisant une synthèse de novo de
CD62L par les lymphocytes T CD8 murins et humains. Il est connu qu’une fois
activés, les lymphocytes T vont perdre l’expression de la sélectine CD62L
exprimée constitutivement par les lymphocytes T naïfs suite au clivage de celle-ci
par la métallo-protéase ADAM-17 [136]. Le clivage de CD62L joue un rôle pro-
inflammatoire dans les réponses immunitaires en inhibant l’adhésion des
lymphocytes T à leur environnement extracellulaire dans les organes lymphoïdes
secondaires, initiant ainsi un mouvement des lymphocytes T vers les lieux
d’inflammation afin d’exercer leurs rôles effecteurs [137]. Lorsque les signaux
74
d’activation se résorbent, on peut ensuite observer une resynthèse de la sélectine
[138]. Nos résultats montrent une resynthèse significativement accrue de la
protéine suite à une incubation de 24 h avec IgIV (expression significativement
plus importante de la protéine en surface des cellules CD8 murines et humaines).
Des résultats préliminaires montrent également une augmentation de l’ARNm
codant pour la sélectine suite à un traitement aux IgIV. Par contre, des analyses
supplémentaires sont nécessaires pour appuyer ses derniers résultats. En effet,
aucune analyse statistique n’a pu être effectuée pour les résultats concernant les
cellules murines étant donné que l’expérience a été réalisée une seule fois. De
plus, comme les IgIV sont des protéines qui peuvent causer des problèmes au
niveau des analyses en PCR en temps réel, il est nécessaire de laver au moins
cinq fois les cellules afin d’éviter des problèmes d’interférence. Dans ces travaux,
les cellules n’ont été lavées que trois fois. Les IgIV peuvent influencer
négativement l’expression relative de la GAPDH et biaiser les résultats.
L’utilisation d’autres gènes de référence seraient une bonne méthode pour
contourner ce biais dans des études futures. Enfin, nous n’avons pas discriminé la
provenance cellulaire de l’expression de l’ARNm codant pour la sélectine et
l’ARNm de toutes les cellules a été analysé. Comme la sélectine CD62L est
également exprimée sur les cellules NK et sur les lymphocytes B, les données
englobent également l’expression de CD62L par ces cellules. L’isolement des
cellules CD8+ avant le recueillement des extraits nucléiques permettraient d’éviter
ce biais dans des études ultérieures. Par contre, nos résultats montrent une
augmentation significative de l’expression de la sélectine sur les cellules CD8
murines et humaines suite à une incubation variant entre 24 h et 48 h avec des
IgIV. Comme la sélectine CD62L a récemment été associée à la régulation de
l’activité lytique des lymphocytes T CD8 activés [65], nous pouvons émettre
l’hypothèse que l’effet des IgIV sur la synthèse accrue de celle-ci pourrait jouer un
rôle dans l’inhibition des capacités lytiques des lymphocytes T CD8 observée in
vitro et in vivo par des membres de l’équipe [100].
75
4.3 Effet des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes
4.3.1 Indoleamine 2,3-dioxygenase
La tolérance aux molécules du soi par le système immunitaire est fondamentale et
les IgIV sont maintenant reconnues comme étant un traitement qui peut susciter un
état de tolérance immunologique sur certaines cellules immunes de patients traités
[139-142]. Un acteur important de la tolérance immune est l’enzyme IDO qui est
exprimée par plusieurs cellules, incluant les monocytes et les DC. En plus d’agir
comme un agent régulateur des réponses immunes en dégradant le Trp [28], IDO
agit également comme un transducteur en conférant aux CPA des propriétés
tolérogènes en réponse au TGF-β [28, 34, 143, 144]. Nos résultats ont permis de
mettre en évidence un effet des IgIV sur l’expression de l’enzyme IDO par des
monocytes isolés à partir des PBMC de quatre différents donneurs. En effet, le
pourcentage des monocytes qui expriment l’enzyme est de quatre à cinq fois plus
important lorsque ceux-ci ont subi un traitement aux IgIV variant de 48 à 96 h.
L’activité enzymatique de IDO a également été mesurée dans des conditions avec
ou sans IgIV et les résultats n’ont pas permis d’observer une différence
significative entre les deux conditions. L’augmentation de l’expression de IDO par
les monocytes traités aux IgIV ne semble donc pas associée à une augmentation
de l’activité enzymatique de celle-ci. Cela indique donc que l’enzyme agirait plutôt
ici via son pouvoir transducteur (mécanisme par lequel la simple augmentation de
son expression suffit) [34] et non via ses capacités enzymatiques afin d’induire un
pouvoir tolérogène aux monocytes traités aux IgIV.
Comme cette voie indépendante de l’activité enzymatique est fortement associée à
la présence de TGF-β dans l’environnement extracellulaire des cellules qui
expriment l’enzyme [145, 146], nous avons comparé l’expression du TGF-β par les
mêmes monocytes dans des conditions avec ou sans IgIV. Nous avons alors
observé une augmentation significative de la quantité d’ARNm codant pour le TGF-
β par les monocytes ayant subi un traitement aux IgIV. Cette cytokine aux effets
76
anti-inflammatoires est reconnue pour ses capacités à inhiber les aptitudes de
présentation antigénique des macrophages [147-149] et pour ses capacités à
permettre aux CPA d’acquérir un pouvoir tolérogène [147-150]. Enfin, le TGF-β
joue un rôle crucial dans l’induction et le maintien des lymphocytes T régulateurs
[147-149, 151]. Ces résultats suggèrent donc que l’induction de la tolérance par les
IgIV pourrait s’expliquer par leur capacité à induire la sécrétion du TGF-β par les
monocytes traités.
Il a été démontré que les effets du TGF-β dans l’induction du pouvoir tolérogène
étaient dépendants d’une seconde cytokine, le TNF-α [152], En effet, suite à une
administration systémique d’anti-TNF-α chez des souris, le pouvoir tolérogène des
CPA a été fortement diminué [152]. De plus, il a été rapporté que le TNF-α, lorsque
sécrété par des CPA ayant été en contact avec du TGF-β, agit comme un support
aux capacités tolérogènes des CPA [153]. Nos résultats montrent que, tout comme
pour le TGF-β, la sécrétion du TNF-α par les monocytes des 4 mêmes donneurs
est significativement augmentée lorsque les cellules sont traitées aux IgIV.
Regroupés ensemble, nos résultats sur l’expression des cytokines par les
monocytes suggèrent une interaction complexe entre ces derniers et les IgIV dans
laquelle les modifications de l’environnement extracellulaire (présence de TGF-β et
de TNF-α) pourraient mener les monocytes à acquérir des propriétés tolérogènes
en exprimant plus fortement l’enzyme IDO. Cependant, d’autres études devront
être menées pour évaluer plus précisément le rôle de la voie TNF-α/TGF-β/IDO
dans l’induction de la tolérance par les IgIV.
4.3.2 NLRP6 et NLRP10
Nos résultats ont permis de démontrer un effet significatif des IgIV sur l’expression
de NLRP10, lequel est exprimé par un pourcentage de monocytes plus élevé suite
à un traitement de 48 et 72 h. Nous avons également démontré que les IgIV n’ont
aucun effet significatif sur l’expression de NLRP6 par des monocytes humains
traités pendant 24 à 96 h. Comme NLRP6 est clairement associé à un effet pro-
77
inflammatoire en collaborant à la formation de l’inflammasome [9, 10], il était
attendu que les IgIV inhibent ou n’aient aucun effet sur ce récepteur. En
démontrant par contre que les IgIV, reconnues pour leurs effets anti-inflammatoires
chez les patients traités, agissent en augmentant l’expression de NLRP10 par des
monocytes humains purifiés, nos résultats appuient les conclusions de deux
études traitant de la découverte [12] et du rôle anti-inflammatoire [11] de NLRP10.
Ces études, menées par le même groupe de recherche en 2004 et 2010
respectivement, sont en fait les premières à avoir démontré un rôle anti-
inflammatoire pour ce membre de la famille des NLRP. Par la suite, d’autres
chercheurs se sont intéressés au récepteur, mais le rôle exact de NLRP10 dans la
régulation négative de l’inflammasome demeure mal compris. En effet, alors
qu’une étude subséquente a démontré qu’une liaison de la caspase-1 par le
NLRP10 pourrait être à l’origine de l’effet inhibiteur observé sur la sécrétion des
cytokines IL-1β et IL-18 [154], d’autres chercheurs ont démontré que NLRP10 était
essentiel à l’établissement d’une immunité innée et adaptative fonctionnelle [155].
Ces chercheurs ont utilisé des souris dont le gène codant pour NLRP10 avait été
invalidé et ne sont pas parvenus à établir un lien entre celui-ci et la régulation de
l’inflammasome, mais ont par contre mis en évidence une défaillance dans leur
habileté à répondre à différents signaux de danger tel le LPS [155]. Par contre, les
résultats obtenus dans la présente étude suggèrent que la modulation de
l’expression de NLRP10 par les IgIV contribue à leur activité immunomodulatrice et
appuient les travaux d’Imamura et al. qui proposent un rôle anti-inflammatoire pour
NLRP10 [11]. La mise en évidence d’un lien clair entre NLRP10 et les IgIV pourrait
mener à une meilleure compréhension des mécanismes d’action des IgIV dans le
traitement de l’auto-immunité.
5. Conclusion
Dans cette étude, nous avons montré que les effets des IgIV dans l’inhibition de
l’activation des lymphocytes T OT-I subséquente à la présentation croisée de
78
l’ovalbumine soluble s’explique partiellement par une neutralisation des
endotoxines présentes dans les préparations commerciales d’ovalbumine
classiques utilisées pour activer les DC. Ce faisant, l’expression des molécules de
surfaces CMH I, normalement accrue suivant un traitement aux endotoxines,
demeure à un niveau basal si les DC sont activées avec de l’ovalbumine en
présence d’IgIV. Nos résultats suggèrent également que les IgIV lient l’intégrine
CD11c présente sur les DC, laquelle lie normalement la molécule ICAM-I présente
sur les lymphocytes T pour ainsi stabiliser les interactions DC-lymphocytes T au
moment de la synapse immunologique. Nos résultats ont permis de mettre en
évidence une nouvelle cible potentielle des IgIV en agissant sur l’expression de la
sélectine CD62L, laquelle régule l’acquisition des capacités lytiques des
lymphocytes T CD8 et participe, via son interaction avec les filaments d’actine, au
modelage de la cellule nécessaire dans l’établissement des contacts cellule-cellule
ou cellule-environnement extracellulaire. Enfin, nos résultats ont permis de
démontrer un impact positif des IgIV sur le pouvoir tolérogène des monocytes
humains en augmentant le pourcentage de monocytes qui expriment l’enzyme IDO
ainsi que le récepteur intracellulaire NLRP10.
À ce jour, les théories concernant les mécanismes d’action des IgIV dans l’auto-
immunité divergent généralement vers deux grandes tendances, soit elles
expliquent l’effet anti-inflammatoire des IgIV via un effet direct sur les lymphocytes
ou alors elles expliquent les effets observés par des mécanismes dirigés plutôt
vers les CPA responsables d’activer les lymphocytes. Dans l’ensemble, les
résultats des travaux entourant mon projet de maîtrise ne suggèrent pas que les
IgIV exercent leur pouvoir immunosuppresseur en agissant seulement sur les
lymphocytes T ou alors seulement sur les CPA, mais suggèrent plutôt un effet
bidirectionnel en agissant à la fois sur les CPA et sur les lymphocytes T CD8.
79
6. Bibliographie
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