IMMUNOGLOBULINES BOVINES ET

BRUCELLOSE. I. – PURIFICATION DES

IMMUNOGLOBULINES ET PREPARATION DE

LEURS ANTISERUMS SPECIFIQUES

D. Levieux, G. Bezard

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D. Levieux, G. Bezard. IMMUNOGLOBULINES BOVINES ET BRUCELLOSE. I. – PU-RIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES ET PREPARATION DE LEURS ANTISERUMSSPECIFIQUES. Annales de Recherches Veterinaires, INRA Editions, 1974, 5 (3), pp.329-342.<hal-00900811>

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Submitted on 1 Jan 1974

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IMMUNOGLOBULINES BOVINES ET BRUCELLOSE

I. &mdash; PURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES ET PRÉPARATIONDE LEURS ANTISÉRUMS SPÉCIFIQUES

D. LEVIEUX

G. BEZARD

Station de Pathologie de la Reproduction,Centre de Recherches de Tours, I. N. R. A., .,

B. P. 1, Nouzilly, 3i380 Monnaie

RÉSUMÉ

Des méthodes de préparation des immunoglobulines bovines IgG¡. IgG2, IgAs et IgM ainsique l’obtention, pour les sous-classes d’IgG, des fragments Fab et Fc ou des chaînes H et L, sontdécrites ; elles permettent d’obtenir, par immunisation du lapin, des antisérums spécifiques.

Des schémas de purification des immunoglobulines présentes dans le sérum et le lactosérumont été mis au point, excluant toute technique de précipitation afin de préserver au maximuml’activité biologique.

La pureté des immunoglobulines ainsi obtenues a été testée par des techniques immunolo-giques (immunoélectrophorèse, immunodiffusion radiale simple et double) et physiques (électro-phorèse sur gel de polyacrylamide) qui sont simples, économiques et sensibles. Elles permettentd’assurer une contamination inférieure à 0,1 p. 100.

INTRODUCTION

Trois classes d’immunoglobulines ont été décrites chez les bovins : IgG, IgAet IgM, dont les propriétés physico-chimiques et antigéniques sont analogues à cellesdes classes d’immunoglobulines humaines correspondantes (M!H’ra et al., ig6i ;AALUND, i968 ; VAERMAN, ig7o). Deux sous-classes d’IgG sont connues, IgG1 et

IgG! ; elles sont présentes approximativement à la même concentration dans le sérum,mais l’IgG1 est sélectivement transférée dans la mamelle et représente l’immunoglo-buline majeure du colostrum et du lactosérum (Dmorr et al., ig6i ; MURPHY et al.,1964 ; KieKHôFEN et al., ig68). Des IgA sécrétoires ont été mises en évidence dans le

colostrum et le lait (MACH et al., 1969 ; PORTER et NOAKES, 1970) ; elles constituentla classe principale dans les autres sécrétions (MACH et PAHUD, 1971 ; DUNCANet al., zg72 ; BUTI.ER et al., ig72).

Les propriétés biologiques de ces immunoglobulines sont peu connues et lesdonnées de la littérature sont très réduites. Dans le domaine de la Brucellose, l’étudede ces propriétés devrait apporter des éléments essentiels au niveau du diagnostic,par une meilleure connaissance de la signification des réactions sérologiques, maiségalement dans la pathogénie, où la séquence d’apparition des différentes classesd’immunoglobulines pourrait conduire à une prévision de l’évolution de la maladie.

Pour réaliser une telle étude, il est nécessaire de disposer :- d’immunoglobulines purifiées en vue de la préparation d’antisérums spéci-

fiques pour le titrage des différentes classes et sous-classes d’immunoglobulines. Lespurifications sont effectuées à partir des milieux les plus appropriés compte tenu desconcentrations absolues et relatives des différentes immunoglobulines, et des inter-férences avec les autres protéines ;- de schémas de purification des immunoglobulines à partir des principaux

liquides biologiques (sérum, lait) dont on veut analyser l’activité. Ces schémas doiventaboutir à des produits de haute qualité, de la manière la plus économique.

L’objet de ce travail est donc de faire une mise au point de la méthodologienécessaire pour préparer les réactifs répondant à ces critères. Il représente un préa-lable indispensable à la poursuite d’études sur l’activité des immunoglobulines bovinesdans la Brucellose, les quelques travaux publiés dans ce domaine ayant été baséssur des purifications très sommaires.

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Bovins

Animaux adultes de la race Frisonne Pie Noire.

Échantillons

Sérum : le sang est obtenu stérilement par ponction de la veine jugulaire et laissé coagulerpendant 24 heures. L’exsudat est centrifugé à 3 00o g pendant 20 mn et stocké à - 2o°C.

Colostrum et lactosérum : ils sont écrémés par centrifugation à 3 00o g pendant 30 mn et lacaséine précipitée à 37°C par addition goutte à goutte d’HCl i N jusqu’à pH 4,6. Après centri-fugation à 9 00o g pendant 30 mn, le surnageant est dialysé 48 heures contre 500 volumes deNaCl 0,15 M et conservé à - 2ooC ou dialysé 48 heures contre 5oo volumes d’H20 désionisée etlyophilisé.

Larmes : après dépôt d’une pincée de saccharose sous la paupière supérieure, les larmes sontrécoltées dans un bécher, centrifugées à i5 00o g pendant 30 mn, dialysées contre du NaCI 0,15 M

et conservées à - 20°C.

Techniques préparatives

Filtration sur gel : du Sephadex G-2oo (Pharmacia) est équilibré en tampon Tris-HCI, 0,1 M,pH 8,0 -!- NaCl o,i5 M -f- Azide de sodium o,2 p. i o00 ; une colonne de 90 X 5 cm reçoit environr5 ml d’échantillon centrifugé 15 00o g pendant 3o mn et filtré sur membrane Sartorius 0,2 [jL,L,élution par voie ascendante est réglée à 40 ml/h au moyen d’un vase de Mariotte. Des fractionsde rq ml sont collectées, leur densité optique mesurée à 28o nm. Le Biogel A-5 m (Bio-Rad est équi-

libré dans le même tampon, mais dans une colonne de 90 x IIO cm, ce qui permet l’utilisationd’échantillons de 30 ml. La vitesse d’élution est de 250 mlih,

Chromatographie sur échangeurs d’ions : la DEAE Cellulose « Serva » est équilibrée en tamponphosphate de potassium o,oi M, pH 8,0 ; 10 mg d’échantillon sont déposés pour i ml de DEAEsédimentée dans la colonne. Les échantillons sont dialysés pendant 48 heures contre 5oo volumesdu tampon d’équilibrage de la colonne.

L’élution est effectuée à 10 ml/cm2/heure par des paliers de tampon phosphate de potassiumà molarité croissante et pH décroissant selon MACH et PAHUD (1971), et modifiés (tampons o,i’et 2’) comme suit :

- Électrophorèse préparative : elle est réalisée sur bloc d’amidon (50 X 30 X l cm) équilibréen tampon Véronal-NaOH o, M, pH 8,6. Une tension de 5 volts/cm est appliquée pendant 24 heures.Les protéines obtenues dans les fractions découpées tous les centimètres sont éluées sur verrefritté par 15 ml de NaCl o, I5 M. La concentration en protéines est mesurée par la technique deLowRV et al. (I95I).

Techniques analytiques

- Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (ORNSTEIN et DAVIS, 1964).- Immunoélectrophorèse : microméthode de SCHEIDEGGER (1955) sur plaques de verre de

7,5 X 14 cm (13 ml de gélose à 1,25 p. 100 en tampon véronal HCI 0,05 M, pH 8,2).- Immunodiffusion radiale double, sur plaque (OUCHTERLONY, 1948).

Techniques quantitatives

- Immunodiffusion radiale simple, sur plaque (MANCINI et al., 1965).

Clivage des immunoglobulines

- Le clivage enzymatique est réalisé par action de la papaïne (PORTER, 1959) ; les fragmentsFab et Fc sont séparés des immunoglobulines intactes et des petits peptides par filtration sur

Sephadex G-IOO, puis purifiés par électrophorèse préparative sur bloc d’amidon ou chromato-graphie sur DEAE cellulose.- Les chaînes H et L sont dissociées par S-sulfonation et filtration sur Sephadex G-ioo en

urée 5 M, acide formique 0,05 M (FRANEK, 1961).

Techniques d’immunisation

- Les lapins reçoivent des injections intradermiques (en points multiples), hebdomadaires,de 0,2 à 2 mg de protéines purifiées en solution dans un volume de 0,5 à l ml, émulsionnées avecun volume égal d’adjuvant de Freund complet (Difco). Trois à cinq injections permettent d’obtenirdes antisérums fortement précipitants. Les saignées sont effectuées 9 à 12 jours après la dernièreinjection.

Techniques d’immuno-absorption

- Les antisérums sont rendus spécifiques par incubation avec des immunoglobulines inso-lubilisées par couplage sur des billes de polyacrylamide au moyen du glutaraldéhyde (TERNYNCKet AVRAMEAS, 1972).- Les IgG, contaminant les IgA$ sont incubées avec un sérum de lapin anti IgG, insolubilisé

par le glutaraldéhyde (AVRAMEAS et TERNYNCK, 1969).

RÉSULTATS

i. - Purification d’immunoglobulinespour l’obtention d’antisérums spécifiques (fig. i)

- Les IgG1 représentent la protéine majeure du colostrum après précipitationde la caséine. Le colostrum lyophilisé est passé sur DEAE cellulose afin d’éliminerdans les pics o et i’ les IgG2 et la lactoferrine ; le pic 2’ chromatographié deux foissur Sephadex G-200 permet d’obtenir les IgG1 pures.

- Les IgGa sont présentes essentiellement dans le sérum ; après chromatogra-phie sur Sephadex G-200, le pic II est passé sur DEAE cellulose où les IgG, ne sontpas retenues. Un deuxième passage sur DEAE cellulose élimine les quelques IgG,non fixées lors du premier passage.- Les larmes sont une des sécrétions les plus riches en IgA!. Après chromato-

graphie sur DEAE cellulose, le pic élué avec le palier 3 est passé sur Sephadex G-200où les IgAs sont exclues.

- Les IgM sont purifiées à partir du colostrum ; en DEAE cellulose, ellessont éluées avec le palier 5, puis exclues sur Sephadex G-2oo.- Le clivage par la papai:ne des IgGl et des IgG, précédemment purifiées a été

étudié de façon analytique à divers temps d’incubation : i h, 3 h, 21 h (fig. 2). Laquantité d’IgG clivées augmente en fonction du temps, mais également la quantitéde petits peptides produits. Le temps d’incubation utilisé à des fins préparatives adonc été limité à 2 h 30 pour les IgG, et 3 h pour les IgGi. Dans ces conditions, laséparation des fragments Fab et Fc (pour les IgG. quelques fragments Fc’ sont pro-duits) effectuée sur DEAE cellulose montre un rendement très faible en fragmentsFc, ce qui permet de supposer que les peptides proviennent essentiellement de cefragment. La préparation des chaînes H et L par S-sulfonation suivie de gel filtrationsur Sephadex G-ioo a été appliquée aux IgG, et a donné des résultats satisfai-sants (fig. 3).

- L’immunisation de lapins par les immunoglobulines purifiées permet d’obte-nir des antisérums très précipitants. L’absorption de ces antisérums est nécessairepour les rendre spécifiques de chaque classe ou sous-classe : l’anti-IgM est absorbéavec des IgG1 ou IgG., l’anti-IgA. par des IgG2. Une préparation semi-purifiée depièce sécrétoire (fraction intermédiaire entre les IgG et l’albumine d’un lactosérumpassé sur Sephadex G-2oo) est utilisée pour éliminer les anticorps révélant cetteprotéine caractéristique des IgA sécrétoires. L’anti IgG1 est absorbé par les IgG, etvice versa, mais le titre en anticorps spécifiques est alors très faible. Pour ces deux

sous-classes, seuls les antisérums préparés à partir des fragments Fc ou des chaînesH ont permis l’obtention d’antisérums spécifiques de titre élevé ne nécessitant

qu’une absorption minime (fig. 4).

2. - Scl2émzs de purification des immunoglobulines du sérum et du lactosérum

- Dans le cas du sérum (fig. 5), le pic d’exclusion (I) obtenu par chromato-graphie sur Sephadex G-200 contient essentiellement les IgM, les a2 macroglobulines,des !-lipoprotéines mais également un peu d’IgG et d’albumine. Par passage de ce pic

sur DEAE cellulose, les IgG sont éliminées par le palier 3, une grande partie de l’albu-mine et des oc,-macroglobulines par les paliers 3 et 4., le palier 5 décroche les IgMet une électrophorèse préparative sur bloc d’amidon élimine les traces d’albumine etd’0(2-macroglobulines. Les IgG1 et IgG, du pic II (Sephadex G-200) sont séparées

sur DEAE cellulose. Le pic 2’ n’est constitué que d’IgGi, le pic o qui contient lesIgGa et quelques IgG est repassé sur DEAE afin d’éliminer ces IgG1 non retenues

sur la colonne précédente ; des IgG,, pures sont ainsi obtenues.Les IgA sériques ne sont pas purifiées dans ce travail car elles sont présentes

en très faible quantité dans le sérum et les techniques physico-chimiques laissentsubsister des IgG1 contaminantes.- Le schéma de purification des immunoglobulines du lactosérum est illustré

par la fig. 6. Le support de filtration sur gel choisi est le Biogel A-5 m, qui a un pou-voir de séparation intéressant dans les poids moléculaires supérieurs à 200 000.

Parmi les fractions obtenues, la fraction I est utilisée pour la purification desIgM, la fraction II pour les IgA. la fraction III pour les IgG1 et les IgG,.

La fraction I contient les IgM du lactosérum, des lipoprotéines et des tracesd’IgG et d’IgA.. Après passage sur DEAE cellulose, les IgG et IgA. sont éluées parles paliers 3 et q., les IgM par le palier 5, les lipoprotéines et un reste d’IgM par lepalier 6.

La fraction II est riche en IgA!, auxquelles s’ajoutent des IgM, quelques lipo-protéines et des IgG1 agrégées (9,5 S d’après BUTLER et MAXWELL, 1972). En DEAEcellulose, la plus grande partie des IgG1 est éluée dans le pic 2’, les IgA! dans le pic 3,les IgM dans le pic 5 et les lipoprotéines dans le pic 6. Les IgA. obtenues à partirdu pic 3 sont encore contaminées par les IgG i, mais cette contamination est inférieureou égale à I p. 100 d’après les titrages en immunodiffusion radiale simple. Ces IgG,sont alors facilement éliminées par un immuno-adsorbant préparé avec le sérum antilgG,.

I,a fraction III est constituée d’IgG1, d’IgG2, de lactoferrine qui donne unecouleur rosée à cette fraction, et des traces d’IgA.. Après DEAE cellulose, les IgG,,quelques IgG1 et la lactoferrine ne sont pas retenues (pic o), des IgG1 pures sont éluéesdans le pic 2, des IgA. et des IgG1 dans le pic 3. Pour obtenir les IgG., le pic o estrepassé sur DEAE afin d’éliminer les IgG1 qui ne s’étaient pas fixées, puis sur G-200où la lactoferrine est retardée par rapport aux IgG, qui sont obtenues pures dans lamoitié ascendante du premier pic.

La pureté des produits obtenus a été analysée (fig. 7) par immuno-électrophorèse,électrophorèse analytique sur gel de polyacrylamide, immunodiffusion double (OUCH-TÈRI,ONY, 1948), immunodiffusion radiale simple (3IANCINI et al., I965). La hautesensibilité de ces techniques permet d’assurer un seuil de contamination inférieur ouégal à 0,1 p. 100.

DISCUSSION

Le choix du colostrum pour purifier les IgG1 et du sérum pour les IgG! faitl’unanimité dans la littérature. La purification des IgA! a été effectuée à partir desources diverses : colostrum (MACH et al., ig6g), lactosérum (PORTER et NOAxF;S

Ig70 ; BUTLER et MAXWELL, I972), salive (MACH et PA!D, I97I), sécrétions nasales(DUCAN et al., ig72), larmes (PEDERSEN et NnxsErr, I972). Le colostrum est le milieule plus riche en IgA. mais elles n’y représentent que 5 p. 100 des immunoglobulinestotales, et la présence d’IgGt agrégées complique la purification. Dans la salive, les

larmes et le mucus nasal, 86 à g7 p. 100 des immunoglobulines sont des IgAs (PaHUD,1971). Les sécrétions lacrymales en sont les plus riches et ne contiennent pas demucines, contrairement à la salive et au mucus nasal, ce qui rend plus aisées lespurifications par chromatographie. Les IgM ont été purifiées aussi bien à partir dusérum que du colostrum : pour le sérum, la présence d’a2 macroglobulines et dequelques IgG dans le pic d’exclusion de la filtration sur Sephadex G-200 imposeune chromatographie sur DEAE cellulose et une électrophorèse préparative. ; dansle colostrum, les IgG, agrégées rendent nécessaire la même DEAE cellulose maisl’électrophorèse préparative n’est pas utile et les IgM y sont deux fois plus abondantes.

Les immunoglobulines ainsi purifiées permettent d’obtenir des antisérums quine nécessitent aucune absorption par d’autres protéines que des immunoglobulines.La difficulté de préparer des antisérums spécifiques des IgG, et des IgG, chez leLapin a conduit quelques auteurs (BUTLER et MAXWELL, rg72 ; DuNCarr et al., 1972)à utiliser le cobaye. La préparation des fragments spécifiques des IgG par clivageà la papaïne ou par S-sulfonation tourne cette difficulté et donne la possibilité deconserver le Lapin comme animal producteur d’antisérums.

Les moyens utilisés pour ces purifications dérivent des travaux de MACH etPAHUD (1971), en particulier dans la détermination des paliers utilisés pour la chro-matographie sur DEAE cellulose. Certains paliers ont été modifiés afin d’obtenirun rendement plus élevé en IgG,. L’introduction, dans ces schémas, de l’électro-phorèse préparative résout le problème de la contamination des IgM par les

«z-macroglobulines. BUTLER et MAXWELL (1972) utilisent également cette techniquepour achever la purification des IgM obtenues dans le pic d’exclusion de G-200,mais des IgG sont présentes dans ce pic, probablement sous forme agrégée (RICE,Ar,!xarrD!x et B!xxET’r, i967 ; BEH, 1973), et le passage supplémentaire sur

DEAE cellulose est nécessaire pour les éliminer. BUTLER et MAXWELL, qui n’uti-lisent pas la DEAE à ce niveau, reconnaissent une contamination de leurs IgM par2 à 5 p. 100 d’IgG. L’utilisation du Biogel A-5m apporte une solution intéressantedans la purification des IgAs du lactosérum. Les propriétés de ce gel permettentd’obtenir une zone riche en IgAs entre les IgM et les IgG, dimères (MACH et al., 1969 ;Bu2r,!R et MAXWELL, zg72), propice à la suite de la purification par DEAE cellulose.Les techniques physico-chimiques ne sont pas suffisantes pour éliminer les IgG,restantes, à l’exception peut-être de l’isoelectric focusing (PORTER et NOAKES, 1970),mais les contaminations sont inférieures à i p. ioo contre 25 p. ioo dans le schéma

de BUTLER et MAXWELL (1972) qui utilisent cependant 5 recyclages sur SephadexG-200. Dans le cas du lactosérum, le Biogel A-5 m a en outre l’avantage de séparernettement les IgM des IgAs, ce qui n’est pas le cas en Sephadex G-200 ; en effet,une petite partie des IgAs est éluée en DEAE cellulose dans le palier avec les

IgM, lorsque l’on utilise le pic d’exclusion de G-200 comme source d’IgAs, et la

contamination est nette. Le Biogel A-5 m peut également être utilisé pour la puri-fication des IgM du sérum car les az macroglobulines sortent de la colonne légè-rement en retard, mais la rentabilité est moins élevée que dans le schéma décrit

précédemment.Pour obtenir des immunoglobulines aussi peu dénaturées que possible, aucune

technique de précipitation n’a été utilisée dans les schémas de purification. La

pureté de ces protéines et la qualité des antisérums obtenus offrent la possibilitéd’étudier l’activité des immunoglobulines bovines dans la Brucellose.

Reçu pour publication en juin 1974.

REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier Mile J. POULAIN (Station de Virologie-Immunologie de Thiverval Grignon)de son aide pour le clivage des immunoglobulines par S-sulfonation.

SUMMARY

BOVINE IMMUNOGLOBULINS AND BRUCELLOSIS.

I. - PURIFICATION OF IMMUNOGLOBULINS

AND PREPARATION OF THEIR SPECIFIC ANTISERA

Methods are described for the preparation of bovine immunoglobulins IgG1, IgG., IgA. andIgM, and for obtaining in the IgG subclasses the Fab and Fc fragments or H and L chains. The useof these preparations for rabbit immunisations results in specific antisera.

Purification schemes other than precipitation technics were developped which preserved thebiological activity of immunoglobulins in the serum and whey.

The purity of immunoglobulins was demonstrated by immunological technics (immunoelec-trophoresis, simple and double radial immunodiffusion) and physical technics (polyacrylamidegel electrophoresis), which are commonly used, economical and sensitive. They allow to assume lessthan o.i p. 100 contamination.

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