Immuno-analyse et biologie spécialisée (2013) 28, 201—206

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www.sciencedirect.com

REVUES GÉNÉRALES ET ANALYSES PROSPECTIVES

Maladie résiduelle et leucémie myéloïde chroniqueResidual disease in chronic myeloid leukemia

G. Dinea,∗,b, Y. Rehna, S. Brahimia, N. Ali Ammara, B. Gaillarda,Y. Bocqa, G. Fumagalli a

a Service d’hématologie clinique et biologique, hôpital des Hauts-Clos, 101, avenue Anatole-France, 10000 Troyes, Franceb Département EMV, école centrale de Paris, Grande-Voie-des-Vignes, 92295 Chatenay-Malabry, France

Recu le 11 mars 2013 ; accepté le 11 mars 2013

KEYWORDSChronic myeloidleukemia;ChromosomePhiladelphia;Tyrosine kinaseinhibitors;BCR-ABL transcripts

Summary The authors have written an update of concepts and managements about diagnosisand therapy of chronic myeloid leukemia.© 2013 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.

MOTS CLÉSLeucémie myéloïdechronique ;

Résumé Les auteurs font le point sur les recommandations en matière de diagnostic et detraitement de l’un des syndromes myéloprolifératifs, la leucémie myéloïde chronique.© 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.

ChromosomePhiladelphie ;Transcrits BCR-ABL ;Biologie moléculaire ;

c

Inhibiteurs de latyrosine kinase

Introduction

Les syndromes myéloprolifératifs sont des maladies dusang chroniques qui provoquent une morbi-mortalitéconséquente. L’évolution lente ne doit pas occulter les

∗ Auteur correspondant.Adresse e-mail : ibt.ims@wanadoo.fr (G. Dine).

lptAebel

0923-2532/$ – see front matter © 2013 Elsevier Masson SAS. Tous droits rhttp://dx.doi.org/10.1016/j.immbio.2013.03.006

omplications thromboemboliques et vasculaires. Le risqueétal des syndromes myéloprolifératifs est réel lors deshases d’accélération ou d’acutisation. Le diagnostic essen-iellement biologique est donc indispensable (Tableau 1).u sein des syndromes myéloprolifératifs, on distingue trois

ntités sans chromosome Philadelphie. Il s’agit de la polyglo-ulie primitive ou maladie de Vaquez, de la thrombocytémiessentielle et de la myélofibrose primitive ou splénoméga-ie myéloïde. La particularité de ces trois maladies est la

éservés.

202

Tableau 1 Les syndromes myéloprolifératifs.

Syndromes myéloprolifératifs

LMC : phase chronique puis aiguë (Chr Ph + : 95 %)Polyglobulie (Vaquez) : JAK2 (90 %)Thrombocythémie essentielle (JAK2 : 50 %)Myélofibrose primitive (JAK2 : 50 %)

Diagnostic biologique et suivi thérapeutiqueNFS plaquettes (lignées myéloïdes)Myélogramme (cytologie)Biopsie de moelle osseuse (fibrose)

psmcLotcLmr

Dc

Lt

pcspalcqucrmfictcdtdcvmlctLmdll

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Génétique moléculaire (sang)Cytogénétique (moelle osseuse)

résence d’une mutation acquise dénommée Jak2 (V617F)elon une fréquence différente. Le quatrième syndromeyéloprolifératif est la leucémie myéloïde chronique (LMC)

aractérisée par la présence du chromosome Philadelphie.e diagnostic et la prise en charge thérapeutique de la LMCnt bénéficié de progrès biologiques conséquents permet-ant de modifier de manière spectaculaire le pronostic deette maladie hématologique considérée comme incurable.es outils diagnostiques et les traitements actuels sont inti-ement reliés. La biologie moléculaire joue aujourd’hui un

ôle décisif dans la prise en charge des patients.

onnées actualisées sur la leucémie myéloïde

hronique

a LMC est un cancer des cellules souches hématopoïé-iques. La phase initiale chronique se manifeste par une

vfas

igure 1 Pathogenèse de la leucémie myéloïde chronique. a : la LMouches de la moelle osseuse ; b : apparition du gène de fusion anor

G. Dine et al.

roduction myéloïde excessive de la moelle osseuse et vaoncerner essentiellement la lignée granulocytaire. À cetade, il n’y a pas de hiatus leucémique et de blastose péri-hérique importante. En revanche, la myélémie constituevec l’hyperleucocytose un élément constant. Dès 1960,a découverte du chromosome Philadelphie observable enytogénétique a permis de démontrer pour la première foisu’une anomalie chromosomique pouvait être associée àne maladie cancéreuse en l’occurrence leucémique. Lehromosome Philadelphie est l’expression du gène chimé-ique BCR/ABL codant pour une protéine oncogénique duême nom. Il n’y a pas de prédisposition génétique identi-ée. Il s’agit d’une translocation acquise réciproque entre lehromosome 9 et le chromosome 22. La formulation de cetteranslocation est la suivante : t(9;22)(q34;q31). L’objet deette translocation aboutit au raccourcissement du bras longe l’un des deux chromosomes 22 dénommé en cytogéné-ique chromosome Philadelphie. La protéine de fusion issuee cette translocation conduira à la transformation leu-émique (Fig. 1). La protéine BCR/ABL active différentesoies de signalisation cellulaire. Les conséquences vont êtreultiples au niveau hématologique : augmentation de la pro-

ifération cellulaire, altérations des propriétés d’adhésionellulaire, inhibition de l’apoptose, dégradation des pro-éines de régulation, altération de la réparation de l’ADN.a protéine BCR/ABL est dotée d’une forte activité enzy-atique de type tyrosine kinase. Le domaine SH1 porteure cette activité est dépendant de l’énergie fournie par’ATP. Le contrôle de la phosphorylation est crucial pour’homéostasie cellulaire. L’activité tyrosine kinase anormale

a entraîner des conséquences désastreuses. La protéine deusion BCR/ABL existe sous deux conformations, inactives etctives. Dans la conformation active, la boucle d’activation’ouvre après fixation de l’ATP et forme un support pour

C : un échange d’ADN entre deux chromosomes dans les cellulesmal.

Maladie résiduelle et leucémie myéloïde chronique 203

Tableau 2 Les traitements de la leucémie myéloïdechronique.

LMC et traitements

Phase aiguë non contrôlable à ce jour sauf par allogreffede moelle osseuse avec donneur HLA identique (familial)Myélo-suppression : busulfan, hydroxy urée (historique)Interféron � avec ou sans aracytine (efficacitésupérieure)Inhibiteurs de tyrosine kinase : ITK (thérapie ciblée)

Traitement de référence aujourd’hui1re génération : imatinib (1re ligne)2e génération : dasatinib (2e ligne)

ccllldelqtov5léopeqtemdamahilsldcgtiellLmettre la mesure quantitative des transcripts BCR/ABL par

Figure 2 Mode d’action des inhibiteurs de la tyrosine kinase(ITK).

le substrat qui peut être alors phosphorylé. Cet aspectprécis est le support des recherches pharmacologiques quiont permis le développement des inhibiteurs spécifiques del’activité tyrosine kinase. Les effets de ces médicaments entant que compétiteurs de l’ATP bloquent le site de fixationde l’ATP, maintenant la protéine BCR/ABL dans une confor-mation inactive sans activité de phosphorylation (Fig. 2).Il existe malheureusement des mécanismes de résistanceaux inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK). L’activation de laprotéine de fusion BCR/ABL est alors de nouveau effec-tive. Parmi les causes aujourd’hui identifiées, ce sont lesmutations BCR/ABL sous traitement qui posent problème. Lalocalisation de la mutation est variable. Il peut exister éga-lement une amplification et une surexpression de la protéinede fusion. Le flux du médicament peut être aussi perturbé.L’activation des voies alternatives est parfois une réalité.La séquestration plasmatique de l’inhibiteur spécifique per-turbe l’efficacité du produit.

La LMC est généralement découverte en phase chro-nique initiale. Cette phase est d’évolution insidieuse avecune progression qui peut être très lente. Le nombre deblastes présents dans le sang et la moelle osseuse est faible.Généralement, les plaquettes et les polynucléaires neu-trophiles conservent une fonction normale et ce, malgrél’hyperleucocytose, la myélémie et la thrombocytose modé-rée. Le diagnostic de LMC est souvent posé alors que lepatient ne présente aucun symptôme. En fait, la plupartdu temps c’est une suspicion biologique à l’occasion d’unhémogramme qui met en évidence notamment le désordrede la lignée granulocytaire. Lorsque la maladie n’est pasprise en charge, l’évolution vers la phase aiguë est iné-luctable dans un délai moyen de trois à cinq ans avec ousans une phase dite d’accélération où l’hyperleucocytose etla myélémie progressent. Dans cette phase d’accélération,l’augmentation des polynucléaires basophiles et la thrombo-pénie sont notées régulièrement. L’expression clinique peutdevenir significative avec fatigue, pâleur liée à l’anémie,dyspnée, perte d’appétit, perte de poids, douleur abdo-minale gauche liée à l’apparition d’une splénomégalie et

hyperthermie nocturne. La phase d’accélération, si ellen’est pas enrayée, va aboutir en quelques mois à unephase aiguë irrémédiable. Le patient présente alors une

rCm

3e génération : bosotunib (mutations réfractaires)

ITK : inhibiteurs de la tyrosine kinase.

rise blastique au niveau sanguin et médullaire. L’altérationlinique est conséquente. L’évolutivité sous forme d’uneeucémie aiguë est constante. L’absence de traitement seraétale. L’affirmation du diagnostic doit être envisagée dèsa découverte des symptômes essentiellement biologiquese la phase chronique. La réalisation d’un myélogrammest nécessaire pour assurer la lecture du frottis médul-aire mais également pour la réalisation d’un caryotypeui permettra d’identifier la présence de la transloca-ion 9/22 et donc le chromosome Philadelphie. La biopsiestéo-médullaire permet de réaliser l’analyse différentielleis-à-vis des autres syndromes myéloprolifératifs car dans

% des cas, il peut exister des LMC à chromosome Phi-adelphie négatif. L’appréciation de la myélofibrose estgalement rendue possible grâce à la biopsie de moellesseuse. Les tests biomoléculaires sont aujourd’hui indis-ensables et vont être réalisés dans le même temps. Ils sontffectués à partir du sang. Ils permettent la détection et lauantification de la protéine de fusion BCR/ABL. La conjonc-ion entre compréhension de l’origine moléculaire de la LMCt développement des inhibiteurs de tyrosine kinase per-ettant une thérapie ciblée a bouleversé la prise en chargees patients et leur devenir. Le rationnel du traitementujourd’hui vise à placer les sujets atteints en rémissionoléculaire dès la phase chronique pour éviter la survenue,

uparavant inéluctable, de la phase aiguë et le recours à uneypothétique allogreffe de moelle osseuse (Tableau 2). Lesnhibiteurs de tyrosine kinase sont donc employés dès quee diagnostic de LMC est posé [1]. Les inhibiteurs de tyro-ine kinase présentent en effet une forte spécificité poura protéine de fusion BCR/ABL qui est la cause principalee la maladie. Ils possèdent une affinité importante pourette protéine de fusion en se liant à la protéine onco-énique. Ils permettent l’inhibition puissante de l’activitéyrosine kinase, ce qui inhibe la prolifération leucémique etnduit l’apoptose des cellules BCR/ABL positives. Le patientst alors placé en rémission hématologique puis médul-aire. La négativation de la translocation 9/22 observée par’étude cytogénétique signe une réponse complète (CCyR).es tests biomoléculaires réalisés à partir du sang vont per-

eal time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR).ette démarche permet d’introduire la notion de rémissionoléculaire majeure ou complète (MMR ou CMR) beaucoup

2 G. Dine et al.

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Figure 3 Mise en évidence de la progression des transcritsBCR-ABL (CcyR : résistance complète observée par étude cyto-génétique). Supériorité de la RQ-PCR vis-à-vis de l’analysecoR

ucsLluLlledtacst(nrersppmtdlptsnplmBpllmo

04

lus sensible que la réponse cytogénétique. Elle autorise leuivi moléculaire de la maladie sous traitement ITK et paronséquent l’ajustement ou la substitution des ITK en cas’inefficacité affirmée par le suivi des transcripts BCR/ABL2].

eucémie myéloïde chronique et monitoringe la maladie résiduelle

vec les progrès accomplis en technologies biomoléculaires,eur simplification voire leur automatisation, le monitoringes transcripts BCR/ABL est devenu une routine indispen-able et sophistiquée pour assurer la prise en charge desatients atteints de LMC traités par ITK. Le schéma métho-ologique nécessite un échantillon sanguin obtenu sur EDTA.’extraction de l’ARN est codifiée grâce à l’utilisation d’uneechnique type Quick Gene 80. La détection qualitative desranscripts BCR/ABL est nécessaire dès la phase diagnos-ique et elle est maintenue dans le cadre du monitoringous traitement. La quantification des transcripts BCR/ABLevient indispensable pour apprécier leur cinétique. Laecherche translationnelle a permis de mettre à dispositiones outils industriels et standardisés du point de vue de laormalisation analytique et vis-à-vis des contrôles de qua-ité [3]. Cette démarche volontariste permet l’accréditationnternationale des laboratoires assurant ce type d’examens.lle assure aux patients la reproductibilité et la fiabilitées tests nécessaires. Il existe plusieurs approches visant à’automatisation complète. Certains laboratoires de biologieoléculaire toutefois continuent à employer des méthodesaison faisant appel à leurs propres réactifs suivant desrotocoles qui leur sont propres.

Pour ce qui est de la détection qualitative des transcriptsCR/ABL qui vaut pour le diagnostic initial de la maladiet pour le monitoring dès la mise en place du traitementar ITK, la routine spécialisée peut être standardisée. Ilaut réaliser une transcription inverse par reverse transcrip-ase polymerase chain reaction (RT-PCR). L’utilisation d’unhermocycler est nécessaire. Dans notre pratique, nous utili-ons un appareil Biorad. La détection des mutations dans unecond temps est validée en faisant appel au kit Seegene et àn second thermocycler de type Eppendorf. Généralement,a détection vise à mettre en évidence les principales trans-ocations en un seul temps, c’est-à-dire : c3a2, b1a1, b3a2,2a2, e1a2, b3a3, e1a3. D’autres translocations existent etlles peuvent être recherchées au coup par coup en cas deesoin après les premières analyses effectuées.

La recherche et la quantification des transcripts BCR/ABLar RQ-PCR permet d’assurer le monitoring du traitementar ITK. Il faut réaliser également une transcription inversear RT-PCR, faisant appel à un thermocycler Biorad. La quan-ification automatisée des transcripts se fait par RQ-PCRn utilisant le kit développé par la société Ipsogen et unppareil Light Cycler 480. Les résultats obtenus doivent êtrenterprétés selon la situation du patient et son traitement.arallèlement, le contrôle caryotypique permet d’observera réponse cytogénétique. Celle-ci est complète lorsque la

isparition du chromosome Philadelphie ou translocation/22 est obtenue. La biologie moléculaire permet d’affinera surveillance et surtout le monitoring pour apprécier’efficacité du traitement par ITK. La finalité est de mesurer

uL(e

ytogenétique à progression des transcripts BCR-ABL avec CCyRbservée: résistance ou mutations à rechercher.adich J.P., 2009 [1]

ne réponse moléculaire majeure. Ce monitorage biomolé-ulaire est directement possible à partir d’un échantillonanguin et ne nécessite pas de prélèvement médullaire.’appréciation de la maladie résiduelle minimale grâce à’emploi de la RQ-PCR permet de détecter quantitativementne cellule leucémique sur un million de cellules analysées.a capacité de détection de réduction de la masse molécu-aire tumorale équivaut à un facteur 10 000 avec l’emploi dea RQ-PCR en appréciant le niveau des transcripts BCR/ABLt observer ainsi une réponse moléculaire majeure. Lorse la réponse cytogénétique complète, le niveau de détec-ion de réduction de la masse tumorale cellulaire est limitéu facteur 100. La performance analytique de la RQ-PCRonstitue donc aujourd’hui le gold standard en matière deurveillance biologique des patients atteints de LMC trai-és par ITK en vue d’ajuster ou de modifier le traitementFig. 3). La puissance de l’outil a permis de proposer deouvelles limites entre rémission moléculaire majeure etémission moléculaire complète (Fig. 4). La comparaisonntre résultats cytogénétiques et moléculaires est favo-able au monitoring des transcripts BCR/ABL en termes deensibilité. La surveillance par RQ-PCR aujourd’hui n’estlus discutée. La cinétique des transcripts BCR/ABL desatients traités par ITK permet d’apprécier l’évolutionoléculaire même en cas de réponse complète cytogéné-

ique. Lors d’une rupture de pente avec élévation confirméees transcripts BCR/ABL, un mécanisme de résistance voire’apparition d’une mutation nécessitant des recherchesrécises et spécifiques doivent être recherchés. La quan-ification des transcripts BCR/ABL par RQ-PCR permet deituer la maladie résiduelle et de déterminer l’efficacité ouon du traitement par ITK. La littérature internationale aroposé, dans ces conditions, des référentiels visant à amé-iorer les traitements par ITK [4]. Aujourd’hui, les premiersois de traitement grâce au monitoring des transcriptsCR/ABL sont codifiés d’une manière précise employant enarallèle l’étude cytogénétique et les analyses biomolécu-aires. Si les résultats indiquent une évolution défavorable,a recherche de résistance et l’identification d’éventuellesutations doivent être effectuées. En fonction des données

bservées, le passage d’une ITK de première génération àne ITK de deuxième génération doit être prescrit (Fig. 5).

a mise à disposition d’une ITK de troisième générationbosotunib) permet de proposer maintenant une alternativen cas de mutation réfractaire notamment le type T315I.

Maladie résiduelle et leucémie myéloïde chronique 205

Figure 4 Suivi thérapeutique de la leucémie myéloïde chronique. Rémission moléculaire majeure ou complète à RMM et RMC.

On percoit donc toute l’importance du suivi biomoléculairepour apprécier la maladie résiduelle de la LMC sous traite-ment par ITK. Dans le souci d’optimiser la prise en chargedes patients, la communauté scientifique internationale aproposé la standardisation des résultats entre les différentslaboratoires. Sous l’égide des réseaux National Comprehen-sive Cancer Network et European LeukemiaNet, un indicede standardisation a été proposé : International Scale (IS)RQ-PCR [5,6]. Les industriels qui commercialisent les kitsréactifs et les systèmes analytiques permettant la détectionquantitative des transcripts BCR/ABL sont invités à respec-ter le label IS RQ-PCR. Il est demandé aux laboratoiresde biologie moléculaire concernés de procéder au mêmeeffort en utilisant des méthodes diagnostiques labellisées.De facon complémentaire aux préconisations émanant desréseaux internationaux cités, le groupe francais des biolo-gistes moléculaires des hémopathies malignes (GBMHM) acréé en 2011 un contrôle national de qualité portant surl’analyse des transcripts BCR/ABL sous l’égide de la Sociétéfrancaise d’hématologie.

Maladies résiduelles et efficacité du

traitement par ITK

3ème mois 6ème mois

Trans cripts BCR -ABL

> 10 % (RQ-PCR)

Trans cripts BCR -ABL

> 1 % (RQ-PCR)

Réponse cyto génétiqu e

> 35 % (Chr Ph+)

Répons e cyto génétiqu e

> 0 % (Chr Ph+)

Recherche de résista nce et de mutations � substit uti ons thérapeuti ques

J0

Figure 5 Suivi du traitement par les inhibiteurs de la tyro-sine kinase. Asco (juin 2012) : Hehlmann R, Hanfstein B, MullerMC et al. The prognosis significance of early molecular andcytogenetic response for long-term progresion-free and over allsurvival in imatinib-treated chronic myeloid leukemia (CML).

C

LLmtcdsmdldsttcLleldmdaeldLdlldiepsss

onclusion

a prise en charge diagnostique et thérapeutique de laMC a été bouleversée depuis dix ans. La compréhensionoléculaire de la maladie et la possibilité de disposer de

hérapies ciblées agissant sur le dysfonctionnement molé-ulaire propre à cette leucémie ont modifié totalement leevenir des patients. L’identification initiale du chromo-ome Philadelphie dans la LMC et l’utilisation de traitementsyélo suppresseurs il y a plus de 30 ans, avaient permise proposer des réponses imparfaites. L’emploi ensuite de’interféron associé ou pas à l’aracytine a permis l’obtentione rémissions leucémiques plus ou moins longues. Pour lesujets jeunes bénéficiant d’un donneur familial HLA compa-ible, l’allogreffe de moelle osseuse a représenté le seulraitement éradiquant la maladie avec toutefois un risqueonséquent lié à la méthode thérapeutique elle-même. LaMC touchant essentiellement des gens matures ou âgés,’indication d’allogreffe de moelle osseuse ne peut pas êtrextensive. La faible disponibilité des donneurs compatiblesimite considérablement l’intérêt de ce traitement vis-à-visu nombre de patients à soigner. Le démembrement bio-oléculaire des mécanismes de la LMC associé à l’efficacitées thérapies ciblées spécifiques apportent une réponse plusdaptée. Le diagnostic peut être rapide et précoce. La misen place d’un traitement actif sur la phase chronique permet’obtention de rémission moléculaire majeure pour ne pasire complète modifiant l’évolution naturelle de la maladie.’optimisation du traitement, son ajustement et l’utilisationes différentes ITK disponibles nécessitent dès le diagnostica mise en place du monitoring biomoléculaire portant sures transcripts BCR/ABL afin d’apprécier la maladie rési-uelle. Cette démarche biologique apparaît non seulementndispensable à l’affirmation du diagnostic de LMC mais ellest également incontournable pour assurer le suivi théra-

eutique et son efficacité [7]. En France les laboratoirespécialisés en charge des tests nécessaires au-delà de leuravoir-faire biomoléculaire doivent améliorer la standardi-ation des résultats en souscrivant au contrôle national de

2

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06

ualité en France mais également en veillant à l’emploi deéactifs et de méthodes labellisés (IS RQ-PCR).

éclaration d’intérêts

es auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts enelation avec cet article.

éférences

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[

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