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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université D’Oran Es- Sénia Faculté des sciences Département de Biologie Laboratoire de Microbiologie Appliquée
MEMOIRE
En vue de l’obtention du diplôme de Magister en Microbiologie
Option : Phytiatrie et Phytopharmacie
THEME
Etude de l’activité protéolytique et le profil protéique total chez Ascochyta rabiei
Présenté par :
TERBECHE FOUZIA
Membre de Jury :
Année Universitaire 2010-2011
Président : M. KIHEL Mebrouk Professeur à l’Université d’Oran
Rapporteur :
Co-rapporteur :
M. HENNI
Mme GUARBI
Jamal Eddine
Samia
Professeur à l’Université d’Oran
Maitre assistante A à l’U.S.T.O
Examinateur : M. SAHRAOUI Tewfik Professeur à l’Université d’Oran
Examinateur : M. SAIDI Noureddine Maitre de conférences à l’université d’Oran
Dédicaces
A la mémoire de mes grands-parents
A mes très chers parents
qui ont toujours été là pour moi, et qui m'ont donné un magnifique
modèle de labeur et de persévérance. J'espère qu'ils trouveront dans
ma réussite toute ma reconnaissance et tout mon amour.
A mes très chers frères et sœurs :
Nassima, Fodil, Zohir, Abd el azize , Lamia
et mon beau frère Omar.
A mes deux petits adorables anges : Annes et Khalil
A ma chère grande mère paternelle
A mon grand père maternel
A mes tantes et mes oncles
A mes cousins et cousines
A tous mes amis
Surtout Assia et Radia
Je dédie ce mémoire
Remerciements
Je tiens à remercier particulièrement mon encadreur, le professeur Henni Jamal-
Eddine, pour son aide précieuse et ces conseils judicieux qu’il m’a réservé durant la
réalisation de mon travail au sein de son Laboratoire de Microbiologie Appliquée, à
l’Université d’Oran au Département de Biologie, je lui assure le témoignage de ma profonde
reconnaissance.
Mes remerciements s’adressent à Madame Gharbi Samia, maitre assistante à
l'Université d'USTO, qui a accepté de me prendre en charge pour réaliser ce modeste travail.
Je remercie vivement les membres de mon jury :
Monsieur Kihal Mebrouk, Professeur au Département de Biologie à l'Université
d'Oran, pour son aide et ces conseils et d’avoir accepté de présider mon jury.
Monsieur Sahraoui Tewfik, Professeur au Département de Biologie à l'Université
d'Oran, Monsieur SAIDI Nour Eddine Maître de Conférences au Département de Biologie à
l'Université d’Oran, qui me font l’honneur d’examiner mon travail.
J’exprime mes plus vifs remerciements à M. karkachi,.M. Guessas madame Kaddar,
Melle
Benichou et Mme
Benfriha F, pour leur aide, conseils et encouragements.
Je tiens à remercier particulièrement M. Hassaïne O pour son précieuse aide, ces
conseils avisés et ces encouragements permanents.
J’adresse mes remerciements à Melle
Faiza et Monsieur Mohamed et tous mes
camarades de promotion.
Je n’omettrai pas de remercier la Direction des Services Agricole de la wilaya
d’Oran.
J’adresse mes sincères remerciements à mes parents et ma famille pour leur soutien,
aide et leurs encouragements. Qu’ils trouvent ici l’expression de ma respectueuse gratitude et
de mon entière reconnaissance.
A toutes les personnes qui ont participé de manière directe ou indirecte à
l’élaboration de ce mémoire, un grand merci pour eux.
RESUME
Ascochyta rabiei est un champignon pathogène causant une des plus sévères
maladies du pois chiche. En effet c’est un champignon qui présente une grande variabilité
morphologique et pathologique. Ce phytopathogène dispose d’un bagage enzymatique varié
qui peut intervenir dans la pathologie de ce champignon sur le pois chiche.
L’objectif de notre travail est d’étudier l’activité protéolytique chez Ascochyta rabiei
et la recherche du polymorphisme au niveau du profil protéolytique.
La présente étude a été effectuée par la méthodologie suivante :
En premier temps, l’isolement du parasite à partir des plantes malades et
l’identification de 14 souches.
Par la suite, la sélection de la souche A31 qui a révélé une expression de l’activité
protéolytique la plus élevée par rapport à l’ensemble des souches pour l’utilisation dans les
parties qui suivent.
L’étude de l’activité protéolytique exprimée par la souche A31 dans le surnageant de
culture de différents milieux et à différents pH par deux méthodes (l’activité protéolytique
évaluée en milieu solide et par dosage à l’UV) a permis d’enregistrer que la sécrétion des
protéases est variable selon le milieu de culture et son pH, et que la présence de la caséine a
un fort effet sur l’expression des protéases.
L’étude de l’activité protéolytique in vitro a nettement montré l’influence de la source
de carbone sur l’activité enzymatique des protéases car en absence du glucose, le
champignon a utilisé différentes familles de protéases, il s’agit de protéases acides, neutres et
alcalines. Ces protéases peuvent avec d’autres groupements enzymatiques intervenir dans le
pouvoir pathogène au cours du processus d’infection du Pois chiche.
L’étude de l’évolution du poids du mycélium de la souche A31 nous a renseigné sur
l’effet important que occupe cette activité lors de la croissance de ce champignon.
Le test du pouvoir pathogène a confirmé que les deux souches testées sont pathogènes,
ainsi l’étude du polymorphisme protéolytique des 14 souches a montré que les souches
appartiennent à deux groupes hétérogènes dont le premier est formé deux souches ( A10 et
A12) et le deuxième formé de deux souches(A1 et A22) et onze sous groupes présentant des
taux d’homogénéité partiellement différents.
Mots clés :
Anthracnose, Ascochyta rabiei , Cicer arietinum, activité protéolytique, profil protéique.
SUMMARY
Ascochyta rabiei is a pathogen causing one of the most severe diseases of chickpea.
Indeed it is a fungus which presents pathological and morphological variability. The
phytopathogenic boasts a diverse enzymatic baggage which plays a role in its pathogenecity
among which the protease.
The objective of this work leads on study of proteolytic activity of Ascochyta rabiei
and research of the polymorphism on proteolytic profile.
The work has been done by the following methodology:
First, isolation of the parasite from diseased plants and 14 isolates identification, following
by selection of a strain A31 that presents high values of proteolytic activity.
The the protéolytic activity was analysed with two methods (enzyme essay on solid
media and enzyme assay with UV) in different medium and pH.
The results show that protease production is dependent on pH and the casein and
carbon source present on de medium and that the fungi has produced different kind of
protease which are acid neutral and alkaline protease proteolytic activity have a large effect
on growth of the fungi moreover.
Study of pathogenic capacity helped us to highlight the aggressiveness of isolates
A31et A10 on chickpea plants.
Protein profile obtained by electrophoresis (SDS - PAGE) system which showed that the 14
strains belong to two groups and nine pennies groups.
Keywords: anthracnose, Ascochyta rabiei, Cicer arietinum, proteolytic activity , pathogenic
capacity, protein profile.
Ascochyta rabiei
A31
A31
caséine
A31 A1
Ascochyta rabiei
DEDICACES
REMERCIEMENTS
RESUME
INTRODUCTION………………………………………………………………………………………………..1
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
1. La plante hôte Le Pois chiche(Cicer arietinum .)………………………………........…………………3
1.1. Valeur nutritionnelle ………………………………………………………………………………..…3
1.1. a- Valeur nutritive par 100 g comestibles……………………………………………………………..…4
1.2. Production internationale……………………………………………………………………………………………..………4
1.3. Place du Pois chiche en Algérie………………………………………………………………………………………..……………6
1.3.1. Production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran…………………………………………………………..…6
1.3.2. Prévision de la production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran…………………………………………………………..…7
1.4. Historique et origine…………………………………………………………………………..……………………………………………..… 7
1.5. Classification classique……………………………………………………………..…………………………………………………………..…8
1.6 Etude générale de la plante……………………………………………………………………..…………………………………………………..… 9
1.7. Types de cultures…………………………………………………………………………………..……………………………………..… 10
2. La maladie de l’anthracnose…………………………………………………………………………………..……………………………………..… 11
2.1. Impact économique……………………………………………………………………..………………………………………………..… 11
2.2. Symptômes…………………………………………………………………………..……………………………………………..… 11
2.3. Epidémiologie………………………………………………………………………………..………………………………………..… 12
2.4. Cycle de la maladie…………………………………………………………………………………..……………………………..…13
2.5. Mécanismes d’infection……………………………………………………………………………………..…………………………………..…15
2.5.1. Itinéraire d’infection………………………………………………………………………………..……………………………..…15
2.5.2. Adhérence et pénétration……………………………………………………………………………..…………………………………………..…15
2.6. Méthodes de lutte…………………………………………………………………………………..……………………………………..… 16
3. L’agent causal……………………………………………………………………………..…………………………………………..…17
3.1. Taxonomie et caractéristiques d’Ascochyta rabiei………………………………………………………………………………..…17
3.1.1. Systématique d’Ascochyta rabiei………………………………………………………………………………………..………………………………..… 17
SOMMAIRE
3.2. Variabilé d’Ascochyta rabiei…………………………………………………………………………………………..……………………………..…19
3.3. Résistance du pois chiche à Ascochyta rabiei…………………………………………………………..… 20
3.3.1. Sur le plan génétique……………………………………………………………………………..…………………………………………..…20
3.3.2. Sur le plan pathologique…………………………………………………………………………..……………………………………………..… 20
3.4. Détection des activités enzymatiques chez Ascochyta rabiei……………………………………..……………………………………………………..…21
3.5. Variabilité protéique chez Ascochyta rabiei…………………………………………………………..… 21
MATERIELS ET METHODES
1. Etude morphologique………………………………………………………………………………..………………………………………..… 22
1.1-Echantillonnage……………………………………………………………………..…………………………………………………..… 22
1.2. L’isolement et la purification……………………………………………………………..…………………………………………………………..… 22
1.3. Conditions d’incubation…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 23
1.4. L’obtention des Cultures monospores…………………………………………………………..…23
1.5. La conservation des isolats…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 24
1.6. L’étude macroscopique…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 24
1.7. L’étude microscopique…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 24
2. Etude enzymatique…………………………………………………………..……………………………………………………………..…25
2.1. Croissance mycélienne de toutes les souches…………………………………………………………..……………………………………………………………..… 25
2.2- Evaluation en milieu solide de l’activité protéolytique exprimée dans
le surnageant de culture…………………………………………………..……………………………… 26
2.3- Dosage de l’activité protéolytique à l’UV…………………………………………………..……………………………… 26
3. Etude du pouvoir pathogène…………………………………………………..……………………………… 27
3.1. Les milieux de culture…………………………………………………..………………………………27
3.2. Conditions d’obtention des plantules…………………………………………………..……………………………… 27
3. 3. Préparation de l’inoculum…………………………………………………..……………………………… 29
3.4. Inoculation des plantes…………………………………………………..……………………………… 29
3.5. Réisolement du parasite…………………………………………………..……………………………… 30
4. Etude du profil protéolytique total…………………………………………………..……………………………… 31
4.1. Préparation des extraits enzymatiques pour le dosage des protéines totales des isolats………………………………………………..……………………………… 31
4 .1. 1. Culture du champignon……………………………………………..…………………………… 31
4 .1. 2. Obtention des extraits enzymatiques……………………………………………..…………………………… 31
4.2. Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford…………………………………………..………………………… 31
4.3 Electrophorèse des protéines totales par le système (SDS-PAGE)…………………………………………..………………………… 32
4.3.1. La préparation d’un gel (SDS-PAGE)…………………………………………..…………………………32
4.3.2. La dénaturation des échantillons…………………………………………..………………………… 33
4.3.3. La révélation des protéines totales…………………………………………..………………………… 33
RESULTATS ET DISCUSSIONS
1. L’étude morphologique des isolats…………………………………………..………………………… 34
1.1. Isolement…………………………………………..…………………………………………………………..…………………………34
1.2. Les caractères macroscopiques…………………………………………..………………………… 34
1.3. Les caractères microscopiques…………………………………………..………………………… 36
1.4. Conservation des isolats…………………………………………..……………………………………………………..………………………………………… 37
2. Etude enzymatique…………………………………………………………………………………..……………………………..…………………………38
2.1. Croissance mycélienne de toutes les souches sur différents milieux…………………………………………..…………………………38
2.2. Etude de l’activité protéolytique exprimée par la souche A31 dans le surnageant
de culture de différents milieux et à différents pH…………………………………………..…………………………40
2.2.1. Évaluation en milieu solide de l’activité protéolytique exprimée dans
le surnageant de culture………………………………………………………………………..………………………………………..…………………………40
2.2.2. Dosage de l’activité protéolytique exprimée dans le surnageant de culture……………………………………………..……………………………40
a- Dans le milieu Czapeck glucose additionné de la caséine……………………………………………..……………………………41
b- Dans le milieu Czapeck glucose………………………………………………..……………………………… 42
c- Dans le milieu Czapeck additionné de la caséine………………………………………………..……………………………… 43
2.3 Evolution du poids du mycélium dans différents milieux et à différents pH………………………………………………..……………………………… 45
a- Dans milieu Czapeck-glucose ajouté et ou dépourvu de caséine à pH :4, 6 et 8………………………………………………..……………………………… 45
b- dans milieu Czapeck caséine à pH : 4, 6 et 8………………………………………………..……………………………… 46
3. Evaluation du pouvoir pathogène des isolats d’Ascochyta rabiei………………………………………………..……………………………… 47
4. Etude du profil protéolytique………………………………………………..……………………………… 50
4.1 Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford………………………………………………..……………………………… 50
4.2 Electrophorèse des protéines totales………………………………………………..……………………………… 51
CONCLUSION GENERALE………………………………………………..……………………………… 54
ANNEXE
REFRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Liste des abréviations
°C : Degré Celsius
cm : Centimètre
D.O : Densité optique.
FAO : Food and Agricultural Organization of the United Nations
g : Gramme
ha : Hectare
I.C.R.I.S.A.T : International Crops Research Institute for the Semi Arids tropics in
Inde.
I.C.A.R.D.A : International Center For Agricultural Research in the Dry Areas.
J : Jour
M : Molaire
mg : Milligramme
µg : Microgramme
ml : Millilitre
MQ : Moyenne quotidienne
P : Poids
PC : Milieu pois chiche
pH : Potentiel d'Hydrogène
q : Quintaux
q.s.p : Quantité suffisante pour
S.D.S-PAGE : Electrophorèse en gel de Polyacrylamide avec SDS (Sodium dodecyl
sulfate).
TCA : Acide Trichloracétique.
TEMED : Tetramethylaminomethane.
TRIS : Tris-Hydroxymétylaminomethane.
U : Unité
V : Volume
Liste des tableaux
Tableaux Pages
Tableau n° 01 : Table de composition des aliments 04
Tableau n° 02 : Bilan de production de pois chiche dans le monde durant la
période (2002-2007) (skypertz, 2006).
05
Tableau n° 03 : Récapitulatif des superficies, des productions, des rendements et
des taux d’accroissement 2005/2006 (Ministère de l’Agriculture).
06
Tableau n° 04 : Bilan des superficies et des productions de pois chiche durant la
période (2005-2010) dans la wilaya d’Oran.
06
Tableau n° 05 : Bilan des prévisions des superficies et des productions de pois
chiche durant la période (2011-2014) dans la wilaya d’Oran
07
Tableau n° 06 : Caractères systématiques d’ Ascochyta rabiei 17
Tableau n° 07 : Echelle quantitative à 9 points pour la notation des réactions du
pois chiche à l’anthracnose
30
Tableau n° 08 : Dilutions de la courbe d’étalonnage 32
Tableau n° 09 : Origine des souches d’Ascochyta rabiei isolées des différents
sites de l’Ouest Algérien
34
Tableau n° 10 : Comportement des hôtes différentiels vis-à-vis de la souche A31 et
A10
47
Tableau n° 11 : Densité optique (D.O.) de chaque dilution de la courbe
d’étalonnage des protéines totales
50
Tableau n° 12 : Densité optique (D.O.) et concentration en protéines dans chaque
extrait enzymatique des isolats d’Ascochyta rabie
51
Tableau n° 13 : Résultats de l’éléctrophorèse des protéines totales 52
Tableau n° 14 : Taux de similitude des bandes des protéines de toutes les souches 52
.
Liste des photos
Photo n° 01 : le pois chiche, Cicer arietinum L 09
Photo n°02 : types de Graines de pois chiche : type Kabuli et type Desi 10
Photo n° 03 : Cycle de l’anthracnose du pois chiche 14
Photo n° 04 : Plantes de Pois chiche présentant les symptômes de l’anthracnose 22
Photo n° 05 : Pré germination des graines 28
Photo n° 06 : Germination des graines 28
Photo n° 07: Plantes de pois chiche saines âgées de 10 jours avant l’inoculation 28
Photo n° 08 : Plantes de pois chiche inoculées avec une suspension sporale de la
souche A31 recouvertes d’un sac en plastique
29
Photo n° 09 : Isolement d’Ascochyta rabiei à partir des tiges de plante malade 35
Photo n° 10 : Aspect morphologique du mycélium sur milieu pois chiche gélosé 35-
36
Photo n° 11 : Observations au microscope optique des pycnides d’Ascochyta
rabiei au grossissement (X 400)
37
Photo n° 12 : Conservation des souches dans des tubes à essai contenants milieu
pois chiche gélosé incliné
38
Photo n° 13 : Aspect du mycélium de la souche A31 sur milieu Czapeck glucose
additionné à la caséine
39
Photo 14 : Activité protéolytique exprimée dans le milieu solide 40
Photo 15 : Les différentes étapes du test de pouvoir pathogène 47-
49
Photo 16 : Profil éléctrophorétiques des protéines totales d’Ascochyta rabiei 51
Liste des figures
Figures Pages
Figure n° 01 : Représentation du développement de toutes les souches sur différents
milieux : Czapeck-caséine-glucose, Czapeck-glucose et Czapeck-caséine
38
Figure n° 02 : Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le
filtrat de milieu de culture (Czapeck-glucose+caséine) évaluée en milieu solide (A)
et par dosage à l’UV (B).
41
Figure n° 03: Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le
filtrat de milieu de culture (Czapeck-glucose) évaluée en milieu solide (A)
et par dosage à l’UV (B).
42
Figure n° 04 : Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le
filtrat de milieu de culture (Czapeck-caséine) évaluée en milieu solide (A)
et par dosage à l’UV (B).
43
Figure n° 05 : Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck glucose à pH : 4, 6
et 8 (A): en présence de caséine, (B) en absence de caséine.
45
Figure n° 06 : Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck+caséine
à pH : 4, 6 et 8
46
Figure n° 07 : Courbe d’étalonnage des protéines 50
Figure n° 08 : Représentation des 14 souches en dendrogramme 53
INTRODUCTION
INTRODUCTION
1
INTRODUCTION
Le pois chiche (Cicer arietinum) se compte parmi les cultures légumineuses les
plus importantes dans le monde. Il occupe la troisième place après le haricot (Phaseolus
vulgaris) (Saxena, 1992).
L’anthracnose du pois chiche causée par (Ascochyta rabiei) est responsable de la
régression de cette culture dans la plupart des zones où elle est cultivée
(Nene et Reddy, 1987).
En Algérie, cette culture qui fournit une graine riche en glucides et en protéines,
est caractérisée par une production instable due principalement à la présence de cette
maladie et à l’utilisation d’un matériel végétal hétérogène et peu amélioré. Les
programmes internationaux actuels, sur les légumes secs, encouragent les efforts
nationaux à améliorer la production de cette culture, notamment par l’utilisation de
variétés résistantes.
Pour stabiliser la productivité de cette culture, une attention particulière est
donnée à la sélection, pour la résistance aux différents stress biotiques et abiotiques.
L’évaluation de cette résistance pour l’anthracnose nécessite une meilleure
connaissance du champignon.
En effet, Ascochyta rabiei est un champignon qui présente une grande variabilité
morphologique et pathologique (Djaoui, 1985 ; Djellali,1988 ; Yamina,1990 ;
Labdi,1990 ; El Biari,1995).
Une étude portant sur la corrélation entre les activités enzymatiques in vitro et le
pouvoir pathogène a montré que les isolats les plus agressifs sont ceux qui produisent le
plus d’enzymes hydrolytiques (Tchicha, 1991). Par ailleurs, une étude sur les toxines a
également montré une corrélation positive entre l’agressivité et la sécrétion des toxines
(Latif et al., 1993). Ces études mettent en évidence une variabilité biochimique du
champignon.
INTRODUCTION
2
Tous ces travaux ont contribué à mieux connaitre le pathogène et sa pathologie
et donc à expliquer la différence dans le comportement des lignées sélectionnées. Ils
permettront la mise en place d’une stratégie de lutte spécifique afin d’améliorer la
sélection à la résistance.
Le but de notre travail serait donc d’apporter une contribution à la connaissance
de la diversité biochimique de ce champignon par l’étude in vitro de l’activité
enzymatique protéolytique et le profil protéolytique total.
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
3
1. La plante hôte Pois chiche (Cicer arietinum) :
1.1. Valeur nutritionnelle :
Le pois chiche, au même titre que la fève et les haricots, est une graine
protéagineuse cultivée pour sa richesse en protéine. Il fait partie du nombre très réduit
d’aliments qui apportent à la fois des protéines et un grand nombre de sels minéraux
(calcium, fer, potassium et phosphore) jouant un rôle important dans l’alimentation. Elle
renferme entre 20 % et 25% de protéines. A titre de comparaison, la teneur en protéines
de la viande est de 16 à 25% et celle du poisson de 14 à 20% (Anonyme b, 2004).
Leur teneur élevée en protéines est le principal atout des légumineuses.
A cet égard, les pois chiches s’en tirent moins bien que le soja, chez qui la proportion de
protéines atteint 39% des calories. Les pois chiches n’atteignent que 23%, mais cela
reste le double de ce que peuvent offrir les céréales, et plus que ce que l’on trouve dans
la viande.
En ce qui concerne l’acide aminé essentiel, la méthionine, la prétendue «valeur
biologique» de la protéine alimentaires activent la digestion, et la lécithine, un élément
important du métabolisme contenu dans toutes les légumineuses, diminue le taux de
graisse dans le sang et fortifie les nerfs. Différentes vitamines essentielles, comme
celles du groupe B – en particulier l’acide folique – et des sels minéraux comme le fer,
le potassium, le calcium, le magnésium et le phosphore, de même que divers oligo-
éléments, (Tableau n°01).
Les rumeurs persistantes selon lesquelles les légumineuses feraient grossir, sont comme
dans le cas des pommes de terre fausses. Si l’on excepte le soja, la part de graisse
contenue dans ce type d’aliments est minime. Dans le cas des pois chiches elle se monte
à 4%. Le fait qu’il s’agisse d’acides gras insaturés et qu’il ne s’y dissimule pas de
cholestérol, et plus encore, le fait que les pois chiches contiennent des saponines qui
influence positivement le taux de cholestérol, tout cela parle en faveur de cette
légumineuse. Elle présente un intérêt particulier pour les diabétiques, car elle fait
grimper moins vite le taux de sucre sanguin que les autres aliments riches en glucides
(BAUMGARTNER.A, 1998).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
4
1.1. a- Valeur nutritive par 100 g comestibles :
Tableau n° 01 : Table de composition des aliments (BAUMGARTNER.A, 1998)
1.2. Production internationale
D’après les statistiques de la FAO, la production mondiale annuelle de pois
chiche et la superficie récoltée sont restées relativement stables entre 1961 et 2003, la
première avoisinant les 7 millions de tonnes et l’autre les 10 millions d’hectares. Les
principaux pays producteurs sont l’Inde, la Turquie, le Pakistan, la Canada, le Mexique
et l’Australie.
Energie (kcal) 275
Eau (g) 10.4
Protéines (g) 20.0
Graisse (g) 4.4
Glucides (g) 48
Fibres alimentaires (g) 15
Sodium (mg) 30
Potassium (mg) 700
Calcium (mg) 140
Phosphore (mg) 350
Magnésium (mg) 130
Fer (mg) 7
Vitamine A (μg) 30
Vitamine B1 (mg) 0.50
Vitamine B2 (mg) 0.17
Niacine (mg) 1.5
Vitamine B6 (mg) 0.54
Vitamine B9 [acide folique] (μg) 180
Vitamine C (mg) 4
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
5
Tableau n° 02: Bilan de production de pois chiche dans le monde durant la période
(2002-2007) (Skypertz, 2006).
Monde. Bilan de pois chiche
Année 2002-2003 2003-2004 2004-2005 2005-2006
ep
2006-2007 p
Superficie
récoltée (Kha)
9 900 10 925 10 545 10 710 10 800
Rendement
moyen (t/ha)
0.72 0.80 0.79 0.82 0.80
……………..milliers de tonnes……………
Stocks de report (e)
400 100 400 300 500
Production :
Inde
Turquie Pakistan
Australie
Iran Mexique
Mayanmar
Canada
Ethiopie Irak
Etats-Unis
Syrie Espagne
Maroc
Autre Production totale
Production totale
Kabuli (e)
Production totale Desi (e)
Offre totale
Utilisation totale (e)
Stocks de fin de
compagne (e) Rapport
stocks/Utilisation
4 240
650 362
139
300 235
212
156
187 97
38
89 70
51
253 7 085
2 103
4 982
7 485
7 385
100
1%
5 720
600 675
186
310 240
228
68
114 104
20
87 51
43
275 8 721
1 885
6 866
8 821
8 421
400
5%
5 470
620 611
123
310 240
230
51
136 100
27
45 57
42
271 8 333
1 871
6 462
8 733
8 433
300
4%
5 650
610 868
138
310 240
230
104
135 95
49
55 10
42
288 8 832
1 914
6 918
9 132
8 632
500
6%
5 700
610 400
304
280 240
230
163
135 100
67
55 40
40
286 8 650
2 005
6 645
9 150
8 650
500
6%
e : estimation d’AAC, septembre 2006 ; ep : estimation provisoire
p : prévision d’AAC et de Pulse Australia, septembre 2006 ; Source : FAO, India. Department of Agriculture. ABARE. Pulse Australia.USDA et Statistiques Canada.
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
6
1.3. Place du Pois chiche en Algérie :
Le pois chiche (Cicer arietinum L) est, en Algérie, la seconde légumineuse
alimentaire produite après les fèves. Sa culture a connu, durant la décennie 1980-90 une
certaine évolution progressive sur le plan des superficies et de la consommation et une
évolution régressive en terme de productivité (Anonyme d, 1994). Les causes de la
faiblesse de la productivité du pois chiche en Algérie sont souvent d’ordre agro
techniques liées aux conditions de semis (période, modes de semis, qualité de la
semence) et à l’infestation par les adventices (Hamadache et Ait Abdallah., 1998).
Tableau n° 03 : Récapitulatif des superficies, des productions, des rendements et
des taux d’accroissement 2005/2006 (Ministère de l’Agriculture).
2005 2006 Taux d’accroissement% 2005-2006
Sup
(ha)
Prod (q) Rdt
(q/ha)
Sup
(ha)
Prod (q) Rdt
(q/ha)
Sup Prod Rdt
Pois-
chiches
23 348 137 270 5.9 21 252 127 058 6.0 -9 -7 2
1.3.1Production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran :
Selon la direction des services agricole (service statistique) :
Tableau n° 04 : Production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran.
Année 2005 2006 2007 2008 2009 2010
Superficie
(hectare)
140 202 96 82.5 114 181
Production
(quinto)
1325 970 598 195 880 /
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
7
1.3.2 Prévision de la production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran :
Tableau n° 05 : Prévision de la production du Pois chiche dans la wilaya d’Oran.
Année 2011 2012 2013 2014
Superficie
(hectare)
116 185 187 188
Production
(quinto)
1180 1300 1400 1500
1.4. Historique et origine :
Le pois chiche est parmi les premières légumineuses à graines domestiquées par
l’homme depuis l’antiquité (Van Der Maesen., 1987). Les premières traces
d’utilisation du pois chiche comme aliment remontent à environ7000 ans. Il aurait été
cultivé pour la première fois dans la région méditerranéenne il y a 5000 ans.
Le pois chiche est originaire du Moyen-Orient, plus précisément du sud-est de la
Turquie et de la Syrie (Saxena, 1984 ;Smithson et al., 1985 ; Singh, 1997). Il arriva
sur les côtes du bassin méditerranéen après avoir traversé de nombreux pays et les
Phéniciens pourraient être à l’origine de cette diffusion (BAUMGARTNER.A, 1998).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
8
1.5. Classification classique:
Selon : Bedard et al, 2005, la classification du Pois chiche est la suivante :
Le pois chiche
Règne Plantae
Sous-règne Tracheobionta
Division
Magnoliophyta
Classe
Magnoliopsida
Sous-classe Rosidae
Ordre Fabales
Famille Fabaceae
Genre
espèce
Cicer
arietinum
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
9
1.6 Etude générale de la plante :
Le pois chiche est une légumineuse annuelle, autogame, herbacée
(Summerfield et Robert, 1985). C’est une plante haute de 20 à 50 cm, à port dressé,
cultivée pour ses graines rondes contenues au nombre de 1 ou 2 dans des gousses
(Photo n° 01) .Cicer arietinum est la seule espèce annuelle cultivée (Summerfield et
al, 1984 ; Van Der Maesen, 1987 ; Giller., 2001).
Le semis du pois chiche se fait au printemps dans la région Nord
méditerranéenne.
Les besoins en humidité dans le sol de la plante sont de 15- 40% pendant la germination
et le développement de la graine ; l’humidité excessive du sol à la floraison réduit le
rendement en grain (Wery et al, 1994).
Photo n° 01
le pois chiche, Cicer arietinum L. : tige feuillue (A), feuille composée de 16 folioles
(B), fleur zygomorphe (C), étamines, pistil et ovaire (D), gousses en
développement (E), graines (F). (Zohary et Hopf, l988).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
10
1.7. Types de cultures :
On distingue 2 groupes principaux : les types kabuli et les types Desi ; il existe
également des cultivars intermédiaires. Les variétés de type Dési sont d’origine
Méditerranéenne (Wang et al., 2005) et présentent environ 85% du pois chiche cultivé,
elles ont habituellement de petites graines, angulaires, de couleur foncée, des fleures
rose et la pigmentation d’anthocyanine sur les tiges (Ahmed et al., 2005).
Les types Kabuli, d’origine Indienne (Wang et al, 2005), qui couvrent les 15%
restant des superficies, sont caractérisés par des grandes graines lisses, un manque de
pigmentation d’anthocyanine et leurs fleures sont blanches (Ahmed et al., 2005) (voir
Photo n° 02).
Photo n°02
types de Graines de pois chiche : type Kabuli- (gauche) et type Desi- (droite)
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
11
2. La maladie de l’anthracnose :
2.1. Impact économique :
Cette maladie a été décrite en Pakistan par Buttler (Nene et Reddy1987).
L’anthracnose dû exister avant puisque le pois chiche est une ancienne culture dans le
subcontinent Indien. Depuis, elle a été décrite dans la plupart des pays où la culture y
est pratiquée (Nene et Reddy,1987).
Cette maladie et sa capacité destructive fait qu’elle est devenue très répondue dans
plusieurs pays produisant cette culture.
2.2. Symptômes :
La maladie affecte toutes les parties de la plante et ce, durant tout le cycle végétatif
de l’hôte (Reddy, 1984). Les plantules provenant de semences contaminées montrent
des lésions brunes foncées au niveau du collet.
Sur les feuilles nouvellement formées, des petites taches blanches et nécrotiques
apparaissent en conditions favorables. Ces lésions s’étendent rapidement et s’unissent
causant le brunissement des bourgeons.
Sur feuilles âgées, les lésions sont arrondies ou allongées avec un centre gris et des
marges brunâtres.
Les pycnides apparaissent comme des points noirs arrangés en cercles
concentriques.
Les graines produites dans ces gousses infectées présentent des lésions brunes
foncées.
Quand les gousses sont atteintes dans leur jeune stade de développement, elles
deviennent brunes et ne produisent pas de semence, ou produisent alors des graines
sombres et ratatinées (Reddy, 1984).
Sur tiges et pétioles, les lésions sont brunes et allongées (3 à 4 cm), les pycnides
en forme de points noirs entourent souvent la portion affectée. Quand les lésions
entourent la tige, la portion de dessus meurt rapidement (Reddy, 1984).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
12
2.3. Epidémiologie :
Les facteurs climatiques conditionnent l’importance de l’attaque du parasite.
Aucune attaque ne peut avoir lieu en dessous de 6°C et ce, quelque soit l’hygrométrie
et pendant les périodes d’humidité inférieures à 6 heures et ce, quelque soit la
température.
La température maximale permettant l’infection est de l’ordre de 30°C ; des
températures entre 15 et 25°C favorisent énormément le développement du pathogène.
En conditions naturelles, les périodes humides prolongées, avec des températures
d’environ 20°C sont très favorables à la propagation de la maladie. Les précipitations
sont le facteur le plus important, et elles déterminent la gravité de l’épidémie ; la pluie
contribue en effet à la réalisation de l’infection puis à la dissémination du parasite et le
vent aggrave la dissémination des spores (Bret, 1990).
La période de latence est définie comme étant le délai qui s’écoule entre
l’infection et l’apparition des premiers symptômes. Elle augmente avec les basses
températures : 5°C-18 jours ; 10°C- 9 jours ; 15°C- 7 jours ; 20°C à 25 jours
(Ameziane, 1985).
Ainsi, pour les températures de printemps qui correspondent à la période de
culture du pois chiche semé au printemps, la période de latence est courte, entraînant les
invasions successives et rapides.
Par contre, pour les semis d’hiver, la période de latence est beaucoup plus
longue, ce qui ralentit l’extension de la maladie (Ameziane, 1985).
Les rapports sur les épidémies de la maladie indiquent l’existence de
mécanismes efficaces pour la survie du champignon d’une saison à l’autre. Les débris
malades et les graines infectées sont une source d’inoculum importante pour l’infection
primaire pour la saison suivante.
Luthra et al en 1935, cité par (Nene et Reddy, 1987), ont été probablement les
premiers à démontrer la nature de la transmission du pathogène par semence. Ils
montrèrent que l’enveloppe de la graine et les cotylédons des semences infectées
contiennent du mycélium.
La propagation de la maladie a été attribuée principalement aux pycnospores
produites par le foyer primaire de l’infection qui opère soit à travers les débris de
récolte, ou les semences infectées. L’inoculum porté par les graines joue un rôle
primordial dans l’épidémiologie de la maladie, nettement plus important que celui
représenté par les débris, car plus que 93% des semences infectées sont capables de
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
13
produire un foyer d’infection. En condition défavorable pour la maladie, on peut
observer un démarrage rapide des plants affectés pouvant produire raisonnablement
selon la durée de la période de croissance (Nene et Reddy,1987).
2.4. Cycle de la maladie
Puisque la détection des traces d’Ascochyta rabiei à l’intérieur et sur les graines
est difficile, le champignon phytopathogène est facilement dispersé dans et sur les
graines de Pois chiche (Wiese et al., 1996) et constituent en plus des résidus infectés les
moyens primaires de la contamination par ce parasite.
Le champignon phytopathogène produit deux types de spores :
a) Spores asexuées : les spores asexuées les plus courantes sont les conidies qui
sont exsudées du pycnides dans une masse collante et exige les éclaboussures de la
pluie pour les écarter aux plantes environnantes. Ces spores résultent de la reproduction
asexuée du champignon phytopatogène, elles se développent aisément dans les
conditions humides et sont produites dan toutes la période de la saison de croissance.
b) Spores sexuées : La recherche récente en Saskatchewan (Canada) indique qu’un
deuxième type de spores peut se produire et se développe sur les résidus de Pois chiche
infectés. Les ascospores qui sont produites dans des pseudothèces pendant l’hiver
résultent de la reproduction sexuée (Pearse et al., 2005) (voir photo n°03).
Il s’est avéré que les pseudothèces et les pycnides peuvent rester viables pendant
au moins 2 années lorsqu’on les laisse à la surface du sol, mais ils sont seulement
viables 2 à 5 mois après enterrement (Weise et al., 1996).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
14
Photo n°03:
Cycle de l’anthracnose du pois chiche causé par Ascochyta rabiei (Pearse et al., 2005).
En hiver les résidus infectés de pois
chiche produisent
de nouvelles spores Les conidies sont le résultat
de la reproduction asexuée
Les ascospores sont le résultat
de la reproduction sexuée
Des lésions entièrement
développées sur la feuille
du pois chiche
Propagation de la maladie par
l'éclaboussure de pluie des spores
pendant la saison de croissance
Les lésions au niveau
d’une gousse
Perte en rendement et en
qualité des semences
Des lésions entièrement
développées sur la tige
du pois chiche
Les premiers signes de
l’anthracnose, des lésions sur
le feuillage du pois chiche
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
15
2.5. Mécanismes d’infection
2.5.1 Itinéraire d’infection
Ascochyta rabiei pénètre normalement la plante de Pois chiche à travers la
cuticule du feuillet, après germination des spores, l’élongation du tube germinatif et la
formation d’un appressorium comme structure d’infection. La pénétration se produit à
travers les parois des cellules épidermiques, sans envahir le protoplaste le
phytopathogène s’étend dans l’espace intracellulaire entre les cellules épidermiques et
la palissade de parenchyme, procède par les lamelles moyennes dans les tissus de
parenchyme du feuillet par les pétioles à la tige. Le phytopathogène peut également
pénétrer la tige directement par la cuticule à l’intérieur, il s’étend principalement dans le
phloème mais les dommages importants se produisent dans les tissus parenchymateux,
les tissus non lignifiés sont complètement détruits, et les tissus lignifiés (en particulier
xylème) sont également endommagés mais restent structurellement intact (Jayakumar
et al, 2005).
2.5.2. Adhérence et pénétration
L’étape nécessaire dans l’infection par les microbes pathogènes est l’adhérence
aux surfaces des plantes. La première barrière pour le parasite est la cuticule de l’hôte,
toutes les parties aériennes des plantes sont normalement couvertes d’une cuticule. En
plus de la cutine, d’autres éléments principaux structuraux des parois des cellules de la
plante sont les pectines et les xylanes. Les tubes germinatifs du microbe sécrètent un
grand nombre d’exsudats mucilagineux qui produisent un contact serré à la cut icule, cet
exsudat également scelle le site d’infection et protège les tubes germinatifs contre la
dessiccation. L’appressoria d’Ascochyta rabiei est non mélanisé, donc la pénétration de
la cuticule n’est pas probablement due à des forces mécaniques, dans leurs absence, le
taux de pénétration de la cuticule est souvent accompagné par la production d’enzymes
tels que les cutinases, xylanases et les pectinases qui attaquent les parois cellulaires. Les
parois des cellules épidermiques sous les hyphes subcuticulaires sont particulièrement
digérées. Le cytoplasme devient désorganisé et des substances électron-denses
extracellulaires. Cette observation indique que les enzymes de dégradations des parois
cellulaires sont impliquées dans la pénétration (Jayakumar et al, 2005).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
16
2.6. Méthodes de lutte :
La méthode de lutte la plus utilisée reste la lutte chimique. Elle concerne le
traitement des semences qui agit sur la phase de transmission de l’agent pathogène des
graines aux plantules et le traitement en végétation qui tente d’éviter la contamination
des gousses et donc des nouvelles graines.
Malgré l’importance de la contamination des semences dans l’apparition de la
maladie, la lutte par des techniques culturales appropriées est à prescrire pour diminuer
l’inoculum primaire.
Aussi, Reddy (1984) préconise le semis à 10 cm, ce mode qui rend l’inoculum
transmis par la semence inaffectif à cette profondeur, comme il préconise également la
rotation, avec l’alternance du pois chiche avec les céréales, et le labour profond pour
prévenir l’inoculum à partir des débris malades provenant des cultures précédentes.
Actuellement l’utilisation de cultivars tolérants à résistants, apparait être le
meilleur moyen pour contrôler la maladie.
Plusieurs sources de résistances ont été relevées chez les types Desi et Kabuli.
Seulement, l’utilisation de variétés résistantes exerce une pression de sélection sur la
population parasite qui conduit à l’apparition de nouvelles races ou pathotypes capables
de contourner cette résistance. En effet, Ascochyta rabiei possède une grande variabilité
pathogénique en raison de l’existence de plusieurs races physiologiques ou pathotypes
(Bedi et Aujla, 1969 ; Vir et Grewal, 1974 ; Reddy et Kabbabeh, 1985 et Labdi,
1990).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
17
3. L’agent causal
3.1. Taxonomie et caractéristiques d’Ascochyta rabiei :
3.1.1. Systématique d’Ascochyta rabiei :
Tableau n°06 : Caractères systématiques d’ Ascochyta rabiei (Chadefaud et
Embrger , 1960)
Subdivision
Deuteromycotiana
Mycélium cloisonné, coloré ou hyalin; Cycle incomplet: forme
parfaite non connue. Reproduction asexuée avec formation de
conidies.
Classe
Coléomycétes
Regroupe les champignons se reproduisant asexuellement avec
des appareils sporifères de types pycnides ou acérvules.
Ordre
Sphaéropsidales
Produisant des conidies regroupées en stroma et formant des
pycnides. Libération de spores par des ouvertures de types
ostioles.
Famille
Sphaéropsidacées
Pycnides avec une ou plusieurs cavités, Spores sèches ou
mucilagineuses, hyalines ou de couleur brune, uni ou
pluricellulaires.
Genre
Ascochyta
Conidies hyalines, bicellulaires, ovoïdes ou légèrement
allongées, avec des extrémités arrondies
espèce
rabiei
Agent responsable de l’anthracnose du pois chiche.
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
18
La forme imparfaite du champignon est caractérisée par la formation de
pycnides visibles sur les lésions portées par l’hôte ; sphériques ou piriformes pourvues
d’un ostiole et mesurant 25µm de diamètre (Sattar, 1933 cité par Nene et Reddy,
1987).
Les hyphes sont hyalins ou bruns et septés. Les pycnides contiennent des spores
portées par de courts conidiophores baignant dans une masse mucilagineuse (cirrhe).
Les conidiospores sont généralement unicellulaires, occasionnellement
bicellulaires, ovales ou cylindriques, droites ou légèrement arrondies à une ou deux
extrémités et hyalines.Kovachevski en 1936 (Nene et Reddy 1987) rapporte une taille
des spores de 6.0 à 16.0 µm x 3.4 à 5.6 µm sur l’hôte et de 4.8 à 14.0 µm x 3.2 à 5.2 µm
sur milieu artificiel. Cette taille serait de 8.2 à 10 µm sur 4 à 5 µm selon (Khunet et
Kpoor ,1980) ou 8.2 à 10 µm sur4.2 à 4.5 µm selon (Nene et Reddy ,1987).
La forme parfaite d’Ascochyta rabiei , Ddymella rabiei (Kovachevski) v. Arx,
appartient à la subdivision des Ascomycotina, à la classe des loculoascomycetes et à
l’ordre des Dothideales (Arx, 1987).
La forme parfaite a été observée en 1936 par Kovachevski et la nomma
Mycosphaerella rabiei Kovachevski. Les périthèces ont été observés uniquement sur
des gousses abandonnées sur le champ durant l’hiver. Ils sont brun-noir globuleux ou
aplatis avec un bec très net et un ostiole, avec une taille variant de 76 à 152 x 120µm
Les asques sont cylindriques, plus ou moins courts, pédicellés mesurant de 48 à 70x 9 à
13.7 µm.
Les ascospores (8 par asque) sont ovoïdes, divisés en 2 ou unicellulaires avec
une constriction au niveau de la cloison, mesurant de 12.5 à 19 x 6.7 µm. La forme
parfaite a également été observée en URSS par Gorlenko et Bushkova en 1958 et en
Grèce par Zachos et al en 1963 in ; (Nene et Reddy,1987).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
19
3.2Variabilé d’Ascochyta rabiei
Les études montrent que le champignon Ascochyta rabiei possède une forme
pathogène très variable. L’existence de races physiologiques a été signalée par( Bedi et
Aujla ,1969). Vir et Grewal, en 1974 ont identifié deux races (race 1 et 2) et un biotype
de la race 2. Reddy et Singh en 1983, ont identifié 4 races et 4 biotypes de ces races
suivant les réactions de 18 génotypes différentiels. En 1985, Reddy et Kabbabech ont
défini 6 races physiologiques du champignon selon les réactions différentielles de 6
génotypes de pois chiche.
Une étude sur la vérifiabilité géographique d’ Ascochyta rabiei montre que les
différences de pathogénèse des isolats seraient attribuées plutôt à une variation dans
l’agressivité (Gowen et al., 1989).
Hmidullah et Wiese (1991), dans une étude pour classer 39 isolats en race, ont
détecté 11 formes de virulences ; 9 des isolats ressemblaient aux 6 races de
l’I.C.A.R.D.A et seraient très virulents. Ils conclurent que la population d’ Ascochyta
rabiei dans la pelouse est composée de formes différentes de virulences.
L’existence d’une interaction différentielle entre les 6 races d’I.C.A.R.D.A et
des lignées de pois chiche n’a pas été complètement confirmée par l’étude de Labdi
(1995), qui montre que celle-ci est plutôt du type non spécifique. Il classe les 6 races en
deux groupes de pathogénie (race 6-4 et 1-5-2-3) dans les quelles l’agressivité est plus
prépondérante que la virulence.
En plus, les lignées ont une résistance incomplète et sont sensibles aux
conditions de l’environnement, ce qui a rendu difficile la mise en évidence des
comportements différentiels stables.
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
20
3.3. Résistance du pois chiche à Ascochyta rabiei :
3.3.1. Sur le plan génétique:
Il existe des cultivars de Pois chiche avec des niveaux variés de résistance ce qui
montre que la génétique de la résistance à Ascochyta rabiei est polygénique ainsi
différents degrés de résistance face au pathogène (Mohamed Bachir, 1984). La
résistance polygénique non spécifique est nettement plus difficilement contournable par
les parasites.
Selon (Peters et Tahiri, 1986), la résistance peut être estimée sur différents
organes et à différents stades de développement de la plante. Selon les mêmes auteurs, il
existe parfois des variations entre la résistance au stade végétatif et la résistance au
stade producteur, ce qui indique que plusieurs facteurs peuvent participer à la résistance
à l’anthracnose. Ces résultats ont été confirmés plus tard par (Labdi ,1995) qui a montré
que cette résistance peut être partielle, s’exprimant différemment selon les stades
physiologiques de la plante et régresserait après le stade floraison. Elle serait de nature
récessive, sous le contrôle de 2 à 4 gènes, et serait déterminée par des gènes différents
selon les stades physiologiques.
3.3.2. Sur le plan pathologique :
Vir et Grewal (1974) font apparaitre une forte corrélation positive entre les
attaques sur tiges et feuilles des variétés sensibles, mais non sur les variétés résistances.
Chez ces derniers, les feuilles sont très peu attaquées par rapport aux tiges. Ils concluent
que l’attaque de la tige est un critère plus approprié pour les classements des variétés
(Ameziane, 1981). Sattar (1933) considère qu’une sécrétion élevée d’acide malique de
par les feuilles au stade floraison-fructification, favorise l’infection
(Nene et Reddy, 1987).
Par contre (Hafiz ,1952) trouve que le cultivar F8 secrète plus d’acide malique
qu’un cultivar sensible (Pb-7) et que l’acide malique est un inhibiteur de la germination
des spores et du développement du tube germinatif. Une autre étude menée à
ICRISTAT, n’indique pas de différence dans la germination de spore et le
développement du tube germinatif dans les exsudats des cultivars résistants et sensibles
(Nene et Reddy, 1987).
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
21
Hafiz (1952) ne trouve pas de différence d’épaisseur de la cuticule entre les
types résistants et sensibles, mais l’acidité de la sève du type résistant est plus élevée
comparée à celle du type sensible. La même année, (Ahmed et al., 1952) signalent un
nombre de poils par unité de surface au niveau de la tige et de la feuille plus élevé et
plus ramifié chez le type résistant par rapport aux types sensibles.
3.4. Détection des activités enzymatiques chez Ascochyta rabiei :
Ascochyta rabiei se comporte comme un parasite nécrotrophe : il provoque à
distance une macération procédée par des réactions des noyaux et par des modifications
de la perméabilité cellulaire. L’étude des modalités de résistance d’un cultivar de Pois
chiche a mis en évidence une action pectinolytique et une dégradation de la cellulose
plus évidente dans les tissus vasculaires que dans le parenchyme (Ameziane, 1981).
Une étude sur l’activité enzymatique in vitro d’isolats algériens a révélé la
production d’une gamme d’enzymes de macération en milieu liquide. Ces enzymes sont
du groupe des amylases, des protéases, des polygalacturonases, des pectines
méthylestérases et des cellulases (Tchicha, 1991).
El Biari (1995), dans son étude sur la variabilité morphologique et culturale
d’Ascochyta rabiei , note l’influence positive sur la croissance de la présence de la paroi
cellulaire du Pois chiche comme source de carbone. Il conclue que le champignon est
capable de dégrader les parois cellulaires en sucres simples, probablement en produisant
des enzymes pectinolytiques.
3.5. Variabilité protéique chez Ascochyta rabiei
les protéines sont les moyens d’expression de l’information génétique
(Lehninger,1985). Il existe un très grand nombre de protéines différentes dans
l’organisme, chacune assurant une fonction spécifique déterminée par son gène.
Les difficultés de caractérisation de la variabilité des organismes à partir des
seuls critères morphologiques, ont conduit à l’utilisation de l’électrophorèse des
protéines.
MATERIELS ET METHODES
MATERIELS ET METHODES
22
1. ETUDE MORPHOLOGIQUE :
1.1-Echantillonnage :
Notre travail a été effectué avec des souches d’Ascochyta rabiei isolées de
l’Ouest algérien (Témouchent et Sidi bel Abbes) de plantes présentant des symptômes
de l’anthracnose.
Photo n° 04 :
Plantes de Pois chiche présentant les symptômes de l’anthracnose
1.2-L’isolement et la purification :
L’isolement est effectué à partir des organes aériens frais (feuilles, tiges et
gousses), par la méthode décrite par (Grewal, 1984), les plantes sont rincées à l’eau
courante afin de les débarrasser de leurs débris de terre. Après lavage les tiges ont
Feuilles mortes
Nécrose au niveau de la gousse
Nécrose au niveau de la tige
MATERIELS ET METHODES
23
été découpées (sauf les graines et les feuilles) en fragments de 1 à 2 cm sur les fronts
d’attaques et désinfectées superficiellement par trempage dans une solution diluée de
l’eau de javel à 2% pendant 3 à 5 mn. Les fragments ont été ensuite rincés trois fois à
l’eau distillée stérile.
Une fois séchés avec du papier stérile trois fragments sont déposés dans des
boîtes de pétri contenant le milieu de culture à base de pois chiche gélosé (Annexe), et
mis en incubation. Dés l’apparition des filaments mycéliens autour des petits fragments,
nous procédons à la recherche d’Ascochyta rabiei par l’observation microscopique, une
fois l’identification primaire est établie, nous procédons au repiquage successif pour
obtenir des souches pures.
Les champignons isolés sont fréquemment contaminés par des bactéries et d’autres
champignons. Ceux ci restent parfois invisibles et modifient les caractères et le mode de
croissance des colonies recherchées. Afin d’éviter ce risque, le procédé le plus simple et
le plus sûr reste celui de la culture monospore.
1.3. Conditions d’incubation :
L’incubation s’effectue dans la chambre d’incubation à 22°C sous une
photopériode de 12 heures.
1.4- L’obtention des Cultures monospores :
Afin de travailler avec des souches génétiquement homogènes, nous avons
réalisé une culture monospore (Rappily, 1968 ; Zerrouk, 1994). Pour cela, nous avons
préparé une suspension de spores, en prélevant un explant à partir de la marge d’une
culture âgée de 10 jours sur milieu pois chiche solide, puis 1 ml de cette suspension est
déposée et étalée sur boîte de Pétri contenant milieu gélose à 2% (Annexe). Après 24h
d'incubation à l'aide d'une loupe binoculaire, les conidies germées sont repérées puis
délimitées d'un cercle d'environ 2mm, et à l'aide d'une aiguille stérile, nous avons
prélevé la conidie et la déposé sur boîte de Pétri contenant milieu pois chiche gélosé
(Zerrouk, 1994).
MATERIELS ET METHODES
24
1.5- La conservation des isolats :
Les cultures purifiées sont conservés dans des tubes à essai inclinés contenant
le milieu pois chiche gélosé (Annexe), la conservation est effectuée à 4°C pour des
utilisations ultérieures (Rapilly , 1968).
1.6- L’étude macroscopique :
Ce type de caractérisation est basée essentiellement, sur l'aspect cultural de la
croissance des isolats sur des milieux artificiels, elle est envisagée pour la distinction
entre les isolats d’Ascochyta tout en se basant les critères suivantes ; la
pigmentation , l’aspect du mycélium , la vitesse de croissance, et l’abondance des
pycnides (Punithalingam et Gibson, 1976 ; Maufras, 1996).
1.7 - L’étude microscopique :
Cette étude se rapporte aux critères microscopiques des isolats, nous avons
préparé un frottis à partir d’un fragment mycélien âgées de 15 jours, ensuite une
observation microscopique des pycnides et des picnydiospores a été effectuée.
Pour voir la structure intacte du champignon, on passe par la culture sur milieu CLA
(qui est un milieu à substrat naturel contenant un morceau de la feuille d’œillet qui
favorise la sporulation) (Synder et al., 1947 ; Fisher et al., 1982).
Les petits morceaux de feuilles d’œillet sont préparés à partir d’une collecte de
cette plante d’œillet fraîche non traitée par des fongicides ou d’insecticides. Les feuilles
collectées sont découpées en petits morceaux de 5-8 mm2
(ils se rétrécissent après
séchage), puis séchés dans un four (~70 °C) pendant 3 à 4 heures, ils peuvent être
séchés aussi dans une micro-onde. Le stockage de ces petits morceaux se fait dans un
endroit sec de température ambiante jusqu’à 12 mois avant usage
(Leslie et Summerell, 2006).
Une bouture mycélienne est placée à côté de cette feuille d’œillet stérile, le tout,
dans une boîte de Pétri contenant le milieu Gélose 2%.
Après environ 3 à 4 semaines, nous avons pu observer nettement sous le
microscope, le mycélium cloisonné et les pycnides ainsi que les pycnidiospores
(monocellulaire et bicellulaire).
MATERIELS ET METHODES
25
2. ETUDE ENZYMATIQUE
2.1 Croissance mycélienne de toutes les souches
Dans un premier temps, nous avons débuté cette étude par la sélection de la
souche la plus protéolytique en mesurant le diamètre de croissance des 14 isolats sur
trois différents milieux solides (Milieu Czapeck glucose additionné à la caséine à 1%,
milieu Czapeck caséine et milieu Czapeck glucose) (annexe), et cela pendant 10 jours
d’incubation.
Ces mêmes conditions de cultures ont été utilisés en milieu liquide (Czapeck
glucose caséine, Czapeck caséine et Czapeck glucose) pour suivre l’évolution de
l’activité protéolytique de la souche sélectionnée et cela aux différents pH (4, 6 et 8).
Pour le milieu liquide, durant les 10 jours d’incubation nous avons vérifié : le
poids du mycélium et le pH du filtrat.
Vérification du poids :
Pour le faire, nous avons récupéré le mycélium, après filtration sur papier filtre
le mycélium a été mis à sécher, puis pesé.
Vérification du pH :
Après avoir récupéré le filtrat, nous mesurons le pH.
MATERIELS ET METHODES
26
2.2- Evaluation en milieu solide de l’activité protéolytique exprimée dans le
surnageant de culture :
L’activité protéolytique exprimée dans les filtrats de cultures (extrait
enzymatique) de chaque jour d’incubation a été évaluée en milieu solide (caséine
gélosé) (annexe) par la méthode des puits. Elle est réalisée par le dépôt de 100µl au fond
des puits préalablement réalisés sur la gélose à la caséine à 1%. Elle est exprimée après
24h d’incubation à 37°C par l’apparition de zones claires autour des puits.
2.3- Dosage de l’activité protéolytique à l’UV :
La solution enzymatique est récupérée chaque jour par une filtration et cela
durant les 10 jours d’incubation.
La caséine est dissoute à 5% dans tampon Tris-Hcl à 0.1M à pH 9.
Pour la solution test :
150 ml de la solution enzymatique est ajoutée à 50 ml de la solution caséine, le
mélange est mis à incuber à 60°C pendant 30 min. La réaction est stoppée par l’addition
de 600ml de TCA à 10% suivie par une centrifugation à 8000 g pendant 10 min pour
précipiter es protéines.
Pour le blanc, le TCA est ajouté avant la solution enzymatique, puis nous
suivons les mêmes procédures que celles de la solution test.
La lecture est effectuée par le spectrophotomètre à l’absorbance λ 280 nm
(Abidi et al., 2008).
MATERIELS ET METHODES
27
3. ETUDE DU POUVOIR PATHOGENE :
3.1. Les milieux de culture
L’inoculum a été préparé sur milieu Czapeck glucose gélosé (annexe). Le milieu
est coulé dans des boites de Pétri de 9cm de diamètre à raison de 18ml chacune. Les
boites sont ensemencées pour la production d’inoculum et mises à incuber.
3.2. Conditions d’obtention des plantules
Les variétés du pois chiche utilisées (Benadla et Akim) sont fournies par Institut
National de la Recherche Agronomique Algérienne (INRAA) de Sidi Bel Abbes. Les
graines sont prétraitées à l’hypochlorite de sodium à 5% pendant 5mn puis rincées dans
3 bains successifs d’eau distillée stérile.
Ces graines sont mises à pré germer dans des boites de Pétri contenant deux
feuilles de papier buvard stériles imbibées d’eau distillée stérile, puis incubées à 22°c
pendant 5 jours.
Les graines pré germées (photo n°05), sont semis individuellement dans des
petits pots (photo n° 06), les plantules sont ensuite transplantées à raison de 03 graines
par pot et par isolats (pots contenant un mélange quantité terreau, quantité sable)
(photo n° 07). Le mélange est stérilisé avant son utilisation. Elles sont arrosées deux
fois par semaine, une fois avec l’eau distillée et la deuxième fois avec la solution KNOP
(Annexe).
A l’âge de dix jours, les plantules sont prêtes pour passer au test du pouvoir
pathogène.
La température moyenne de la serre est de 30 °C avec des fluctuations de
25 °C à 35 °C durant la période de l’expérimentation.
MATERIELS ET METHODES
28
Photo n°05 : Photo n° 06 :
Pré germination des graines Germination des graines
Photo n° 07 :
Plantes de pois chiche saines âgées de 10 jours avant l’inoculation.
MATERIELS ET METHODES
29
3. 3. Préparation de l’inoculum
La méthode utilisée est celle décrite par El Biari (1995), qui consiste à préparer
l’inoculum par addition de 5 ml d’eau distillée stérile sur des cultures fructifiées. Les
pycnidiospores sont libérés dans l’eau par grattage avec une pipette Pasteur courbée,
puis la suspension de spores est filtrée sur papier filtre stérile (la souche est âgée de 10
jours).
La concentration en spores est estimée à l’aide d’une cellule de Malassez, puis
ajustée à 106 spores/ml d’eau distillée stérile.
3.4. Inoculation des plantes
La pulvérisation de l’inoculum est réalisée à l’aide d’un pulvérisateur sur
toutes les parties aériennes de la plante pour régénérer son pouvoir pathogène. Toutes
les dispositions sont prises pour que chaque plante reçoit le même volume de
l’inoculum .
Les pots contenant les plantes sont ensuite recouverts d'un film plastique
transparent durant les soixante douze (72h) heures qui suivent l'inoculation
(Labdi ,1990).
Des pulvérisations légères d’eau sont poursuivies plusieurs fois par jour même
après avoir enlevé le film plastique de façon à maintenir une humidification continue
des organes aériens des plants afin de faciliter la germination des spores
(Bouznad, 1989).
Les plantes témoins sont pulvérisées avec de l’eau distillée stérile.
Photo n°08 :
Plantes de pois chiche inoculées avec une suspension sporale
de la souche A31 recouvertes d’un sac en plastique
MATERIELS ET METHODES
30
Tableau n° 07 : Echelle quantitative à 9 points pour la notation des réactions du pois
chiche à l’anthracnose (d’après Reddy et al, 1984)
Note Pourcentage de
bourgeons
morts
Pourcentage
des feuilles
infectées
Pourcentage
des tiges avec
lésions
Pourcentage de
tiges cassées
Types de
réaction
1 0 0 0 0 Résistant
2 0 1.0 0 0 Résistant
3 0 – 2.5 5.0 80.0 5.0 Résistant
4 0 – 5.0 20.0 80.0 15.0 Résistant
5 10.0 40.0 100.0 40.0 Modérément
sensible
6 25.0 50.0 100.0 50.0 Modérément
sensible
7 40.0 75.0 100.0 75.0 Sensible
8 100.0 90.0 100.0 100.0 Sensible
9 Plantes complètement malades Très sensibles
3 .5. Réisolement du parasite :
Dès que les symptômes de l’anthracnose apparaissent nous passons au
ré isolement du parasite à partir des plantes testées par la méthode décrite par
(Grewal, 1984).
La recherche du parasite dans les plantes infectées a pour objectif de montrer la
capacité du champignon à pénétrer dans les plantes et de s’assurer que les symptômes
notés sont dus au parasite. Le champignon est recherché dans la tige de chaque plante.
MATERIELS ET METHODES
31
4. ETUDE DU PROFIL PROTEOLYTIQUE TOTAL
4 .1. Préparation des extraits enzymatiques pour le dosage des protéines totales des
isolats
4 .1. 1. Culture du champignon
Des Erlenmeyers contenant 50 ml de milieu Gyp liquide (annexe) sont
ensemencées par 10 fragments mycéliens (de 6 mm de diamètre), prélevés de la zone
de croissance à partir d’une pré culture du champignon âgée de 10 jours sur milieu PC
solide et sont mis à incuber.
4 .1. 2. Obtention des extraits enzymatiques
Après 10jours, le mycélium est récupéré après filtration du milieu de culture à
l’aide d’une passoire stérile. Il est ensuite broyé dans un mortier maintenu au froid dans
de la glace, additionné du sable fin (le sable est lavé à l’acide sulfurique, rincé et lavé à
l’eau distillée, séché dans le four Pasteur) et du Tampon Phosphate (0,1 M - pH 7,1)
(P/P/V), jusqu’à l’obtention d’une pâte fine et homogène. Le broyât est récupéré dans
des tubes puis centrifugés à 10 000 g pendant 20 minutes dans une centrifugeuse
réfrigérée (4 °C).
Le surnageant est réparti rapidement dans des tubes Eppendorf par fraction de
100 µl. Il peut être utilisé directement pour l’électrophorèse, comme il peut être
conservé au congélateur.
Pour déterminer la concentration des protéines dans l’extrait enzymatique de
chaque échantillon, nous suivons la méthode de Bradford.
4.2 Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford :
La méthode Bradford (1976) consiste à une coloration des protéines par le Bleu
de Coomassie G250.
L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration des protéines et
le maximum d’absorption est situé à λ 595nm.
Pour les dosages, il faut établir une courbe d’étalonnage. Elle est réalisée à partir
du SBA dont la solution mère est de 1mg/ml.
A partir de cette dernière, une série des solutions filles est préparée.
MATERIELS ET METHODES
32
Tableau n° 08 : Dilutions de la courbe d’étalonnage.
Dilution 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 blanc
SBA (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 /
Eau distillée (µl) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 200
Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Pour déterminer la concentration en protéines dans les extraits enzymatiques,
nous prenons 100µl de chaque extrait, puis nous ajoutons 2ml du réactif de Bradford.
Après agitation au vortex et un petit moment de repos, la lecture se fait à λ 595nm
contre le blanc de la gamme. A la fin, nous extrapolons les densités optiques obtenues
sur la courbe d’étalonnage pour obtenir la concentration en protéines dans chaque
extrait enzymatique.
4.3- Electrophorèse des protéines totales par le système (SDS-PAGE) :
Une analyse quantitative des protéines solubles est effectuée par
électrophorèse sur gel polyacrylamide en conditions dénaturantes SDS-PAGE
(Lammli, 1970), où les molécules sont séparées uniquement en fonction de leur
masse molaire ( Lafont, 2005).
4.3.1-La préparation d’un gel (SDS-PAGE):
Cette méthode consiste à utiliser deux gels superposés de concentration et
de pH différents (annexe).
Le gel supérieur appelé gel de concentration, permet de concentrer la solution en
protéines en une fine bande , tandis que le gel inférieur est le gel de séparation
permettant de séparer les différentes protéines.
La polymérisation est déclenchée avec du persulfate et temed; il faut agiter
délicatement et dégazer avant d’ajouter le persulfate d’ammonium (Annexe).
MATERIELS ET METHODES
33
4.3.2 La dénaturation des échantillons :
Nous avons réparti dans des tubes neufs des extraits protéiques et tampon de
dénaturation (tampon de charge) (Annexe) à raison de 80 µl, puis nous avons porté les
échantillons à ébullition dans un bain-marie pendant 5 minutes.
4.3.3 La révélation des protéines totales :
Après une migration complète et un démoulage du gel , ce dernier est fixé
puis coloré afin de visualiser les bandes protéiques.
Le gel subit ensuite une décoloration effectuée par plusieurs rinçages avec la
solution de décoloration (annexe).
RESULTATS ET DISCUSSIONS
RESULTATS ET DISCUSSIONS
34
1. ETUDE MORPHOLOGIQUE DES ISOLATS :
1.1 .Isolement :
L’isolement à partir les parties aériennes des plantes présentant les symptômes
de l’anthracnose récoltées de différentes régions, nous a permis d’obtenir 14 souches
(tableau n°09). Un exemple est donné dans la (photo09).
Tableau n° 09 : Origine des souches d’Ascochyta rabiei isolées des différents
sites de l’Ouest Algérien
Référence de la souche Site du prélèvement Partie d’isolement
A 1 Aïn Témouchent La tige
A 6 Sidi Bel-Abbès La gousse
A 10 Sidi Bel-Abbès La gousse
A 12 Sidi Bel-Abbès La gousse
A 17 Aïn Témouchent La gousse
A 20 Sidi Bel-Abbès La tige
A 22 Aïn Témouchent La gousse
A 23 Sidi Bel-Abbès La tige
A 27 Sidi Bel-Abbès La tige
A 31 Sidi Bel-Abbès La gousse
A35 Sidi Bel-Abbès La gousse
A 38 Sidi Bel-Abbès La gousse
A40 Sidi Bel-Abbès La tige
A 45 Aïn Témouchent La tige
1.2. Les caractères macroscopiques :
L’observation macroscopique de la nature du mycélium des isolats a révélé
quelques différences au niveau de la pigmentation qui varie entre noire ,marron
foncé et marron clair.
Les colonies mycéliennes d’Ascochyta rabiei ont un développement
relativement long, elles sont d’abord crémeuses , puis prennent des teintes
extrêmement variées selon les isolats et les milieux (vert clair, vert foncé, brun).
RESULTATS ET DISCUSSIONS
35
Après repiquage, elles présentent généralement des cercles concentriques très
caractéristiques (photo10).
Photo 09 : Isolement d’Ascochyta rabiei à partir des tiges.
Mycélium
d’Ascochyta rabiei
A
RESULTATS ET DISCUSSIONS
36
Photo010:
Aspect macroscopique de quelques souches d’Ascochyta (A) et la souche A31 (B) sur le
milieu pois chiche gélosé
1.3. Les caractères microscopiques :
L’observation microscopique des isolats d’Ascochyta rabiei par la culture sur
milieu CLA est caractérisée par la présence des pycnides, pycnidiospores.
Le stade imparfait est caractérisé par la formation des pycnides (organes
de fructification du champignon) , apparaissant sous forme de points noirs visibles
à l’œil nu .Les pycnides sont tapissés intérieurement de conidiophores très courts
portant des conidies ou pycnidiospores ovales à allongées , droites ou légèrement
courbées sur les deux extrémités, hyalines , non cloisonnées (photo11).
B
RESULTATS ET DISCUSSIONS
37
Photo11:
Observations au microscope optique des pycnides d’Ascochyta rabiei au grossissement
(X 400).
A : Eclatement d’une pycnide d’Ascochyta rabiei et libération des spores.
B: pycnidiospores :
-1 : pycnidiospore monocellulaire
-2 : pycnidiospore bicellulaire
1.4. Conservation des isolats :
Photo12:
Conservation des souches dans des tubes à essai contenants milieu pois chiche incliné
A B
2
1
3.7µm 3.7µm
RESULTATS ET DISCUSSIONS
38
2. ETUDE ENZYMATIQUE :
2.1. Croissance mycélienne de toutes les souches sur différents milieux:
Dans le but de sélectionner une souche exprimant une activité protéolytique la
plus élevée, nous avons suivi et comparé la croissance de l’ensemble des souches dans 3
différents milieux de culture, il s’agit de milieu Czapeck-glucose additionné de 1% de
caséine (Cz-glu-cs), le milieu Czapeck à 1% de caséine (Cz-cs) et le milieu Czapeck-
glucose( Cz-glu). Les diamètres de croissance ont été mesurés pendant 10 jours
d’incubation.
Les résultats obtenus montrent que la souche A31 présente une croissance
mycélienne la plus élevée en comparaison avec l’ensemble des souches, fort
probablement qu’elle dispose d’un équipement enzymatique performant qui lui a permis
d’utiliser les substrats retrouvés dans les différents milieux, et ceci justifie notre choix
pour cette souche (A31) pour le reste de notre travail.
Figure 01
Représentation du développement de toutes les souches sur différents milieux :
Czapeck-caséine-glucose, Czapeck-glucose et Czapeck-caséine.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
A1 A6 A10 A12 A17 A20 A22 A23 A27 A31 A35 A38 A40 A45
diamètres en cm
souches
Croissance de toutes les souches sur différents milieux
10jcz cs glu
10jcz cs
10j cz glu
*
RESULTATS ET DISCUSSIONS
39
Photo 13
Aspect du mycélium de la souche A31 sur milieu Czapeck-glucose-caséine.
L’exemple donné dans la présente photo montre l’aspect morphologique après
15 jours d’incubation de la souche A31 sur milieu Czapeck-glucose additionné de 1%
caséine. Nous avons enregistré une légère différence de l’aspect morphologique par
rapport à celui obtenu par la même souche sur le milieu pois chiche. Cette différence
est relevée au niveau de la couleur et la zonation des cercles concentriques du
mycélium de cette souche.
RESULTATS ET DISCUSSIONS
40
2.2. Etude de l’activité protéolytique exprimée par la souche A31 dans le
surnageant de culture de différents milieux et à différents pH :
- a. Dans le milieu Czapeck glucose additionné de la caséine
- b. Dans le milieu Czapeck glucose
- c. Dans le milieu Czapeck additionné de la caséine
2.2.1. Évaluation en milieu solide de l’activité protéolytique exprimée dans le
surnageant de culture.
Nous avons étudié l’expression d’enzymes protéolytiques dans le filtrat de
différents milieux de cultures, (Cz-glu+cs, Cz-glu et Cz+cs) et à différents pH de la
souche sélectionnée (A31).
Le filtrat est déposé dans des puits réalisés préalablement dans une gélose à la
caséine. L’activité protéolytique après incubation se manifeste par la formation d’une
zone claire autour des puits dont le diamètre de cette dernière est exprimé en mm (photo
14). Les résultats obtenus sont représentés dans les figures 2, 4 et 6.
2.2.2. Dosage de l’activité protéolytique exprimée dans le surnageant de culture.
A fin de mieux étudier l’expression d’enzymes protéolytiques dans le surnageant
de différents milieux de cultures (Cz-glu+cs, Cz-glu et Cz+cs) et à différents pH de la
souche sélectionnée (A31) nous avons dosé cette activité à l’UV (λ 280 nm) en utilisant
la caséine comme substrat. L’activité protéolytique exprimée dans le filtrat est exprimé
en pourcentage. Les résultats sont représentés dans les figures 3, 5 et 7.
Photo 14 :
Activité protéolytique exprimée dans le milieu solide
Zone claire de
protéolyse
pH4 pH6 pH8
RESULTATS ET DISCUSSIONS
41
a. Dans le milieu Czapeck glucose additionné de la caséine :
Figure 02
Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de milieu
de culture (Czapeck-glucose+caséine) évaluée en milieu solide (A)
et par dosage à l’UV (B).
L’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de culture du milieu Czapeck-
glucose additionné de caséine mesuré en milieu solide apparait dès le 4ème
jour
d’incubation (0.5mm de diamètre) et atteint son maximum au voisinage du 10ème
jour
(11 mm de diamètre) alors qu’au pH 8 cette expression enzymatique apparait dès le 3ème
jour d’incubation (2mm de diamètre) et évolue avec des valeurs plus au moins élevées
par rapport au pH 4 et 6.
De la même manière, cette activité protéolytique exprimée dans le filtrat de
culture du milieu Czapeck-glucose additionné de caséine obtenus par le dosage à l’UV
suit globalement le schéma retrouvé préalablement, c’est-a-dire, une augmentation
progressive pour atteindre son maximum au 10ème
jour d’incubation. Cette technique
offre l’avantage au manipulateur d’être plus précise, rapide et moins laborieuse.
B A
RESULTATS ET DISCUSSIONS
42
b. Dans le milieu Czapeck glucose :
Figure 03
Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de milieu
de culture (Czapeck-glucose) évaluée en milieu solide (A) et par dosage à l’UV (B).
En présence du glucose et de la caséine, l’activité enzymatique des protéases apparait
au voisinage du 8ème
jour dans les différents pH mais avec une production plus au moins
importante au pH8.
l’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de culture du milieu Czapeck-glucose
à différents pH mesurée par les deux méthodes, révèle que cette dernière est exprimée à
des niveaux très faibles en comparaison aux autres milieux ou la caséine est ajouté au
milieu, elle garde le même mode d’ascension que celui de la précédente (Czapeck-
glucose+caséine) car elle apparait au 7ème
et 8ème
jour pour atteint son maximum au
10ème
jour avec des valeurs très faibles, car elle ne représente que le 1/10ème
de ce qui est
enregistré précédemment lors de l’ajout de la caséine au milieu de culture ce qui laisse
suggérer que cette activité protéolytique est fortement liée à la présence de caséine dans
le milieu.
A b
RESULTATS ET DISCUSSIONS
43
c. Dans le milieu Czapeck additionné de la caséine :
Figure 04
Représentation graphique de l’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de milieu
de culture (Czapeck-caséine) évaluée en milieu solide (A) et par dosage à l’UV (B).
l’activité protéolytique exprimée dans le filtrat de culture de milieu Czapeck
additionné de caséine à différents pH mesurée par les deux méthodes apparait au
voisinage du 3ème
jour et atteint son maximum au voisinage du 10ème
jour, dans ce cadre
l’expression enzymatique des protéases garde la même cadence que celle enregistrée
dans les précédents cas, mais nous avons enregistré l’apparition d’un pic d’expression
important de cette activité entre le quatrième et le cinquième jour ce qui est totalement
différent des deux autres cas, c'est-à-dire l’absence du glucose dans le milieu de culture,
qui nous laisse penser que le champignon à vraisemblablement emprunté une autre voie
métabolique pour remédier l’absence du glucose dans le milieu par la synthèse d’une
seconde famille de protéase qui agit précocement, ces résultats se concordent avec ceux
trouvés par (Duniesky. M et al., 2003).
Cette activité protéolytique précoce a apparu dans les deux pH (4 et 6), ceci montre
bien qu’il s’agit famille de protéases acides et neutres et ces observations ont été
rapportées par (Kolaczkowska et al.,1980) chez un autre champignon phytopathogène
Fusarium moniliforme qui produit deux protéases acides et neutres.
A la fin d’incubation (10ème
jour) Nous avons remarqué que cette expression
protéolytique est plus importante au pH4, Fort probablement qu’il s’agit de production
de protéases acides. La même observation a été rapporté par (Tremacoldi et al., 2004),
A B
RESULTATS ET DISCUSSIONS
44
qui ont montré que les espèces d'Aspergillus synthétisent des protéases acides, ce même
type protéases est aussi synthétisé par les espèces de Rhizopus (Kumar et al., 2005).
La souche A31 produit des protéases. Ce résultat se concorde avec celui de
(Tchicha, 1990) qui a enregistré que Ascochyta rabiei produit des enzymes dégradant
la paroi cellulaire in vitro dont on peut décrire des des amylases, des protéases, des
polygalacturonases, des pectines mthylestérases et des cellulases. D’autres champignons
sont aussi capables de cette performance tels que Ascochyta pisi, Fusarium oxysporum
f.sp. ciceri, Verticillum alboatrum (Bouznad, 1983 ; Carder et al., 1987 ; Perès et
Tena, 1990).
La présente étude nous a permis de montrer l’influence de la composition du milieu et
les conditions de culture sur la production in vitro d’enzymes protéolytiques qui font
partie d’un ensemble d’équipement enzymatique de ce champignon (Ascochyta rabiei)
pour exercer et induire son rôle pathologique sur la plante hôte
Cela a été illustré par la réponse du champignon vis-à-vis la présence ou l’absence de la
caséine comme substrat et le glucose comme source de carbone. Batemant et Millar
(1966) ont montré que les conditions de culture et la composition du milieu peuvent
influencer nettement sur la production in vitro des enzymes dégradant La paroi
cellulaire que les protéases font partie d’eux.
RESULTATS ET DISCUSSIONS
45
2.3 Evolution du poids du mycélium dans différents milieux et à
différents pH :
a- Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck-glucose ajouté et ou
dépourvu de caséine à pH :4, 6 et 8
Figure 05 :
Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck glucose à pH : 4, 6 et 8 (A): en présence de caséine, (B) en absence de caséine.
Les résultats obtenus montrent que le poids du mycélium dans le milieu Czapeck
glucose (additionné (A) et ou dépourvu (B)) de la caséine à différents pH évolue en
fonction du temps et atteint un poids maximal au 10ème
jour avec des valeurs plus ou
moins importantes dans le milieu à pH6 pour le milieu de culture (a) alors que pour le
milieu de culture (b) les valeurs les plus importantes ont été relevées dans le milieu à
pH4.
Nous avons remarqué aussi que le poids du mycélium évolue lentement durant les
sept premiers jours et par la suite la vitesse d’évolution augmente et le poids atteint une
valeur maximale au dixième jour. Cette augmentation est fortement liée aux niveaux
élevés d’expressions de l’activité protéolytique ce qui renseigne sur l’effet important
que occupe cette activité lors de la croissance de ce champignon, ces résultats rejoignent
ceux enregistrés par (Seed Khan R., 1981) qui a montré l’existence d’une corrélation
entre la croissance du mycélium et l’activité protéolytique chez les Mucor.
B A
RESULTATS ET DISCUSSIONS
46
b- Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck caséine à pH : 4, 6 et 8
Figure 06 :
Evolution du poids du mycélium dans milieu Czapeck+caséine à pH : 4, 6 et 8
Les résultats obtenus montrent que le poids du mycélium dans le milieu Czapeck
additionné de la caséine à différents pH évolue en fonction du temps et que les valeurs
obtenues dans le milieu à pH4 sont plus les importantes (5.1 g) par rapport au pH6
(1.2g) et pH8 (0.9).
En premier temps ces résultats semblaient inattendus pour nous (5.1g de poids dans
un milieu dépourvu de glucose alors que le poids du mycélium n’a pas dépassé 3.5g en
présence du glucose). Cependant, en comparant ces résultats avec ceux obtenus dans
l’étude de l’activité protéolytique nous avons remarqué que le poids du mycélium était
plus important quand l’expression protéolytique était aux plus élevés niveaux (voir 2.2.
figure 4). Vraisemblablement que les protéases acides ont agis plus fortement dans ce
milieu de culture.
Nous avons remarqué aussi que la vitesse de l’évolution du poids de mycélium dans
ce milieu de culture à augmenté dans le pH4 après le 4ème
jour là où nous avons
enregistré l’expression protéolytique par une deuxième famille de protéases. Ces
résultats rejoignent ceux cités précédemment montrant l’influence de l’activité
protéolytique sur la croissance de ce champignon.
RESULTATS ET DISCUSSIONS
47
3. Evaluation du pouvoir pathogène des isolats d’Ascochyta rabiei :
La vérification de l’agressivité des isolats utilisés est nécessaire afin de vérifier
la corrélation qui pourrait exister entre le pouvoir pathogène et la capacité à produire
des enzymes métabolites jouant un rôle dans la pathogénèse.
Les résultats obtenus ont montré que les isolats A31 et A10 d’Ascochyta rabiei
utilisés dans ce test attaquent les plantules après quelques jours de l’inoculation, en
provoquant chez celles-ci différents symptômes d’altération, tels qu’u .n jaunissement,
cassure des tiges, nécrose au niveau des tiges et des feuilles jusqu’à la mort totale de la
plante (après 15 jours de l’inoculation)
Les résultats obtenus sont représentés dans la (photo 15).
Les symptômes obtenus sont évalués selon l’échelle à 9 points décrite par
(Reddy et al, 1984). Cette dernière est essentiellement basée sur la réponse de l’hôte et
le développement des symptômes sur les différentes parties aériennes Tableau n° 10.
Pour pouvoir confirmer les symptômes constatés du pouvoir pathogène des souches
A31 et A10, il est nécessaire de passer par le ré-isolement du champignon qui a révélé sa
présence dans les tiges et les feuilles de chaque plantule.
Tableau n° 10: Comportement des hôtes différentiels vis-à-vis de la souche A10 et A31
Hôtes
Isolats
Benadla Akim 91
A31 Modérément sensible sensible.
A10 Modérément sensible sensible.
Photo 15 :
Les différentes étapes du test de pouvoir pathogène
A : Plantules saines avant l’inoculation
B : Le témoin
C : Plantules après inoculation
D : Apparition des symptômes dus à l’isolat A10 sur la variété Akim 91
E : Apparition des symptômes dus à l’isolat A31 sur la variété Benadla
RESULTATS ET DISCUSSIONS
48
F : la mort totale de toutes les plantules inoculées par A10 après 15 jours d’incubation
G : la mort totale de toutes les plantules inoculées par A31 après 15 jours d’incubation
H : Ré isolement à partir des feuilles présentant des symptômes d’anthracnose du à
l’isolat A 31 sur la variété Benadla
I : Ré isolement à partir des feuilles présentant des symptômes d’anthracnose du à
l’isolat A 10 sur la variété Akim 91
A B
C D
Cassure au
niveau de tige
Nécrose au
niveau de la
feuille
RESULTATS ET DISCUSSIONS
49
E F
G
H I
Nécrose
au niveau
de la tige
Mort totale des plantes
Mycélium
d’Ascochyta rabiei
RESULTATS ET DISCUSSIONS
50
4. ETUDE DU PROFIL PROTEOLYTIQUE :
4.1 Dosage des protéines totales par la méthode de Bradford:
Après la lecture au spectrophotomètre à la longueur d’ondes λ = 595 nm, les
résultats de la densité optique de chaque dilution sont représentés sur le Tableau n°11.
Ils seront par la suite reportés sur la Figure n°16 qui constitue la courbe d’étalonnage
D.O. = f (concentrations).
La concentration en protéine dans chaque échantillon d’extrait enzymatique, est
calculée par l’équation de la droite de la courbe d’étalonnage Tableau n°12.
Tableau n° 11 : Densité optique (D.O.) de chaque dilution de la courbe d’étalonnage
des protéines totales.
Dilutions 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10
D.O 0.397 0.393 0,383 0,380 0,378 0,365 0,356 0,343 0,334
Figure n°07 :
Courbe d’étalonnage des protéines
y = 0,0095x + 0,0125R² = 0,9817
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 10 20 30 40 50
D.O
concentration de SBA µg/ml
Courbe d' étalonnage des protéines totales
RESULTATS ET DISCUSSIONS
51
Tableau n° 12 : Densité optique (D.O.) et concentration en protéines dans chaque
extrait enzymatique des isolats d’Ascochyta rabie.
4.2 Electrophorèse des protéines totales :
Le profil électrophorètique des protéines totales des 14 souches par
électrophorèse sur gel polyacrylamide en conditions dénaturantes SDS-PAGE a
révélé six niveaux de migration de bandes protéiques.
Photo 16 :
Profil électrophorètique des protéines totales d’Ascochyta rabiei
souches A1 A6 A10 A12 A17 A20 A22 A23 A27 A31 A35 A38 A40 A45
D.O 0.265 0.231 0.220 0.172 0.186 0.235 0.175 0.205 0.263 0.232 0.219 0.154 0.261 0.25
[ ] µg/ml 26.4 23 21.9 17.1 18.5 23.4 17.4 20.4 26.2 23.1 21.8 17.3 26 25.1
A45 A40 A38 A35 A31 A27 A23 A22 A20 A17 A12 A10 A6 A1
RESULTATS ET DISCUSSIONS
52
Tableau n°13 : Résultats de l’électrophorèse des protéines totales
A1 A6 A10 A12 A17 A20 A22 A23 A27 A31 A35 A38 A40 A45
N1 + + - - + + + + + + + + + +
N2 + - - - + + + + - + + + + -
N3 + + - - - + + + + + - + - +
N4 + + + - - + + + - - - + + +
N5 + + + + - + + + + + + + + -
N6 + - + + - + + - - - - + + -
Tableau n° 14 : Taux de similitude des bandes des protéines de toutes les souches
A1 A6 A10 A12 A17 A20 A22 A23 A27 A31 A35 A38 A40 A45
A1 100,0 66,7 50,0 33,3 33,3 100,0 100,0 83,3 50,0 66,7 50,0 100,0 83,3 50,0
A6 66,7 100,0 33,3 16,7 16,7 66,7 66,7 66,7 50,0 50,0 33,3 66,7 50,0 50,0
A10 50,0 33,3 100,0 33,3 0,0 50,0 50,0 33,3 16,7 16,7 16,7 50,0 50,0 16,7
A12 33,3 16,7 33,3 100,0 0,0 33,3 33,3 16,7 16,7 16,7 16,7 33,3 33,3 0,0
A17 33,3 16,7 0,0 0,0 100,0 33,3 33,3 33,3 16,7 33,3 33,3 33,3 33,3 16,7
A20 100,0 66,7 50,0 33,3 33,3 100,0 100,0 83,3 50,0 66,7 50,0 100,0 83,3 50,0
A22 100,0 66,7 50,0 33,3 33,3 100,0 100,0 83,3 50,0 66,7 50,0 100,0 83,3 50,0
A23 83,3 66,7 33,3 16,7 33,3 83,3 83,3 100,0 50,0 66,7 50,0 83,3 66,7 50,0
A27 50,0 50,0 16,7 16,7 16,7 50,0 50,0 50,0 100,0 50,0 33,3 50,0 33,3 33,3
A31 66,7 50,0 16,7 16,7 33,3 66,7 66,7 66,7 50,0 100,0 50,0 66,7 50,0 33,3
A35 50,0 33,3 16,7 16,7 33,3 50,0 50,0 50,0 33,3 50,0 100,0 50,0 50,0 16,7
A38 100,0 66,7 50,0 33,3 33,3 100,0 100,0 83,3 50,0 66,7 50,0 100,0 83,3 50,0
A40 83,3 50,0 50,0 33,3 33,3 83,3 83,3 66,7 33,3 50,0 50,0 83,3 100,0 33,3
A45 50,0 50,0 16,7 0,0 16,7 50,0 50,0 50,0 33,3 33,3 16,7 50,0 33,3 100,0
RESULTATS ET DISCUSSIONS
53
Le dendrogramme suivant nous a permis de classer les souches en deux groupes
hétérogènes.
Le premier groupe est formé de A10 et A12. Il est très hétérogène par rapport au
deuxième groupe formé de A1 et A22 , à partir de ce dernier 11 sous groupes sont
classés dans un ordre croissant de homogénéité partielle, il s’agit de : A17, A45, A35,
A31, A6, A40, A23, A38.
Figure n°08 :
Représentation des 14 souches en dendrogramme
DENDROGRAMME DES 14 SOUCHES
DISTANCE EUCLIDIENNE
65 70 75 80 85 90 95 100 105
A12
A10
A17
A45
A35
A27
A31
A6
A40
A23
A38
A20
A22
A1
CONCLUSION
Conclusion
54
CONCLUSION GENERALE
Notre étude menée au laboratoire de microbiologie appliqué nous a permis de
rapporter de nouvelles approches sur la pathologie d’Ascochyta rabiei.
Notre travail a été abordé par l’isolement et la purification de 14 souches d’Ascochyta
rabiei, Par la suite la sélection de la souche A31 qui a révélé une expression de l’activité
protéolytique la plus élevée par rapport à l’ensemble des souches pour l’ut ilisation dans les
parties qui suivent.
Le travail a été suivi par l’étude de l’activité protéolytique exprimée par la souche A31
dans le surnageant de culture de différents milieux et à différents pH
Cette étude nous a permis d’enregistrer que la sécrétion des protéases est variable
selon le milieu de culture et son pH :
En présence du glucose, l’activité protéolytique est mieux exprimée au cours du 10ème
jour.
En absence du glucose, l’expression protéolytique a apparu en deux phases, la
première est similaire à la précédente et la seconde a apparu précocement (4ème
-5ème
jour),
cela nous a laissé de suggérer que le champignon a emprunté une autre voie métabolique pour
remédier cette carence, et de supposer que le champignon dispose de plusieurs familles de
protéases, il s’agit de protéases acides, neutres et alcalines.
En absence de la caséine, cette expression protéolytique est très faible, ce résultat nous
a autorisé de relier cette expression protéolytique à la présence de la caséine.
L’étude de l’activité protéolytique in vitro a nettement montré l’influence de la source
de carbone sur l’activité enzymatique des protéases qui peuvent avec d’autres groupements
enzymatiques intervenir dans le pouvoir pathogène au cours du processus d’infection du Pois
chiche.
L’étude de l’évolution du poids du mycélium de la souche A31 a permis de penser que
la croissance mycélienne est liée aux niveaux élevés d’expressions de l’activité
protéolytique ce qui renseigne sur l’effet important que occupe cette activité lors de la
croissance de ce champignon.
Le test du pouvoir pathogène a confirmé que les deux souches testées sont pathogènes,
ainsi l’étude du polymorphisme protéolytique des 14 souches montre qu’elles appartiennent à
deux groupes et onze sous groupe.
Conclusion
55
Cependant, il serait intéressant de poursuivre cette étude par la Purification de l’enzyme
protéase par la chromatographie, Par la suite tester l’effet de cette enzyme sur les plantules de
pois chiche et étudier d’autres enzymes qui peuvent avoir un rôle dans la pathologie du
parasite étudié.
Annexe
Annexe
COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE
- Tous les milieux de culture sont stérilisés à l’autoclave à 120 °C pendant 20 minutes sous une
pression de 1 bar.
Milieu Pois chiche (g/ l) :
Pois chiche …………………….. 200 g
Glucose …………………….. 20 g
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
- le Pois chiche est trempé dans de l’eau distillée pendant une nuit puis cuit dans de l’eau distillée.
Après cuisson, le filtrat est récupéré, ajusté à 1000 ml puis ajuster le pH à 6.
Gélose 2 % :
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
Milieu Gyp:
Glucose 20 g
Peptone
Extrait de levure
5 g
5 g
Eau distillée q.s.p.
1000 ml
Milieu Czapeck glucose 2% (g/ l):
Glucose …………………….. 20 g
KH2PO4 …………………….. 1 g
KCl …………………….. 0,5 g
Na2No3 …………………….. 2 g
MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g
FeSO4 …………………….. 0,01 g
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
Annexe
pH = (4 / 6 /8)
Milieu Czapeck caséine 2% (g/ l):
Caséine …………………….. 20 g
KH2PO4 …………………….. 1 g
KCl …………………….. 0,5 g
Na2No3 …………………….. 2 g
MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g
FeSO4 …………………….. 0,01 g
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
pH = (4 / 6 /8)
Milieu Czapeck caséine 1% + glucose 1% (g/ l):
Caséine …………………….. 10 g
Glucose …………………….. 10 g
KH2PO4 …………………….. 1 g
KCl …………………….. 0,5 g
Na2No3 …………………….. 2 g
MgSO4 7H2O …………………….. 0,5 g
FeSO4 …………………….. 0,01 g
Agar agar …………………….. 20 g
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
pH = (4 / 6 /8)
Remarque : pour préparer des milieux liquides il suffit de ne pas ajouter l’agar agar.
Annexe
PREPARATION DES SOLUTIONS DE L’ELECTROPHORESE
Tampon de charge (SDS-PAGE) :
(Tris –Hcl :0,125 M ;SDS :4% ; Glycérol : 20% ; 2- Mercaptoethanol 0,04% ;
pH =6,8) :
Tris- Hcl 0,5M …………………… 1,25ml
SDS10 ………………….2 ml
Glycérol …………………..5 ml
2-mercaptoethanol ………………...0,5 ml
Bleu de Bromophénol1 …………………..1 ml
Eau distillée q.s.p …………………10 ml
Le tampon est réparti à raison de 0,5ml par tube à hémolyse avant d’être conservé au
congélateur jusqu’au moment de l’emploi.
Tampon de migration :
(Tris : 0,25M ;Glycine :1,92M ; SDS :0,1 ;pH =8,3) :
Tris 3,03 g
Glycine 14,4 g
SDS 1 g
Eau distillée 1000 ml
Le tampon est conservé au réfrigérateur.
Annexe
Solution d’acrylamide : 30 % :
Acrylamide 30g
Eau distillée 1000ml
Solution de bis –acrylamide 1% :
bis –acrylamide 1g
Eau distillée 1000ml
Tampon de séparation :
(Tris-Hcl : 1,5 M ; pH =8,8)
Tris 36.3g
Eau distillée 1000ml
Tampon de concentration :
(Tris-Hcl : 0,5 M ; pH =6,8)
Tris 3g
Eau distillée 1000ml
Pour les deux derniers tampons , le pH est ajusté avec environ 24 ml d’HCL , 1N puis
complété à 200 ml avec de l’eau distillée .Après filtration les solutions sont conservées à 4°C.
Annexe
Tampon Tris – HCL 0,5M, pH=8,5:
Tris (hydroxyméthyl-amino-méthane) 6,05g
H2O q .s. p. 95ml
Ajuster à Ph=8,5 avec HCL ½ concentré, completer à 100 ml avec H2O.
Tampon Na-phosphate 0,1 M – pH = 7,1 (1) :
Solution A : KH2PO4, H2O …………… 2,76 g dans 100 ml H2O
Solution B : Na2HPO4, 2 H2O …………… 7,12 g dans 100 ml H2O
Ajuster le pH de la solution A à 7,1 avec la solution B.
Solution de fixation :
Acide acétique …………………….. 200 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
Solution de coloration
Bleu de coomassie G250 …………………….. 1,5 g
Ethanol …………………….. 250 ml
Acide acétique …………………….. 40 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
Solution de décoloration
Ethanol …………………….. 250 ml
Annexe
Acide acétique …………………….. 20 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
Solution de conservation :
Acide acétique …………………….. 70 ml
Eau Distillée q.s.p. …………………….. 1000 ml
La composition des gels de polyacrylamide en SDS-PAGE
Solutions mères Gel de séparation
15% (ml)
Gel de concentration
5% (ml)
Solution 30% acrylamide mix
Tampon de séparation (pH: 8.8)
Tampon de concentration (pH: 6.8)
Eau distillée
Solution SDS 10 %
Temed
Solution persulfate d’Ammonium 10%
7,5
3,8
-
3,5
0,15
0,006 ml
0.15
0,83
-
0,63
3,4
0.05
0,005 ml
0.05
Annexe
CALCULS DES DIAMETRES QUOTIDIENS EN CM ET LES VALEURS DES DENSITES
OPTIQUES
Diamètre quotidien des souches d’Ascochyta rabiei sur milieu Czapeck caséine1% +
glucose 1% pendant 10 jours d’incubation :
Moyenne
quotidienne
des souches
MQ A1 MQ A6 MQ A10 MQ A12 MQ A17 MQ A20 MQ A22
1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
2ème
jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
3ème
jour 0.63 1.2 0.63 0.5 0.4 0.53 0.58
4ème
jour 0.77 1.08 0.88 0.58 0.47 0.8 0.68
5ème
jour 0.88 0.88 1.12 0.72 0.62 0.85 0.9
6ème
jour 1.00 0.53 1.5 0.92 0.77 1.28 1.12
7ème
jour 1.27 0.57 1.9 1.13 1.22 1.45 1.28
8ème
jour 1.32 0.6 1.32 1.32 1.4 1.63 1.35
9ème
jour 1.4 0.72 2.2 1.32 1.3 1.82 1.47
10ème
jour 1.55 0.75 2.4 1.65 1.63 1.93 1.68
Moyenne 10
jours des
souches
0.901 0.808 0.901 0.813 0.82 1.04 0.923
Moyenne
quotidienne
des souches
MQ A23 MQ A27 MQ A31 MQ A35 MQ A38 MQ A40 MQ A45
1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
2ème
jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
3ème
jour 0.62 0.62 0.68 0.45 0.58 0.47 0.55
4ème
jour 0.75 0.88 0.82 0.73 0.8 0.67 0.67
5ème
jour 1.08 0.95 1.12 0.92 1.02 1.02 0.87
Annexe
6ème
jour 1.37 1.53 1.42 1.22 1.37 1.47 0.93
7ème
jour 1.65 1.72 1.97 1.58 1.58 1.5 1.00
8ème
jour 1.78 2.08 2.15 1.73 1.78 1.7 1.17
9ème
jour 1.9 2.27 2.52 2 1.5 1.98 1.22
10ème
jour 2.1 2.5 2.72 2.27 2.15 2.18 1.4
Moyenne 10
jours des
souches
1.136 1.291 1.378 1.16 1.141 1.201 0.871
Diamètre quotidien des souches d’Ascochyta rabiei sur milieu Czapeck caséine2%
pendant 10 jours d’incubation :
Moyenne
quotidienne
des souches
MQ A1 MQ A6 MQ A10 MQ A12 MQ A17 MQ A20 MQ A22
1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
2ème
jour 0.6 0.7 0.6 0.75 0.6 0.75 0.65
3ème
jour 0.6 0.9 0.75 0.95 0.65 0.95 0.65
4ème
jour 0.65 1.1 0.85 1 0.8 1.2 0.7
5ème
jour 0.75 1.15 1.05 1.1 1.05 1.35 0.9
6ème
jour 0.9 1. 3 1.15 1.25 1.15 1.5 0.95
7ème
jour 0.5 1.4 1.3 1.35 1.25 1.7 1.05
8ème
jour 1.32 0.6 1.32 1.32 1.4 1.63 1.35
9ème
jour 1.1 1.6 1.45 1.75 1.65 1.8 1.25
10ème
jour 1.2 1.7 1.5 1.8 1.75 1.85 1.35
Moyenne 10
jours des
souches
0.73 1.135 1 1.15 1.035 1.28 0.865
Annexe
Moyenne
quotidienne
des souches
MQ A23 MQ A27 MQ A31 MQ A35 MQ A38 MQ A40 MQ A45
1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
2ème
jour 0.65 0.8 0.8 0.6 0.6 0.65 0.9
3ème
jour 0.9 0.9 1 0. 7 0.85 0.8 1.05
4ème
jour 1.05 0.95 1.2 0.9 1 1 1.05
5ème
jour 1.15 0.95 1.4 1.05 1.15 1.15 1.15
6ème
jour 1.35 1.1 1.5 1.25 1.25 1.25 1.25
7ème
jour 1.4 1.15 1.6 1.3 1.45 1.4 1.45
8ème
jour 1.6 1.45 1.8 1.35 1.45 1.55 1.6
9ème
jour 1.75 1.75 2.05 1.45 1.65 1.85 1.95
10ème
jour 2.1 2.5 2.72 2.27 2.15 2.18 1.4
Moyenne 10
jours des
souches
1.155 1.07 1.325 1 1.105 1.13 1.21
Annexe
Diamètre quotidien des souches d’Ascochyta rabiei sur milieu Czapeck glucose 2%
pendant 10 jours d’incubation :
Moyenne
quotidienne
des souches
MQ A1 MQ A6 MQ A10 MQ A12 MQ A17 MQ A20 MQ A22
1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
2ème
jour 0.6 0.7 0.6 0.75 0.6 0.75 0.65
3ème
jour 0.6 0.9 0.75 0.95 0.6 0.75 0.65
4ème
jour 0.65 1.1 0.85 1 0.8 1.2 0.7
5ème
jour 0.75 1.15 1.05 1.1 1.05 1.35 0.9
6ème
jour 0.9 1. 3 1.15 1.25 1.15 1.5 0.95
7ème
jour 0.5 1.4 1.3 1.35 1.25 1.7 1.05
8ème
jour 1 1.5 1.35 1.55 1.45 1.7 1.15
9ème
jour 1.1 1.6 1.45 1.75 1.65 1.8 1.25
10ème
jour 1.2 1.7 1.5 1.8 1.75 1.85 1.35
Moyenne 10
jours des
souches
0.235 0.595 0.46 0.615 0.495 0.74 0.39
Moyenne
quotidienne
des souches
MQ A23 MQ A27 MQ A31 MQ A35 MQ A38 MQ A40 MQ A45
1er jour 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6
2ème
jour 0.65 0.8 0.65 0.6 0.6 0.65 0.9
3ème
jour 0.9 0.9 0.8 0. 7 0.85 0.8 1.05
4ème
jour 1.05 0.95 0.95 0.9 1 1 1.05
5ème
jour 1.15 0.95 1.4 1.05 1.15 1.15 1.15
6ème
jour 1.35 1.1 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25
7ème
jour 1.4 1.15 1.4 1.3 1.45 1.4 1.45
8ème
jour 1.6 1.45 1.5 1.35 1.45 1.55 1.6
Annexe
9ème
jour 1.7 1.65 1.7 1.4 1.65 1.65 1.7
10ème
jour 1.75 1.75 1.8 1.45 1.65 1.85 1.95
Moyenne 10
jours des
souches
0.615 0.575 0.58 0.465 0.565 0.59 0.67
Mesure des diamètres obtenus dans le test de la mise en évidence de l’activité
protéolytique sur milieu solide
CZ + CS+ Glu CZ + Glu CZ+CS
pH4 pH6 pH8 pH4 pH6 pH8 pH4 pH6 pH8
1er jour 0 0 0 0 0 0 0 0 0
2ème
jour 0 0 0 0 0 0 0 0 0
3ème
jour 0 0 2 0 0 0 3 0 0
4ème
jour 1 1 2 0 0 0 8 5 1
5ème
jour 1 1 2 0 0 0 10 12 2
6ème
jour 1 1 2 0 0 0 1 1 1
7ème
jour 1 1 3 0 0 0 2 2 2
8ème
jour 1 1 4 1 1 1 3 3 4
9ème
jour 2 2 6 1 1 1 6 3 3
10ème
jour 11 10 11 1 2 1 10 4 3
Annexe
Mesure des D.O obtenues dans le dosage protéolytique à L’UV
Moyenne des D.O de
dosage dans milieu
Czapeck glucose caséine
2%
Moyenne des D.O de
dosage dans milieu Czapeck
caséine 2%
Moyenne des D.Ode
dosage dans milieu
Czapeck glucose 2%
pH 4 pH6 pH8 pH4 pH6 pH8 pH4 pH6 pH8
1er
jour 0 0,0093 0 0,138 0 0,046 0 0,002 0,033
2ème
jour 0 0 0 0,079 0,036 0,0383 0 0 0
3ème
jour 0,008 0 0,0006 0,042 0,013 0,01855 0 0 0
4ème
jour 0,0143 0,017 0,01766 0 0,065 0,0275 0,0003 0,024 0,005
5ème
jour 0 0,0146 0,03 0,262 0,46 0,2506 0,001 0 0,0583
6ème
jour 0 0 0,0426 0 0,031 0,0245 0 0,004 0,13
7ème
jour 0 0,019 0 0,222 0,103 0,1083 0 0 0,0633
8ème
jour 0,0263 0,0223 0,048 0,122 0,039 0,0696 0 0,039 0,0116
9ème
jour 0,0053 0,018 0,0616 0,438 0,023 0,1742 0,003 0,023 0,0123
10ème
jour 0,0513 0,0333 0,099 0,496 0,032 0,209 0,0033 0,032 0,0566
Annexe
Mesure des variations quotidiennes de pH et de Poids de la souche A31 sur milieu
liquide Czapeck caséine glucose 2% pendant 10 jours d’incubation :
paramètres
ΔpH et
Δ poid
pH 4
pH 6
pH 8
Δ poid ΔpH Δ poid Δ poid Δ poid ΔpH
1er jour 0,27 5,3 0,27 5,8 0,27 6,9
2ème jour 0,27 5,6 0,27 6,55 0,32 6,82
3ème jour 0,31 5,2 0,36 6,4 0,36 6,9
4ème jour 0,31 5,2 0,51 6,3 0,38 6,8
5ème jour 0,52 5,2 0,81 6,3 0,41 6,9
6ème jour 0,8 5,4 0,99 6,3 0,55 6,8
7ème jour 1,18 5,2 1,06 6,2 0,91 6,7
8ème jour 1,56 4,9 1,62 5,9 1,41 6,3
9ème jour 2,12 5,3 2,49 5,7 2,15 6,1
10ème jour 2,7 6,3 3,16 5,4 2,7 5,9
Annexe
Mesure des variations quotidiennes de pH et de Poids de la souche A31 sur milieu liquide
Czapeck caséine 2% pendant 10 jours d’incubation :
paramètres
ΔpH et Δ
poid
pH 4
pH 6
pH 8
Δ poid ΔpH Δ poid ΔpH Δ poid ΔpH
1er jour 0,13 5,98 0,14 6,23 0,13 7
2ème jour 0,13 6,2 0,19 6,41 0,16 7,45
3ème jour 0,52 5,99 0,3 6,44 0,36 7,07
4ème jour 0,6 6,02 0,37 6,47 0,4 7,31
5ème jour 0.9 9 0.5 9 0.9 9
6ème jour 1,84 5,37 0,46 6,83 0,63 7,35
7ème jour 2,69 5,8 0,83 6,78 0,79 7,53
8ème jour 3,55 5,66 0,91 7,14 0,92 7,73
9ème jour 4 5,53 1,52 8,6 1,4 8,67
10ème jour 5,17 5,95 2,28 7,27 1,77 7,82
Annexe
Mesure des variations quotidiennes de pH et de Poids de la souche A31 sur milieu liquide
Czapeck glucose 2% pendant 10 jours d’incubation :
paramètres
ΔpH et Δ
poid
pH 4
pH 6
pH 8
Δ poid ΔpH Δ poid ΔpH Δ poid ΔpH
1er jour 0,14 5,5 0,1 6,45 0,13 7.1
2ème jour 0,14 5,81 0,1 6,49 0,13 7,03
3ème jour 0,14 6,1 0,14 6,6 0,18 7,46
4ème jour 0,18 5,81 0,39 6,64 0,33 7,44
5ème jour 0,21 6,1 0,48 6,78 0,42 7,52
6ème jour 0,37 6,66 0,69 6,72 0,67 7,2
7ème jour 0,89 7,49 1,18 6,84 0,92 7,47
8ème jour 1,53 5,93 1,48 6,04 1,16 6,28
9ème jour 2,58 4,96 1,96 4,83 1,27 5,14
10ème jour 2,97 4,57 2,17 4,9 1,47 5,08
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