Milieux Et Caractérisation Microbienne

8/12/2019 Milieux Et Caractrisation Microbienne

1/8

page 1

1

TP DE MICROBIOLOGIE - ANNEE 2010-2011

Licence Sciences, Technologies, Sant mention BiologieUE 6.3 b : Bactriologie et Virologie Gnrales

MATERIEL : Travail en binme- une blouse en coton Etuve :groupe du matin, tage du haut- un feutre indlbile groupe de laprs midi, tage du bas- un lastique cheveux Pipetage uniquement avec poires

1re semaine

PROGRAMME DU TP : LE COURS ET LESTD DOIVENT ETRE COMPRIS Travail strileIdentification de 3 souchesIdentification prsomptive de souches dun mlange

- Techniques de base :- Travail strile- Etat frais- Coloration de Gram

- Ensemencement- Isolement sur milieux gloss slectifs et non slectifs

- Identification bactrienne par ltude des caractres mtaboliques et antigniques

I - TRAVAIL STERILE(J1, J2)

1) J1A partir dun bouillon Trypticase Soja ( TS) de 10 mL (tube essai), transvaser strilement 2mL dans 5 tubes hmolyse laide dune pipette Pasteur.

- 2 bouillons serviront au test de strilit : les incuber 24h 37C.- les 3 autres bouillons serviront pour lidentification des 3 souches (voir II).

2) J2Les 2 bouillons non ensemencs sont-ils limpides ? Conclusion.

II - IDENTIFICATION DE 3 SOUCHES(J1, J2, J3)Chaque binme reoit 3 souches isoles sur glose TS en vue dune identification.

1) J1- Caractres morphologiques. Pour chacune des 3 souches, raliser sparment :

- Gram (objectif x 100 limmersion). Dessiner la forme exacte (allonge, ovale, ronde,incurve, ). Prciser le groupement.

- Etude de la mobilit- ensemencement dun milieu semi-solide mannitol-mobilit : piqre centrale avec 1 colonie.- ensemencement dun bouillon TS de 2 mL avec 1 colonie.

- Risolement - Faire scher 3 gloses TS 30 min. ltuve.- Isoler partir du bouillon TS ensemenc par 1 colonie chaque souche

sur une glose TS par la mthode des quadrants. Flamber entre chaque quadrant.Semaine 1


2/8

2

2) J2Etudier sur les 3 souches :

- Caractres morphologiques.- tude de la mobilit :

- lecture du milieu mannitol-mobilit.- tat frais entre lame et lamelle partir du bouillon TS (objectif x 40 sec).

- tude macroscopique des colonies

- Mtabolisme nergtique - T ESTS REALISER SUR LA MEME LAME -- catalase : Dposer 1 goutte de H 2O2 puis les colonies avec 1 pipette Pasteur.- oxydase : Dposer 1 papier buvard avec 1 goutte de TMPD. Dposer les colonies avec

une pipette Pasteur la limite de la goutte et du buvard sec. Le test est + si cest la colonie quivire qu rouge.

Etudier selon lidentification prsomptive de la famille ou du genre :

- Caractres mtaboliques- pour bacilles Gram -

Lecture de la fermentation du mannitol sur le milieu mannitol-mobilit ensemenc en J1.Ensemencement dune galerie didentification simplifie en tubes ( voir fiches techniques) :

- milieu de Kligler-Hajna- milieu de Clark et Lubs (pour raction de RM et VP)- milieu ure-indole de Ferguson- recherche de la nitrate rductase sur mannitol-mobilit.

Ensemencement dune galerie API 10E.

- pour staphylocoques (coques Gram +, catalase +)Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus).Recherche dune DNAse : ensemencer une glose lADN.Recherche dune coagulase : agglutination de particules de latex sensibilises par du fibrinogne.

- pour streptocoques (coques Gram +, catalase -)Lecture de la fermentation du mannitol (cf. ci-dessus).Etude des caractres antigniques ( faire ventuellement J3) :

Recherche du polyoside C parital : 1- extraction du polyoside C : mettre 20 coloniesen suspension dans 0.5 mL denzyme dextraction. Incuber 10 min. 37C au bain-marie

2- raction dagglutination de particules de latexsensibilises par des anticorps spcifiques de chaque polyoside C de groupe A, B, C et D.

3) J3- pour bacilles Gram -

Rvlation et lecture de la galerie didentification en tubes.Test ONPG : uniquement si la bactrie est lactose - (voir milieu de Kligler-Hajna).Rvlation et lecture de la galerie API 10E.Comparaison des rsultats obtenus par les 2 mthodes.

- pour les staphylocoquesRvlation de la DNAse.

Semaine 1


3/8

3

III - ETUDE DUN MELANGE DE GERMES(J1, J2, J3)Chaque binme reoit un bouillon TS renfermant un mlange de germes.

1) J1- Etude morphologique

- Etat frais : mettre 1 anse de bouillon entre lame et lamelle. Observer (cf. fichetechnique).

- Gram : mettre 2 gouttes de pipette Pasteur sur une lame.

- prsomption : types de germes prsents (forme, groupement, mobilit, Gram)- choix de milieux de culture slectifs ou non pour lisolement de ces bactries

- Isolement sur milieux solides :Faire scher les gloses 30 min. ltuve avant lisolement

- sur milieu non slectif (glose TS) qui permettra la croissance de toutes les bactries- sur milieu(x) slectif(s) si ncessaire pour inhiber certaines bactries :

- milieu de Chapman slectif pour staphylocoques et microcoques

- milieu de Drigalski slectif pour bacilles Gram - courants (entrobactries,Pseudomonas , Vibrion).

2) J2- Voir la qualit des isolements. Si besoin, risoler.- Lecture des milieux Chapman et Drigalski.- Comparaison des isolements entre eux. Aspect macroscopique des colonies.

- Identification prsomptive de chaque germe :- Gram- oxydase- catalase- type respiratoire : Lecture des gloses Viande Foie (VF). VOIR clichs fournis

Les gloses VF ont t ainsi prpares. Les VF sont pralablement rgnres 20 min. au bain-marie bouillant et ramenes 55C. Elles sont ensemences avec une colonie sur toute lahauteur du tube puis solidifies immdiatement en passant le tube sous leau froide. Les VF sontincubes 24h 37C. Le bouchon est lgrement dviss pour laisser lair pntrer.

AUCUN AUTRE TEST faire

3) J3 Finir les lectures des tests.

COMPTE RENDU par binme : rendre imprativement en J3 la fin de la sance :- Travail strile.- Identification des souches : classer les rsultats par souche ; regrouper les tests pour

dgager la logique de la dmarche dune identification.- Identification prsomptive des germes du mlange.- Inclure une note sur : - principe et mode de lecture des milieux TS, Chapman et

Drigalski. - principe et mode de lecture des milieux Kligler, Clark etLubs, ure-indole et du test de la recherche de la nitrate rductase.

- dfinition des entrobactries.NB : - Ne pas oublier le n des 3 souches tudies et la lettre du mlange.

- Les comptes-rendus ne doivent pas dcrire les techniques utilises mais doiventcomporter les rsultats et la dmarche suivie si possible sous forme de tableau.

Semaine 1


4/8


5/8

5

II - MUTATION(J1, J2, J3)- Principe. Slection de mutants spontans rsistants lacide nalidixique par la

technique du gradient de Szybalski.

1) J1- Prparation du milieu de culture :

On dispose de solutions mres dantibiotiques 10 g/L. La concentration finale en acidenalidixique dans la glose Mueller Hinton (MH) doit tre de 40 g/mL.

- Calculer le volume de solution mre dantibiotique ajouter 20 mL de glose.- Ajouter lantibiotique 20 mL de glose de MH fondue et refroidie 50C.- Couler dans une bote de Petri. Laisser solidifier en position incline.- Lorsque la glose est solidifie, reprer laxe et le noter sur le fond de la bote.- Mettre la bote plat et rtablir le niveau avec 20 mL de glose MH sans antibiotique

fondue et refroidie 50C.- Laisser solidifier. Lantibiotique va diffuser et il stablit un gradient de concentration

allant de 0 40 g/mL.- Mettre scher au moins 30 min. ltuve avant utilisation de la glose.

- Prparation de la souche bactrienneLa souche Escherichia coli 2 est distribue sur glose Trypticase Soja (TS).Prparer une suspension trs dense (comme du lait concentr) dans 1 mL deau distillestrile ( 10 10 bactries/mL).Ensemencer le milieu de culture par talement au rteau de 0.2 mL de suspension bactrienne.Incuber 24h 37C.

- Sensibilit aux antibiotiques ( voir fiche technique) :Pratiquer un antibiogramme par la mthode des disques pour vrifier la sensibilit de la souche.Faire scher 10 min. 2 gloses de Mueller-Hinton.Ensemencer ces 2 gloses MH avec la mme suspension bactrienne. Tester :Bote 1 : sulfamides, trimthoprime, acide nalidixique, streptomycine, kanamycine, gentamicine.Placer un disque de rifampicine au centre.Bote 2 : amoxicilline, amoxicilline+acide clavulanique, cfalotine, cfotaxime, ticarcilline,pfloxacine.

2) J2- Lire lantibiogramme (voir fiche technique).- Reprer et compter les colonies de mutants rsistants qui ont pouss dans la partie de la boteo lantibiotique est le plus concentr.- Pratiquer un antibiogramme par la mthode des disques sur une colonie pour vrifierlapparition de la rsistance. Utiliser une suspension bactrienne moins dilue pour ensemencer 1glose MH prsche 10 min. : 1 colonie dans 10 mL deau distille.Dposer les antibiotiques de la bote 1 et rajouter la pfloxacine au centre.

3) J3Lecture de lantibiogramme.

Semaine 2


6/8


7/8


8/8

8

III - EXAMEN PRATIQUE INDIVIDUEL (J2 et J3)

Documents autoriss : Un mlange de germes en bouillon TS est distribu chaque tudiant pour

- isolement des diffrentes bactries sur milieux slectifs ou non- Gram et Etat Frais (EF)- identification au moins partielle (famille, genre ou espce) des bactries

Chaque tudiant est not sur :- la qualit des isolements- les colorations de Gram et tats frais- sa dmarche- son compte rendu

Les tudiants pourront utiliser les ractifs pour les tests oxydase et catalase.Les tudiants devront indiquer lorientation de lidentification.

Les tudiants devront lister les milieux et ractifs quils utiliseraient pour aboutir lidentification des germes.

AUCUNE AIDE NE SERA APPORTE POUR REGLAGE ET LECTURE GRAM et EF

COMPTE RENDU INDIVIDUEL A RENDRE A LA FIN DE LA SEANCE EN J3

Ne pas oublier le n du mlange.Les comptes-rendus ne doivent pas dcrire les techniques utilises mais

doivent comporter les rsultats et la dmarche suivie si possible sous forme de tableau.

REMARQUEUn examen thorique de Travaux Pratiques aura lieu pendant les sessions de juin et deseptembre sous la forme dun contrle crit de 30 minutes sans documents.

NOTATION DES TPCompte rendu semaine 1 : sur 20Compte rendu semaine 2 : sur 20 - une note moyenne sur 20

Examen pratique de TP : sur 20

Examen thorique de TP : - une note sur 20

Note finale sur 40 points, puis remise au coefficient de TP de lUE.

Semaine 2

Notation au cours de lexamen