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UNIVERSITE DE LIMOGES

Ecole doctorale « Science-Technologie-Santé » ED 258

Faculté des Sciences et Techniques

UMR CNRS 6101

Laboratoire "Physiologie moléculaire de la

réponse immune et des lymphoproliférations"

TTTHHHEEESSSEEE

N° …………. Pour soutenir le grade de

DDDOOOCCCTTTEEEUUURRR DDDEEE LLL’’’UUUNNNIIIVVVEEERRRSSSIIITTTEEE DDDEEE LLLIIIMMMOOOGGGEEESSS

Discipline : Biologie, Sciences, Santé

Spécialité : Immunologie

Présentée et soutenue publiquement par

Sophie Raynal-Duchez

Le 19 Octobre 2007

Directeurs de Thèse : Pr. Michel Cogné

Pr. Raymond Julien

Jury :

Président : Abderrahman Maftah – Professeur, Limoges (UMR INRA 1061)

Rapporteurs : Claudine Schiff – Directrice de recherche INSERM, Marseille (CIML)

Hervé Watier - Professeur, Tours (IPGA)

Examinateur : Bernardo Reina – Chargé de recherche 1 CNRS, Strasbourg (IGBMC)

Modèles transgéniques pour l’étude de la fonction

des récepteurs des cellules B et de leur glycosylation

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Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier Claudine Schiff, Hervé Watier et Bernardo Reina qui me font

l’honneur de juger mon travail. Je remercie également Abdou Maftah d’avoir accepté de présider

ce jury de thèse et Raymond Julien pour être l’instigateur du projet « cellules B et

glycosylation ».

Je tiens à remercier Michel pour m’avoir accueillie au sein de son laboratoire dès mon stage de

maîtrise et de m’avoir acceptée en thèse, sous sa direction. Merci de m’avoir dirigée, motivée et

stressée (ça, ce n’était pas le plus facile pour moi !).

Je remercie tous mes collègues du 2ème et du 3ème pour tous les bons moments que nous avons

partagés : les soirées de Noël, les repas de midi et apéros divers (de même qu’une fameuse

omelette aux girolles après une soirée éprouvante au cyto !!!)… une sacrée équipe de joyeux

lurons qui savent travailler, s’investir mais également prendre du bon temps quand il faut. Merci

au « labo du fond », à la Denizot’s team, Eric-le roi de la recup’, Anne-Gaëlle, la Laurent’s team,

Vincent, Seb, Cathy, « la caisse », Cendrine, Chahrazed, ZO-la reine des southern, Jean- ses

clusters et son petit monde du 2ème, Bernadette… Sans oublier le personnel du CHU des

laboratoires d’Hématologie et d’Immunologie qui ont également contribué au bon déroulement

de cette thèse.

Un petit mot pour Rada, Cécile et V2 qui m’ont aidée dans les manips surtout à la fin… vous êtes

trop mignonnes !!! mais également pour mes « serial killer »… de souris : Rémi, tu restes une

énigme pour moi et Virgo : « t’es vraiment trop cool ». Je remercie Armelle pour les multiples

immunisations, Nadine pour les jolies chimères et Sylvie, « ma petite souris préférée »,

continuellement souriante, qui s’est toujours occupée avec respect de mes diverses lignées de

souris transgéniques…

Le petit bureau « Tempus »… nous sommes 4 (Claire, Laulau, Krap et moi) et je pense que je ne

retrouverai jamais « meilleur bureau » !! Vous êtes plus dans mon cœur que des collègues ou

copains de cerveau (voir freezbe VWR), ami(e)s ??? Outre les bonnes blagues, les « remontages

de moral » et les grandes conversations-manip, j’ai beaucoup appris auprès de vous. Merci Krap

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de m’avoir donnée le goût pour la recherche, c’est avec toi que tout a commencé et je t’en suis

reconnaissante (même si tu m’avais dit que j’allais en … baver !!!).

Je n’ai pas oublié mes copines « soirées – Grey’s » (Virginie, Nathalie et Christelle), on a passé

de bons moments ensemble et j’espère en passer plein d’autres… sans oublier les soirées

« Pécharmant » avec Virgo qui seront suivies, j’espère, de superbes soirées « piῆa colada » dans

un paysage de rêve !!!!!

Merci à Chantal, Jean-Luc et Claire, les Pro de la cytométrie de m’avoir donner le goût et les

bases de cette technique, et surtout d’avoir passé pas mal d’heures à trier mes cellules (petit

rappel douloureux pour Chantal !!!!)

Je tiens à remercier toute ma famille et ma belle-famille pour m’avoir soutenue et surtout mes

parents pour leur présence, leur amour et leurs encouragements… sans oublier mes amies :

Hélène, Emilie, Mylène et Vinciane qui sont continuellement à mon écoute, et toujours en attente

de mes appels téléphoniques… je vais me rattraper… et toutes les personnes que j’oublie

certainement de citer, qui me sont chères.

Enfin le meilleur pour la fin, mon Jordi… merci de m’avoir épaulée, soutenue, encouragée,

réconfortée dans cette longue aventure et de t’être même transformé en homme à tout faire

pendant quelques semaines… Tu as su respecter mon travail tout en supportant les contraintes…

je t’aime fort. Je suis fière d’être ta femme et cette thèse, c’est un peu la tienne.

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Abréviations

-/- : homozygote négatif -/+ : hétérozygote +/+ : homozygote positif Ac : anticorps ADCC : « Antibody Dependent Cell-mediated Cytotoxicity » ADN : acide désoxyribonucléique Ag : antigène AID : cytidine désaminase induite après activation APE1 : endonucléase apyrimidique 1 ARN : acide ribonucléique ARNm : acide ribonucléique messager B : lymphocyte B BCR : récepteur des cellules B BLNK : B-cell linker protein BSAP : B-cell specific activation protein C : région constante CAT : chloramphénicol acétyltransférase CD40-L : ligand de CD40 CDC : « Complement-Dependent Cytotoxicity » CDGs : « Congenital Disorders of Glycosylation » (désordres congénitaux de la glycosylation) CDR : complementary determining region (protéine se liant aux imunoglobulines) CG : centre germinatif CH : région constante de chaîne lourde CL : région constante de chaîne légère CSH : cellule souche hématopoïétique CSPG : Chondroitin Sulfate Proteoglycan CSR : commutation de classe D : segment de diversité D.O : Densité Optique Da : dalton DH : segment de diversité de chaîne lourde DNase I : désoxyribonucléase I dNTPs : désoxyribonucléosides triphosphates DO : absorbance EGF : « epidermal growth factor » Eiκ : séquence stimulatrice intronique des chaînes légères kappa

ELISA : enzyme linked immunosorbent assay (test avec un immunoadsorbant lié à une enzyme) ES : Embryonic stem (cell) Eµ : séquence stimulatrice intronique des chaînes lourdes Fab : domaine de liaison à l’antigène d’une immunoglobuline FACS : Fluorescence Activated Cell Sorter Fc : domaine effecteur d’une immunoglobuline FDC : Follicular dendritic cells (cellules dendritiques folliculaires) FR : framework (région « armature ») Fuc : fucose GAGs : Glycosaminoglycannes Gal : galactose GalNAc : N-acétylgalactosamine GalNac-T : N-actétylgalactosaminyltransférase Gal-T : Galactosyltransférase Glc : glucose GlcA : acide glucuronique GlcNAc : N-acétylglucosamine GlcNAc-T : N-Acétylglucosaminyltranférase GlcT : Glucosyltransférase GPI : Glycosyl Phosphatidyl Inositol HAT: histone acétyltransférase HES : Hairy/Enhancer of Split hs : site hypersensible à la DNase I HSA : heat stable antigene HSPG : Heparan Sulfate Proteoglycan ICN : Intracellular Notch IdoA : acide iduronique IFN : interféron Ig : immunoglobuline IgH : locus de chaîne lourde d’immunoglobuline IgL : locus de chaîne légère d’immunoglobuline IL : interleukine J : segment de jonction Kb : kilobase kDa : kilodalton

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KO : « knock-out » : délétion de gène par recombinaison homologue LCR : région de contrôle du locus Lfng : Lunatic Fringe LPS : lipopolysaccharide bactérien Man : mannose MAR : région d’ancrage à la matrice MEC : Matrice extracellulaire member Mfng : Manic Fringe Néo

r : gène de résistance à la néomycine NeuAc : N-acetyl-D-neuraminic acid NeuAc : acide N-acétylneuraminique ou acide sialique NHEJ : jonction d’extrémités non homologues NMD : Nonsense-mediated mRNA decay (dégradation des ARNm non-sens) ORF : Open Reading Frame PALS : manchons périartériolaires spléniques Pax : Paired box pb : paire de bases pb, Kpb : paire de bases, Kilo paires de bases PBS : « phosphate buffered saline » PCR : réaction de polymérisation en chaîne Pgk : promoteur de la phosphoglycérate kinase

PLC : phospholipase C PolyA : site de polyadénylation pVH : promoteur des régions variables des chaînes d’immunoglobulines RAG : Recombination activating gene (gène activant la recombinaison) REG : réticulum endoplasmique rugueux RPMI : Rosewell Park Memorial Institut (milieu de culture pour cellules eucaryotes) RSS : séquence signal de recombinaison S : région switch Shh : Sonic Hedgehog SHM : hypermutation somatique SiaT : Sialyltransférase SVF : sérum de veau fœtal TCR : récepteur des cellules T TdT : déoxynucléotidyltransférase TGF: transforming growth factor TGFβ : Transforming Growth Factor β TLDA : TaqMan Low Density micro-Array TNF : tumor necrosis factor UNG : uracil glycosilase V : région variable VH : région variable de chaîne lourde VL : région variable de chaîne légère Wnt : Wingless-type MMTV integration site family Xyl : Xylose

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Table des figures et des tableaux

Figure 1 : Structure des immunoglobulines. 19

Figure 2 : Juxtaposition des régions hypervariables CDR en « 3D » 20

Figure 3 : Les Récepteurs de la cellule B (BCR) et de la cellule préB (préBCR) sont associés aux

deux molécules de signalisation Igα et Igβ. 21

Figure 4 : Représentation schématique des loci codant les Ig chez la souris. 23

Figure 5 : Les séquences signal de recombinaison (RSS) 25

Figure 6 : Réarrangements des gènes variables du locus IgH. 26

Figure 7 : Résolution des coupures double brin induites par les enzymes RAG. 27

Figure 8 : Les nucléotides N et P. 29

Figure 9 : L’accessibilité du locus des gènes d’Ig lors des réarrangements V(D)J par remodelage

de la chromatine. 30

Figure 10 : L’exclusion allélique. 32

Figure 11 : Structure des loci IgH chez la souris et l’homme. 34

Figure 12 : Les différentes étapes de l’ontogénèse des lymphocytes B conventionnels (B2). 40

Figure 13 : PAX5 et lineage B 42

Figure 14 : Bilan des blocages partiels ou complets de la différenciation B causés par des défauts

de gènes codant des facteurs de transcription mais également des protéines de la

machinerie de transduction du signal. 45

Figure 15 : Maturation des B périphériques au niveau des centres germinatifs 47

Figure 16 : BLIMP-1 contrôle la différenciation plasmocytaire 49

Figure 17 : Schéma récapitulatif de la maturation des B périphériques 51

Figure 18 : Exemple de « switch » (commutation de classe) vers IgE. 52

Figure 19 : Structures générées par la transcription lors de la commutation de classe. 56

Figure 20 : Rôle de AID dans la commutation isotypique. 58

Figure 21 : Translocation des BCR dans les rafts après crosslinking avec un antigène. 60

Figure 22 : Signalisation médiée par le BCR. 61

Figure 23 : Représentation schématique de la transduction du signal par le BCR. 62

Figure 24 : Comparaison des régions spécifiques aux mIg 69

Figure 25 : Séquences des domaines cytoplasmiques. 70

Tableau 1 : Les principales glycosyltransférases de vertébrés greffant des sucres

monosaccharidiques sur des substrats mono- ou polysaccharidiques. 79

Figure 26 : Synthèse des N-glycoprotéines 80

8

Figure 27 : Les trois types de N-glycannes présents chez les Eucaryotes. 82

Figure 28 : Représentation schématique des principaux monosaccharides O-liés sur des résidus

Sérine et Thréonine. 83

Figure 29 : Liste non exhaustive des CSPGs et HSPGs 86

Figure 30 : La famille des glycosaminoglycannes 88

Figure 31 : Biosynthèse des HS et des CS. 90

Tableau 2 : Les différents motifs des CS 92

Figure 32 : Structure et fonction d’une IgG. 93

Figure 33 : Voie de signalisation Wnt. 98

Figure 34 : Voie de signalisation Notch. 100

Figure 35 : Les différentes structures de glycannes O-fucosylés observées sur la protéine Notch.

102

Figure 36 : Les HSPGs jouent de nombreux rôles dans la physiologie cellulaire. 105

9

Sommaire

Introduction Générale 11

Rappels Bibliographiques 17

I. Organisation et expression des gènes d’immunoglobuline 21

1.1 Le locus des chaînes lourdes (IgH) 22 1.2 Les loci des chaînes légères (IgL) 22

1.2.1 Le Locus Igκ 22 1.2.2 Le Locus Igλ 23

II. Génération du répertoire des cellules B 24

2.1 Les recombinaisons V(D)J 24 2.2 La régulation de la recombinaison V(D)J 29

2.2.1 Modèle ou théorie de l’accessibilté 29 2.2.2 La théorie de l’exclusion allélique 31 2.2.3. La régulation transcriptionnelle 33

a. Les promoteurs 33 b. Les enhancers introniques (Eμ, DQ52, Eκ) 35 c. Les enhancers 3’ (3’IgH, 3’kappa et 3’ lambda) 36 d. Les éléments atténuateurs « silencers » et les « MAR » 37

2.3 L’épissage des transcrits d’Ig 38

III. L’ontogenèse B 39

3.1 La phase indépendante des antigènes 41 3.2 La phase dépendante des antigènes 44 3.3 Le mécanisme de la commutation de classe 51

a. Les régions S 53 b. La transcription germinale et le rôle des cytokines 54 c. Le rôle de AID dans la commutation de classe 56

IV. L’activation des lymphocytes B où la signalisation via le BCR 59

4.1. La signalisation par le BcR et sa modulation 59 4.2. La signalisation en fonction des différents isotypes du BCR 68

V. « Glycannes et glycoconjugués » 77

5.1. La glycosylation 78 5.1.1. La N-glycosylation des protéines 80 5.1.2. La O-glycosylation des protéines 83 5.1.3. La O-Glycosylation de type Glycosaminoglycanne (GAG) 85

a. Les différentes sous-familles de GAGs 87 b. La biosynthèse des GAGs 89

5.2. Les « sucres » et leur implication dans le système immunitaire 92 5.2.1. La glycosylation des Ig 92

10

5.2.2. Les galectines, les voies Notch et Wnt : importance de la glycosylation. 95 a. Les galectines 95 b. Les WNTs 97 c. Notch 99

5.2.3. Les différentes fonctions associées aux GAGs 102

Résultats - Discussion 107

Première partie : les BCR modifiés 109

Article 1 111 Article 2 113 Demande de dépôt de brevet 115

Deuxième partie : les glycosaminoglycannes 131

Article 3 133

Perspectives 135

Annexes 145

Article 4 147 Article 5 149

Références Bibliographiques 151

Résumé 15180

11

Introduction Générale

12

13

Afin d’assurer la défense de l’organisme, le système immunitaire dispose d’une capacité

d’apprentissage permettant de spécifier la tolérance des antigènes du « soi » (ce qui est propre à

l’organisme) et l’élimination des antigènes du « non-soi » (ce qui est étranger). Cette dichotomie

est nuancée par la nécessité de co-signaux d’activation de l’immunité innée (signaux de

« danger ») pour la mise en place d’une réponse immunitaire efficace. Les bases de la réponse

adaptative reposent ensuite principalement sur les deux lignées lymphoïdes T et B et sur leurs

récepteurs membranaires spécifiques d’antigènes, ainsi que sur la possibilité pour la lignée B de

produire des formes solubles de leurs récepteurs pour l’antigène : les anticorps. Ces anticorps

sont capables de se lier spécifiquement à un antigène dans le but de le neutraliser et de l’éliminer.

Les cellules participant à cette immunité peuvent circuler dans l’ensemble de l’organisme et se

localiser, à des étapes spécifiques de leur maturation, au niveau d’aires spécialisées (moelle

osseuse, organes lymphoïdes secondaires…). Le système immunitaire inclut donc, non seulement

les lymphocytes T ou B mais aussi des cellules accessoires telles que les macrophages et autres

cellules présentatrices d'antigènes, et des cellules épithéliales de soutènement ou des cellules

stromales qui constituent le « microenvironnement » de la maturation lymphocytaire et de la

réponse immune.

La capacité des lymphocytes à répondre de manière spécifique à un grand nombre

d’antigènes étrangers, est le résultat d’un processus de différenciation à l’issue duquel chaque

lymphocyte exprime un récepteur unique à l’antigène.

Une longue série de phénomènes d’activation et de coopération cellulaire est nécessaire

avant d’aboutir à la sécrétion d’un anticorps spécifique par une cellule de la lignée lymphoïde B.

Cette réponse présuppose l’expression à la surface cellulaire d’une forme membranaire de

l’immunoglobuline au sein du récepteur des cellules B pour l’antigène (BCR), dont la spécificité

est définie pour chaque clone B. La population des lymphocytes B est donc formée d’un vaste

répertoire de clones produisant des BCR spécifiques des différents antigènes. Ce processus de

génération de la diversité des immunoglobulines a été proposé par Burnet en 1959 dans sa théorie

de la sélection clonale. Les cellules B subissent au cours de l’ontogenèse une sélection

directement dépendante de la spécificité de leur récepteur pour l’antigène.

Chez l’homme et chez la souris, les cellules B se différencient à partir de cellules souches

hématopoïétiques d’abord dans le foie fœtal puis dans la moelle osseuse par un processus

ordonné qui comprend un nombre limité d’étapes et nécessite une série de réarrangements intra-

géniques permettant l’assemblage de gènes d’immunoglobulines fonctionnels. Ces

14

réarrangements aboutissent à la mise en place d’un récepteur pré-B à la surface des précurseurs B

puis d’un récepteur B à la surface des cellules B immatures puis matures.

Immunocompétent, le lymphocyte B naïf va alors quitter la moelle osseuse via la

circulation sanguine et gagner les organes lymphoïdes secondaires tels la rate et les ganglions

lymphatiques. Si un lymphocyte B interagit avec un antigène dont son BCR est spécifique, la

cellule entreprendra alors une expansion clonale et pourra subir les processus de commutation de

classe et d’hypermutation somatique pour obtenir un récepteur de haute affinité dont l’expression

sera ensuite durablement conservée par des cellules B mémoires, leur conférant une capacité de

réponse rapide et adaptée en cas de nouveau contact avec le même antigène. La stimulation B

pourra également bifurquer vers la différenciation terminale plasmocytaire, soit précocement en

aboutissant à la génération de plasmocytes à courte durée de vie au niveau de foyers extra-

folliculaires (capables de sécréter rapidement de grandes quantités d’Ig de faible affinité), soit

plus tardivement au niveau des centres germinatifs, aboutissant alors à des plasmocytes qui

produisent des anticorps de haute affinité, certains de ces plasmocytes étant en outre à longue

durée de vie et capables de maintenir une production très prolongée d’anticorps spécifiques

même en l’absence de nouveau challenge antigénique.

A chaque grande étape de la maturation B, des mécanismes de sélection ont lieu et

permettent d’une part de ne conserver que les cellules exprimant un BCR fonctionnel et d’autre

part de limiter l’apparition ou l’activation de cellules exprimant un récepteur auto-réactif

(reconnaissant les antigènes du soi). Ces cellules auto-réactives sont en grande majorité éliminées

ou « anergisées » pendant la différenciation B précoce, durant laquelle elles peuvent mourir par

apoptose (délétion clonale), entrer en anergie, ou réinitier le réarrangement des gènes

d’immunoglobulines (« BCR editing »).

Au final, tant au niveau de l’activation B que du contrôle de l’autoréactivité, on conçoit

donc que la sélection d’un répertoire adapté de BCR (ou d’anticorps) via la sélection de clones B,

n’est possible que grâce au caractère clonotypique du BCR, bénéficiant donc du fait que chaque

cellule ne possède qu’un seul type de récepteur à sa surface grâce au phénomène d’exclusion

allélique qui régit l’expression des chaînes lourdes et des chaînes légères d’immunoglobulines.

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la fonction même du BCR et notamment du

BCR commuté vers IgA et IgE afin de savoir si une chaîne lourde α ou une chaîne lourde ε

étaient capables de jouer un rôle similaire à celui d’une chaîne lourde µ et donc apporter des

éléments de réponse concernant la capacité d’un récepteur B (soit de type IgA soit de type IgE) à

15

conduire les cellules B au long de leur développement jusqu’au stade final plasmocyte-sécréteur

d’anticorps. Pour cela, nous avons réalisé plusieurs modèles de knock-in portant des BCR

modifiés où le gène Cα1 humain dans un cas et Cε humain dans un autre, ont été intégrés par

recombinaison homologue au niveau de la région switch µ afin d’obtenir une lignée de souris

transgéniques n’exprimant que des IgA ou des IgE. Nous avons choisi des gènes constants

humains pour palier au problème de switch résiduel endogène.

Dans une autre perspective d’étude des phénomènes pouvant modifier la réactivité des

récepteurs de surface de la cellule B, nous nous sommes intéressés à la modulation de la

glycosylation au cours de la différenciation B. La glycosylation est un des principaux événements

de maturation post-traductionnelle des protéines et des lipides. Elle consiste en une succession de

réactions enzymatiques aboutissant à l’élaboration de motifs glycanniques greffés sur des

glycoprotéines ou des glycolipides. La diversité des combinaisons glycanniques permet de

multiples interactions. Sachant que chaque modification (le greffage ou le clivage d’un sucre)

dépend de l’activité d’un gène, il nous a semblé intéressant d’étudier les variations de

l’expression de gènes impliqués dans la glycosylation afin d’être capables, par la suite, de

différencier des sous-populations B correspondant à différents états de maturation, d’activation

ou de localisation. Cette étude du glycotranscriptome au cours de la maturation B, nous a permis

de cibler puis d’étudier d’une manière plus approfondie 2 gènes d’intérêt CsGalNacT1 et Extl1

jouant un rôle dans la biosynthèse des glycosaminoglycannes. Nous avons donc réalisé des

lignées de souris transgéniques surexprimant de façon B-spécifique ces gènes afin de comprendre

plus précisément le rôle de ces enzymes in vivo au cours du développement B.

16

17

Rappels Bibliographiques

18

19

Les immunoglobulines sont des hétérodimères protéiques, d’environ 150 kDa, exprimés à

la surface des lymphocytes B (comme un composant majeur du récepteur pour l’antigène) ou

excrétés par les plasmocytes. Elles sont composées de deux chaînes lourdes (H pour Heavy)

identiques et deux chaînes légères (L pour Light) identiques. Figure 1.

Figure 1 : Structure des immunoglobulines.

A : Représentation tridimensionnelle d’une IgG1 de souris. Les chaînes lourdes sont représentées en rouge, les chaînes légères en jaune et les glycosylations en violet. B : Représentation bidimensionnelle d’une Ig. VH et VL : régions variables des chaînes lourdes et légères. CH, CL : régions constantes des chaînes lourdes et légères. Remarque : la région située entre les domaines CH1 et CH2 des chaînes H ou région charnière assure la flexibilité de l’anticorps dont les 2 bras, portant les paratopes, sont mobiles dans l’espace.

Les chaînes lourdes sont unies entre elles par un ou plusieurs ponts disulfures. Les chaînes

légères sont unies aux chaînes lourdes par un pont disulfure proche de leur extrémité carboxy-

terminale.

B

20

Chaque chaîne est composée d'une région constante C et d'une région variable V.

L'association des domaines variables des chaînes lourdes et légères définit le site de fixation à

l'antigène (« niche antigénique ») tandis que les domaines constants des chaînes lourdes confèrent

ses propriétés effectrices à l'immunoglobuline. Chacun des domaines variables VL et VH possède

trois zones hypervariables ou « régions déterminant la complémentarité » (CDR) séparées par des

régions plus conservées (régions « charpente » ou FR pour « framework ») et la juxtaposition de

ces zones CDR forme le paratope (site de liaison). Figure 2.

Figure 2 : Juxtaposition des régions hypervariables CDR en « 3D »

L’homme et la souris possèdent deux types de chaînes légères, appelés κ et λ, qui peuvent

s'associer à chacune des cinq classes de chaînes lourdes (µ, δ, γ, ε et α) définissant respectivement

les IgM, IgD, IgG, IgE et IgA. Les IgG sont subdivisées en 4 sous-classes : IgG1, IgG2a, IgG2b,

IgG3 chez la souris et IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4 chez l’homme. Les IgA existent en outre chez

l’homme comme deux sous-classes IgA1 et IgA2.

Il est à noter que les Ig sécrétées n’existent pas uniquement sous des formes

monomériques mais peuvent se présenter sous formes dimériques (IgA) voir multimériques

(pentamériques pour IgM) grâce à l’association avec un petit polypeptide de 16 kDa appelé

chaîne J. Dans le cas des IgA sécrétoires retrouvées dans les compartiments muqueux, les IgA

dimériques s’associeraient secondairement avec un composant sécrétoire (polyIgR) de 70 kDa

synthétisé par les cellules épithéliales des muqueuses.

Le récepteur de la cellule B (BCR) est constitué tout d’abord d’une Ig possédant à

l’extrémité C-terminale des deux chaînes lourdes, une région transmembranaire d’une vingtaine

d’acides aminés hydrophobes permettant l’ancrage des Ig de membrane, suivie d’une courte

région cytoplasmique qui semble jouer un rôle (encore très mal connu) dans l’internalisation des

21

antigènes et dans la transduction du signal. Les capacités les plus évidentes et les mieux

explorées de transduction de signal viennent en fait non pas directement de l’immunoglobuline

membranaire mais de son association avec des modules de transduction du signal Igα/Igβ

contenant des motifs ITAMs (Immunoreceptor Tyrosine Based Activation Motif) dans leur

domaine intracytoplasmique (Hombach et al., 1988; Schamel and Reth, 2000a; Schamel and

Reth, 2000b). Figure 3.

Figure 3 : Les Récepteurs de la cellule B (BCR) et de la cellule préB (préBCR) sont associés aux deux

molécules de signalisation Igα et Igβ. Schéma de Martenson et al., 2007.

I. Organisation et expression des gènes d’immunoglobuline

La formation des chaînes lourdes et des chaînes légères des Ig résulte de l’association de

plusieurs segments de gènes qui sont organisés en loci sur des chromosomes différents.

Les régions variables des chaînes lourdes sont obtenues par l’association, dans un premier

temps, d'un segment de jonction JH avec un segment de diversité DH (induisant la délétion de

l'ADN compris entre ces segments) puis le réarrangement de cette association D-JH avec un

segment variable VH, le tout aboutissant à la formation d'un exon VDJ. Les régions variables des

chaînes légères sont quant à elles, générées seulement par jonction des segments VL et JL. Les

parties comprises entre les différents segments sont délétées lors de ces réarrangements sous

forme d'un ADN circulaire ou épisome. Les segments géniques codant les régions variables des

chaînes lourdes et des chaînes légères sont ensuite associées aux exons codant la région constante

des chaînes correspondantes par épissage, formant ainsi des ARN messagers matures prêts à être

traduits en protéines. De plus, les exons V sont précédés d'une petite séquence de 60 à 90 paires

22

de bases (pb), l’exon signal ou leader (L), codant la majeure partie (N-terminale) du peptide

signal de la protéine (Huber et al., 1993; Weichhold et al., 1993; Zachau, 1993). Le passage de la

forme membranaire à la forme sécrétée des Ig s'effectue par épissage alternatif d'un même

transcrit primaire de chaîne lourde (Early et al., 1980; Maki et al., 1981; Rogers et al., 1981;

Rogers et al., 1980).

1.1 Le locus des chaînes lourdes (IgH)

Le locus des chaînes lourdes est situé sur le chromosome 12 chez la souris et sur le

chromosome 14 chez l’homme. Il comprend chez la souris 97 segments VH (dont environ 55

pseudogènes), regroupés en 15 sous-familles, 12 à 14 segments DH (DQ52 étant le segment DH

localisé le plus en 3’), regroupés en 4 sous-familles, et 4 segments JH suivis de huit gènes codant

les régions constantes des 8 classes et sous-classes d'immunoglobulines, répartis selon l'ordre

suivant: µ, δ, γ3, γ1, γ2a, γ2b, ε, et α (Figure 4). Chez l’homme, le locus des chaînes lourdes

comprend 38 à 46 segments VH regroupés en 7 sous-familles, 23 segments DH, 6 segments JH

suivis de neuf gènes codant les régions constantes des 9 classes et sous-classes

d'immunoglobulines, répartis selon l'ordre suivant: µ, δ, γ3, γ1, α1, γ2, γ4, ε, et α2.

Chaque gène constant est composé de multiples exons codant les domaines structuraux

propres à chaque chaîne lourde ainsi que les régions charnières pour certaines immunoglobulines.

Enfin, des exons codent les régions intra-cytoplasmiques et transmembranaires pour chaque

isotype.

1.2 Les loci des chaînes légères (IgL)

1.2.1 Le Locus Igκ

Les gènes des chaînes légères sont situés sur le chromosome 6 chez la souris et sur le

chromosome 2 chez l’homme. Le locus Ig κ murin, en configuration germinale, comporte 94 à 96

segments Vκ (dont environ 70 pseudogènes) et 5 segments Jκ (dont seulement 4 fonctionnels)

tandis que le locus Ig κ humain comporte quant à lui, 31 à 35 segments Vκ fonctionnels répartis

en 5 sous-familles ainsi que 5 segments Jκ.

Les segments Vκ et Jκ codent la partie variable de la chaîne légère. Un seul segment Cκ

code la partie constante que ce soit chez l’homme ou la souris.

23

1.2.2 Le Locus Igλ

Les gènes de chaînes légères sont situés sur le chromosome 16 chez la souris et sur le

chromosome 22 chez l’homme. Ils sont répartis en 4 familles comprenant chacune une paire de

segments Jλ et Cλ (Jλ1 à Jλ4 et Cλ1 à Cλ4). Le locus de la souris ne comporte que trois segments

Vλ : le segment Vλ1 s’associe préférentiellement à Jλ1 et Jλ3 tandis que les segments Vλ2 et Vλ3

s’associent préférentiellement à Jλ2 (Jλ4 et Cλ4 étant défectifs) (Figure 4). Le répertoire Vλ très

restreint de la souris explique probablement en partie le faible pourcentage de lymphocytes B

exprimant une chaîne légère λ (environ 5% de cellules λ+ par rapport à 95% de cellules κ+ soit

un rapport de 1/20). Ce rapport est largement supérieur chez l'homme (1/3) qui possède presque

autant de gènes codant les régions variables λ que de gènes codant les régions variables κ

(Lefranc et al., 1999).

Figure 4 : Représentation schématique des loci codant les Ig chez la souris. Les segments variables V sont représentés en bleu. Les segments de diversité D sont en violet. Les segments de jonction J en vert et les gènes constants C en beige.

24

II. Génération du répertoire des cellules B

2.1 Les recombinaisons V(D)J

Les régions variables des immunoglobulines sont codées par l’association d’un segment

V, d’un segment D, spécifique des chaînes lourdes, et d’un segment J, par un mécanisme appelé

« recombinaison V(D)J ». Le grand nombre de segments V, D et J disponibles, les multiples

combinaisons entre ces éléments (diversité combinatoire) ainsi que l’imprécision de leurs

jonctions (diversité jonctionnelle) contribuent considérablement à la diversité des

immunoglobulines.

La recombinaison V(D)J est ciblée vers de courtes séquences spécifiques RSS

(Recombination Signal Sequence) non codantes et relativement conservées, qui bordent tous les

segments V, D et J. Les séquences RSS sont coupées de façon précise et forment des bouts francs

alors que l’autre moitié du site de coupure située du côté des segments codants, doit passer par

une structure intermédiaire en épingle à cheveux qui devra être ouverte, générant une extrémité

simple brin traitée secondairement. Des modifications aléatoires de ces extrémités simple brin,

avant leur jonction, vont générer des imprécisions jonctionnelles majeures (mutations, délétions

ou insertions nucléotidiques). Les mécanismes de réarrangement demeurent relativement

identiques pour les gènes variables des chaînes lourdes et légères (ou des gènes du TCR) (Cobb

et al., 2006; Tonegawa, 1983; Yancopoulos and Alt, 1986).

Chaque RSS est constituée d’un motif consensuel très conservé de sept nucléotides

(heptamère 5’-CACAGTG) et d’un autre de neuf nucléotides (nonamère 5’-ACAAAAACC). Ces

deux motifs sont séparés par une séquence peu conservée de 12 ou 23 nucléotides (Tonegawa,

1983) nommée « espaceur ». Selon la longueur de ce motif, deux classes de RSS sont définies :

les 12-RSS et les 23-RSS. Ces séquences sont présentes en 3’ des gènes V, en 5’ des gènes J et

flanquent les gènes D. La recombinaison ne peut s’effectuer qu’entre RSS possédant un

séparateur de taille différente (règle 12/23) permettant d’éviter des réarrangements non désirés.

Ainsi, chaque segment D est flanqué du même type de RSS en 5’ et en 3’, ne l’autorisant à

réarranger qu’avec les RSS compatibles d’un V en 5’ et d’un J en 3’ et évitant la formation

d’exons VH-JH ou VH-D-D-JH (Meek et al., 1989). De même, tous les segments V d’un même

locus étant flanqués de la même RSS, il ne peut survenir de réarrangement V-V. Figure 5. Dans

des locus comme ceux du TCR, où l’arrangement des RSS ne suffirait théoriquement pas à

25

empêcher des recombinaisons illégitimes, on observe en outre qu’au-delà de la règle 12/23, les

séquences mêmes de certains RSS influencent fortement l’ordre des réarrangements en favorisant

notamment DJ avant VD (règle « beyond 12/23 »)(Bassing et al., 2000).

Figure 5 : Les séquences signal de recombinaison (RSS) a. Règle 12/23. La recombinaison V(D)J n’est initiée qu’entre deux segments géniques bordées par des RSS portant des espaceurs de longueur différente. Une coupure double brin génère la fusion des segments codants. Les heptamères sont indiqués par un triangle jaune. Les nonamères, par un triangle blanc. b. Localisation des trois régions hypervariables (CDR) au niveau de l’exon assemblé VDJ. Schéma de (Jung et al., 2006).

Les réarrangements des segments V(D)J mettent en jeu une machinerie enzymatique composée

des protéines RAG1 et RAG2 (pour « Recombination Activating Gene ») dont l’expression n’est

détectée qu’aux stades de développement durant lesquels ont lieu les réarrangements V(D)J

(Oettinger et al., 1990; Schatz et al., 1989), des protéines Ku70, Ku80, DNA-PKcs, Artémis,

XRCC4 et la ligase IV. Les inactivations géniques de ces différents gènes chez la souris

conduisent à des phénotypes plus ou moins sévères. Les souris RAG-1-/- ou RAG-2-/- présentent

un blocage complet de la différenciation lymphoïde au stade précoce du développement

(Mombaerts et al., 1992; Shinkai et al., 1992). De plus des mutations au sein de ces gènes

entraînent des immunodéficiences sévères (de Villartay et al., 2003). L‘inactivation génique des

molécules DNA-PKcs, Ku70, Ku80, Artémis, XRCC4 ou ligase IV conduit à des phénotypes

plus sévères (sensibilité aux radiations ionisantes, aberrations chromosomiques) car ces

transcription

26

molécules sont impliquées de façon ubiquitaire dans les mécanismes de réparation de l’ADN

(Rooney et al., 2004).

L’expression des gènes RAG-1 et RAG-2 lors du développement lymphocytaire B est un

processus strictement contrôlé de façon spatio-temporelle: une première vague d’expression

survient au stade pro-B permettant les réarrangements au niveau du locus IgH, puis au stade pré-

B pour les réarrangements des gènes de chaînes légères, sans oublier une intervention dans

l’édition du BCR des cellules immatures. Figure 6.

Figure 6 : Réarrangements des gènes variables du locus IgH. Les exons codant sont représentés par des rectangles gris, les introns par des traits fins, les signaux de recombinaisons par des triangles, les promoteurs par des flèches et les activateurs par des cercles. D’après (Dudley et al., 2005).

Pendant les premières étapes de la réaction de recombinaison, le complexe RAG-1/ RAG-

2 s’associe à une séquence RSS (12 ou 23) et induit, en présence de cations divalents métalliques,

une coupure endonucléolytique précisément à l’extrémité de l’heptamère. Grâce à une courbure

de l’ADN, la deuxième séquence RSS (23 ou 12) est rapprochée de la première séquence RSS et

forme ainsi le complexe synaptique. C’est au niveau de ce complexe que la coupure double brin

ARNm µ épissé

Réarrangement D vers J

Réarrangement V vers DJ

Expression

ADN cellule proB

ADN cellule préB

transcription

Eµ

VH1 VH2 Vn JH DH Cµ

Sµ23 23 23 23 2312 12 12 12 2323 23

ARNm µ épissé

Réarrangement D vers J

Réarrangement V vers DJ

Expression

ADN cellule proB

ADN cellule préB

transcription

Eµ

VH1 VH2 Vn JH DH Cµ

Sµ23 23 23 23 2312 12 12 12 2323 23

Recombinaison-règle 12/23

Recombinaison-règle 12/23

Epissage

Alternatif

27

de l’ADN est réalisée par les protéines RAG1 et RAG2. Les molécules HMG1 et HMG2,

exprimées de façon ubiquitaire, participent à cette réaction en améliorant l’efficacité du clivage

par les RAG (Gellert, 2002). La coupure génère quatre extrémités libres intermédiaires : deux

extrémités « codantes » en épingle à cheveux et deux extrémités « signal » phosphorylées en 5’

(Figure 7).

Figure 7 : Résolution des coupures double brin induites par les enzymes RAG. A : Les coupures induites par les enzymes RAG-1 et RAG-2 se produisent au niveau des séquences RSS. B : Ku70 et Ku80 se lient aux extrémités coupées de l’ADN. C : DNA-PKcs et Artemis facilitent l’ouverture des structures en épingle à cheveux générées par RAG-1 et RAG-2. D : TdT ajoute des nucléotides au niveau des extrémités codantes. XRCC4 et DNA ligase IV relient les extrémités franches formées et produisent des jonctions codantes modifiées. D’après (Dudley et al., 2005).

La résolution des extrémités fait appel à la voie de jonction NHEJ (« Non Homologous End

Joining »), voie prédominante de réparation des cassures double brin de l’ADN dans les cellules

de mammifères. A ce jour, au moins sept protéines sont impliquées dans cette voie : Ku70, Ku80,

DNAPKcs, Artemis, DNA ligase IV, XRCC4 et Cernunnos-XLF (Bassing et al., 2002; Sekiguchi

and Ferguson, 2006). D’autres acteurs généraux du phénomène de NHEJ, tels Mre11, Rad50,

D J

A. RAG1 et 2

D J

B. Ku80 et 70

D J

D. Lig4 XRCC4 DNA-PKcs

D J

� � D. Lig4 XRCC4 TdT

C. DN

- PKcs

Artemis

D J

�

RAG1 et 2 Ku80 et 70 DNA -PKcs

Artemis XRCC4

Ligase

Jonction codante

(modifiée)

Jonction signal

(précise)

28

γH2AX ou Nbs1, ont également une implication dans le processus particulier de NHEJ que

représente la recombinaison VDJ (Chen et al., 2000; Clatworthy et al., 2005).

Les deux extrémités signal sont liguées par la DNA ligase IV tandis que les extrémités codantes

sont d’abord reconnues par Ku70 qui interagit avec Ku80. L’hétérodimérisation des protéines

Ku70 et Ku 80 produit une structure en anneau dont la partie centrale forme un canal qui encercle

les extrémités d’ADN libre (Walker et al., 2001). La protéine DNA-PKcs représente la sous-unité

catalytique qui constitue, avec les protéines Ku70 et Ku80, les composants de la protéine kinase

dépendante de l’ADN, la DNA-PK. La DNA-PKcs va recruter et former un complexe avec

Artemis facilitant l’ouverture des structures en épingle à cheveux (Ma et al., 2002). La protéine

XRCC4 s’associe avec la DNA ligase IV, complexe qui sera recruté aux sites de cassures par des

interactions avec la DNA-PK (Drouet et al., 2005). Cernunnos, protéine récemment identifiée, va

interagir avec ce complexe et relier les extrémités codantes (Ahnesorg et al., 2006; Buck et al.,

2006). Figure 7.

La jonction codante est imprécise et peut comporter de courtes délétions, additions de

duplications palindromiques (appelées « P ») ou de courtes insertions GC-riches (appelées « N »)

ajoutées par la terminal désoxynucléotidyltransférase ( TdT ) avant la ligation des extrémités. La

TdT insère des nucléotides de manière aléatoire et ne nécessite pas de matrice (Alt and

Baltimore, 1982). Cette cascade de réactions aboutit à la fusion des segments recombinants avec

une importante variabilité jonctionnelle (et donc des boucles CDR3) augmentant ainsi la diversité

du répertoire (Schlissel, 2003; Sekiguchi and Ferguson, 2006). Figure 8.

La recombinaison V(D)J permet donc in fine de générer un vaste répertoire d’Ig à partir

d’un nombre restreint de gènes. En effet, grâce à l’utilisation des différents gènes, des coupures

de l’ADN quelquefois imprécises, ainsi que la « P et la N diversité », il est possible de générer

théoriquement jusqu’à 109 Ig différentes (Tonegawa, 1983). Cependant, le tribut à payer pour

cette variabilité particulièrement importante, est la répercussion aléatoire sur le cadre de lecture

des protéines, avec seulement une jonction codante sur trois en phase correcte de lecture et

pouvant coder une protéine fonctionnelle.

29

Figure 8 : Les nucléotides N et P.

Ils sont présents en nombre aléatoire et contribuent à la diversité jonctionnelle. Ils peuvent conduire à des réarrangements non-productifs (incapacité à produire une chaîne d’Ig fonctionnelle).

2.2 La régulation de la recombinaison V(D)J

L’existence de séquences de recombinaison (RSS) où d’enzymes (RAG) spécifiques aux

lignées lymphoïdes B et T n’explique pas à elle seule le haut niveau de régulation des

réarrangements V(D)J.

2.2.1 Modèle ou théorie de l’accessibilté

Il a été établi que le ciblage spécifique de la recombinase RAG vers les séquences RSS

s’exerçait grâce à des modifications de l’accessibilité des différents loci à la recombinaison des

différents segments géniques (Yancopoulos and Alt, 1985). Les mécanismes physiques et

biochimiques de cette accessibilité mettent en jeu plusieurs phénomènes entre lesquels tous les

liens n’ont pas encore été clairement établis. On parle ainsi de remodelage chromatinien par

hyper-acétylation et méthylation des histones, de repositionnement et ouverture des nucléosomes

(Roth and Roth, 2000). Figure 9.

30

Figure 9 : L’accessibilité du locus des gènes d’Ig lors des réarrangements V(D)J par remodelage de la

chromatine. HAT : histones acétyltransférases. Modifié à partir de (Roth and Roth, 2000).

La structure de la chromatine n’est pas figée. Elle est soumise à un remodelage qui permet

le passage entre formes condensée et décondensée. Le degré de condensation est faible dans

l’euchromatine définie comme ouverte et accessible aux protéines agissant directement sur

l’ADN : polymérase, enzymes diverses et facteurs de transcription, et est élevé dans

l’hétérochromatine définie comme fermée et inaccessible (Felsenfeld, 1992; Kadonaga, 1998). Il

a été démontré que la méthylation des histones réprimait les réarrangements des gènes d’Ig :

l'analyse du profil de méthylation des gènes des chaînes lourdes et légères montre que les loci

sont méthylés dans les tissus non lymphoïdes et que l'initiation de la recombinaison V(D)J au

cours du développement des précurseurs lymphocytaires est associée à une déméthylation des

CChhrroommaattiinnee

ccoonnddeennssééee

HATs

DDéémméétthhyyllaattiioonn

ddee ll’’AADDNN

AAccééttyyllaattiioonn

ddeess hhiissttoonneess

RRééaarrrraannggeemmeenntt

ddeess

nnuuccllééoossoommeess

HATs

CChhrroommaattiinnee aacccceessssiibbllee

31

séquences Ig (Goodhardt et al., 1993; Mather and Perry, 1983; Mostoslavsky et al., 1998; Storb

and Arp, 1983).

Remodelage chromatinien et accessibilité transcriptionnelle sont liés : il a longtemps été

admis que la présence de transcrits germinaux reflétait l’ouverture des loci des Ig et donc leur

accessibilité aux enzymes de la recombinaison (Sleckman et al., 1996). Enfin des modifications

d’interactions avec la matrice nucléaire mais aussi le regroupement des loci accessibles dans des

compartiments nucléaires (foci) spécialisés contribuent à l’accessibilité des loci et donc aux

réarrangements V(D)J (Sen, 2005).

2.2.2 La théorie de l’exclusion allélique

Afin que chaque lymphocyte B généré exprime un récepteur unique pour l’antigène, il est

nécessaire de contrôler/surveiller la recombinaison V(D)J au sein du locus. Ce mécanisme,

appelé « exclusion allélique » apparaît comme essentiel dans la génération de cellules B

fonctionnelles. Il implique que pour chaque composant des chaînes d’Ig (HC et LC) ne soit

exprimé qu’un seul allèle. Trois modèles ont été proposés afin d’expliquer ce phénomène :

- le modèle de « toxicité » postulant que la présence de chaînes lourdes d’Ig différentes dans une

même cellule induirait un signal d’apoptose – modèle infirmé par les travaux de Sonoda et al.

(Sonoda et al., 1997).

- le modèle « stochastique » postulant que la probabilité de deux réarrangements productifs est

très faible (Coleclough et al., 1981).

- le modèle « régulé » qui avance que lorsqu’un réarrangement est productif, permettant la

transcription d’un ARNm en phase, non aberrant, codant une chaîne lourde µ (ou plus tard une

chaîne légère κ ou λ), va induire un rétrocontrôle négatif bloquant les réarrangements sur les

autres allèles. Figure 10. Ce modèle s’expliquerait par une perte de l’accessibilité du deuxième

allèle (mécanismes épigénétiques cités ci-dessus) (Mostoslavsky et al., 2001).

32

Figure 10 : L’exclusion allélique. L’inhibition par rétroaction (feedback inhibition) : l’expression d’une chaîne µ fonctionnelle (ou L) va inhiber les réarrangements du second allèle. Schéma de (Jung et al., 2006).

Ce modèle est fortement remis en cause au regard du processus d’édition du BCR où une cellule

B immature mais exprimant un BCR autoréactif (chaîne lourde et chaîne légère déjà réarrangées

mais induisant un signal fort), va continuer d’exprimer les RAG, donc réaliser des

réarrangements secondaires des gènes des chaînes légères afin de remplacer la chaîne

autoréactive (Gay et al., 1993; Tiegs et al., 1993). Ce mécanisme d’induction de la tolérance

montre qu’aux loci des chaînes légères (particulièrement le locus κ), la théorie de l’exclusion

allélique est sérieusement mise à mal de même que la théorie de la sélection clonale de Burnet,

selon laquelle chaque cellule B présenterait un récepteur défini dont l’autoréactivité serait

sanctionnée par une délétion clonale. En fait, il semble aujourd’hui que les cellules B subissent

un apprentissage du soi au cours duquel elles vont pouvoir modifier la spécificité de leur

récepteur. Le processus d’édition et/ou révision du BCR peut être vu comme un moyen important

de limiter les pertes occasionnées par cette autoréactivité en donnant des « secondes chances » à

la cellule avant d’induire sa délétion.

En conclusion, l’exclusion allélique est un processus complexe mettant en jeu de

nombreuses régulations qui vont aboutir à la monospécificité des cellules B impliquées dans la

réponse immune. Ce phénomène est très efficace puisque malgré les nombreux réarrangements

successifs que peuvent subir les gènes d’immunoglobulines lors du développement des cellules

Réarrangement

sur les 2 allèles

Configuration germinale

33

B, le nombre de cellules exprimant plusieurs BCR distincts en périphérie est extrêmement faible.

Nos travaux suggèrent en fait qu’une part importante de ce phénomène repose sur l’avantage

sélectif que représente pour un clone B l’expression d’une seule chaîne et donc d’un BCR

clonotypique, sans que pour autant il n’existe d’interdiction mécanique absolue à une inclusion

allélique (Sirac et al., 2006).

2.2.3. La régulation transcriptionnelle

La régulation de la transcription des gènes d’Ig est similaire à celle d’autres gènes, et fait

intervenir principalement des séquences nucléotidiques cis-régulatrices et des protéines se fixant

à ces séquences (éléments trans régulateurs). Les interactions multiples entre ces différents

éléments sont complexes et permettent un contrôle rigoureux de l’expression et de la spécificité

cellulaire B des gènes d’Ig. Plusieurs types d’éléments cis-régulateurs ont été identifiés : les

promoteurs (responsables de la transcription appropriée et efficace de ces gènes), les activateurs

transcriptionnels (« enhancers »), les atténuateurs (« silencers ») et les régions d’ancrage à la

matrice (« MAR : Matrix Association Region ») (Ernst and Smale, 1995) Figure 11. Toutes ces

séquences régulatrices comportent des sites de fixation pour les facteurs de transcription et

agissent de façon concertée. La majorité de ces facteurs de transcription ne sont pas spécifiques

de la lignée lymphoïde B mais l’action synergique de plusieurs d’entre eux peut, elle, s’avérer B-

spécifique.

a. Les promoteurs

Les promoteurs des gènes de chaînes lourdes et légères d’Ig se situent en amont de chaque

région V et assurent un niveau basal de transcription. Leur activité est comprise dans une région

d’environ 250 pb en amont du site d’initiation de la transcription. L'ensemble des promoteurs des

gènes d'Ig possèdent une séquence octamérique très conservée en amont de la TATA box :

ATGCAAAT dans les promoteurs des gènes de chaînes lourdes (pVH), ou la séquence inversée

ATTTGCAT dans les promoteurs de chaînes légères (Falkner and Zachau, 1984; Parslow et al.,

1984).

Ces séquences sont entre autres reconnues par les facteurs Oct-1, exprimé de façon

ubiquitaire, et Oct-2, spécifique à la lignée B. La forme en « hélice-boucle-hélice » du domaine

de liaison à l'ADN permet une forte affinité pour l'ADN. Ces deux protéines activent

34

efficacement la transcription à partir d’un promoteur d’immunoglobuline mais uniquement dans

la lignée B (LeBowitz et al., 1988; Pfisterer et al., 1994; Pierani et al., 1990).

Un co-activateur appelé OCA-B interagit physiquement avec les facteurs Oct-1 et Oct-2. Il

facilite l’activation transcriptionnelle d’un promoteur d’Ig par Oct-1 ou Oct-2 (Luo et al., 2006;

Pierani et al., 1990). Cependant, des souris déficientes en Oct-2 et OCA-B ont un développement

B précoce normal (Schubart et al., 2001).

En plus de l’octamère, chez la souris, les promoteurs pVH contiennent une séquence

heptamérique, nécessaire pour assurer en association avec l’octamère, une activation spécifique et

optimale du promoteur (Eaton and Calame, 1987). L’octamère et l’heptamère lient in vitro les

mêmes facteurs de transcription Oct et semblent avoir une interaction coopérative (Kemler et al.,

1989; Poellinger et al., 1989). D’autres éléments ont été localisés en amont de l’heptamère : une

région riche en pyrimidines (Eaton and Calame, 1987) de fonction inconnue, un motif reconnu

par le facteur de transcription Ig/EBP-1 et un motif µE3. Chez l’homme, l’heptamère n’est

présent que dans le promoteur des régions VH appartenant à la famille VH1(Kemler et al., 1989).

Figure 11 : Structure des loci IgH chez la souris et l’homme. Les gènes constants sont représentés par des rectangles gris, les activateurs par des ellipses rouges, les régions répétées en tandem (TR) et répétées inversées (IR) sont positionnées en 3’ des gènes α. A : Locus murin. Les ellipses jaunes représentent les régions S et les rectangles verts, les régions d’ancrage à la matrice (MAR). Les promoteurs germinaux sont signalés par des flèches coudées. B : Locus humain. Les régions en 3’ des gènes α1 et α2 contiennent des activateurs et des régions riches en G+C (ellipses bleues).

Cγ3 Cγ1 Cα1 Cγ4

35

Des promoteurs ont également été décrits en amont de chaque gène des régions constantes

des chaînes lourdes d'Ig, à l'exception de Cδ. Ce sont les sites d'initiation de la transcription

germinale. Les activateurs situés en amont des promoteurs germinaux jouent également un rôle

important dans la commutation isotypique.

b. Les enhancers introniques (Eµ, DQ52, Eκ)

L’activateur intronique Eµ fut le premier découvert au sein du locus IgH. Il est localisé

dans l’intron entre le dernier segment JH et le gène Cµ (Banerji et al., 1983). Il est entouré par

deux régions d’attachement à la matrice (MAR : « Matrix Associated Region »). Cet élément

semble actif tout au long du développement B. Sa localisation en amont de Sµ lui permet d’être

préservé de tous les évènements de recombinaisons survenant dans le locus. Eµ régule

positivement les réarrangements V(D)J et la transcription initiée au niveau de multiples

promoteurs du locus IgH (Chen et al., 1993; Engler et al., 1991; Serwe and Sablitzky, 1993). On

retrouve au sein de cette séquence, une séquence octamérique identique à celles des promoteurs

VH ainsi qu’un noyau dur « core Eµ », responsable de l’essentiel de l’activité de l’enhancer,

contenant les sites µE5, µE2, µA, µE3 et µB. Eµ fixe de nombreux facteurs parmi lesquels Oct-1

et Oct-2 (Ernst and Smale, 1995) mais aussi les protéines activatrices de la famille « hélice-

boucle-hélice » dont les produits du gène E2A (Murre et al., 1989). Ces derniers sont essentiels

dans la lymphopoïèse B, les animaux E2A -/- présentant un blocage précoce de l’ontogenèse B

(avant même les premiers réarrangements D-JH) (Bain et al., 1994). On peut remarquer que des

sites consensuels pour la fixation des produits du gène E2A sont présents sur de nombreux

éléments cis-régulateurs du locus IgH (Eµ, DQ52 et la LCR en 3’) de même que dans d’autres

loci B-spécifiques.

DQ52 présente plusieurs caractéristiques qui font de lui un segment de gène particulier. Il

est préférentiellement utilisé lors des premiers réarrangements DJ au cours de l'ontogénie (Bangs

et al., 1991; Tsukada et al., 1990) et est le seul segment D à être transcrit bien avant la survenue

des premiers réarrangements V(D)J (Alessandrini and Desiderio, 1991).

Il a été longtemps considéré que les transcrits germinaux (µ0) étaient des indicateurs les plus

précoces de l'engagement vers la lignée B et que leur transcription pouvait être un préalable

nécessaire à l'accessibilité de la région D-J à la recombinase V(D)J (Thompson et al., 1995)

L’activateur situé en 5’ de DQ52 constitue un promoteur-activateur synergique de Eµ (Kottmann

et al., 1994) impliqué dans l’activation des réarrangements précoces aux stades initiaux de

36

l’ontogenèse B. Sa délétion, chez la souris, n’inhibe pas le réarrangement DJH et ne bloque pas la

transcription µ0. En revanche, une diminution des réarrangements impliquant JH3 et JH4 est

observée (Nitschke et al., 2001). La délétion conjointe de cet élément avec Eµ a révélé que DQ52

n’était pas requis pour le réarrangement DJH et pour la transcription µ0 (Afshar et al., 2006).

Ceci suggère l’existence d’autres éléments de contrôle dans le locus IgH qui régulent le

réarrangement DJH et la transcription.

Des régions stimulatrices introniques ou « amont » ont également été caractérisées au

niveau du locus κ comme par exemple : les éléments en 5’ des Jκ et l’enhancer intronique κ

(EIκ).

c. Les enhancers 3’ (3’IgH, 3’kappa et 3’ lambda)

Différents groupes ont identifié, chez la souris, quatre activateurs transcriptionnels en 3’

du locus IgH (Figure 11), nommés hs1,2 (Lieberson et al., 1991), hs3a (Matthias and Baltimore,

1993), hs3b (Giannini et al., 1993) et hs4 (Michaelson et al., 1995) – « hs » pour site

hypersensible à la DNase I. Cette région régulatrice présente une structure palindromique

contenant de longues séquences répétées inversées qui flanquent hs1,2, centre de cet immense

palindrome. Les activateurs hs3a et hs3b présentent 97% d’homologies entre eux mais sont en

orientation opposée dans le locus (Chauveau et al., 1998). La région 3’ du locus IgH humain est

assez similaire dans sa structure, sauf en ce qui concerne hs3b qui n’a pas d’homologue chez

l’homme. De plus, il existe, suite à une duplication ancestrale du locus IgH, deux gènes α (α1 et

α2) et donc deux régions cis-activatrices en 3’.

L’activité de la région 3’ du locus IgH a surtout été appréciée par des expériences de

transfections dans des lignées cellulaires établies correspondant à des stades B définis, et plus

récemment par des modèles transgéniques. Ainsi, il a été montré que hs1,2 était actif aux stades B

tardifs (Lieberson et al., 1991). Les éléments hs3a et hs3b sont décrits comme des activateurs

plus faibles en expression transitoire ; leur activité n’est détectée qu’aux stades B mature et

plasmocyte (Madisen and Groudine, 1994; Matthias and Baltimore, 1993) Hs4 est également

considéré comme assez faible mais son activité se retrouve tout au long de l’ontogénie B, depuis

le stade pro-B jusqu’au stade plasmocyte (Madisen and Groudine, 1994; Michaelson et al., 1995).

Considérés séparément, ces quatre activateurs sont faibles. Cependant, leur combinaison conduit

à une forte activité de transcription. Des études de transfections transitoires combinant Eµ et les

différents activateurs 3’ murins ont montré des effets synergiques dépendant du stade de

37

maturation : aux stades précoces, Eµ et hs4 semblent prépondérants ; hs3a, hs1,2 et hs3b sont

actifs aux stades tardifs, mais leurs effets continuent d’être accentués par Eµ et hs4 jusqu’au stade

plasmocytaire, au cours duquel l’efficacité des séquences régulatrices semble être optimale

(Chauveau et al., 1998). Par ailleurs, il a été suggéré que la combinaison de ces quatre éléments

leur conférait les propriétés d’une LCR (Locus Control Region) (Chauveau et al., 1999; Madisen

and Groudine, 1994). Une LCR est définie comme une séquence d’ADN capable, dans un

système transgénique ou de transfection stable, de conférer au gène associé une expression tissu-

spécifique avec un taux transcriptionnel élevé dépendant du nombre de copies et indépendant du

site d’intégration (Ernst and Smale, 1995). Le rôle in vivo de la LCR en 3’ du locus IgH n’est pas

encore totalement élucidé. En effet, la redondance des séquences activatrices complique

considérablement l’évaluation de leur implication individuelle dans les processus touchant le

locus IgH (réarrangements, transcription, etc...). Ainsi, le remplacement, par recombinaison

homologue, de hs1,2 par le gène de résistance à la néomycine induit une forte diminution de la

commutation de classe (Cogne et al., 1994; Manis et al., 1998). L’inactivation individuelle de

hs3a et hs1,2 par le système Cre-loxP n’a pas révélé de phénotype remarquable (Manis et al.,

1998). Ce n’est que récemment que l’action redondante de ces différents activateurs à été mise en

évidence dans une expérience de délétion où deux de ces éléments étaient éliminés du locus. Ces

travaux ont clairement démontré le rôle essentiel des deux éléments les plus distaux dans la

transcription germinale des gènes constant de chaînes lourdes et dans la commutation isotypique

(Pinaud et al., 2001).

En 3’ du locus κ existe en outre un activateur « 3’κ », qui fonctionne en synergie avec

l’activateur intronique afin de permettre l’expression et les réarrangements normaux au niveau du

locus Igκ (Inlay et al., 2002). Plus loin encore en 3’, un enhancer « downstream » (« Ed ») a été

récemment identifié chez la souris et chez l’homme, avec une activité spécifique du stade

plasmocytaire (Liu et al., 2002). Il existe également en 3’ du locus λ, un enhancer intronique

« 3’λ » qui va permettre l’expression et les réarrangements au niveau du locus lambda de même

que l’hypermutation somatique (Popov et al., 1999).

d. Les éléments atténuateurs « silencers » et les « MAR »

Ils ont notamment été caractérisés dans les régions intervenantes entre segments V et J, ainsi que

dans les régions d’ancrage à la matrice nucléaire (régions MAR). Comme les promoteurs et les

enhancers, ils possèdent des sites de liaison à des facteurs de régulation trans (Liu et al., 2002).

38

En ce qui concerne les MAR, elles semblent avoir une certaine dualité et leur fonction précise à

proximité des enhancers introniques reste controversée : il semblerait qu’elles soient inhibitrices

dans les cellules non B et participent à la spécificité cellulaire B (Kadesch et al., 1986; Pierce et

al., 1991) ; en contrepartie dans la lignée B, elles modifieraient la structure de la chromatine pour

amplifier la propagation d’un état d’accessibilité du locus au voisinage de l’activateur (Forrester

et al., 1994). Probablement du fait de redondances biologiques, la délétion ciblée des MARs

flanquant l’enhancer Eµ n’a révélé aucun phénotype (Sakai et al., 1999).

2.3 L’épissage des transcrits d’Ig

Les gènes de chaînes lourdes d’Ig incluent des exons susceptibles de subir un épissage alternatif

et codant soit des régions d’ancrage membranaire soit des peptides spécifiques des chaînes

sécrétées. La régulation de cet épissage alternatif des ARN pré-messagers est donc capitale pour

la maturation des lymphocytes B. Elle intervient d’une part lors de la différenciation des

lymphocytes B immatures (exprimant une IgM membranaire sans IgD associée) en cellules B

matures co-exprimant alors IgM et IgD membranaires. Cette régulation est aussi impliquée dans

la maturation des cellules en plasmocytes excréteurs.

Dans les cellules B immatures, il semble que le gène δ soit méthylé et que la transcription initiée

à partir du promoteur VH ne s’étende pas au-delà du gène µ, donnant lieu à un transcrit mature

qui est épissé de façon à ne coder que la forme membranaire de la chaine µ (Maki et al., 1981).

La situation devient plus complexe dans les cellules B matures, où un seul transcrit primaire

inclut l’ensemble des séquences µs, µm, δm et δs (m pour membranaire et s pour sécrété) (Wall

and Kuehl, 1983). Les mécanismes exacts de la régulation post-transcriptionnelle des ARN pré-

messagers µ/δ ainsi que des formes membranaires et sécrétées des Ig restent encore mal connus.

L’épissage alternatif des formes membranaires semble être orienté par le clivage ou le non-

clivage préalable des ARNm au niveau du site de polyadénylation « de type sécrété », mais

semble aussi contrôlé par une structure spécifique des introns, capables de promouvoir l’une ou

l’autre forme d’épissage indépendamment et avant même la polyadénylation (Bruce et al., 2003;

Danner and Leder, 1985; Peterson and Perry, 1986). Pour la régulation µ/δ, la terminaison de

transcription qui survient en 3’ du site de polyadénylation de Cµ pourrait jouer un rôle, mais il a

été montré que sa délétion, tout en favorisant la production de transcrit primaires longs allant

39

jusqu’à Cδ, ne supprime pas pour autant la production exclusive de transcrits épissés µ plutôt que

δ dans les cellules immatures (Yuan et al., 1996).

Par ailleurs, la stabilité des ARNm augmente lors de la différenciation terminale des cellules B, et

la synthèse importante de ribosomes au sein du plasmocyte ralentit probablement la dégradation

enzymatique des ARNm des Ig, s’accompagnant d’une augmentation de la demi-vie des ARNm

qui codent les formes sécrétées des chaînes lourdes (Jack and Wabl, 1988; Mason et al., 1988).

Enfin, il a été montré que l’équipement global en facteurs régulateurs d’épissage variait entre le

stade lymphocytaire et le stade plasmocytaire, avec un effet s’exerçant même sur des transcrits

primaires non-Ig (Bruce et al., 2003).

III. L’ontogenèse B

Les gènes d’immunoglobulines sont spécifiquement exprimés dans la lignée

lymphocytaire B. Spontanément non fonctionnels dans leur disposition germinale, ils devront

d’abord subir au cours du développement B, une série de réarrangements somatiques ordonnés.

Codées par ces réarrangements, des chaînes d’Ig membranaires fonctionnelles pourront s’associer

de manière non covalente à deux molécules transmembranaires : Igα (CD79a ou mb-1) et Igβ

(CD79b ou B29), et former successivement les récepteurs pré-BCR puis BCR, clés de la

maturation, de l’activation et de la survie de la lignée B. On peut séparer l’ontogenèse des

lymphocytes B en deux phases principales :

Une phase de différentiation et de maturation indépendante de l’antigène. Elle se déroule

principalement dans la moelle osseuse et aboutit à la formation de lymphocytes B immatures

exprimant une Ig de surface qui vont pouvoir alors répondre aux antigènes.

Une phase d’activation et de différentiation finale dépendante des antigènes du soi d’abord puis

du non-soi en « périphérie » au niveau des organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions

lymphatiques et formations lymphoïdes associées aux muqueuses MALT pour Mucosae

Associated Lymphoid Tissue). Elle aboutit à la formation de plasmocytes et de cellules B

mémoires spécifiques d’un antigène étranger.

Les différentes étapes de ce processus de différenciation vont amener les cellules à exprimer où à

ne plus exprimer un ensemble de récepteurs (marqueurs de surface) et à répondre à divers

médiateurs directement impliqués dans le processus ordonné aboutissant à l’expression à la

surface et/ou la sécrétion d’une immunoglobuline spécifique d’un antigène (Figure 12).

40

Figure 12 : Les différentes étapes de l’ontogénèse des lymphocytes B conventionnels (B2).

41

3.1 La phase indépendante des antigènes

La différenciation B débute dès le stade embryonnaire et se poursuit tout au long de la vie.

Les mammifères ne possèdent pas d'organe spécialisé dans la lymphopoïèse B et celle-ci se

déroule au sein des tissus hématopoïétiques. Les cellules B se développent ainsi à partir des

cellules souches lymphoïdes dans le tissu hématopoïétique du foie fœtal à partir de 8 à 9

semaines de gestation chez l’homme et vers le 14ème jour chez la souris. Le foie fœtal est ensuite

relayé par la moelle osseuse, qui conserve cette fonction chez l'adulte.

La phase indépendante des antigènes se déroule dans la moelle osseuse et correspond à la

différenciation de cellules précurseurs hématopoïétiques en cellules B matures

immunocompétentes. Cette étape implique les réarrangements des gènes d’immunoglobulines,

respectant le plus souvent un ordre précis (le modèle " ordonné " décrit par Alt et Baltimore (Alt

et al., 1984) : d’abord dans le locus IgH puis dans le locus Igκ ou Igλ. Ces réarrangements

séquentiels se produisent en l’absence d’antigène exogène et caractérisent les divers stades de la

maturation.

Le stade pré-proB est caractérisé par la forte expression du transcrit germinal µ0 (ou JH1)

(Li et al., 1996). Ces cellules n’ont pas encore engagé de réarrangements et expriment faiblement

les enzymes RAG. Elles présentent à leur surface le marqueur de la lignée B, B220 (Hardy et al.,

1991). Différents facteurs de transcription sont précocement impliqués dans la différenciation des

progéniteurs hématopoïétiques en progéniteurs communs lymphoïdes (CLP) puis en cellules B

(Fuxa and Skok, 2007; Nutt and Kee, 2007).

C’est au stade proB que débutent les réarrangements des gènes d’Ig par le rapprochement

d'une région DH vers une région JH sur les deux allèles (les enzymes RAG et la TdT sont

fortement exprimés). Vient ensuite se recombiner sur cet assemblage DJ un gène VH afin de

former l'exon codant la région variable de la chaîne lourde. Pax-5, l’interleukine 7 (IL-7) et E2A

jouent un rôle dans le maintien du lignage B. Le facteur de transcription Pax5 (BSAP) activerait

les gènes spécifiques du lignée B et inhiberait simultanément les gènes spécifiques des autres

populations médullaires (Cobaleda et al., 2007). Figure 13. Durant la lymphopoïèse B précoce, la

recombinaison V(D)J est régulée de différentes façons dont le repositionnement du locus IgH en

périphérie du noyau (accessibilité du locus). Pax5 jouerait un rôle dans la contraction du locus et

permettrait la recombinaison des VH les plus distaux sur le DJH déjà assemblé (Fuxa et al.,

2004). Il aurait également un rôle transactivateur dans la recombinaison VH-DJH en se liant au

niveau des régions codantes des VH (mais seulement sur certaines familles de VH, ce qui

42

pourrait influencer la diversification du répertoire) et en interagissant physiquement avec le

complexe RAG1/RAG2 pour faciliter la recombinaison V(D)J (Zhang et al., 2006). Si ces

réarrangements permettent l'expression d'un ARN messager fonctionnel (sans codons stop, et

avec une phase de lecture correcte), la chaîne lourde µ est alors synthétisée et exportée à la

membrane en association avec d’une part la " pseudo-chaîne légère " (composée de deux

protéines invariantes λ5 et VpreB chez la souris ou SLC pour Surrogate Light Chain chez

l’homme) et d’autre part, les molécules de transduction du signal intracellulaire Ig-α et Ig-β,

formant ainsi le pré-BCR (stade pre-B).

Figure 13 : PAX5 et lineage B L’engagement vers la lignée B est encore réversible jusqu’au stade proB. La cellule est capable de se différencier, in vitro, en présence de cytokines choisies, en différents types cellulaires et in vivo après transplantation dans des souris receveuses. La délétion de PAX5 induit une rétrodifférenciation des B en précurseurs lymphoïdes. Schéma de (Cobaleda et al., 2007).

Contrairement au stade pro-B où les réarrangements D-J ont lieu sur les deux

chromosomes, les réarrangements V-DJ ne se produisent de façon fonctionnelle que sur un seul

allèle («exclusion allélique »). Le rôle de ce pré-BCR est indispensable au bon déroulement du

développement des cellules B et a, en particulier, été souvent considéré comme essentiel dans

l'induction des réarrangements des gènes des chaînes légères. Il est en effet très habituel que les

gènes des chaînes légères soient réarrangés après ceux des chaînes lourdes et de façon

séquentielle, gènes κ d'abord puis gènes λ, lorsque les réarrangements κ n'ont pas permis

d'aboutir à un exon VJ fonctionnel (Brauninger et al., 2001; Hieter et al., 1981; Korsmeyer et al.,

1982). Cependant, de nombreuses exceptions sont venues en partie infirmer cette théorie du

modèle ordonné, qui ne semble en fait correspondre qu’à une préférence stochastique. En

particulier, il a été démontré que certains réarrangements κ pouvaient avoir lieu avant la

formation d'une chaîne lourde fonctionnelle (Chen et al., 1993; Ehlich et al., 1993;

43

Novobrantseva et al., 1999) et que des réarrangements des gènes λ pouvaient avoir lieu en même

temps, ou même avant les gènes κ. (Berg et al., 1990; Hauke et al., 1988; Liu et al., 1997;

Oberdoerffer et al., 2003; Pauza et al., 1993). Le pré-BCR fournit surtout un signal prolifératif

qui va permettre la multiplication des cellules (« small » pré-B) avant qu’elles n’engagent les

réarrangements au niveau des loci des chaînes légères (réinduction des enzymes de

recombinaison RAG1 et RAG2 mais cette fois sans expression de la TdT), poursuivant ainsi la

différenciation B (Melchers et al., 1999). La question des ligands du pré-BCR est aussi un point-

clé. Même si certains travaux montrent qu’un certain degré de différenciation B est possible en

l’absence d’association chaîne lourde - λ5/VpréB ou en substituant aux pseudo-chaînes légères

des chaînes légères normales (by-passant ainsi le stade pré-B), cette différentiation B perd en

efficacité de par la diminution de la prolifération du stade pré-BI (Corcos et al., 1995; Corcos et

al., 1991; Ohnishi and Melchers, 2003; Shaffer and Schlissel, 1997). La différenciation précoce

se fait au contraire de façon optimale lorsque l’expression d’un pré-BCR normal (incluant

« l’extra-boucle de la molécule λ5), permet aux cellules pré-B d’interagir physiquement avec les

niches des cellules stromales et d’y recevoir un signal prolifératif. Les ligands du pré-BCR

exprimés à la surface des cellules stromales sont notamment des intégrines, dont la liaison au pré-

BCR se fait grâce à une molécule de couplage soluble, la galectine-1 (Gauthier et al., 2002; Rossi

et al., 2006). Un rôle de ligand stromal non confirmé à ce jour a aussi été évoqué pour les

héparansulfate protéoglycannes (HSPGs) chez la souris (Bradl et al., 2003). Dans tous les cas,

l'expression des gènes recombinés des chaînes lourdes et légères aboutit in fine à l'expression à la

membrane de la cellule B d'une IgM composée de la chaîne lourde µ et d'une chaîne légère κ ou λ

(stade B immature). Toute cellule incapable d’assembler son pré-BCR ou d’associer et de

transporter à la membrane une chaîne lourde µ avec une chaîne légère sera éliminée, et la

sélection des lymphocytes B implique un taux très élevé d’apoptose tout au long de leur

développement. A cette sélection positive, s’ajoute un processus de sélection négative selon

lequel les cellules immatures possédant des Ig membranaires spécifiques pour les antigènes du

soi (autoréactifs – induisant un signal fort) seront également éliminées (de 40 à 60% des cellules)

(Melchers et al., 1993). Des réarrangements secondaires produisant de nouvelles chaînes légères

pourront aussi au stade B immature sauver un clone B en le dotant d’un BCR qui ne soit plus

autoréactif (Hertz and Nemazee, 1997; Melamed and Nemazee, 1997; Pelanda et al., 1997; Tiegs

et al., 1993). Une cellule immature conservant son autoréactivité malgré l’editing peut encore

entrer en anergie (diminution de la prolifération, désensibilisation et sous-expression du BCR

(Goodnow et al., 1988; Pike et al., 1982; Vilen et al., 1997) ou être éliminée par apoptose

44

(Hartley et al., 1993; Norvell et al., 1995). Il faut noter que si ce système de prévention de

l’autoréactivité vaut pour le compartiment principal des cellules B périphériques (dites B2), un

autre compartiment plus minoritaire dit B1 ou CD5+ (se localisant préférentiellement dans le

péritoine et dans la zone marginale de la rate), est au contraire sélectionné positivement lors de sa

maturation via l’expression de BCRs auto-réactifs (Cariappa and Pillai, 2002).

Les cellules qui survivent quittent la moelle osseuse vers les organes lymphoïdes périphériques

où elles pourront subir les dernières étapes de maturation.

Par recombinaison homologue (délétion partielle ou complète de certains gènes), on a pu mettre

en évidence un certain nombre de blocages à différentes étapes de la maturation B qui sont

récapitulés dans la figure 14.

3.2 La phase dépendante des antigènes

Les cellules B immatures, qui ont quitté la moelle osseuse, passent par un stade

intermédiaire, le stade B transitionnel durant lequel vont avoir lieu des modifications de la

réponse induite par le BCR. Ce stade constitue la dernière étape avant la rencontre avec des

antigènes exogènes. Les cellules B transitionnelles font donc le lien entre les cellules B

immatures de la moelle osseuse et les cellules B matures périphériques. Elles représentent une

étape importante de la maturation B puisque c’est à ce stade que la cellule va perdre sa sensibilité

à la sélection négative par le BCR, gagner les follicules de la rate et devenir sensible aux signaux

induits pas les lymphocytes T (Chung et al., 2003). Loder et al., en 1999, ont été les premiers à

montrer que le compartiment B immature de la rate pouvait se subdiviser en deux populations

bien distinctes : les B transitionnelles de type 1 (T1) et les B transitionnels de type 2 (T2)

exprimant toutes les deux fortement HSA (Loder et al., 1999). Le phénotype des cellules T1 est

très proche de celui des cellules immatures de la moelle avec pas ou peu d’IgD membranaire, une

forte expression d’IgM membranaire et une absence d’expression des récepteurs CD21, CD23 et

de la molécule anti-apoptotique Bcl2. La population des cellules T2 est quant à elle un

intermédiaire phénotypique entre les cellules T1 et les cellules matures folliculaires. Elles

expriment IgD ainsi que CD21 et CD23 (marqueurs utilisés comme témoin d’activation des

cellules B) (Rolink et al., 2004).

45

Figure 14 : Bilan des blocages partiels ou complets de la différenciation B causés par des défauts de gènes

codant des facteurs de transcription mais également des protéines de la machinerie de transduction du signal.

46

Au sein de la lignée B une marque distinctive de l’ensemble des cellules transitionnelles,

T1 comme T2, est l’expression de CD93 (une lectine transmembranaire qui lie le facteur C1q du

complément), couramment reconnue par l’anticorps monoclonal AA4.1. Allman et al., en 2001

ont subdivisé la population T2 en deux selon l’expression de l’IgM membranaire (les T2 sont

IgMhigh alors que les T3 sont IgMint)(Allman et al., 2001). Cette nouvelle population T3,

caractérisée tout d’abord comme transitionnelle, pourrait en fait correspondre à une population

anergique indépendante (compartiment An1) qui serait maintenue dans son état anergique par la

présence d’autoantigènes dans la rate (Merrell et al., 2006).

Les cellules T1 circulent dans le sang et se situent dans la partie externe des manchons

lymphoïdes péri-artériolaires (PALS) de la rate tandis que les T2 sont uniquement retrouvées

dans la rate aussi bien dans les PALS que dans les follicules où ont lieu la présentation des

antigènes exogènes et l’activation T-dépendante des cellules B matures. A la différence des T1,

les cellules T2 sont capables de proliférer suite à la stimulation par le BCR (Petro et al., 2002; Su

and Rawlings, 2002) et d’intégrer les signaux de costimulation par les lymphocytes T (Chung et

al., 2002). La population T1 est la cible de la sélection négative en périphérie : seulement un petit

pourcentage de cellules T1 se différenciera en cellules T2 (délétion clonale et anergie). BAFF (B

cell activating factor) jouerait un rôle crucial dans l’homéostasie des B périphériques. Les B

transitionnels qui reçoivent un signal de BAFF via BAFF-R, sont sauvées de la mort cellulaire et

peuvent se différencier pour devenir des B matures (Sasaki et al., 2004; Schiemann et al., 2001).

La différenciation des cellules transitionnelles semble également être dépendantes des signaux

délivrés par le BCR. L’étude de nombreux modèles de souris transgéniques où des mutations

affectent la signalisation par le BCR a permis de montrer qu’une altération du signal empêche

soit le passage du stade T1 au stade T2 soit le passage du stade T2 au stade B mature (Figure

14). Ces cellules semblent en outre pouvoir s’orienter vers plusieurs « destins » (cellules B1, B2

folliculaires ou cellules de la zone marginale). Casola et al. en 2004 ont développé la théorie de

« la force du signal » (signal strentgh) en utilisant des souris dépourvues de BCR et qui

expriment à la place la protéine de latence du virus d’Epstein Barr LMP2A. Il apparaît que des

signaux faibles, intermédiaires et forts favorisent la formation de cellules B de la zone marginale,

de cellules B folliculaires et de cellules B1 respectivement.

Les cellules T2 vont finir d’émigrer dans les zones centrales des follicules où vont leur

être présentés des antigènes exogènes dans un micro-environnement constitué notamment par des

lymphocytes T helpers (TH) et des cellules présentatrices d’antigènes, les FDC ( pour « Follicular

47

Dendritic Cells »). Elles deviennent des B matures folliculaires. Après stimulation antigénique,

ces cellules B seront activées et vont initier la formation de centres germinatifs (CG).

Figure 15 : Maturation des B périphériques au niveau des centres germinatifs

Les B folliculaires représentent 80% des cellules B de la rate murine adulte et possèdent,

de part leur expression de CD62L, la capacité de coloniser les ganglions lymphatiques. Les CG

apparaissent quelques jours après la stimulation antigénique et persistent de quelques jours à

quelques semaines. Ils sont associés à l’expansion clonale des cellules B blastiques et sont le

siège de l’hypermutation somatique (SHM pour « somatic hypermutation »), de la commutation

isotypique (CSR pour « class switch recombination ») toujours dans le cadre d’une réponse T-

dépendante, deux processus supplémentaires de diversification du répertoire B et de maturation

de l’affinité. Ils sont également le siège de la sélection positive ou négative (contre les anticorps

de faible affinité ou autoréactifs) et de l’induction de la différenciation en cellules B mémoires ou

plasmocytes.

Les CG sont constitués de deux parties : une zone sombre et une zone claire (Figure 15). Les

centroblastes sont localisés dans la zone sombre, siège d’une prolifération massive, et sont la

cible de l’hypermutation somatique. Ces cellules vont ensuite se différencier en centrocytes

exprimant à leur surface des BCR potentiellement mutés. Les centrocytes sont séparés de leurs

progéniteurs dans la zone claire du GC où ils seront à nouveau confrontés à l’antigène complexé

à la surface des cellules dendritiques folliculaires (FDC) (Rajewsky, 1996). Les mécanismes de

Centre germinatif

centroblastes

MZB cell

centrocytes

48

sélection des cellules exprimant des anticorps de haute affinité sont particulièrement stringents et

font intervenir des interactions spécifiques avec des cellules T (coopération B/T). De plus ces

cellules rentrent en compétition pour une interaction la plus affine possible avec les FDC (Berek

et al., 1991; Jacob et al., 1991; Kuppers et al., 1993).

Les cellules B folliculaires vont accumuler des mutations somatiques au niveau des séquences de

leur domaine variable modifiant ainsi leur affinité pour l’antigène (processus d’« hypermutation

somatique »). Ces cellules expriment faiblement la protéine anti-apoptotique bcl-2 et fortement le

récepteur Fas (CD95) (Yoshino et al., 1994) et semblent donc destinées à mourir sauf si des

signaux de survie leur sont adressés par les lymphocytes TH (H pour Helpers) reconnaissant le

même antigène (Liu and Arpin, 1997). Ainsi, si les mutations accumulées améliorent l’affinité

pour l’antigène, les cellules seront sauvées et pourront proliférer avant d’entrer dans les

compartiments B mémoires ou plasmocytes (Liu et al., 1991). Au contraire, si les mutations ne

changent pas, voire diminuent l’affinité, ou si les interactions avec les lymphocytes TH

n’ont pas

lieu (cas d’anticorps autoréactifs), ces cellules sont alors éliminées par apoptose (MacLennan,

1994).

Les cellules B mémoires, exprimant fortement le gène bcl-2, constituent un groupe

minoritaire de cellules à longue durée de vie, capable de persister à l’état quiescent sans proliférer

(de plusieurs mois à plusieurs dizaines d’années chez l’homme). Elles n’expriment en général

plus d’IgD, ont commutées et peuvent avoir des localisations préférentielles (telles que les

muqueuses pour les cellules ayant « switché » vers IgA) (Liu et al., 1995). Elles ont la faculté de

répondre très rapidement à des pathogènes externes. En effet, elles peuvent présenter rapidement

et efficacement l’antigène aux lymphocytes T lors d’une réponse secondaire et se différencier en

plasmocytes. Cette différenciation peut se faire en dehors des centres germinatifs (Liu et al.,

1991) bien que les cellules B mémoires puissent aussi recommencer de nouveaux cycles de

sélection et d’hypermutation dans les centres germinatifs, permettant ainsi d’optimiser la

mémoire immunitaire de l’individu (Berek and Milstein, 1988). Par ailleurs, il a été montré que

des cellules B mémoires pouvaient se développer en l’absence de CG, notamment celles portant

des IgM et des IgG1 dépourvues de mutations somatiques (Toyama et al., 2002).

Les plasmocytes, exprimant le récepteur de surface CD138 (syndecan-1), sont les cellules

effectrices de la réponse immunitaire humorale. Ce sont de vraies usines de production et de

sécrétion d’anticorps à destination de l’ensemble de l’organisme. La durée de vie de ces cellules

49

sécrétrices est controversée. Deux sortes de plasmocytes peuvent être générés : à durée de vie

longue ou à durée de vie courte en fonction de l’antigène et des signaux reçus suite à la

stimulation antigénique. Certains pourraient également naître de la transformation rapide d’une

cellule B mémoire suite à une stimulation antigénique (Ochsenbein et al., 2000). La mise en place

du programme de différenciation plasmocytaire est dépendante de deux facteurs de transcription :

Blimp-1 et Xbp-1 (Calame et al., 2003; Lin et al., 2003). La délétion conditionnelle du gène

Prdm1 (codant Blimp-1) dans les cellules B provoque un blocage sévère de la différenciation

plasmocytaire qui se traduit par un défaut de sécrétion d’Ig et par l’absence de plasmocytes de vie

longue et courte (Shapiro-Shelef et al., 2003). Le mode d’action de Blimp-1 consiste à réprimer

plusieurs autres facteurs de transcription indispensables à la voie B tels que Pax5 et Bcl6 (Shaffer

et al., 2002) Figure 16. Le facteur de transcription IRF4 est également requis pour la génération

de plasmocytes. Son KO conditionnel dans les B du CG montre un défaut en plasmocytes post-

CG et montre également que les B mémoires sont incapables de se différencier en plasmocytes.

De plus, les B des souris IRF4-/- perdent l’expression d’AID et ne peuvent plus « switcher »

(Klein et al., 2006). Benson et al. en 2007, ont montré qu’une expression forte d’ IRF4 dans les

cellules B des CG orienterait ces cellules vers une différenciation en plasmocytes à longue durée

de vie et non pas en B mémoires (Benson et al., 2007).

Figure 16 : BLIMP-1 contrôle la différenciation plasmocytaire Schéma de Kallies and Nutt, 2007. Blimp-1 exprimé dès le stade pré-plasmablast va réprimer les facteurs de transcription du lignage B, Bcl6 et pax5 et permettre l’expression de Xbp-1 et IRF-4.

50

D’autres cellules B périphériques interviennent dans les réponses immunes T-indépendantes.

Leurs origines restent encore controversées mais leur action est essentielle puisque ce sont ces

cellules qui vont constituer la première ligne de défense contre les micro-organismes (Hardy,

2006) : ce sont les cellules B de la zone marginale folliculaire (MZ) de la rate et les cellules B1

présentes notamment dans la cavité péritonéale. Ces cellules B périphériques présentent

l’originalité d’être positivement sélectionnées par des antigènes du soi, indiquant que des

différences dans le niveau de signalisation du BCR en réponse à ces antigènes peuvent

déterminer la localisation des cellules B et leur rôle en périphérie (Cariappa and Pillai, 2002).

Elles sont à l’origine des autoanticorps « naturels » polyréactifs de faible affinité dont les

fonctions sont multiples : élimination des débris cellulaires, transports de cytokines ou encore

formation des complexes antigènes/anticorps présentés aux cellules B folliculaires par les FDC

dans les centres germinatifs (Coutinho et al., 1995; Stall et al., 1996).

Les cellules B MZ expriment fortement IgM et CD21, faiblement IgD et CD23 et ne

montrent chez la souris aucun signe de maturation de l’affinité, ce qui les différencie des autres

populations de cellules B présentes dans la rate (transitionnelles, matures folliculaires et

mémoires) (Dammers et al., 2000). Elles ne semblent pas nécessiter la présence de lymphocytes

T pour être sélectionnées et activées puisqu’elles sont présentes chez les souris nudes ou

thymectomisées (Kumararatne and MacLennan, 1982). Elles sont aussi caractérisées par un état

d’activation élevé leur permettant de répondre rapidement à un antigène T-indépendant par

différenciation en cellules sécrétrices d’anticorps (Oliver et al., 1997; Oliver et al., 1999). La voie

Notch et notamment Notch2 jouerait un rôle important dans la formation de cette population

(Hozumi et al., 2004; Kuroda et al., 2003; Saito et al., 2003; Tanigaki et al., 2002). Il est

important de signaler que la physiologie des cellules B MZ semble radicalement différente chez

l’homme puisque cette fois les cellules B IgM+ IgD+ y portent majoritairement le marqueur B

mémoire CD27 et expriment un BCR muté. Une partie des cellules B mémoires (CD27+) du sang

périphérique humain semble d’ailleurs être un équivalent circulant de ces B MZ. A la différence

des cellules B folliculaires, les B MZ humains mutent leur BCR de façon indépendante de

l’interaction CD40-CD40L et ont un rôle dans la réponse aux antigènes polysaccharidiques

(capsules bactériennes notamment) (Weller et al., 2005).

Les cellules B1 sont, elles, situées en dehors de tout organe lymphoïde dans les cavités

péritonéales. Leur origine est controversée : il semblerait qu’elles dérivent de précurseurs issus

du foie foetal mais de récentes études tendent à montrer qu’elles pourraient dériver aussi des

précurseurs médullaires ou des cellules B périphériques « classiques » (B2) chez l’adulte (Arnold

51

et al., 2000; Chumley et al., 2000; Wortis and Berland, 2001). Elles expriment, pour la plupart, le

marqueur de surface CD5 qui les différencient des autres populations de cellules B.

Figure 17 : Schéma récapitulatif de la maturation des B périphériques Ce modèle proposé par Casola et al., en 2007, montre 2 voies de maturation partant de deux progéniteurs différents (foie fœtal et moelle osseuse) et aboutissant à la génération de cellules B1 dans un cas et de cellules B2/conventionnelles dans un autre (Casola, 2007).

3.3 Le mécanisme de la commutation de classe

La spécificité antigénique des Ig est déterminée par les régions variables des chaînes lourdes et

des chaînes légères des Ig. Les fonctions effectrices, en revanche, dépendent des régions

constantes des chaînes lourdes et varient selon les isotypes. Les IgM sont majoritairement

produites au cours de la réponse primaire, alors que les IgG, IgA ou IgE sont majoritairement

produites au cours d'une réponse secondaire ou tertiaire. Au cours du changement d'isotype ou

commutation de classe, un même gène réarrangé VDJ (éventuellement remanié par

l'hypermutation somatique) va se rapprocher d’un nouveau segment constant de classe différente

par un processus de recombinaison somatique. Les cellules B matures peuvent alors exprimer et

sécréter des IgG, IgA ou IgE spécifiques de l’antigène. Ce processus se révèle donc primordial

pour la diversité fonctionnelle des réponses anticorps.

52

Figure 18 : Exemple de « switch » (commutation de classe) vers IgE. Les exons codants sont représentés par des rectangles beiges, les introns par des traits fins, les régions S par des ellipses et les activateurs par des cercles.

L’IgG est l’isotype prédominant dans le sang et la lymphe. Les différentes sous-classes d’IgG ont

des fonctions effectrices différentes dues à leur capacité variable à lier les différents récepteurs Fc

(FcγRI, FcγRII, FcγRIII and FcγRIV), à induire l’ADCC (Antibody-Dependant cell-mediated

Cytotoxicity) et/ou à activer le complément (Nimmerjahn and Ravetch, 2005). Les IgG3 jouent

un rôle important dans la réponse antibactérienne et sont très efficaces dans la phagocytose. Les

IgG2a sont prédominantes dans les réponses antivirales. Dans les réponses T-dépendantes, les

IgG1 représentent l’isotype dominant dans la lutte contre les infections virales et parasitaires. La

voie du complément n’est pas activée mais les IgG1 stimulent la phagocytose efficacement.

Les IgA sont prédominantes dans les sécrétions (respiratoires, digestives ou génitales) et sont

fortement résistantes à la protéolyse enzymatique. Les IgA mucosales sécrétées dans la lumière

intestinale protègeraient l’organisme contre les virus et les bactéries à tropisme muqueux.

Les IgE sont impliquées dans la défense parasitaire, mais peuvent également médier les réactions

d’hypersensibilité. Les mastocytes (tissus) et basophiles (circulation) expriment des récepteurs à

haute affinité pour IgE (FcεRI) qui peuvent lier les IgE monomériques en absence d’Ag. Les Ag

spécifiques induisent l’agrégation des complexes IgE-FcεR entraînant la sécrétion d’histamine

impliquée dans les réactions d’hypersensibilité. Il existe en revanche une voie d'hypersensibilité

indépendante d'IgE. Chez des souris délétées pour Cε, on note la persistance d'une réaction

anaphylactique en l’absence d'IgE (Oettgen et al., 1994).

53

La commutation isotypique, permettant à une cellule d'exprimer une chaîne lourde

différente d'IgM est un mécanisme complexe et hautement régulé. Elle cible des points chauds de

recombinaisons appelés région « switch » ou S, situées en amont de tous les domaines constants à

l'exception de Cδ. Plusieurs éléments cis-régulateurs du locus IgH sont également impliqués dans

le contrôle ce processus. Alors que les éléments situés les plus en 5’et notamment l’activateur

transcriptionnel intronique Eµ, semblent n’avoir que peu de rôle ou un rôle redondant (Perlot et

al., 2005), les promoteurs germinaux situés en amont des régions switch jouent un rôle majeur et

les activateurs transcriptionnels qui les contrôlent semblent pour l’essentiel regroupés en aval du

locus IgH, où ils constituent la « région régulatrice 3'IgH » (éléments pour la plupart détaillés

dans le chapitre 2).

a. Les régions S

Les régions S ou régions « switch » sont des sites de recombinaison composés de motifs répétés,

riches en G, situés dans l’intron qui précède chacun des gènes constants, à l’exception de Cδ

(Figure 18). Elles sont composées de répétitions de courtes séquences en tandem (les pentamères

GAGCT, GGGGT ou GGGCT) en aval d’un court exon I précédé de son promoteur. Les

répétitions courtes peuvent elles-même s’organiser en motifs se répétant sous la forme d’unités

plus longues, comme par exemple dans les régions Sγ caractérisées par des motifs répéts de 49

pb. La longueur des régions S varie de 1 kb (Sε) à 10 kb (Sγ1) (Dunnick et al., 1993).

La recombinaison a lieu de façon imprécise entre différents sites localisés dans ou au voisinage

des régions S. Les étapes de reconnaissance et de clivage des régions S demeurent mal comprises.

Des cassures à la fois double et simple brin pourraient être impliquées dans l’initiation de la

commutation de classe (Chen et al., 2001b), et de fréquentes mutations, stigmates de

l’intervention d’AID, sont retrouvées au voisinage des points de cassures (Kenter, 2003; Manis et

al., 2002a; Manis et al., 2002b). Les cassures d’ADN situées dans les régions S sont suivies d’une

étape de réparation et de ligation impliquant le mécanisme NHEJ et les processus de réparation

ubiquitaires, tels que les mécanismes de réparation des « mistmatchs ». L’ADN intermédiaire,

sous forme circulaire non réplicative ne subsiste que transitoirement sous forme d’épisome et se

perd au cours de la division celulaire, tandis que la réparation chromosomique place la région

constante cible à proximité de la région VDJ.

La délétion quasi complète de Sµ aboutit à un blocage sévère mais incomplet de la commutation

de classe vers tous les domaines constants en aval (Khamlichi et al., 2004; Luby et al., 2001). Par

contre, la délétion de Sγ1 aboutit à un blocage quasi-complet de la commutation vers IgG1 mais

54

pas vers les gènes constants en aval (Shinkura et al., 2003). L’inversion de la région Sγ1, diminue

son efficacité en tant que cible du switch, de mêm que toute amputation de sa longueur et il est

donc clair que ces longues séquences répétées contribuent par leur orientation, leur longueur et

leur caractère répétitif à cibler les recombinaisons, sans qu’elles soient pour autant indispensables

à ces recombinaisons (Zarrin et al., 2005). Le caractère GC-riche des régions switch de

smammifères ne semble pas fondamental pour la mécanique du switch et on a pu leur substituer

avec efficacité une région Sµ AT-riche provenant de Xenopus laevis (Zarrin et al., 2004) au sein

de laquelle le processus de recombinaison s’est révélé cibler des motifs AGCT.

b. La transcription germinale et le rôle des cytokines

Avant la commutation, les cellules B activées expriment un ou plusieurs ARN appelés

transcrits germinaux codés par l’un ou l’autre gène constant. Le caractère obligatoire de cette

transcription préalable au switch a permis de considérer très tôt qu’une grande partie de la

régulation du switch portant sur l’accessibilité des gènes cibles, pouvait être ramenée pour

l’essentiel à une régulation de la transcription germinale (Lutzker et al., 1988). Ce phénomène de

transcription germinale se déroule aussi bien sur l’allèle exprimé que sur l’allèle exclu et il est

fréquent que les deux allèles recombinent vers le même gène constant (Delpy et al., 2003). Tous

les transcrits germinaux ont une structure analogue présentant un site d’initiation de la

transcription localisé en 5’ de chaque région S, appelé promoteur I. Après initiation, la

transcription se poursuit à travers un exon I non traductible puis à travers la région S et les

différents exons constants CH jusqu’aux sites de polyadénylation (Dudley et al., 2005).

L’épissage se fait normalement entre l’exon I et le site accepteur de CH1. La présence de

nombreux codons stop rend ces transcrits stériles (Chaudhuri and Alt, 2004; Goodman et al.,

1993).

Différents modèles d’études ont mis en évidence le contrôle de la production des

différents isotypes par les cytokines et différents mitogènes (Stavnezer, 2000). Pour les

principaux, l’addition d’interleukine 4 (IL-4) à des cellules activées par le LPS induit la

commutation de classe vers IgG1 et IgE tandis que l’addition d’interféron-γ (IFN-γ) induit la

commutation vers IgG2a. Le « transforming growth factor » (TGF-β) induit quant à lui la

commutation de classe vers IgA et IgG2b. En plus des cytokines, les signaux issus des contacts

entre cellules T et B sont impliqués dans la commutation de classe. L’élément le plus important

dans ces contacts est CD40-L exprimé sur les cellules T activées. Le signal médié via CD40

induit la commutation de classe vers la majorité des isotypes.

55

L’action des cytokines semble s’exercer essentiellement au niveau des promoteurs

germinaux. Des sites de fixation de certains facteurs de transcription dans les promoteurs

germinaux ont été identifiés et agissent en réponse à l’action des cytokines. Les cytokines

induiraient l’expression ou l’activité de facteurs transcriptionnels souvent multiples et capables

de former des complexes activateurs en se liant à leurs promoteurs germinaux cibles (Delphin

and Stavnezer, 1995; Warren and Berton, 1995). Par exemple, la stimulation in vitro des cellules

B par le l’IL-4 en présence de LPS induit la transcription germinale de γ1 et ε par le recrutement

de Stat6, NF-κB, PU.1, BSAP(Pax5), C/EBP et AP-1 (Geha et al., 2003).

Le fait que tous les transcrits germinaux aient la même structure suggère qu’ils exercent,

par eux-mêmes, une fonction importante. Des mutations ciblées qui abolissent ou altèrent la

structure de ces transcrits indiquent que non seulement leur existence mais encore leur épissage

correct sont nécessaires au mécanisme de commutation isotypique. La transcription en elle-même

n’est pas suffisante pour obtenir la commutation de classe, puisque le remplacement de l’exon Iε

par un promoteur fort mais non inductible par l’IL4 (Eµ associé au promoteur pVH) conduit à

une transcription germinale forte, mais diminue cependant la commutation de classe (Bottaro et

al., 1994). La corrélation entre la synthèse des transcrits germinaux et la commutation isotypique

a conduit à proposer un modèle basé sur l’accessibilité de la chromatine. Grâce à leur remodelage

chromatinien et à la transcription germinale qui lui est associée, les régions S deviendraient

accessibles à des facteurs agissant en trans (Stavnezer-Nordgren and Sirlin, 1986). Au regard de

cette hypothèse, il a été montré que les gènes constants, en cours de commutation, étaient

hypométhylés, hyperacétylés et présentaient des sites d’hypersensibilité à la DNase I dans le

promoteur germinal (Berton and Vitetta, 1990).Cependant, l’hyperacétylation des histones des

régions S et des promoteurs germinaux ne suffit pas à induire la commutation isotypique sans

transcription germinale (Nambu et al., 2003).

La transcription germinale pourrait également aboutir à la formation de structures

particulières, au niveau de l’ADN, qui seraient la cible de AID pour initier le clivage de l’ADN et

déclencher la commutation de classe (Chaudhuri and Alt, 2004). Quatre modèles de structures ont

été proposés : les quartets G (Dempsey et al., 1999), les stem-loops (Tashiro et al., 2001), la

boucle R (Yu et al., 2003) et la bulle stabilisée par RPA (protéine se liant à l’ADN simple brin et

impliquée dans la réplication et la réparation) (Chaudhuri et al., 2004). Figure 19. De ces quatre

structures, seul le modèle de la boucle R simple brin a été démontré in vivo. Ces boucles

contiennent un hybride stable ARN-ADN sur le brin riche en G et une région simple brin au

niveau de la séquence riche en C.

56

Figure 19 : Structures générées par la transcription lors de la commutation de classe. Les transcrits des régions S peuvent s’associer de façon stable au brin d’ADN matrice pour former des hybrides ARN-ADN, dans lesquels le brin non matrice peut, en théorie, adopter différentes structures (quartets G, stems loops ou bulles) ou peut rester simple brin (R loop). RPA : protéine de réplication A. Schéma de (Chaudhuri and Alt, 2004).

c. Le rôle de AID dans la commutation de classe

AID (« Activation-induced cytidine deaminase ») a été découverte par criblage soustractif

de banques d’ADNc, dans une lignée B (CH12-F3) pouvant commuter in vitro. Cette protéine de

24kDa est exclusivement exprimée dans les centres germinatifs in vivo, ou après stimulation de

splénocytes in vitro (Muramatsu et al., 1999). AID est absolument indispensable pour la SHM et

la CSR. En cas de déficit en AID, le développement B est normal (expression d’IgM et d’IgD)

mais on peut voir un blocage complet de la commutation de classe (souris déficientes pour tous

les autres isotypes malgré induction de la transcription germinale) et de l’hypermutation

somatique (Muramatsu et al., 2000; Revy et al., 2000).

L’analyse de la séquence codante d’AID a révélé une forte homologie avec APOBEC-1.

APOBEC-1 est une sous-unité catalytique d’un complexe multiprotéique d’édition de l’ARN ;

elle agit sur l’ARNm de l’apolipoprotéine Apob. AID a ainsi été considérée dans un premier

temps comme une nouvelle protéine d’édition de l’ARN agissant sur un ou plusieurs ARNm

codant des endonucléases impliquées dans l’introduction de cassures de l’ADN au cours de

57

l’hypermutation (Muramatsu et al., 1999). Ce modèle est encore aujourd’hui soutenu par l’équipe

d’Honjo. Cependant, un autre courant et des données solides suggèrent plutôt qu’AID agit

directement sur l’ADN (Bransteitter et al., 2003; Chaudhuri et al., 2003; Dickerson et al., 2003;

Petersen-Mahrt et al., 2002; Pham et al., 2003).

AID est essentiellement localisée dans le cytoplasme des cellules B, probablement pour

limiter son effet mutagène. Après activation des cellules B, elle est transloquée dans le noyau

grâce à un signal de localisation nucléaire présent dans se partie N-terminale puis est exportée du

noyau grâce à une séquence-signal d’export localisée dans sa partie C-terminale (Ito et al., 2004;

McBride et al., 2004). Le mécanisme qui régule le ratio nucléaire/cytoplasmique est inconnu

mais certaines données suggèrent une corrélation avec la phosphorylation de AID par la protéine

kinase A (PKA) dépendante de l’AMPc (Basu et al., 2005). L’analyse mutationnelle de AID a

révélé que la protéine avait une structure bipartite au regard de son activité mutagénique. Les

mutations affectant sa partie N-terminale bloquent la SHM mais pas la CSR alors que les

mutations affectant sa partie C-terminale bloquent la CSR mais pas la SHM suggérant fortement

l’existence de cofacteurs distincts pour la SHM et la CSR, mais leur identité reste pour l’instant

inconnue (Shinkura et al., 2004).

AID semble intervenir dans l’initiation de la commutation de classe en générant une

déamination des cytosines (dC) en uraciles (dU) au niveau des régions S riches en motifs AGCT

considérés comme des « hots spots » de déamination, comparables à ceux de l’hypermutation

somatique (Chaudhuri and Alt, 2004; Zarrin et al., 2004). La génération d’ADN simple brin au

cours de la transcription germinale des régions S semble être impliquée dans le ciblage de

l’action d’ AID vers les régions riches en GC (Figure 20). A la suite de la déamination des

cytosines par AID, l’action de l’uracile glycosilase (UNG) (et peut-être du complexe Msh2-

Msh6) est d’éliminer la mutation entraînant ainsi la formation d’un site abasique (gap) :

processus pré-requis dans le modèle de réparation des « mismatch » par la voie de réparation

BER (« Base Excision Repair »). Il est à noter que les souris déficientes en UNG montrent un

blocage sévère dans la commutation de classe (Rada et al., 2002; Schrader et al., 2005). APE1,

endonucléase apurinic/apyrimidique ayant un rôle majeur dans cette voie, génère une coupure au

niveau de ce site. Cependant, des données récentes impliquent plutôt le complexe MRN

(Mre11/Rad50/Nbs1) dans ce clivage (Larson et al., 2005). Les coupures sont ensuite réassociées

par un processus nécessitant l’intervention de nombreux facteurs protéiques tels que H2AX

(histone 2A family member X), 53BP1 (p53 binding protein), mutL homologue 1 (MLH1),

l’ataxia telangiesctasia mutated (ATM) et DNA-PKcs (Petersen et al., 2001; Reina-San-Martin et

58

al., 2007; Shiloh, 2003; Ward et al., 2004). La commutation de classe est complètement achevée

lorsque les deux régions S fusionnent selon un processus faisant intervenir la voie NHEJ.

Figure 20 : Rôle de AID dans la commutation isotypique. La transcription germinale génère des boucles R à l’origine de la formation de substrats ADN simple brin. A la suite de la déamination des cytosines, l’action de UNG élimine l’uracile entraînant la formation d’un site abasique. APE 1 génère une coupure au niveau de ce site. Les coupures sont ensuite réassociées. La commutation de classe est complètement achevée lorsque les deux régions S fusionnent. Schéma de (Chaudhuri and Alt, 2004).

59

IV. L’activation des lymphocytes B où la signalisation via le BCR

4.1. La signalisation par le BcR et sa modulation

La liaison de l'antigène au BCR (B cell antigen Receptor) permet l'activation de la

cascade des signaux de transduction, l'internalisation et l’apprêtement ("processing") des

complexes BCR/antigènes. Le complexe BCR, identifié pour la première fois en 1970 (Raff et

al., 1970), est un complexe multimérique. Il comprend une immunoglobuline membranaire (mIg),

structure de reconnaissance de l'antigène, un hétérodimère associé de manière stable, non

covalente, Igα (CD79A) et Igβ (CD79B), élément de transduction du signal.

Igα et Igβ sont des glycoprotéines de 22kDa et de 26kDa codées respectivement par le

gène mb1 (Hombach et al., 1988; Sakaguchi et al., 1988) et par le gène B29 (Hombach et al.,

1990; Parkhouse, 1990), appartenant à la superfamille des immunoglobulines et composées

chacune d’un domaine extracellulaire (114 et 132 acides aminés), d’un domaine

transmembranaire (22 acides aminés) et d’un domaine cytoplasmique (61 et 48 acides aminés)

(Wang and Clark, 2003). Le domaine extracellulaire de Igα comporte deux cystéines et un

tryptophane qui sont retrouvés dans les protéines de la super-famille des Ig. Ces deux cystéines

semblent permettre la formation d'un pont di-sulfure intra-chaîne et une troisième cystéine serait

probablement engagée dans la liaison di-sulfure interchaîne entre Igα et Igβ. La protéine Igβ est

quant-à elle, dotée de 5 cystéines dont 3 seraient engagées dans des liaisons analogues à Igα, et

les deux dernières pourraient former un autre pont di-sulfure intra-chaîne (Williams and Barclay,

1988). Tout comme les Ig de surface, les séquences murines et humaines de ces deux protéines

révèlent une très grande conservation dans les domaines transmembranaires (100% pour Igα et

85% pour Igβ) et intra-cytoplasmiques (87% pour Igα et 90% pour Igβ) mais faible dans la partie

extracellulaire (56% d'identité pour Igα et 59% pour Igβ). Le pourcentage élevé d'identité de

séquence des domaines transmembranaires suggère un rôle fonctionnel très important, lié à

l'interaction avec les mIg et/ou avec d'autres protéines membranaires.

Cet hétérodimère est indispensable à la transduction du signal grâce à l'existence, au

niveau de leurs queues cytoplasmiques, de motifs ITAM (Immunoreceptor Tyrosine-based

Activation Motif) qui servent de substrat pour des protéines tyrosine kinases (PTKs). Décrit pour

la première fois en 1989 (Reth, 1989), le cœur de ce motif très conservé,

(D/E(X)7D/EXXYXXI/L(X)7YXXI/L), comprend deux tyrosines séparées par onze résidus et

suivies chacune par une leucine(L) ou isoleucine (I) en position +3.

60

Le profil de glycosylation d'Igα et Igβ varie en fonction du stade de différenciation. Igα se

trouve sous 3 formes différentes de glycosylation aux stades pro-B, pré-B et B mature, alors que

Igβ se trouve sous une seule forme. La différence de forme pourrait également dépendre de

l'isotype avec lequel elle entre en association (Batista et al., 1996; Chen et al., 1990).

L’aggrégation des BCR suite à la reconnaissance de l’antigène entraîne leur translocation

dans des micro-domaines membranaires spécifiques appelés « rafts » (ou radeaux lipidiques) et la

phosphorylation des ITAMs d’Igα et d’Igβ par les PTKs. Les rafts agissent comme une plate-

forme de signalisation et de trafic : structure rigide qui évolue dans la « mosaïque fluide » qu’est

la membrane plasmique (Simons and Toomre, 2000) et permet ainsi la stabilisation spatiale du

complexe BCR. Ils sont riches en sphingolipides et cholestérol. Il a été montré que l’association

du BCR avec les micro-domaines lipidiques variait au cours du développement et serait donc un

mécanisme efficace dans le contrôle de la signalisation en régulant la rencontre du récepteur avec

d’autres partenaires tels que les protéines kinases, le substrat PIP2… Le pré-BCR est en majorité

localisé dans les micro-domaines d’où il transmet un signal de survie (Guo et al., 2000) tandis

que le BCR de cellules B au repos y serait exclu (Cheng et al., 1999).

Figure 21 : Translocation des BCR dans les rafts après crosslinking avec un antigène.

cholestérol

sphingolipides

phospholipides

phospholipides saturés

Ag crosslinking

BCR

Igαααα/β rafts

CD45

Lyn

Lyn

Lyn

Lyn

ITAM

Syk

mIg

Syk

PP

PP

a.

b. BCR

CD45

61

La translocation du BCR après pontage antigénique, est donc la première étape dans la

signalisation du BCR où une cascade d'activation de protéines tyrosines kinases peut avoir lieu.

On distingue trois familles de PTKs engagées dans la transduction du signal : la famille Src

(p59Fyn, p53/p56Lyn, p55Blk, p59Fyn, p56Lck), la famille Syk/ZAP 70, et la famille Tec (tel

que Btk) (Burkhardt et al., 1991; Yamanashi et al., 1992).

Figure 22 : Signalisation médiée par le BCR. PKC : protein kinase C ; ERK : extracellular signal-regulated kinase ; JNK : c-Jun N-treminal protein kinase ; NF-κB : Nuclear factor- Κb ; BTK : Bruton’s tyrosine Kinase. Schéma de (Wang and Clark, 2003).

La liaison du BcR (ou "cross-linking") induit préférentiellement la phosphorylation des

résidus Tyrosyl conservés des ITAMs de l’hétérodimère Igα/β par des tyrosine kinases de la

famille Src, elles-mêmes préalablement maintenues déphosphorylées (et donc activables) par le

récepteur membranaire à activité phosphatase CD45. CD45 est une PTPase (Protein Tyrosine

phosphatase) transmembranaire qui régule positivement la signalisation par le BcR en

déphosphorylant les résidus tyrosine « inhibiteurs » de la région C-terminale des kinases Src,

favorisant ainsi le passage de ces effecteurs à une conformation active (déphosphorylée), et donc

permettant leur activité tyrosine kinase. Les souris CD45-/- n'ont pas ou très peu de lymphocytes

T périphériques matures et les lymphocytes B ont un défaut de signalisation.

Lyn a été reconnue comme la première kinase responsable de la phosphorylation des

tyrosines des motifs ITAMs de l’hétérodimère Igα/β, mais il existe une redondance fonctionnelle

entre les kinases de la famille Src puisque l'absence de l'une d'entre elles n'entraîne pas de déficit

majeur dans la lignée B (Chan et al., 1997; Hibbs et al., 1995).

Voie Ras/Raf/MEK

Voie Rac/Rho/Cdc42

62

Figure 23 : Représentation schématique de la transduction du signal par le BCR.

Les voies de la PLCγ2 -1- (Ca2+ et PKC), de la PI3K -2- (Ca2+ et AKT) et des MAP kinases -3- (ERK, JNK, p38MAPK) sont représentées dans ce schéma. Schéma de (Niiro and Clark, 2002).

La phosphorylation des motifs ITAMs va permettre le recrutement et l’activation de Syk. Cette

protéine kinase est donc également associée au BCR (ZAP 70 au TCR) et est phosphorylée sur

une tyrosine conservée entre ces domaines SH2 (Src-Homology 2) et SH1 (Src-Homology 1).

Elle est indispensable à la transmission du signal aux effecteurs secondaires. Il a été démontré

que le recrutement et l’activation de Syk ne sont possibles que dans le cas où les deux tyrosines

de l’hétérodimère Igα/β sont phosphorylées (Pao et al., 1998). Syk est essentielle à la

transduction du signal qui initie le programme de maturation de la cellule B (Cornall et al., 2000).

Elle permet l’augmentation du taux de calcium intracellulaire et régule en aval, l’expression de

facteur de transcription important dans la maturation B. Les souris Syk-/- présentent un défaut du

développement B (blocage précoce au stade proB CD43high, B220+) (Cheng et al., 1995; Turner et

al., 1995). Si un rôle critique de la protéine Syk a été mis en évidence grâce à ce modèle, la

présence de quelques cellules ayant dépassé le stade pro-B suggère l'implication d'autres

1

2 3

63

protéines. La protéine ZAP-70 était décrite comme étant exclusivement exprimée dans les

cellules T et dans les cellules NK (Chan et al., 1992), mais son implication dans la transduction

du signal des cellules B a récemment été démontrée (Schweighoffer et al., 2003). En effet, les

cellules déficientes à la fois pour Syk et ZAP-70 présentent un blocage complet au stade Pré-B.

ZAP-70 semble donc être exprimée pendant le développement B et interviendrait dans la

transduction du signal.

Syk participe à la voie de la PLC-γ2. Elle va former un complexe avec la PLC-γ2

(phospholipase C gamma2), isoforme prédominante dans les lymphocytes B, par l’association de

la tyrosine phosphorylée de Syk au domaine SH2 de la PLC-γ2. Syk phosphoryle la Tyrosine 783

de la PLC-γ2 ce qui va aboutir, au final, à l'augmentation de la concentration du Ca2+

cytosolique. La PLC-γ2 est recrutée à la membrane cellulaire par l’intéraction de son domaine PH

(phospholipid-binding pleckstrin-homology domain) et réalise l'hydrolyse du PIP2 (Phosphatidyl

Inositol 4-5 biphosphate) en IP3 (inosito 1-4-5 triphosphate) et DAG (diacylglycérol). L'IP3

permet la libération dans le cytosol du Ca2+ stocké dans les vésicules intra-cytoplasmiques.

L’augmentation du niveau de la concentration intracellulaire du calcium est nécessaire à

l’activation de facteurs de transcription comme NF-κB (Nuclear Factor-κB) et NFAT (Nuclear

Factor of activated T-cells). Le DAG active quant à lui, la protéine kinase C (PKC) qui peut ainsi

être transloquée dans le cytoplasme où elle pourra phosphoryler les résidus sérine/thréonine

d'autres protéines. Les phosphoprotéines devront agir ensuite comme des facteurs de transcription

de différents gènes, tels que les oncogènes c-fos et c-myc. Les PKC semblent également

participer à l'activation de la voie Ras par le BCR, que l'on décrira plus loin, puisque un

inhibiteur des PKC bloque la voie de l'activation des MAP (Microtubule Associated Protein)

kinases au cours de l'activation des cellules immatures (Gold et al., 1992). Les GTPases de la

famille Vav jouent également un rôle crucial dans la signalisation via le BCR, notamment dans

l’activation de rac1, la réorganisation du cytosquelette après l’engagement du BCR et la

mobilisation du Ca2+ (Tedford et al., 2001). Néanmoins, l'activation de PLC-γ2 et le flux de

Ca2+ intracellulaire sont insuffisants pour déclencher la prolifération des lymphocytes B. L'influx

de Ca2+ extracellulaire apparaît indispensable pour entraîner la prolifération et la synthèse de

cytokines induites par le BcR. C'est sous l'action de la tyrosine kinase de la famille Tec, Btk pour

Bruton agammaglobulinemia Tyrosine Kinase (Hashimoto et al., 1999) (Itk et Rlk dans les

lymphocytes T), relayée par la molécule adaptatrice Blnk/SLP-65 (pour B-cell linker protein) que

se fera cet influx de Ca2+ extracellulaire. Des mutations de Btk sont la cause de déficits

64

immunitaires : XLA (X-linked agammaglobulinemia ou Bruton agammaglobulinemia) chez

l'homme et XID (X-linked immunodeficiency) chez la souris. Il a été également montré que Btk

se liait directement à Igα au niveau de sa queue cytoplasmique et jouerait certainement un rôle

dans l’initiation de l’activation du signal (Kabak et al., 2002).

La deuxième voie de signalisation est la voie de la PI3-Kinase. On distingue 3 groupes

dans cette famille : PI3KI, PI3KII, et PI3KIII. Le mode d'action des acteurs de cette voie reste

controversé, mais son importance a été validée par l'utilisation d'inhibiteurs de PI3K (Beckwith et

al., 1996). La PI3K est impliquée dans de nombreux processus biologiques cellulaires comme la

différenciation, la survie, la migration ou le métabolisme. Dans le système immunitaire, des

dérèglements de la signalisation de la PI3K entraînent des immunodéficiences ou leucémies et

des maladies auto-immunes dans le cas d’une hyperactivation de la PI3K. Elle régule le

développement et la différenciation des précurseurs de la moelle osseuse ainsi que l’activation et

la prolifération des cellules B matures. Les souris déficientes pour la sous-unité régulatrice p85α

présentent des défauts profonds dans le fonctionnement des cellules B : prolifération diminuée et

survie altérée avec un blocage partiel au stade pro-préB accompagné d’un nombre de B matures

diminué en périphérie (Fruman et al., 1999; Suzuki et al., 2003).

Le co-récepteur CD19 semble jouer un rôle important dans cette voie. En effet, au cours

de l'engagement du BCR, il peut y avoir co-ligation avec plusieurs autres récepteurs, tel que

CD19, entraînant la phosphorylation de leurs parties cytoplasmiques. CD19 pourrait alors

recruter la PI3K. Cette association se fait grâce au domaine SH2 de la sous-unité p85, ce qui

entraîne la phosphorylation de tyrosines impliquées dans l'activation de cette protéine (Fearon

and Carter, 1995). Cette protéine voit également son activité augmenter par la liaison de sa sous-

unité avec le domaine SH3 des PTK, Fyn et Lyn (Yamanashi et al., 1991). Il y aurait donc

formation d'un complexe multiprotéique après l'engagement du BCR, dans lequel PI3K serait liée

simultanément avec CD19 et Fyn ou Lyn (DeFranco, 1997). Activée, la PI3K va phosphoryler en

position 3’ les phosphatidylinositol 4-5 biphosphate (PIP2) pour générer les phosphatidylinositol

3-4-5 triphosphate (PIP3). La production de PIP3 est un élément central dans la signalisation du

BCR car beaucoup d’effecteurs impliqués dans la cascade, contiennent des domaines PH pouvant

se lier aux PIP3. Dans la signalisation du BCR, une des cibles de la PI3K activée est la

sérine/thréonine kinase Akt, également appelée protéine kinase B (PKB) (Franke et al., 1997;

Klippel et al., 1997). Une fois recrutée et activée, Akt est transloquée dans le noyau. Elle favorise

la survie cellulaire en régulant par phosphorylation des facteurs de transcription de « survie »

65

comme NF-κB (Krappmann et al., 2001) et E2-F mais peut aussi transmettre un signal anti-

apoptotique en phosphorylant Bad, protéine de la famille Bcl-2 (del Peso et al., 1997) ou en

inhibant GSK-3 (glycogen synthase kinase-3). L’activation rapide et transitoire de NF-κB en

réponse à tout type de stimuli, implique généralement la phosphorylation de IκB par le complexe

kinase IKK, qui permet la libération de NF-κB et sa translocation dans le noyau afin d’initier les

transcriptions.

Une autre voie initiée après l'engagement du BCR est la voie des MAP-kinases qui

regroupe trois membres : ERK (Extracellulaire signal-regulated kinase), JNK/SAPK (c-Jun NH2-

terminal kinase) et p38 MAPK (Johnson and Lapadat, 2002). Après leur activation en cascade,

ces kinases vont jouer leur rôle dans la signalisation en phosphorylant différents groupes de

facteurs de transcription : Elk-1 et c-Myc (pour ERK), c-jun et ATF-2 pour activating

transcription factor 2 (pour JNK) et ATK-2 et MAX (pour p28 MAPK) qui pourront se fixer sur

les régions promotrices des gènes impliqués dans l'activation B.

Des enzymes ayant une activité GTPasique comme Ras et Rac-1 vont intervenir en amont de

cette voie de signalisation. Par exemple, Ras contrôle la cascade Raf-1/MEK/ERK. L’activation

de cette voie est essentielle au développement des cellules B matures (Iritani et al., 1997). La

phosphorylation des ITAMs va permettre le recrutement indirect de la molécule adaptatrice Shc

qui va former un complexe d’activation de Ras avec les molécules Grb2 et SOS : passage de la

forme Ras-GDP à la forme Ras-GTP induisant ainsi la voie classique des MAP kinases.

La signalisation du BCR est donc une voie régulée par :

- la concentration de l’antigène et la force de liaison entre l’antigène et le récepteur (Casola et

al., 2004; Pillai et al., 2004).

- l’auto-régulation du BCR : la phosphorylation de l’hétérodimère Igα/β peut dicter la qualité

et la quantité du signal (Choquet et al., 1994; Luisiri et al., 1996).

- la présence de co-récepteurs membranaires.

On peut détailler une partie des corécepteurs membranaires du BCR jouant un rôle dans la

régulation de la signalisation tout en sachant que cette régulation est sans doute encore plus vaste

et plus complexe…

CD19, co-récepteur, associé au BCR, favorise son entrée dans les rafts. Il contribue

positivement à la signalisation induite par Igα/Igβ en favorisant le recrutement de Lyn, Fyn, PI3K

(Buhl and Cambier, 1999; Cherukuri et al., 2001) mais également de Vav. CD19 forme un

66

complexe avec les récepteurs CD81 et CD21, le récepteur du C3d (Otero et al., 2001). Ce

complexe collabore avec le BCR pour permettre aux lymphocytes B de répondre à de faibles

concentrations d'antigènes. CD45 n’est jamais recruté dans les rafts après l’engagement du BCR

et son absence permet une signalisation du BCR via une phosphorylation de Lyn plus importante

(Cheng et al., 1999; Katagiri et al., 1999).

CD22 est une glycoprotéine transmembranaire de type I spécifique des lymphocytes B qui

lie des résidus acides sialiques liés en α2,6. Elle appartient à la famille des Siglecs (Sialic acid-

binding Ig-like lectins). Cette molécule est exprimée très tôt au cours du développement B

(transition pro-B/pré-B) et son taux d’expression à la surface des cellules B augmente durant la

maturation, atteignant un maximum au stade B mature (Moyron-Quiroz et al., 2002) et

disparaissant au stade plasmocyte. Ce récepteur est aussi retrouvé à la surface de lymphocytes B

isolés des différents compartiments lymphoïdes. Il est associé au BCR et est connu pour réguler

plutôt négativement la transduction du signal (Nitschke et al., 1997), constituant une boucle de

rétro-contrôle. Il a été démontré que les 3 motifs ITIMs (Immunoreceptor Tyrosine-based

Inhibitory Motifs) de son domaine cytoplasmique sont phosphorylés par Lyn au niveau de leur

tyrosine juste après l’engagement du BCR. Ceci permettrait l’accrochage de plusieurs protéines

(contenant des domaines SH2) telles que les tyrosines phosphatases SHP-1 et SHP-2 qui auraient

alors une activité inhibitrice sur le BCR (Nitschke, 2005). Les souris déficientes en CD22

répondent fortement à une stimulation du BCR par une augmentation du taux de Ca2+ et par une

forte prolifération cellulaire (O'Keefe et al., 1996) : « hyper-réponse » des cellules B. De plus,

cette réponse exagérée est associée à une production importante d'auto-anticorps (O'Keefe et al.,

1999). Les substrats de SHP-1 regroupent entre autre, Syk, Blnk, CD22 lui-même (Mizuno et al.,

2000). La déphosphorylation de Blnk par SHP-1 empêche le recrutement de la PLC-γ2 et la

déphosphorylation de Syk et des PTKs de la famille Src diminue leur activité et empêche la

phosphorylation des motifs ITAMs du BCR. Donc en conclusion, l’activation de Lyn va jouer

deux rôles : activateur, en initiant la signalisation du BCR via la phosphorylation des ITAMs de

l’hétérodimère Igα/β et inhibiteur par phosphorylation des motifs ITIMs de CD22 aboutissant au

recrutement de SHP-1. Le phénotype « hyper-immun » des souris CD22-/- est proche de celui

observé chez les souris déficientes pour la phosphatase SHP-1 de même que l’étude de plusieurs

lignées B déficientes en CD22 conforte la thèse du rôle inhibiteur de CD22. Dans ces lignées, une

réponse exagérée est également observée à la suite d'une stimulation antigénique avec un flux

calcique augmenté de manière significative (Nadler et al., 1997). Razi et Varki (1998) ont

67

démontré que CD22 était continuellement « masquée » par des ligands en cis présents à la surface

des lymphocytes B et qu’il pouvait être « démasqué » suite à une stimulation avec un anticorps

anti-IgM/CD40 (Razi and Varki, 1998). Les interactions avec les ligands en cis peuvent dominer

d’autres interactions avec des ligands en trans ce qui modulerait l’activité de CD22. La structure

sialoside terminale reconnue par CD22 est synthétisée in vivo par l’enzyme ST6GalI

(sialyltransférase). Les souris déficientes en ST6GalI suggèrent un rôle complexe ou double de

CD22 puisqu’elles ont une immunodépression B (après immunisation avec des antigènes T-

dépendants ou T-indépendants), présentent de faibles taux sériques d’IgM, et une prolifération B

diminuée (Collins et al., 2002), alors que le double KO CD22/ST6gal1 a montré une restauration

de la réponse B (flux calcique et prolifération après pontage du BCR) (Collins et al., 2006b).

CD22 est localisé préférentiellement au niveau des domaines riches en clathrine et est exclu des

rafts après activation et translocation du BCR mais, se rapprocherait du BCR (pour jouer son rôle

de régulateur négatif) lors de la fusion rafts avec les domaines riches en clathrine pour

l’internalisation (Collins et al., 2006a). Il a été montré que dans les souris ST6Gal1-/-, CD22 était

associé avec des IgM de surface dans les B au repos. On peut donc suggérer que la suppression

du signal B dans les souris ST6Gal1-/- est médiée par une colocalisation ou un rapprochement de

CD22 avec le BCR. Le domaine lectine de CD22 et sa liaison à des ligands glycosylés ne

semblent donc pas à ce jour être clairement associés à sa fonction inhibitrice de l’activation (Poe

et al., 2004).

Le récepteur de faible affinité pour les fragments Fc des IgG, appelé FcγRIIB ou CD32

peut également exercer un effet négatif sur la signalisation du BCR et inhibe la prolifération. De

façon similaire à CD22, le signal inhibiteur est assuré par Lyn qui va également phosphoryler les

motifs ITIMs de FcγRIIB favorisant le recrutement des tyrosines phosphatases SHP-1 et SHP-2.

Ces dernières agissent directement en hydrolysant les PIP3 en PIP2 ou indirectement en

déphosphorylant CD19 bloquant le recrutement et l’activation de la PI3K (Fong et al., 2000;

Hippen et al., 1997).

Le récepteur membranaire CD40, quant à lui, appartient à la famille des récepteurs de

TNF. Il induit un signal mitogénique par interaction avec son ligand CD40L (CD154) exprimé

par les lymphocytes T activés.

Dernièrement, un nouveau récepteur membranaire inhibiteur spécifique des cellules B1 a

été caractérisé (Hoffmann et al., 2007). Siglec-G (orthologue de la siglec-10 humaine) est un

membre de la famille des siglec tout comme CD22 mais plutot relié à la sous-famille de CD33

68

(siglec3). Siglec-G ne serait exprimé que dans les cellules B avec une plus forte expression dans

les cellules B1. Les souris Siglec-G-/- présentent une expansion du compartiment B1 dans la

cavité péritonéale, une plus forte mobilisation du calcium intracellulaire après pontage avec un

anti-IgM dans les cellules B1 et un fort taux d’IgM sérique.

CD72 est également un co-récepteur membranaire inhibiteur du BCR, du fait de la

présence d’un motif ITIM dans son domaine cytoplasmique. En réponse à une stimulation

antigénique, CD72 régulerait négativement toute la voie de transduction du signal en aval du

BCR incluant NF-AT, NF-κB, ERK, JNK, MAPK mais aussi AKT ce qui aboutirait à un arrêt du

cycle cellulaire et à la mort des cellules primaires B matures (Li et al., 2006).

Les mécanismes de transduction du signal semblent être partagés par les récepteurs pré-B et B

compte tenu des différents blocages démontrés dans les souris déficientes en Syk, Btk, Blnk,

PI3K, Lyn, CD19…. récapitulés dans la Figure 14 du chapitre II.

4.2. La signalisation en fonction des différents isotypes du BCR

Quelqu’en soit l’isotype, la présence d’un BCR à la membrane du lymphocyte B est

indispensable à sa survie (Lam et al., 1997). La signalisation via le BCR ne se limite cependant

pas à la survie mais contrôle au contraire de multiples choix (notamment entre apoptose, anergie,

prolifération et différenciation) tout au long de l’ontogénie B. En contraste avec cette complexité

et cette variété des choix cellulaires, la description d’une structure univoque du BCR, associant

toujours une molécule d’immunoglobuline membranaire à un hétérodimère Igα/Igβ, et

l’identification des motifs de signalisation ITAM portés par les régions intracellulaires de ces

deux peptides (Venkitaraman, Reth, etc…) pourraient donner à penser que toutes les

immunoglobulines membranaires transduisent le même type de signal « limité » à une

signalisation α/β lors de leur pontage par un ligand. Une comparaison des différentes classes de

chaînes lourdes entre elles et au cours de l’évolution suggère cependant que la structure des trois

domaines (extra-cellulaire / transmembranaire et intra-cellulaire) de l’immunoglobuline elle-

même pourrait moduler cette signalisation.

69

Figure 24 : Comparaison des régions spécifiques aux mIg

70

La partie transmembranaire des immunoglobulines membranaires est très conservée au cours de

l'évolution, ce qui témoigne de son importance fonctionnelle (Bensmana and Lefranc, 1990;

Rogers and Wall, 1984). Elle est quasiment identique entre la souris, le lapin, et l'homme (Figure

24). Cette conservation se retrouve également entre les différents isotypes (Rogers and Wall,

1984; Yamawaki-Kataoka et al., 1982) et il semble donc vraisemblable que ce domaine

transmembranaire ait une fonction unique d’une espèce à l’autre et d’un isotype à l’autre. Sur les

25 acides aminés composant le domaine transmembranaire, 10 sont des résidus Sérine/Thréonine

ou Tyrosine. Ces résidus hydrophiles sont impliqués dans l'interaction avec les domaines

transmembranaires d'autres molécules, notamment l'hétérodimère Igα/Igβ.

À l’inverse, une importante variabilité inter-isotypes, suggestive de variations

fonctionnelles, apparaît au niveau des domaines intra-cytoplasmiques. Leur taille varie en

fonction des isotypes : IgM et IgD comptent seulement trois résidus dans cette partie, IgA 14,

IgG et IgE en comptent 28. La taille des isotypes commutés, nettement plus importante, peut

donc suggérer que cette queue intra-cellulaire serait d’une façon ou d’une autre gênante pendant

le développement précoce de la cellule B et serait donc absente des deux isotypes qui s’expriment

à ces stades précoces. De plus, on note la présence d’une tyrosine conservée dans un motif

commun à γ et ε.

Figure 25 : Séquences des domaines cytoplasmiques.

IgM ---VTLF KVK

IgD ---VTFI KVK

IgG1 ---LTVT KVKWIFSSVVELKQTLVPEYKNMIGQAP

IgG2a ---LTVT KVKWIFSSVVELKQKISPDYRNMIGQGA

IgG2b ---VTLF KVKWIFSSVVELKQKISPDYRNMIGQGA

IgG3 ---VTLF KVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA

IgA ---LTVT TVRGPFGSKEVPQY

IgE ---LTVT KVKWVLSTPMQDTPQTFQDYANILQTRA

domaines transmembranaires domaines cytoplasmiques

IgM ---VTLF KVK

IgD ---VTFI KVK

IgG1 ---LTVT KVKWIFSSVVELKQTLVPEYKNMIGQAP

IgG2a ---LTVT KVKWIFSSVVELKQKISPDYRNMIGQGA

IgG2b ---VTLF KVKWIFSSVVELKQKISPDYRNMIGQGA

IgG3 ---VTLF KVKWIFSSVVQVKQTAIPDYRNMIGQGA

IgA ---LTVT TVRGPFGSKEVPQY

IgE ---LTVT KVKWVLSTPMQDTPQTFQDYANILQTRA

domaines transmembranaires domaines cytoplasmiques

71

Au cours du développement B, le premier isotype à être exprimé est l'IgM. Le domaine

cytoplasmique de cet isotype, ainsi que celui d'IgD est court et n'est composé que de 3 aa. IgM et

IgD sont donc entièrement dépendantes de l'hétérodimère Igα/Igβ pour assurer les fonctions de

transduction du signal. L’intérêt pour des cellules matures au repos (resting B cells) d’exprimer à

la fois deux isotypes différents de même spécificité antigénique, IgM et IgD, n’est pas encore

bien compris. Comme tous les isotypes, le cross-linking d’IgM et d’IgD entraîne l'activation des

PTK et la phosphorylation de leurs substrats. Mais on sait que l'intensité du signal d’activation est

dépendante de l'isotype. La réponse médiée via IgD est plus intense et plus durable que celle

médiée via IgM et cette différence serait due à son extrémité C-proximale ainsi qu’à un profil de

phosphorylation différent (Kim and Reth, 1995). La similitude de leurs domaines cytoplasmiques

leur permet de se remplacer l'un l'autre. Des souris déficientes pour IgM (délétion de Cµ et de

l’intron µ-δ) présentent un développement B quasi-normal avec expression membranaire et

sécrétée d’IgD. Les différents compartiments B de la moelle et des organes lymphoïdes

secondaires (compartiments B conventionnels - B2) sont normaux. On note une légère différence

dans le péritoine où le nombre de cellules B1 (B220+ CD5+) est diminué dans les souris IgM-/-

par rapport aux souris WT. Après stimulation antigénique (T-dépendante ou T-indépendante), il y

a formation de centres germinatifs, commutation de classe et réponse spécifique à l’antigène. La

seule anomalie rapportée est un retard des réponses antigène-spécifiques. IgD est donc capable de

se substituer en grande partie à IgM (Lutz et al., 1998). C’est en fait l’expression conjointe d’IgM

et d’IgD qui semble présenter un certain degré de redondance non indispensable aux réponses

immunes mais capable de les optimiser. En effet et réciproquement, les souris déficientes pour

IgD (Roes and Rajewsky, 1993), ont un nombre normal de cellules B (conventionnels B2 ou les

B1), une expression membranaire des deux recepteurs CD23 et CD22 (marqueurs d’activation) et

une réponse quasiment aussi efficace que chez les souris sauvages aux antigènes T-dépendants ou

T-indépendants. Par contre, les IgD-/- ont un retard dans la maturation d’affinité après

stimulation avec un Ag T-dépendant. IgD semblerait être important pour accélérer, optimiser le

recrutement de cellules B hautement spécifiques dans les étapes précoces d’une réponse primaire

T-dépendante. En conclusion, l’expression précoce de µ ou de δ est suffisante (mais non

optimale) pour induire le développement B. La formation du pré-BCR semble possible que ce

soit avec la chaîne µ ou avec la chaîne δ. Ceci est certainement du à la présence du court domaine

cytoplasmique identique que ce soit pour IgM ou IgD. IgM comme IgD peut médier l'activation

(Sieckmann et al., 1982), et les deux récepteurs semblent transduire le signal par le même

mécanisme (Cambier et al., 1987).

72

L’absence conjointe de µ et δ aboutit à un phénotype bien plus délétère pour la lignée B.

Elle est observée chez les souris µMT où un codon stop (suivi d’une cassette NéoR) a été inséré

dans le premier exon de membrane µM1 de Cµ (Kitamura et al., 1991). Ces souris présentent

lorsqu’elles sont sur fond génétique mixte C57Bl6/129 un blocage complet au stade préB.

Aucune expression membranaire d’IgM et d’IgD n’est détectée. Il n’y a pas de B matures, de

plasmocytes ni d’Ig dans le sérum. L’étude des réarrangements des chaînes lourdes a montré que

de nombreuses cellules possédaient des réarrangements VDJ productifs sur les deux allèles et que

les cellules B sécrétrices d’anticorps issues d’animaux hétérozygotes exprimaient deux chaînes

lourdes (Kitamura and Rajewsky, 1992). Une étude plus approfondie de ces animaux a en fait

permis de montrer qu’au bout de plusieurs mois, ils finissaient par peupler leur tractus digestifs

de cellules commutées vers la synthèse d’IgA, qui avaient pu quitter la moelle osseuse sous

forme de progéniteurs B et bénéficier ensuite d’un milieu cytokinique propice à la commutation

de classe IgA pour récupérer de cette façon l’expression d’un BCR fonctionnel (Macpherson et

al., 2001). Au-delà, Hasan et al en 2002 puis Orinska et al, en 2002, ont montré, chez les souris

µMT sur fond génétique BALB/c, la présence d’une petite population B à IgG, IgA ou IgE de

membrane, capable de reconnaître spécifiquement des antigènes et de se différentier en

plasmocytes sécréteurs d’anticorps (Hasan et al., 2002; Orinska et al., 2002). Les auteurs ont émis

l’hypothèse qu’une petite partie des précurseurs µ-/- s’échappait de la moelle (en échappant à la

sélection « positive » pour l’expression d’un BCR fonctionnel) et pouvait switcher en périphérie

vers les différents isotypes (avec le risque que ce chemin alternatif de différenciation ne laisse

émerger des clones auto-réactifs potentiellement responsables de maladies auto-immunes…).

Comme nous l’avons vu dans le chapitre 3, lors d'une réponse secondaire, la commutation

de classe permet l'expression d'un nouvel isotype chez la souris : IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE

ou IgA. La taille des domaines cytoplasmiques de ces isotypes est plus grande que celle d’IgM et

d’IgD et comporte notamment une tyrosine conservée. Sans que son rôle dans un BCR complet

assemblé ne soit clarifié, un motif commun à toutes les IgG et aux IgE a pu être défini autour de

cette tyrosine (motif Tyr-X-X-Met/Ile) comme jouant un rôle dans l’internalisation du BCR IgG

en l’absence d’association à Igα/Igβ (Knight et al., 1997; Weiser et al., 1997). Le rôle de ces

domaines cytoplasmiques et leur degré de dépendance vis-à-vis de l'hétérodimère Igα/Igβ sont

mal connus mais on sait que tous les isotypes sont normalement exprimés à la surface de la

cellule en association avec l'hétérodimère Igα/Igβ, même si une stabilité du récepteur

73

membranaire s’avère possible expérimentalement pour les IgG en absence de l’hétérodimère

(Abney et al., 1978; Knight et al., 1997; Venkitaraman et al., 1991; Weiser et al., 1994).

Au cours de ce travail de thèse, nous avons voulu savoir si un BCR commuté à IgA où à

IgE pouvait permettre un développement B normal chez la souris, ainsi qu’une réponse

spécifique à l’antigène. Avant d’aborder la partie plus expérimentale de mon travail, je vais vous

détailler dans ce chapitre, les différents modèles de souris transgéniques (KO, KI et transgenèse)

déjà établis dans le but de susbstituer à l’expression d’un BCR normal IgM/IgD celle d’un BCR

muté, commuté ou pas.

Roth et al., en 1993, ont montré qu’une chaîne lourde transgénique γ2b bloquait

partiellement le réarrangement et l’expression de la chaîne µ endogène mais ne pouvait ensuite se

substituer à cette chaîne µ. Les souris porteuses du transgène γ2b présentent donc un déficit en

cellules B. Les jeunes souris n’ont pratiquement pas de cellules B. A 4 semaines, les souris ont

environ 10% de B dans la rate et n’arrivent à accumuler un nombre normal de cellules B qu’à

partir de 16 semaines. Toutes les cellules B qui se développent dans ces conditions expriment la

chaine µ endogène (comme c’est le cas dans les souris transgéniques human γ1 qui n’ont pas de

cellules B exprimant uniquement le transgène γ1 (Yamamura et al., 1986)). γ2b ne peut donc pas

promouvoir la maturation B et ceci ne serait pas dû à un effet toxique du transgène puisqu'un

croisement avec des souris transgéniques µ restaurerait la maturation B et un croisement avec les

souris µ-membrane KO, ne restaurerait pas le compartiment B. L'expression d'IgG2b est

retrouvée dès les stades précoces du développement et induirait un fort « feed-back » négatif sur

l'expression des gènes des chaînes lourdes endogènes (Denis et al., 1990; Roth et al., 1993; Shen

et al., 1999). Une fois ce stade dépassé, le rôle anti-apoptotique d'IgM ainsi que le signal de

différenciation cellulaire ne pourraient donc être assurés par cette chaîne γ2b transgénique. Ces

différents résultats ont été montrés dans plusieurs lignées transgéniques fondatrices différentes,

porteuses du même transgène. Une seule lignée transgénique (« C line »), exprimant le même

transgène γ2b, permettrait un développement normal après croisement avec les souris µ-

membrane KO). Le site d'intégration et/ou le niveau d’expression du transgène semblent donc

moduler ce phénotype. On ne peut pas exclure non plus dans ces expériences de transgenèse, un

rôle de la région variable, la restriction du répertoire à un VHDJH particulier pouvant peut-être

avoir des effets imprévisibles sur la maturation B. Mais si la maturation B dans ces souris (« C

line ») ne nécessite pas l'expression d'IgM, elle semble dépendante de l'expression de la chaîne λ5

en association avec un facteur inconnu (Kurtz et al., 1997; Roth et al., 1995).

74

Certains auteurs (Achatz et al., 1997; Kaisho et al., 1997; Martin and Goodnow, 2002) ont

suggéré l'implication de certains domaines cytoplasmiques d'Ig commutées dans la mémoire

immunologique. Achatz et al. en 1997 ont établi deux lignées de souris différentes portant des

mutations au niveau des domaines constant ε. La lignée ∆M1M2 est délétée des domaines

transmembranaires et cytoplasmiques d’IgE alors que la lignée KVK∆tail est quant à elle délétée

du domaine cytoplasmique ε et a, à la place, le domaine cytoplasmique d’IgM/d’IgD « KVK ».

Dans les deux cas la réponse spécifique après immunisation est fortement compromise. En effet,

la sécrétion d'IgE spécifique est négligeable dans les souris sans domaine

transmembranaire/cytoplasmique ε. Lorsque seul le domaine cytoplasmique est absent, la

production d'IgE sérique est diminuée de moitié. On observe une nette diminution de la réponse

secondaire à l’Ag chez ces souris. Cette baisse de production d'IgE sérique est le résultat d'une

baisse de l'activité biologique associée à l'absence du domaine transmembranaire/cytoplasmique

d'IgE et non à un défaut de la commutation isotypique vers IgE.

Une autre étude (Kaisho et al., 1997) s'est intéressée au domaine cytoplasmique d'IgG1. A

partir de lignées de souris où le gène γ1 a été amputé des exons codant pour le domaine d’ancrage

membranaire de l’IgG1, elle montre la dépendance de l'expression membranaire de l'Ig pour

obtenir une réponse primaire et secondaire IgG1. Ces souris sont naturellement incapables de

produire des cellules B mémoires IgG1+. Comme pour les IgE, il est donc établi que le passage

par un stade d’expression membranaire de l’IgG1 est indispensable pour la production efficace de

plasmocytes sécréteurs de cette IgG1, en particulier en réponse secondaire.

Puisque, grâce à la commutation de classe, les cellules B vont exprimées un BCR

commuté à Ig contenant une queue intra-cytoplasmique que les cellules naïves ne possèdent pas

(IgM), la question qui reste en suspens est celle d’un rôle régulateur spécifique, modifiant le

« destin » des cellules commutées, pour cette région additionnelle du BCR commuté.

Cette question a d’abord été abordée par l’étude de trois lignées de souris transgéniques

exprimant des BCR spécifiques pour un même antigène (HEL : Hen-Egg Lysozyne), et mettant

en avant l'implication du domaine cytoplasmique d'IgG1 dans le développement B et dans la

mémoire immunologique. Sur ces 3 lignées exprimant une même région variable, une exprime le

transgène IgM, une autre le transgène IgG1, et une troisième un récepteur chimérique dont la

partie extracellulaire est celle de l'IgM et les parties transmembranaires et cytoplasmiques, celles

d'IgG1. Il est à noter qu’une chaîne légère anti-HEL kappa a également été co-transfectée. En

croisant ces différentes lignées transgéniques (comportant de faibles nombres de copies du

transgène) avec des souris RAG2-/-, comme ça a déjà été réalisé pour de simples transgènes

75

IgM/IgD (Brink et al., 1992; Spanopoulou et al., 1994), dans les 3 cas, il y a restauration du

développement B et maturation B complète (population mature CD21+ en périphérie). Dans ce

cas, IgG1 pourrait donc se substituer à IgM non seulement pour médier l’exclusion allélique (pas

ou peu de cellules co-exprimant IgM et IgG1) mais aussi pour assurer les signaux de maturation

des cellules B (Pogue and Goodnow, 2000). De plus, il apparaît que, dans ce cas, ce transgène

IgG1 anti-HEL via son domaine cytoplasmique, permettrait d'augmenter significativement

l’expansion clonale, la production d'Ac ainsi que le nombre de plasmocytes au cours d'une

réponse T-dépendante. Le domaine cytoplasmique d'IgG1 interviendrait certainement dans la

survie des cellules au cours des divisions cellulaires successives. Les auteurs suggèrent que pour

obtenir une réponse secondaire efficace, la présence de quelques cellules spécifiques de

l’antigène et exprimant de l’IgG membranaire suffit (Martin and Goodnow, 2002). Après

initiation et transduction du signal, l'activation doit cesser. Le signal médié par IgM est régulé

négativement, en partie par le co-récepteur inhibiteur CD22 comme nous l’avons vu dans le sous-

chapitre ci-dessus. La présence d’un BCR à IgG n’induirait pas la phosphorylation des motifs

ITIMs de CD22, ne permettrait donc pas le recrutement et l'activation de la phosphatase SHP-1 et

donc l'inactivation de protéines de signalisation. La queue cytoplasmique d’IgG serait donc

responsable à la fois de l'inhibition du signal médié via CD22 et de l'augmentation de la

transduction du signal observée dans les cellules IgG+. Ce qui a amené à proposer le modèle

selon lequel IgG serait indépendante du rétro-contrôle inhibiteur du signal par la phosphorylation

de CD22 afin de rendre l’IgG membranaire plus sensible à la stimulation antigénique, et obtenir

une réponse secondaire plus forte que celle obtenue avec IgM (Wakabayashi et al., 2002). Cette

hypothèse très séduisante a conduit à proposer l’existence de 2 catégories de BCR : un BCR

« affecteur » IgM exprimé précocément et très efficace pour la mise en place du répertoire, la

sélection négative et la maturation précoce de la lignée B, et un BCR « effecteur » (notamment

IgG) hyper-excitable et capable de contribuer à la forte réactivité du système immunitaire et à la

génération rapide de cellules sécrétrices d’anticorps de haute affinité lors des réponses

secondaires à l’antigène (Manser, 2002).

Sato et al., (2007) ont également montré, en établissant différents transfectants exprimant

chacun un BCR commuté (IgM, IgG, IgA et IgE) que, comme IgG, après pontage du BCR-IgE, il

y avait augmentation du taux de calcium intracellulaire associée à une plus forte phosphorylation

de ERK, évènements qui ne sont pas retrouvés après pontage d’un BCR à IgA ou IgM. Ils ont

également montré que CD22 jouerait son rôle de co-récepteur membranaire inhibiteur du signal

de prolifération, d’une manière isotype –dépendant. Il régulerait le signal médié par un BCR IgA

76

alors qu’il n’aurait pas d’effet inhibiteur sur un BCR IgE, du à une mauvaise association de

CD22 avec la queue cytoplasmique de l’IgE, générant ainsi une augmentation de signal. Par

contre, ils montrent que CD72 a un même effet inhibiteur que ce soit un BCR IgM, IgG, IgE ou

IgA. Ils ont par la suite montré que le motif conservé Tyr-X-X-(Met/Ile) commun à toutes les IgG

et aux IgE, n’intervenait pas dans cette augmentation du signal.

Si ces hypothèses sont séduisantes pour rendre compte de la physiologie des réponses humorales,

elles ont cependant, récemment, été remises en cause par Horikawa et al. et Waisman et al., en

avril 2007. L’augmentation du taux de calcium intracellulaire et de la réponse antigénique dans

les cellules B à BCR IgG ne serait pas due à une diminution de la phosphorylation de CD22 ou à

une diminution de sa fonction inhibitrice. Horikawa et al., ont montré que le signal médié par la

queue cytoplasmique de l’IgG n’induisait pas l’expression de certains gènes retrouvés beaucoup

plus exprimés dans des B à IgM de membrane (ces gènes seraient plutôt inducteurs d’une

différenciation MZ) et ils montrent que c’est cette absence ou ce faible signal qui induirait une

réponse B mémoire augmentée et orienterait les cellules vers la différenciation plasmocytaire

(théorie du « less is more ») (Horikawa et al., 2007). Waisman et al., quand à eux, ont démontré

en réalisant une lignée de souris γ1 KI, qu’un BCR IgG pouvait se substituer à un BCR IgM et

permettre un développement B normal. Ils montrent quand même, un léger blocage au stade pro-

préB mais n’identifient ni hyper-différenciation plasmocytaire (non explorable dans leur modèle),

ni indépendance par rapport à CD22 (Waisman et al., 2007).

77

V. « Glycannes et glycoconjugués »

Le dogme central de la biologie moderne a quelque temps reposé sur le concept d’un flux

d’informations biologiques se déplaçant de l’ADN vers l’ARN puis vers la protéine. Il est

cependant maintenant clair que la compréhension des mécanismes de biogenèse d’un organisme

ne repose pas uniquement sur la colinéarité de ces 3 molécules, mais aussi notamment sur 2

autres types de structures majeures que sont les lipides et les sucres, en particulier dans le cadre

des modifications post-traductionnelles des protéines. Polyosides et lipides servent de réserves

énergétiques, de signaux transducteurs, ou encore d’éléments structuraux. Toutes les cellules

vivantes portent sur leurs lipides ou leurs protéines un réseau complexe et dense

d’oligosaccharides (ou glycannes) formant ainsi des glycoprotéines et des glycolipides (dont nous

ne ferons pas état dans ce manuscrit). Localisés pour la plupart à la surface cellulaire, les

glycannes jouent un rôle fondamental dans les interactions “cellule-cellule” et “cellule-matrice

extracellulaire”, cruciales pour le développement d’organismes multicellulaires complexes. Ils se

trouvent également dans une position privilégiée pour l’établissement d’interactions avec

différents pathogènes. Ainsi, au cours des dernières décennies, les chercheurs ont par exemple

mis en évidence, leur importance dans la détermination des groupes sanguins (Kabat, 1956), leurs

rôles dans les interactions cellulaires (Roseman, 1970), leurs implications dans la fécondation

(Jego et al., 1980) et la différenciation erythrocytaire (Liu et al., 1981)...

La grande complexité des structures glycanniques, ajoutée au fait que leur séquence n’est pas

déterminable simplement en décodant une matrice d’acide nucléique, a considérablement freiné

les recherches, et ce n’est que depuis ces vingt dernières années que de nouvelles technologies,

destinées à étudier de façon approfondie ces molécules, ont permis l’essor d’une nouvelle

discipline connue sous le nom de « glycobiologie ». La glycobiologie allie les fondements de la

biochimie et de la biologie moléculaire des glucides. Son but est donc de décoder le sens de ce

troisième alphabet des sucres, qui s'ajoute à celui des protéines et des acides nucléiques. Ainsi,

bien que l’activité biologique des glycoprotéines soit généralement portée par la partie protéique,

les glycannes détiennent des informations supplémentaires permettant notamment de moduler la

fonction biologique des glycoprotéines, déterminer leur durée de vie, et signaler leur adressage

aux différents compartiments cellulaires.

78

5.1. La glycosylation

La glycosylation, généralement définie comme le principal événement de maturation post-

traductionnelle des protéines et des lipides, consiste en une succession de réactions enzymatiques

se déroulant, chez les eucaryotes, principalement dans le réticulum endoplasmique et dans

l’appareil de Golgi. Les glycoprotéines sont constituées d’une chaîne peptidique sur laquelle sont

greffés des sucres. Il est à noter que plusieurs résidus d’une même chaîne polypeptidique peuvent

être substitués par des sucres. Les enzymes impliquées, les glycosyltransférases, font preuve, à

l’image de leurs nombreux substrats, d’une très grande diversité fonctionnelle. Leur action

principale consiste à greffer des mono- ou des polysaccharides sur différents substrats

(monosaccharides, polysaccharides, lipides, ou peptides), en des sites bien définis. Les substrats

donneurs sont utilisés sous une forme énergétique (ou activée) de nucléotide-sucre (GDP-fucose,

UDP-galactose…), et plus rarement sous une forme lipide-sucre (dolichol-P-Glc) (Kleene and

Berger, 1993). Les glycosyltransférases eucaryotes sont en très grande majorité des

glycoprotéines membranaires de type 2, associées aux compartiments cellulaires

exocytoplasmiques, en particulier le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi (Paulson and

Colley, 1989). Après un court domaine cytoplasmique N-terminal (≈10 acides aminés) et une

portion transmembranaire unique (≈ 15 acides aminés), se déploie la portion luminale de la

protéine formée d’un domaine intermédiaire flexible de longueur très variable (70 à 320 acides

aminés), assurant la liaison avec un domaine catalytique globulaire dont la taille varie de 200 à

250 résidus. Les glycosyltransférases sont nommées selon le sucre qu’elles transfèrent, par

exemple « mannosyltransférase » s’il s’agit du mannose, ou « fucosyltransférase », s’il s’agit du

fucose, mais aussi et surtout en fonction de la liaison formée (α ou β) entre le sucre transféré et le

substrat accepteur, ce dernier restant, dans la majorité des cas de nature mono- ou

polysaccharidique (Tableau 1). Dans les cellules animales, de nombreux travaux soulignent

l’importance de la régulation spatio-temporelle de l’expression de ces enzymes dans la définition

des épitopes glycanniques. Grâce au séquençage des génomes, nous savons aujourd'hui

qu'environ 1% des gènes d'un organisme leur est dédié (Lowe and Marth, 2003).

79

Tableau 1 : Les principales glycosyltransférases de vertébrés greffant des sucres monosaccharidiques sur des substrats mono- ou polysaccharidiques.

A la série d’enzymes « classiques » s’ajoutent des enzymes plus singulières, telle que

l’oligosaccharidyltransférase, qui utilise comme substrat donneur un oligosaccharide lié à une

molécule de dolichol-phosphate, ultérieurement transféré sur une protéine au cours des premières

étapes de la biosynthèse des N-glycannes, ou encore telles que les mannosyltransférases et

glucosyltransférases, utilisant du mannose ou du glucose liés également au dolichol-phophate

(Kornfeld and Kornfeld, 1985). Il existe aussi des glycosyltransférases d’origine procaryote qui

transfèrent des sucres liés à l’undecaprényl-phosphate (Shaper and Shaper, 1992). Enfin,

certaines glycosyltransférases sont en mesure de lier des monosaccharides à des résidus Thr ou

Ser, la protéine servant alors directement de substrat accepteur. C’est le cas pour certaines N-

acétylgalactosaminyltransférases, qui initient la synthèse des O-glycannes, ainsi que pour des

enzymes plus récemment caractérisées, que sont les O-fucosyltransférases ou les O-N-

acétylglucosaminyltransférases (Van den Steen et al., 1998).

Pour les glycoprotéines, deux grandes familles de glycannes ont donc été définies selon la

nature de la liaison covalente établie entre le glycanne et la partie peptidique : les N- et les O-

glycannes. Les protéines N-glycosylées portent un glycanne sur l’atome d’azote de la chaîne

latérale d’une asparagine comprise dans un motif consensus de type N-X-S/T (X pouvant être

n’importe quel résidu autre que la proline). Les protéines O-glycosylées portent un

monosaccharide ou un glycanne fixé par l’intermédiaire de l’atome d’oxygène de la chaîne

latérale d’une sérine ou d’une thréonine. Ces deux types de glycosylation peuvent se retrouver

simultanément sur une même protéine (comme par exemple, les récepteurs de la famille Notch).

α1,2 ; α1,3 ; α1,4 ; α1,6 ; β1,4

GDP-ManMannoseMannosyltransférase

α1,3 ; β1,4 UDP-GalNacN-acétylgalactosamineN-acétylgalactosaminyltransférase

β1,2 ; β1,4 ; β1,6 UDP-GlcNacN-acétylglucosamineN-acétylglucosaminyltransférase

β1,3 ; β1,4 ; α1,3UDP-GalGalactoseGalactosyltransférase

α1,2 ; α1,3 ; α1,4 ; α1,6GDP-FucFucoseFucosyltransférase

α2,3 ; α2,6 ; α2,8CMP-NeuAcAcide N-acétylneuraminiqueSialyltransférase

Liaisons formées entre sucre donneur et sucre accepteur

Substrat donneur

Sucre transféréGroupe d'enzymes

80

5.1.1. La N-glycosylation des protéines

Les N-glycoprotéines représentent la classe la plus abondante de glycoprotéines (Vijay, 1998). La

N-glycosylation des protéines chez les Eucaryotes est un processus métabolique hautement

conservé. En effet, on retrouve des N-glycannes aussi bien chez les organismes unicellulaires

(Levures, Trypanosomes, etc.) que chez les organismes pluricellulaires (Plantes, Insectes,

Mammifères, etc.) (Spiro, 2002). Pour tous les Eucaryotes, cette modification post-

traductionnelle est indispensable au bon fonctionnement des cellules (Kukuruzinska and Lennon-

Hopkins, 1999). Ainsi, un défaut dans la machinerie de la N-glycosylation peut conduire, chez

l’Homme, à un syndrome de type CDG (Congenital Disorder of Glycosylation) (Freeze and Aebi,

2005; Lowe and Marth, 2003).

Figure 26 : Synthèse des N-glycoprotéines

La synthèse des N-glycoprotéines (Figure 26) est un processus très complexe qui se

déroule dans trois compartiments cellulaires : le cytoplasme, le réticulum endoplasmique rugueux

(RER) et le Golgi. Le nombre et la taille des branchements varient en fonction de la protéine, du

tissu et de l’espèce considérée (Kornfeld and Kornfeld, 1985).

La translocation co-traductionnelle des protéines dans la lumière du RER constitue la première

étape du transport intracellulaire des protéines N- glycosylées (Roth, 2002). A leur arrivée dans le

réticulum, les protéines subissent de nombreuses modifications, dont la glycosylation. Une fois

leur maturation achevée, au sein de l’appareil de Golgi, les glycoprotéines non résidentes de ce

compartiment sont triées puis prises en charge par des vésicules golgiennes afin d’assurer leur

transport vers leurs zones d’activité (Roth, 2002).

Membrane du RE

Dolichol-phosphate N-acetylglucosamine Mannose Glucose Fucose Galactose Acide sialique Chaîne polypeptidique Protéine

Membrane de l’appareil de Golgi

81

L’édification d’une structure polymannosylée, préalable à la N-glycosylation des

protéines, débute sur la face cytosolique du RER par l’addition séquentielle de deux résidus N-

acétylglucosamine et de cinq résidus mannose sur le dolichol-phosphate (1), un lipide

membranaire. Par un mécanisme de flip-flop (Vishwakarma and Menon, 2005), ce complexe est

déplacé vers la face luminale de la membrane du RER (2), où quatre mannoses et trois autres

glucoses sont ajoutés (3). L’oligosaccharide de 14 résidus (Glc3Man9GlcNAc2), structure

consensuelle à tous les N-glycannes, est ensuite transféré « en bloc » du dolichol-phosphate vers

un résidu asparagine d’une chaîne polypeptidique naissante (4) via une liaison β-N-glycosidique,

si et seulement si ce dernier est inclus dans la séquence consensuelle Asn-X-Ser/Thr (X désignant

tout acide aminé excepté la proline) (Pan and Elbein, 1990). Cette réaction est catalysée par un

complexe enzymatique membranaire appelé oligosaccharyltransférase (OST) (Silberstein and

Gilmore, 1996). Il a été estimé que 90% de ces asparagines consensuelles sont glycosylées

(Gavel and von Heijne, 1990). Alors que la protéine acquiert sa structure native, trois glucoses et

un mannose sont éliminés par différentes enzymes de déglycosylation (5, 6, 7). La glycoprotéine,

est ensuite adressée, via des vésicules de transport, vers le Golgi (8) afin d’y poursuivre sa

maturation (dans le sens cis-trans). Après quelques démannosylations et transfert de trois résidus

N-acétylglucosamine (9, 10, 11, 12), la synthèse du glycanne est achevée par divers ajouts de

molécules de fucose à sa base, de galactose et d’acides sialiques à sa périphérie (13, 14).

Au cours de leur maturation golgienne, les N-glycannes évoluent structuralement en 3

groupes (Figure 27) (Geisow, 1991). Les N-glycannes riches en mannoses ou

oligomannosidiques, qui pourront éventuellement se diversifier dans les différents compartiments

golgiens et acquérir une structure hybride, car conservant des branches mannosidiques et

présentant de nouvelles substitutions par des GlcNAc. Enfin, le dernier niveau de diversification

aboutit à des glycannes complexes, ne possédant plus aucune branche mannosidique. Quelle que

soit leur structure, ces glycannes possèdent un noyau pentasaccharidique commun GlcNAc2Man3.

82

Figure 27 : Les trois types de N-glycannes présents chez les Eucaryotes.

83

5.1.2. La O-glycosylation des protéines

Contrairement à la N-glycosylation qui débute par l’assemblage d’un oligosaccharide dans

le RER qui sera ensuite transféré en bloc sur la protéine naissante, la O-glycosylation se fait par

additions successives de monosaccharides sur un acide aminé hydroxylé d’une protéine

(Brockhausen et al., 1995). Elle est initiée dans la lumière du RER et se poursuit dans les

compartiments de l’appareil de Golgi. Le lieu de synthèse des O-glycannes reste à ce jour très

controversé, se situant dans une zone allant du RE au Golgi proximal, en passant par le

compartiment intermédiaire de ces 2 organites, appelé ERGIC, « ER-Golgi compartment » (Roth

et al., 1994). Dans une grande majorité des cas, l’acide aminé impliqué est un résidu sérine ou

thréonine, mais on rencontre également l’hydroxyproline et l’hydroxylysine (dans le cas du

collagène) (Yamauchi et al., 1982) ou la tyrosine (dans le cas de la glycogénine) (Kao et al.,

1999). Les principaux monosaccharides constituant les O-glycannes sont la N-

acétylgalactosamine, la N-acétylglucosamine, le galactose, le glucose, le xylose, le mannose, le

fucose et l’acide sialique. Alors que pour les N-glycoprotéines, la liaison entre glycanne et

squelette peptidique est unique (liaison d’une asparagine à un GlcNAc), il existe différents types

de liaisons pour les O-glycoprotéines en fonction de la nature du glycanne et de l’acide aminé

engagé (Figure 28).

Figure 28 : Représentation schématique des principaux monosaccharides O-liés sur des résidus Sérine et

Thréonine.

Les signaux qui déterminent quel acide aminé sera O-glycosylé ne sont pas encore bien connus.

Le site de O-glycosylation ne fait pas forcément intervenir un acide aminé compris dans une

séquence peptidique consensus, sauf dans les cas de la O-glucosylation et de la O-fucosylation.

Dans le domaine de la glycobiologie, la O-glycosylation est un thème de recherche relativement

récent (fin des années 70) par rapport à l’intérêt porté à la N-glycosylation (début des années 60),

les données disponibles sur les O-glycannes sont donc beaucoup moins conséquentes. Les

structures O-glycanniques sont extrêmement variées et présentent de nombreuses différences,

84

aussi bien au niveau de leurs synthèses qu’au niveau de leurs rôles biologiques. On peut les

classer en différentes « famille » :

• La O-glycosylation de type mucine est la plus répandue. Elle est initiée par l’ajout d’un

GalNac (par des ppGaNtases) sur les résidus Ser/Thr de protéines transmembranaires ou

sécrétées. Le résidu GalNAc peut rester sous la forme de monosaccharide ou être allongé

par d’autres enzymes (ajout de GlcNAc et/ou de Gal, de Fuc et de NeuAc). Un glycanne

de type mucine peut contenir jusqu’à 15 sucres. Les mucines sont des macromolécules

recouvrant les cellules en contact avec le milieu extérieur et protégeant les épithéliums

contre toutes sortes d’agressions d’origine endogène ou exogène (sucs digestifs, micro-

organismes, polluants, toxines…). Elles représentent une grande famille de protéines

fortement glycosylées. L'"enrobage sucré" dense des mucines les rend plus résistantes à la

protéolyse assurant ainsi la protection de nos épitheliums digestifs ou respiratoires. Les

O-glycannes de type mucine se retrouvent majoritairement sur des protéines de

l’épithélium, de l’endothélium vasculaire et à la surface des globules rouges (tel que

CD43 (leukosialin), CD45RA ; CD34, glyCAM-1, MadCAM-1 qui sont des ligands de la L-

selectine exprimée sur les leucocytes…). Ces stuctures sucrées définissent différents types

d’antigène : elles constituent les déterminants des groupes sanguins (A, B, O) et

tissulaires (Lewis). Le dissaccharide Galβ1,3GalNAc appelée antigène T et le simple

résidu GalNAc, appelé antigène Tn sont présents à la surface de nombreuses cellules (la

« Peanut Agglutinin » pour PNA, serait connue pour se lier à l’antigène T). Cette 0-

glycosylation permet également la synthèse des ligands des galectines.

• la O-mannosylation, qu’on retrouve sur des glycoprotéines du cerveau, du système

nerveux et des muscles squelettiques. La plupart des structures 0-mannosylées comportent

le « core glycanne » Galβ1,4GlcNAcβ1,2Man1-O-S/T (Haltiwanger and Lowe, 2004)

• la O-N-acétylglucosaminylation, qui est catalyséee par l’enzyme OGT (O-GlcNAc

Transférase). Cette modification, par un seul sucre, est fréquemment retrouvée sur des

protéines telles que l’ARN polymérase II, les protéines des pores nucléaires, les facteurs

de transcription (SP1- specificity protein-1 et SRF –Serum response Factor), le récepteur

aux oestrogènes, les protéines de proto-oncogènes (c-myc, c-fos, c-jun…), les protéines

« suppresseurs de tumeur » (p53), et les protéines du cytosquelette (Tau, Vinculine,

Ankyrine, Clathrine…). Une délétion du gène OGT provoque l’apoptose des cellules ES

murines (Shafi et al., 2000).

85

• la O-glucosylation qui a lieu sur les domaines EGF (Epidermal growth factor) et EGF-like

que comportent de nombreuses protéines de surface (Harris and Spellman, 1993).

• la O-fucosylation affecte également les domaines EGF mais aussi les domaines TSR

(Thrombospondin type I repeat) et dépend respectivement de deux enzymes. Celle

responsable de la O-fucosylation des EGF est Pofut1 (Protein Ofucosyltransferase 1)

(Wang et al., 1996a) alors que celle greffant le fucose sur les TSR est Pofut2 (Protein O-

fucosyltransferase 2) (Luo et al., 2006). Notch et ses ligands seraient régulés par o-

fucosylation.

• et enfin la O-Glycosylation de type Glycosaminoglycanne (GAG) que je développerai

plus particulièrement dans ce chapitre.

5.1.3. La O-Glycosylation de type Glycosaminoglycanne (GAG)

Au cours de ma thèse, je me suis particulièrement intéressée aux GAGs, auxquels je vais donc

dédier un paragraphe indépendant afin d’être le plus exhaustif possible.

Les GAGs sont de longues chaînes polysaccharidiques non ramifiées d’unités

disaccharidiques répétées, généralement un hexosamine (glucosamine GlcN ou N-

acétylgalactosamine GalNAc) suivi d’un acide hexuronique (acide D-glucuronique GlcA ou

acide L-iduronique IdoA) d’où la dénomination actuelle : glyco pour l’acide hexuronique, amino

pour l’hexosamine, et glycanne pour signifier qu’il s’agit de chaînes glucidiques en général

greffées sur une protéine. Les GAGs sont généralement sulfatés de façon variable. Ces longues

chaînes polysaccharidiques sont liées par liaison covalente à une protéine centrale (ou « core

protein ») par l’intermédiaire d’un résidu sérine, formant ainsi les protéoglycannes, qui

constituent une famille hétérogène de macromolécules (Figure 29). Il est difficile d’établir une

classification des protéoglycannes. On distingue toutefois selon leur localisation cellulaire des

protéoglycannes intracellulaires, membranaires et extracellulaires.

86

Figure 29 : Liste non exhaustive des CSPGs et HSPGs

87

Les protéoglycannes peuvent varier considérablement par leur composition protéique, leur

taille moléculaire ainsi que le nombre et le type de chaînes GAGs par molécule. On ne connaît

pas encore le mécanisme qui dicte à la cellule la glycosylation d’une protéine donnée par une

chaîne de GAGs. Ceci est d’autant plus vrai que certaines protéines existent temporairement, soit

sous forme de protéoglycannes, soit sous forme de protéines sans chaînes GAGs, et sont appelées

ainsi des « protéoglycannes à temps partiel ». Il semble que toutes les cellules diploïdes

possèdent un système de synthèse de GAGs, mais on ignore encore si la synthèse de composants

polysaccharidiques constitue pour la cellule une condition nécessaire à sa survie bien que chez le

nématode, Caernorhabditis elegans, il ait été récemment démontré que les CSPGs (pour

Chondroitin Sulfate Proteoglycans) étaient nécessaires à la survie et à la division cellulaire

(Hwang et al., 2003; Mizuguchi et al., 2003).

Bien qu’il existe toujours un motif disaccharidique de base, la longueur et la composition

des chaînes de GAGs sont extrêmement variables, tout comme l’arrangement spatial des

groupements latéraux hydroxyle, sulfate et carboxyle, le long des chaînes. Les chaînes de GAGs

étant parfois fortement sulfatées, les protéoglycannes ont donc généralement une assez forte

charge anionique. Leur polarité, trait physicochimique le plus marquant, les fait implicitement

participer à certaines fonctions biologiques comme l’hydratation des tissus, la fixation des cations

ou le rôle de barrière à filtration ionique. Les chaînes polysacharidiques ont tendance à adopter

des conformations très étirées, repliées au hasard qui occupent un volume considérable par

rapport à leur masse.

a. Les différentes sous-familles de GAGs

La nature des sucres formant le motif disaccharidique tout comme la nature et le degré de

sulfatation permettent de classer les différents GAGs en sous familles (Perrimon and Bernfield,

2001). Figure 30 :

- les galactosaminoglycannes comprennent les Chondroïtines Sulfate (CS) et les

Dermatans Sulfates (DS), caractérisés par une Galactosamine N-Acétylée (GalNAc) attachée à

GlcA (pour CS) ou à GlcA/IdoA (pour DS).

o Le DS est en fait un isomère du CS où le résidu D-glucuronate est remplacé par

un épimère, le L-iduronate. La quantité d’acide iduronique dans la chaîne de DS peut varier de 0

à 90%. De plus, l’épimérisation se fait en « bloc », ce qui donne des régions riches en L-iduronate

et d’autres riches en D-glucuronate dans la même chaîne de DS. Le DS est associé

principalement à la peau et aux tissus non cartillagineux.

88

o Les chondrocytes sont les cellules spécialisées dans la synthèse des CS. Les

groupements sulfates se trouvent en général sur les carbones C-4 et C-6 de la galactosamine et

sur les carbones C-2 des iduronates, pour les DS. Les C4S et C6S sont liés aux protéoglycannes

du cartilage, du matériel squelettique, de la peau et de la cornée. Ces GAGs assurent au cartilage

une fonction protectrice. Alors que le C4S est un composant important pour les processus de

calcification, le C6S serait responsable de l’intégrité des surfaces articulaires.

Figure 30 : La famille des glycosaminoglycannes

- les glucosaminoglycannes, qui sont eux-même divisés en trois catégories :

o L’acide hyaluronique ou hyaluronane (HA) est le seul GAG non fixé à une

protéine porteuse et non sulfaté (Iozzo, 1998). Il possède une structure homogène d’unités

répétées GlcA-GlcNAc et est beaucoup plus long que les autres GAGs. L’HA est un composant

très représenté dans l’organisme (tissu conjonctif, peau, cartilage, fluide synovial). Du fait de son

haut degré d’hydratation, l’HA est probablement responsable de la grande teneur en eau de

certains tissus. Ce polysaccharide gigantesque (masse moléculaire moyenne voisine de 1000

kDa…) possède une viscosité intrinsèque très élevée, assurant l’hydratation et l’assemblage des

différents éléments du tissu conjonctif par formation de complexes supramoléculaires et donnant

au liquide synovial sa viscosité.

o Le Keratane Sulfate (KS) n’est pas considéré comme un GAG à part entière car

il est dépourvu d’acides hexuroniques mais étant combiné à une protéine porteuse de la même

manière que les proteoglycannes, il est communément classé parmi les GAGs. Il est constitué

d’une alternance de galactose et de N-acétylglucosamine. Les groupes sulfates se situent

généralement en C-6 de la glucosamine et occasionnellement en C-6 du galactose. Le KS est

représenté dans le cartilage, le matériel squelettique et la cornée.

Glycosaminoglycannes

Galactosaminoglycannes Glucosaminoglycannes

CS DS

HS/HP

KS

HA

Glycosaminoglycannes

Galactosaminoglycannes Glucosaminoglycannes

CS DS

HS/HP

KS

HA

89

o L’Héparane Sulfate (HS) et l’Héparine (HP, notamment produite dans les

granulations des mastocytes et basophiles). Ils font partie d’une même sous-famille. Ce sont les

formes les plus complexes et les plus sulfatées de la famille des GAGs dans le cas de l’héparine.

La distribution des groupements sulfates le long des chaînes osidiques va déterminer si le produit

final est classé parmi les héparines (très fortement sulfatées – 80% des glucosamines) ou les HS

(moins sulfatées- 40 à 50% des glucosamines). Ils ont été énormément étudiés à cause de leur

implication dans de multiples fonctions biologiques proteoglycans (Gallagher et al., 1986;

Salmivirta et al., 1996), les HS étant retrouvés dans le milieu extracellulaire de nombreux tissus,

et de l’application thérapeutique majeure de l’HP comme anticoagulant (Bourin and Lindahl,

1993).

b. La biosynthèse des GAGs

La biosynthèse des GAGs (Lindahl et al., 1998; Perrimon and Bernfield, 2000) est un

processus multi-étapes qui a lieu dans l’appareil de Golgi. La première étape implique

l’attachement d’un tétrasaccharidique unique, commun à tous les GAGs, au niveau du

groupement hydroxyle d’une sérine d’une « core protein » (Figure 31). Le tétrasaccharide

toujours rencontré est GlcAβ(1,3)-Galβ(1,3)-Galβ(1,4)-Xylβ1-0-Ser. Ce processus est catalysé

par quatre enzymes qui ajoutent les monosaccharides de manière séquentielle à l’extrémité non

réductrice de la chaîne en croissance.

Il y a ensuite, élongation de la chaîne par ajout d’unités saccharidiques puis modification

de la chaîne polysaccharidique par N-déacétylation, N et O-sulfatations, épimérisation… faisant

intervenir un large répertoire d’enzymes spécifiques : N-desacétylase/N-sulfotransférase (NDST),

C5-épimérase, 6-O-sulfotransferase, 3-O-sulfotransferase…. Les enzymes ne modifient pas

toutes les unités saccharidiques de la chaîne ce qui crée un degré d’hétérogénéité structurale. Les

GAGs sont modifiés variablement en fonction des conditions cellulaires (Sugahara and Kitagawa,

2002). Le degré de sulfatation semble lui être déterminé par le type de cellules et leur état

physiologique (Tumova et al., 2000). La variabilité de ces modifications le long du polymère crée

la diversité structurale et fonctionnelle des chaînes de GAGs (Zimmermann and David, 1999). Il

est à noter que dans le cas des HS, la réaction d’initiation, catalysée par la xylosyltranférase, a

lieu au niveau d’une région d’ancrage spécifique définie par deux ou trois séquences consécutives

de résidus « Serine-Glycine » (Esko and Zhang, 1996) encadrées par des résidus hydrophobes et

acides. Le nombre de sites d’attachement de chaînes varie en fonction de la nature de la « core

protein », mais typiquement, il y en a entre deux et quatre pour HS et beaucoup plus pour HP.

90

Figure 31 : Biosynthèse des HS et des CS.

91

C’est le premier hexosamine greffé sur l’extrémité non-réductrice du tétrasaccharide

d’attachement (dans ce cas, l’acide glucuronique) qui va déterminer la nature de la chaîne de

GAG. Si c’est un N-acétylglucosamine (GlcNAc), il y aura alors biosynthèse de

glucosaminoglycanne (HS ou HP) et si c’est un N-acétylgalactosamine (GalNAc), il y aura alors

biosynthèse de galactosaminoglycanne (CS ou DS). Il a été suggéré que les motifs de la séquence

peptidique proche du site d’attachement du tétrasaccharide jouaient un rôle de signal pour

l’addition de l’un ou l’autre des monosaccharides (Zhang et al., 1995). De plus la modification du

tétrasaccharide commun aux GAG par phosphorylation et sulfatation pourrait avoir un rôle

important dans l’assemblage des ces chaînes. Effectivement, la phosphorylation du résidu xylose

est retrouvée pour les chaînes HS et CS alors que la sulfatation du deuxième galactose n’est

visible que pour les chaînes CS. Cette sulfatation semble donc dicter à la cellule la synthèse de

chaînes CS spécifiquement.

Après le premier saccharide attaché, un transfert alternatif de GlcA et de GlcNAc (pour

HS) ou GalNAc (pour CS), à partir de leurs nucléotides UDP-sucres correspondants, forme le

reste de la chaîne GAG. Approximativement, 20 à 300 monosaccharides sont additionnés au

polysaccharide linéaire avant la fin de synthèse. Cette hétérogénéité de longueur crée un premier

niveau de complexité. Une fois la chaîne formée, les disaccharides subissent une série de

modifications. On estime qu’environ 10% des disaccharides constituants les chaînes HS subissent

des modifications contre 80% pour les chaînes héparines (Salmivirta et al., 1996).

Dans le cas des glucosaminoglycannes, la modification du polymère est initiée par une N-

désacétylation/N-sulfatation des GlcNAc par une enzyme la N-désacétylase/N-sulfotransférase.

Les étapes suivantes ont lieu de façon séquentielle sur les résidus adjacents des N-

sulfoglucosamines (GlcNS) qui sont reconnus par la C5- épimérase qui va alors catalyser la

transformation de certains acides D-glucuroniques (GlcA) en acides L-iduroniques (IduA)

(Salmivirta et al., 1996). Ensuite a lieu une O-sulfatation des acides iduroniques en position C-2

par une 2-O-sulfotranférase. Cette sulfatation est suivie par l’action d’une glucosamine-6-O-

sulfotransférase, qui va alors transfèrer un groupe O-sulfate sur la position C-6 de GlcNac ou du

GlcNS. Des sulfatations peuvent également avoir lieu en position C3 de certains GlcNS6S

(Tumova et al., 2000).

Dans le cas des galactosaminoglycannes, des groupements ester-sulfates peuvent être

greffés sur les galactosamines. La place de ces groupements détermine la nature des

chondroïtines sulfates. Si ce dernier est fixé à l’alcool porté par le C-4 du GalNAc, il s’agit de

92

chondroïtine-4-sulfate (C4S) ; s’il est fixé sur le C-6, il s’agit de chondroïtine-6-sulfate (C6S)

(Tableau 2).

CSA = [-4)GlcA(β1-3)GalNAc4S(β1-]n

CSB = [-4)IdoA(β1-3)GalNAc4S(β1-]n (ou DS)

CSC = [-4)GlcA(β1-3)GalNAc6S(β1-]n

CSD = [-4)GlcA2S(β1-3)GalNAc6S(β1-]n

CSE = [-4)GlcA(β1-3)GalNAc4S,6S(β1-]n

Tableau 2 : Les différents motifs des CS

La fixation des sulfates n’est pas d’une régularité absolue, certains résidus des chaînes HS et CS

peuvent donc en être dépourvus. On a donc une alternance de domaines hautement sulfatés de

séquences variables (appelés domaines S ou NS) avec des domaines peu ou pas sulfatés de

séquences d’unités saccharidiques de base (appelés domaines NA). Toutes ces réactions de

sulfatation font intervenir des sulfotransférases qui utilisent le 3’-phosphoadénosine-5’-

phosphosulfate (PAPS) comme donneur de groupements sulfates. D’une manière générale, les

chaînes CS sont plus sulfatées donc plus chargées négativement que les chaînes HS. De plus, les

chaînes HS (co-polymères) possèdent des résidus IduA. Elles présentent donc, contrairement aux

chaînes CS (polymères simples), une très grande flexibilité conformationnelle qui leur permet de

s’auto-associer et d’interagir avec de multiples molécules extracellulaires et cellulaires. La

structure dans l’espace des CS est celle d’une simple hélice, les groupements sulfates chargés

étant dirigés vers l’extérieur de l’hélice. Il est également à noter qu’il existe des enzymes de

dégradation comme les héparitinases et les chondroïtinases qui éliminent certains groupements

sulfates et contribuent de ce fait à la formation de domaines plus ou moins sulfatés adoptant ainsi

des structures 3D différentes.

5.2. Les « sucres » et leur implication dans le système immunitaire

5.2.1. La glycosylation des Ig

Toutes les IgG possèdent un site de N-glycosylation situé sur l’asparagine 297 du

domaine CH2 de la chaîne lourde d’Ig et 20% d’entre elles possèdent un site potentiel de N-

glycosylation sur la région variable. Nous nous contenterons ici d’évoquer la glycosylation de la

CS4

CS6

CS4/6

93

région constante. L’analyse des différentes structures oligosaccharidiques rencontrées sur l’IgG

humaine (Jefferis, 2005; Raju et al., 2001) nous révèle la présence d’une structure bi-antennée de

type complexe GlcNAc2Man3GlcNAc2 présentant un haut degré d’hétérogénéité quant à la

présence de certains sucres terminaux comme le galactose, fucose, l’acide sialique et un résidu

GlcNAc intercalaire (Figure 32). Ces différentes glycoformes rencontrées constituent une

microhétérogénéité tout en sachant que la présence de ce N-glycanne est déterminante, et capable

de fortement moduler l’activité de l’anticorps notamment au niveau de fonctions effectrices

comme l’activation du complément et l’ADCC.

Figure 32 : Structure et fonction d’une IgG. Schéma de Carter et al., 2006.

L’absence anormale de structure N-glycosylée au niveau de la région Fc des Ig est ainsi capable

d’altérer sa conformation et de perturber les liaisons Fc / facteur C1q du complément ou Fc /

récepteurs FcγR (FcγRI ou CD64, FcγRIIa ou CD32a ou FcγRIIIa ou CD16a) exprimés à la

surface des cellules cytotoxiques communément appelées « tueuses » (NK, monocytes,

macrophages).

94

L’ADCC est une réaction de cytotoxicité dans laquelle des cellules cytotoxiques porteuses de

récepteurs FcγR reconnaissent les cellules cibles recouvertes d’un anticorps spécifique. La lyse

est induite seulement si l’oligosaccharide greffé sur l’asparagine 297 de l’anticorps humain est

correctement glycosylé. De la même manière, il a été montré que la présence de sucres sur

l’Asparagine 297 était indispensable à la fixation au complément, le complément étant constitué

d’un groupe de protéines sériques (C1q, C1r et C1s) impliqué dans l’inflammation, l’activation

de cellules phagocytaires et la lyse cellulaire (on parle également d’activité CDC pour

Complement-Dependent Cytotoxicity).

Un grand nombre d’études ont montré qu’un anticorps non glycosylé aurait une affinité de liaison

aux récepteurs FcγR très fortement diminuée (Lund et al., 1995; Mimura et al., 2001; Radaev and

Sun, 2001; Watt et al., 2003). Par contre, l’absence de fucose à la base du N-glycanne du Fc des

IgG (ARNi ou Fut8-/-) améliore nettement l’affinité pour le FcγRIIIa et augmente fortement

l’ADCC (sans modifier l’activation du complément) (Niwa et al., 2005; Shields et al., 2002;

Shinkawa et al., 2003; Yamane-Ohnuki et al., 2004). L’addition d’un résidu N-acétylglucosamine

(GlcNAc) intercalaire, catalysée par la Gnt-III, qui réduirait le niveau de fucosylation,

augmenterait également la fixation au récepteur FcγRIIIa et donc la lyse par ADCC (Umana et

al., 1999). Ces observations prennent de l’importance à la lumière de travaux montrant qu’un

variant du récepteur FcγRIIIa, FcγRIIIa-158V qui lie fortement l’IgG1, est associé à une

meilleure réponse à l’anticorps thérapeutique Rituximab (IgG1 chimérique anti-CD20 utilisée

dans le traitement des lymphomes B) comparé à des patients qui ont l’allotype FcγRIIIa-158F

ayant une faible affinité de liaison pour l’IgG1 (Cartron et al., 2002). D’autres modifications de la

structure du pentasaccharide greffé sur l’Asn297 peuvent avoir des effets sur la lyse. Par exemple,

une diminution de la galactosylation entraînerait une diminution de la CDC (Boyd et al., 1995;

Hodoniczky et al., 2005). Par contre, un fort degré de sialylation diminuerait l’ADCC du fait

d’une faible affinité de liaison pour le récepteur FcγRIIIa sur les cellules NK (Scallon et al.,

2007). En parallèle, il a également été démontré que la présence d’acide sialique sur ce N-

glycanne du Fc des IgG donnait des propriétés anti-inflammatoires à l’Ig, dépendantes de

l’expression accrue de FcγRIIB à la surface des cellules effectrices, et qu’après un challenge

antigénique, les IgG spécifiques de l’antigène pouvaient passer d’un état sialylé à un état

hyposialylé afin de générer une réponse adaptative pro-inflammatoire (Kaneko et al., 2006).

L’ingénierie des anticorps monoclonaux, désormais utilisés en clinique humaine, peut ainsi

permettre le développement d’une nouvelle génération d’anticorps, dont les propriétés

fonctionnelles ont été optimisées, permettant des avancées significatives dans le traitement de

95

pathologies pour lesquelles l’arsenal thérapeutique est limité. L’ingénierie du profil de

glycosylation de la région Fc des IgG1 humaines (l’isotype utilisé dans la très grande majorité

des anticorps monoclonaux commercialisés) est donc une stratégie importante, utilisée pour

optimiser les fonctions effectrices de ces anticorps.

5.2.2. Les galectines, les voies Notch et Wnt : importance de la

glycosylation.

a. Les galectines

Les galectines appartiennent à une famille de lectines très conservée à travers les espèces, qui

comprend 15 membres chez les mammifères. Ce sont des lectines de type S (thiol-dépendantes)

capables de lier les galactoses ou les N-acétylgalactosamines de nombreuses protéines N ou O-

glycosylées intra- ou extra-cellulaires. Ces lectines, molécules solubles, ne requièrent pas la

présence de calcium pour leur activité de liaison. Les différentes galectines ont un profil

d’expression spécifique, hautement régulé (les galectines 1, 3, 7 et 9 sont connues comme

s’exprimant dans les cellules de l’immunité). Ces protéines peuvent être exprimées dans le noyau

et dans le cytoplasme. Certaines sont sécrétées et interagissent avec de nombreuses molécules

glycosylées (appelées « contre-récepteurs ») exprimées à la surface des cellules (Hughes, 1999).

Les galectines peuvent interagir avec des intégrines, des molecules de la matrice extra cellulaire

(telles que la laminine et la fibronectine), le ganglioside GM1 et avec des molécules exprimées

par les lymphocytes comme CD3, CD7, CD43 et CD45… (Fukumori et al., 2003; Gu et al., 1994;

Hadari et al., 2000; Moiseeva et al., 2003; Pace et al., 1999; Sturm et al., 2004). La famille des

galectines peut se diviser en 3 sous-groupes selon le nombre de domaines de reconnaissance aux

hydrates de carbone qu’elles possèdent. Ces CRD pour Carbohydrate Recognition Domain, sont

longs d’environ 130 acides aminés et sont donc responsables de la liaison aux résidus β-

galactosides. Les galectines prototypes (galectines 1, 2, 5, 7, 10, 11, 13, 14 et 15) contiennent un

CRD mais existent soit sous forme monomérique, soit sous forme homodimérique. Les galectines

chimériques ne sont représentées que par un seul membre, la galectine 3 qui est composée de

courtes répétitions proline-glycine d’environ 120 acides aminés, fusionnéees au CRD. Les

galectines tandem (galectines 4, 6, 8, 9 et 12) contiennent 2 CRD connectés par l’intermédiaire

d’un « linker » d’environ 70 acides aminés.

96

Des rôles variés ont été démontrés pour les galectines dans l’induction ou la protection vis-à-vis

de l’apoptose : la galectine 3 serait anti-apoptotique alors que les galectines 7 et 12 induiraient

l’apoptose lorsqu’elles sont surexprimées (Hoyer et al., 2004; Yang and Liu, 2003). Les

galectines interviendraient dans des domaines aussi variés que la signalisation cellulaire et la

stabilisation des microdomaines lipidiques, l’adhésion cellulaire, la régulation de la prolifération,

la différenciation cellulaire, la migration et la transformation cellulaire (Honjo et al., 2001;

Lagana et al., 2006; Liu and Rabinovich, 2005). L’expression des galectines est un facteur

pronostic clé dans de nombreux cancers (estomac, foie, colon, reins, sein, prostate, ovaires,

thyroïde et système nerveux central).

La fonction des galectines est dépendante des contre-récepteurs sur lesquels elles peuvent se

fixer. Un certain nombre de glycosyl-transférases ont déjà été identifiées pour leurs capacités à

synthétiser les galactosides reconnus par les galectines. Ainsi dans les lymphocytes T,

l’expression de la core 2 beta-1, 6-N-acetylglucosaminyltransferase (core2GnT) est à l’origine

d’une structure O-liée qui peut-être allongée et présenter de multiples résidus lactosaminiques

permettant la liaison de la galectine-1, qui joue alors un rôle pro-apoptotique pour ces cellules

(Galvan et al., 2000) A l’inverse, les galactosides peuvent être spécifiquement masqués par

l’addition d’acides sialiques. Des sialyltransférases telles que la ST6GalI peuvent ainsi empêcher

la liaison de la galectine-1 à des glycoprotéines des cellules T immatures telles que CD45. Cette

sialylation semble protéger les cellules T les plus immatures du thymus contre une apoptose et

une inhibition de l’activité phosphatase de CD45 induites par la galectine-1 (Amano et al., 2003).

Il a récemment été démontré que les galectines 1 et 3 induisaient la mort des cellules T en se liant

à différents récepteurs membranaires comme CD45 et CD7, respectivement (Stillman et al.,

2006). Mgat5 (beta1,6 N-acetylglucosaminyltransferase V), enzyme de branchement qui catalyse

le transfert d’un GlcNAc en β(1,6) sur le Man lié en α(1,6) du pentasaccharide cœur commun à

tous les N-glycannes, a également été démontrée comme capable d’augmenter le seuil

d’activation du TCR des cellules T matures via l’augmentation d’expression des galactosides liés

par les galectines (Demetriou et al., 2001), de telle sorte que le déficit en Mgat5 s’accompagne de

réponses auto-immunes exacerbées.

Les galectines reconnaissent, via leur CRD, une famille de molécules d’adhésion cellulaire très

étudiée : les intégrines. Il a récemment été démontré que la galectine-1, sécrétée par les cellules

stromales, intéragissait avec des contre-récepteurs glycosylés exprimés à la fois à la surface des

lymphocytes préB et à la surface des cellules stromales de la moelle osseuse, formant ainsi une

synapse entre les préB et les cellules stromales. Cette liaison se ferait par l’intermédiaire des

97

intégrines VLA-4, VLA-5 et α4β7, la synapse permettant la re-localisation des pré-BCR et des

intégrines et induisant ainsi une transduction du signal (Gauthier et al., 2002; Rossi et al., 2006).

b. Les WNTs

Les Wnts constituent une famille de molécules de signalisation impliquées dans le contrôle du

développement. Ce sont des glycoprotéines de poids moléculaires compris entre 39 et 45kDa,

riches en cystéine. Il existe 19 membres de la famille Wnt chez l’homme et seulement 18 chez la

souris (Miller, 2002). Les Wnts stimulent différentes activités cellulaires : prolifération, migration

et polarité cellulaire. Beaucoup de Wnts sont essentiels pendant l’embryogenèse, mais sont aussi

actifs dans la régénération des tissus adultes tels que la peau, les follicules pileux et l’os (Alonso

and Fuchs, 2003; Staal and Clevers, 2003). Chez les vertébrés, les Wnts activent trois voies

différentes, la voie Wnt/ß-caténine, la voie Wnt/Ca2+ et le mécanisme du contrôle de la polarité

cellulaire (Huelsken and Birchmeier, 2001). La voie Wnt/ß-caténine, connue sous le nom de

« voie canonique », intervient dans le contrôle de la prolifération et de la survie cellulaire. La ß-

caténine est une molécule multifonctionnelle agissant en particulier au cours de la signalisation

par Wnt et de l'adhésion cellule-cellule (Hecht and Kemler, 2000; Obara and Lesot, 2004; Willert

and Nusse, 1998). Phosphorylée par la GSK-3β (glycogène synthase kinase), elle-même associée

à la protéine APC (Adenomatous Polyposis Coli), la βcaténine est rapidement dégradée dans les

protéasomes après ubiquitinylation. En présence d’un signal Wnt, la phosphorylation est inhibée,

ce qui permet à la ß-caténine de s’accumuler dans le noyau, de s’associer au complexe de

transcription LEF/TCF et d’activer la transcription de gènes cibles (Figure 33). Lors de

processus tumoraux, la βcaténine va induire la transcription des gènes c-myc, c-jun, Fra et

cycline-D1 (Karim et al., 2004). La voie Wnt/Ca2+ augmente le niveau du calcium intracellulaire

par la voie d’activation de la phospholipase C, aboutissant à l’activation de la PKC et de la

calcineurin. Il y aura alors accumulation de facteurs de transcription tels NF-AT dans le noyau, et

donc transcription de gènes cibles (Wang and Malbon, 2003). La voie Wnt/polarité cellulaire

(« PCP pathway » pour planar cell polarity) est activée par la liaison de Wnt à des petites

GTPases (RhoA, Rac) permettant l’activation de JNK… ayant des effets sur la polarité cellulaire

et sur l’organisation du cytosquelette (Habas et al., 2003).

98

Figure 33 : Voie de signalisation Wnt. Wnt se lie au récepteur Frizzled via un domaine riche en cystéine, CRD, faisant également intervenir les corécepteurs LRP5 et LRP6 (b). Schéma de (Staal and Clevers, 2003).

Wnt1, premier membre de la famille, a été décrit comme un proto-oncogène induisant le

développement de tumeurs mammaires quand on le surexprimait chez la souris (Nusse and

Varmus, 1982). De même, Wnt5a, tout d’abord décrit comme induisant la transformation

cellulaire via son potentiel oncogénique, serait surexprimé dans de nombreuses tumeurs et

faciliterait l’invasion des métastases. A l’opposé, il régulerait négativement la prolifération B et

supprimerait les tumeurs hématopoïétiques via la voie non-canonique Ca2+ (Liang et al., 2003).

Il est également connu que Wnt1 interagirait avec des chaînes HS à la surface cellulaire mais leur

rôle n’est pas encore bien établi (Reichsman et al., 1996). Il a par ailleurs été démontré, chez la

drosophile (D.melanogaster), que les glypicans (HSPGs) liés à la membrane cellulaire par un

ancrage glycosylphosphatidylinositol - ancre GPI) jouaient un rôle dans la distribution tissulaire

de Wingless et Hedgehog au cours du développement (Hacker et al., 2006). Le rôle de la voie

Wnt n’est pas encore bien étudié dans la lignée lymphoïde. On sait que l’absence de TCF-1

aboutit à une détérioration précoce du compartiment T (atrophie thymique avec déficit en

99

thymocytes double négatifs CD4- CD8-) sans répercussion sur la fonction immune ni sur le

nombre de cellules T en périphérie (Schilham et al., 1998). Un blocage complet de la maturation

T est obtenu dans les double KO TCF/LEF (Galceran et al., 1999).

Les WNTs se lient à des récepteurs membranaires au nombre de 10 chez l’homme et 9 chez la

souris, connues sous le nom de Frizzled (Fzds) (Wang et al., 1996b). Peu de données existent sur

la spécificité ou l’affinité WNT/ligand sur leur récepteur/frizzled, mais il doit exister des

redondances puisqu’il y a deux fois plus de membres Wnts que de membres Fzds.

De nombreuses souris KO pour les récepteurs Frizzled (3, 4, 5, 6, 9) ont été réalisées mais les

conséquences de ces déficiences sévères (qui touchent principalement le système nerveux central)

n’ont pas été regardées dans le système hématopoïétique et encore moins dans le développement

B. Ranheim et al., en 2005, ont cherché vainement à reproduire le syndrome humain de Williams-

Beuren (délétion de 1,4 Mb dans la région chromosomique 7 q11.23) chez la souris en réalisant le

KO du gène Frizzled 9. Par contre, ils ont obtenu une lignée de souris présentant un phénotype

sévère touchant le système lymphoïde. Les souris Fzd9-/- présentent une splénomégalie, une

atrophie thymique et une lympho-adénopathie, selon leur âge, avec accumulation de plasmocytes

dans les ganglions. Elles ont un développement B immature altéré (diminution du nombre de pré-

B et de B immatures mais pas d’accumulation pro-B). Par contre, elles présentent un nombre de

B normal dans la rate et les ganglions. Ces données suggèrent donc un rôle pour la signalisation

wnt/fzd dans le développement lymphoïde.

c. Notch

La voie de signalisation Notch intervient dans de nombreux processus développementaux comme

la neurogénèse, la gliogénèse, la myogénèse mais également dans le développement des

lymphocytes (Tanigaki and Honjo, 2007). Chez les mammifères, la famille des récepteurs

transmembranaires Notch est hautement conservée et se compose de 4 membres : Notch 1, 2, 3 et

4. Ils peuvent interagir avec au moins 5 ligands (Serrate/Jagged 1 et 2 ; Delta-like 1, 3 et 4).

La liaison ligand-récepteur, via des motifs glycanniques, induit une série de clivages

protéolytiques au niveau du domaine transmembranaire de Notch aboutissant à la libération de

son domaine intracellulaire (ICD), qui transloqué dans le noyau, ira s’associer avec RBP-Jκ

(aussi appelé CSL/ Rbpsuh). Figure 34. Il y aura alors recrutement des coactivateurs PCAF et

GCN5 (ce seraient des histones acétyltransférases) et initiation de la transcription de gènes cibles

comme Hes1, Hes5 et NF-κB (Artavanis-Tsakonas et al., 1999; Kurooka and Honjo, 2000;

Mumm and Kopan, 2000). MINT, régulateur négatif de Notch, va rentrer en compétition avec

100

ICD pour lier RBP-Jκ et supprimait l’intiation de la transcription. Alternativement, NIC (Notch

intracellular fragment) peut inhiber la voie de signalisation Jnk en s’associant avec Deltex1

lorsqu’il ne s’associe pas avec RBP-Jκ (Osborne and Miele, 1999).

Figure 34 : Voie de signalisation Notch. Schéma de (Osborne and Minter, 2007). CoA : Co-activateurs et CoR : Co-répresseurs.

Notch serait impliqué dans les différents « choix d’orientation » que font les cellules au cours du

développement et notamment du développement lymphocytaire. Nous savons que les cellules T

et B dérivent d’un même précurseur lymphoïde et qu’elles se développent dans différents micro-

environnements (T, Thymus et B, moelle osseuse). Il a été démontré que l’activité de Notch-1

orienterait le développement vers la lignée T (Robey, 1999), tandis que E2A, BSAP/Pax-5

l’orienteraient vers la lignée B. Koch et al. (2001) ont mis en évidence que l’activation de Notch-

1 serait essentielle à la formation d’un compartiment T dans le thymus car il induirait les cellules

précurseurs, qui ont préalablement migré dans cet organe, à se développer en cellules T et non en

cellules B (les précurseurs lymphoïdes choisiraient par défaut la voie de différenciation B…). La

Génération de l’hétérodimère

Expression à la membrane

Intéraction avec un ligand

Libération du domaine IC

Translocation dans le noyau

Association avec RBP-Jκ et initiation de la transcription

101

délétion conditionnelle des gènes Notch1 et RBP-Jκ dans la moelle osseuse de souris adultes,

aboutit à un défaut de développement T et induit la différenciation B (Han et al., 2002; Radtke et

al., 1999; Wilson et al., 2001). De plus, une expression ectopique de Lunatic Fringe (Lfng) dans

le thymus régulerait négativement l’activité de Notch-1, ce qui induirait les précurseurs

lymphoïdes à choisir la voie de maturation B. Cette enzyme golgienne catalyse la liaison d’un

GlcNAc en β(1,3) sur un fucose O-lié. Sa seule activité connue à ce jour s’exerce vis-à-vis des

domaines EGF-like O-fucosylés du récepteur Notch (Moloney et al., 2000) et de ses ligands,

Delta et Jagged (Panin et al., 1997). Il est important d’ajouter que Fringe (et ses homologues,

manic et radical) a un effet variable sur Notch, dépendant des ligands de Notch. Fringe activerait

Notch par l’intermédiaire de Delta et inhiberait Notch par l’intermédiaire de Serrate/Jagged

(Panin et al., 1997). Donc, le fait que Lfng régule négativement Notch-1 dans les précurseurs

lymphoïdes reflète la probable implication de Serrate/Jagged dans la décision T ou B. Des études

structurales ont montré que les di- (GlcNAcβ1,3Fucα1-O-Ser), tri- (Galβ1,4GlcNAcβ1,3Fucα1-

O-Ser) ou tétra-saccharides (NeuAcα2,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3 Fucα1-O-Ser) construits sur le

fucose O-lié (Figure 35) au niveau d’une sérine d’un domaine EGF-like moduleraient l’activité

de Notch (Chen et al., 2001a). L’enzyme qui réalise la liaison du fucose est la O-

fucosyltransférase I, est une enzyme golgienne codée par le gène POFUT1 (Wang et al., 2001).

Une souris KO pour POFUT1 meurt à l’état embryonnaire suite à de nombreux

dysfonctionnements dans divers processus développementaux. Le greffage de résidus O-fucoses

sur les domaines EGF de Notch et de ses ligands est donc un évènement incontournable dans le

déclenchement des voies de signalisation, puisque c’est leur allongement (ou non) par les

enzymes de la famille Fringe qui va moduler leurs interactions. Parmi les 6 enzymes de la même

famille (β4GalT-I à VI), seule β4GalT-I (Zhou et al., 1998), une β-1,4-galactosyltransférase, a la

capacité d’allonger le disaccharide pour former le motif Galβ1,4GlcNAcβ1,3Fucα1-O-Ser qui

semble être indispensable à l’activation de la voie de signalisation de Notch (Chen et al., 2001a).

Une souris mutante pour la β4GalT-I, montre des altérations de la somitogénèse (Chen et al.,

2006) bien que cette lignée soit viable. Le phénotype discret de l’adulte mutant est sans doute dû

à une activité redondante des β4GalTs. Pour compléter le motif, une β-galactoside-α-2,3-

sialyltransférase, grefferait un acide sialique en α(2,3) sur le Gal d’un motif Galβ1,3GalNAc

(Harduin-Lepers et al., 2001).

102

Figure 35 : Les différentes structures de glycannes O-fucosylés observées sur la protéine Notch. La maturation du O-fucose est sous le contrôle de 2 glycosyltransférases, Fringe et β4GalT1. Le 4ème sucre greffé est un acide sialique en position α(2,3). D’après Moloney et al., 2000.

L’inactivation de RBP-Jκ dans le lignage B aboutit à une défaut en cellules B MZ avec une

augmentation du nombre de B folliculaires, indiquant que la voie Notch peut intervenir

également dans le « choix d’orientation » MZB versus FOB à partir d’un même précurseur, ici :

la cellule B transitionnelle 2. La délétion conditionnelle de Notch2 dans les cellules

hématopoïétiques cause également la perte du compartiment B MZ (Saito et al., 2003). De plus

l’inactivation du ligand delta-like 1, dans les cellules hématopoïétiques, aboutit également à une

perte du compartiment B, ce qui n’est pas le cas lors de son inactivation B-spécifique. Notch2

exprimé sur les cellules B pourrait interagir avec Delta-like 1 qui serait exprimé sur les cellules

dendritiques afin d’induire la différenciation des B de la zone marginale (Hozumi et al., 2004;

Kuroda et al., 2003). Thomas et al., en 2007, ont montré que la co-stimulation de B folliculaires

avec le ligand de Notch, delta-like 1, stimulait l’activation et la prolifération B médiées par le

BCR et CD40 et augmentait le switch vers IgG1 et la production d’IgG1. La voie Notch serait

donc très importante dans l’apparition et la maturation de la lignée B.

5.2.3. Les différentes fonctions associées aux GAGs

Les protéoglycannes sont des constituants majeurs de la membrane plasmique, du

glycocalyx et de la matrice extracellulaire (MEC) (Vidal y Plana and Karzel, 1980). Ils peuvent

interagir avec un grand nombre de molécules/macromolécules dans différents tissus et peuvent

donc être associés à différentes fonctions, différents processus (Bandtlow and Zimmermann,

2000; Coombe and Kett, 2005).

Fucα1-O-Ser

GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

Galβ1,4-GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

NeuAcα2,3-Galβ1,4-GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

B4galactosyltransférase-1 (β4GalT I)

Β3-N-acétylglucosaminyltransférase (Fringe)

β-galactoside α-2,3-sialyltransférase (ST3Gal II)

Fucα1-O-Ser

GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

Galβ1,4-GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

NeuAcα2,3-Galβ1,4-GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

Fucα1-O-Ser

GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

Galβ1,4-GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

NeuAcα2,3-Galβ1,4-GlcNAcβ1,3-Fucα1-O-Ser

B4galactosyltransférase-1 (β4GalT I)

Β3-N-acétylglucosaminyltransférase (Fringe)

β-galactoside α-2,3-sialyltransférase (ST3Gal II)

103

Dans la MEC, les protéoglycannes forment un gel hydraté dont la taille des pores et la densité des

charges varient selon la composition moléculaire des GAGs. Ils jouent ainsi un rôle dans la

viscosité et la résistance aux compressions des tissus (Schonherr et al., 1995). L’existence d’un

tel gel contrôle la vitesse de diffusion ainsi que la disponibilité des molécules hydrosolubles

(Kolset and Gallagher, 1990). Ils facilitent la migration des cellules au cours de la morphogenèse

(Lin and Perrimon, 2002; Sanes, 2003). Lors des processus tumoraux, ils sont impliqués dans la

modulation des interactions cellulaires (Ma and Geng, 2000; Wegrowski and Maquart, 2004),

dans la formation de plaques amyloïdes comme dans la maladie d'Alzheimer (Gupta-Bansal et

al., 1995; van Horssen et al., 2003). Ils jouent également un rôle dans d’autres maladies sévères

comme les arthropathies (Schwartz and Domowicz, 2002).

Les protéoglycannes de la MEC agiraient sur l’adhésion, la migration et la prolifération cellulaire

et joueraient aussi un rôle important dans le système immunitaire en retenant du fait de leur

charge et en augmentant donc la concentration locale au voisinage de la membrane plasmique de

nombreux facteurs de croissance comme les fibroblast growth factors (FGFs, impliqués dans de

nombreux processus physiologiques incluant la prolifération cellulaire, la différenciation, la

morphogenèse et l’angiogenèse) (Nishimura et al., 2000; Ornitz et al., 1992), ou encore les HGFs

(Hepatocyte Growth Factor), les TGFs (Transforming Growth Factor), les membres de la famille

TNFs (Tumor necrosis Factor) notammant APRIL et GM-CSF en initiant des cascades de

signalisation intracellulaire (Haltiwanger and Lowe, 2004; Ingold et al., 2005). Par exemple, les

FGFs en s’associant fortement avec les HS des protéoglycannes de la membrane cellulaire,

induiraient la dimérisation de leurs récepteurs FGFR initiant ainsi un signal de transduction

(Guerrini et al., 2002; Thompson et al., 1994). Très récemment, Sakurai et al. (2007), ont

démontré que TACI, membre de la famille des récepteurs TNF régulerait la production d’IgA

dans les cellules B par APRIL via son association avec des HSPGs. Les protéoglycannes présents

à la surface cellulaire et dans la MEC interagiraient également avec des interleukines (IL3, IL-6,

IL8, IL7, IFNγ…) et des chimiokines (CXCL4 ou facteur plaquettaire 4, SDF-1 pour Stromal

cell-Derived Factor, RANTES…) souvent produites au niveau des sites inflammatoires (Ashikari

et al., 1995; Proudfoot et al., 2001; Spillmann et al., 1998; Stringer and Gallagher, 1997; Tanaka

et al., 1998). Ils retiendraient ces molécules à la surface cellulaire augmentant de ce fait leur

concentration effective (gradient) au voisinage des récepteurs (Figure 36). Les CSPGs sont

également connus pour jouer des rôles importants dans l’adhésion cellulaire et la migration

cellulaire mais surtout au niveau des cellules neuronales et/ou au niveau du cartilage.

104

Enfin, leurs multiples fonctions peuvent être exploitées à des fins thérapeutiques. Par exemple,

l'héparine est depuis longtemps utilisée pour son activité anticoagulant (Petitou et al., 1988) grâce

à son interaction avec l’antithrombine III stabilisant la liaison avec la thrombine, les

chondroïtines sulfates sont, quant à elles, testées pour tenter de ralentir voire stopper le

développement de l'arthrose (Leeb et al., 1996).

Il a été démontré que le profil de sulfatation des unités disaccharidiques constituant les chaînes

GAGs et surtout CS influençait les propriétés de liaison des GAGs et donc la fonction des

CSPGs. Les monocytes/macrophages sécrètent spécifiquement des CSPGs et 80 à 90% de ces

CSPGs seraient des C4S (CSA ou CSB) (Laskin et al., 1991; Uhlin-Hansen et al., 1993).

Rachmilewitz et Tykocinski, en 1998 ont regardé les effets des C4S sur des PBMC (Human

Peripheral Blood Mononuclear Cell) et ont montré que CSA activerait les monocytes qui alors,

sécrèteraient de l’IL-1β (cytokine pro-inflammatoire) quand à CSB, il activerait les cellules B

(pas les T) par le biais de CD44 (prolifération qui peut-être inhibée en présence de TGFβ et

d’anti-CD44). Il a en outre été démontré que HA induit la production d’IL-1β (de même que

TNFα et IGF-1) par les macrophages et la différenciation/prolifération des cellules B dépendant

de son interaction avec CD44 (Noble et al., 1993; Rafi et al., 1997). De plus, Aoyama et al. 2005,

ont montré que CSB induit la prolifération des B murins dépendants de la voie de la PKC et

PI3K, induisant la phosphorylation de Akt mais pas de ERK. La serglycine est un CSPG (C4S),

sécrétée par les cellules hématopoïétiques. On en retrouve dans les granules de sécrétions des

mastocytes, des basophiles et des cellules NK (Natural Killer). Elle serait également un ligand de

CD44 et contribuerait à activer les T cytotoxiques (Toyama-Sorimachi et al., 1995). Elle serait

également constitutivement sécrétée dans des cellules plasmatiques myélomateuses (Theocharis

et al., 2006). Akiyama et al, en 2004, ont montré que la présence de CS dans les cultures

cellulaires en présence d’ovalbumine, induisait la sécrétion de cytokines de type TH1 (IFNγ, IL2

et IL12) et supprimait ou diminuait fortement la sécrétion de cytokines de type TH2 (IL5 et

d’IL10) par des splénocytes préalablement sensibilisés à l’ovalbumine. Cette activité semble être

renforcée lorsqu’ils utilisent des dissaccharides CSA (sulfate en position 4 et pas d’IdoA) et CSE

comparés aux autres séquences. Le degrè de sulfatation ainsi que la position des sulfates semblent

donc être importants dans l’activité des CS. De plus, l’association de CSA avec la L-selectin

exprimée à la surface des lymphocytes T jouerait également un rôle important. Il a également été

montré que le Versican (CSPG contenant des chaînes CS et DS) interagirait avec la L-, la P-

selectin (acteurs moléculaires de l’adhésion cellulaire qui, en reconnaissant leurs différents

ligands, vont autoriser un contact transitoire des leucocytes avec la couche monocellulaire

105

endothéliale, de façon à permettre leur attachement, leur déplacement, puis en dernier lieu leur

migration trans-endothéliale) (McEver et al., 1995), mais également avec certaines chemokines

comme SLC, IP-10 et SDF-1β grâce à des motifs disaccharidiques hautement sulfatés (CSE). Par

contre l’interaction Versican-CD44 requiert des motifs disaccharidiques moins voir pas du tout

sulfatés comme peut l’être, HA (Kawashima et al., 2002). Vander Voort et al. (2000) ont

démontré, chez l’homme, que les lymphocytes B d’amygdales fraîchement isolés, exprimaient

peu de HSPGs et qu’après activation du BCR et/ou du CD40, il y avait une forte augmentation de

l’expression des HSPGs membranaires comme par exemple, CD44 qui via ses chaînes HS, allait

interagir avec HGF et induire la transduction d’un signal (phosphorylation de Met, Akt/PKB).

Les HSPGs peuvent donc être considérés comme des co-récepteurs fonctionnels intervenant dans

la régulation B spécifique de l’antigène. Il a également été démontré que différents mitogènes

induisaient la synthèse de GAGs (CS et HS) que ce soit dans le milieu de culture ou à la surface

cellulaire dans 3 lignées humaines Jurkat (lignée T), Daudi (lignée B) et THP-1 (Makatsori et al.,

2001).

Figure 36 : Les HSPGs jouent de nombreux rôles dans la physiologie cellulaire.

Schéma de Bishop et al. Nature 2007.

106

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Résultats - Discussion

108

109

Première partie : les BCR modifiés

110

111

Article 1

“Premature expression of α Ig heavy chains delays B cell differentiation and

promotes plasma cell maturation but not mucosal homing”

Sophie Raynal-Duchez, Rada Amin, Nadine Cogné, Christophe Sirac, Laurent Delpy, Micael

Bardel, Blaise Corthesy and Michel Cogné.

(Manuscrit soumis à Journal of Experimental Medecine)

Cet article est consacré à l’étude par un modèle de knock-in chez la souris, de la fonction

d’un BCR commuté à IgA afin de savoir si une chaîne α peut se substituer et promouvoir un

développement B ainsi qu’une réponse B-spécifique à l’antigène comme le fait normalement une

chaîne lourde µ. On sait en effet, qu’une chaîne lourde δ peut fonctionner de façon quasi-

identique à µ (Lutz et al., 1998) alors qu’une chaîne γ se comporte au contraire, de façon

spécifique, moins efficace que µ pour la différenciation B précoce mais hyperstimulatrice dans

les cellules B matures en cas de pontage du BCR IgG même si les modalités moléculaires

précises de cette hyper-réactivité restent l’objet de controverses (Horikawa et al., 2007; Pogue

and Goodnow, 2000; Waisman et al., 2007; Wakabayashi et al., 2002). Alors que de nombreuses

études ont été consacrées au BCR IgG, très peu ont exploré la fonction du BCR IgA (Leduc and

Cogne, 1996; Sato et al., 2007) et nous avons donc décidé d’aborder cette question dans un

modèle de knock-in où le gène Cα1 humain a été intégré par recombinaison homologue au niveau

de la région switch µ afin d’obtenir une lignée de souris transgéniques n’exprimant que des IgA.

Nous avons choisi le gène constant humain pour être en mesure de distinguer l’expression de

notre transgène de celle du gène Cα endogène, en particulier chez les hétérozygotes, mais aussi

chez les homozygotes puisque nous savions d’expérience que la délétion de Sµ ne bloque que

partiellement le switch sur le locus muté (Khamlichi et al., 2004).

Cette étude nous permet de dire que la chaîne lourde α est capable de jouer un rôle

similaire à celui d’une chaîne lourde µ pendant les étapes précoces de la différenciation, à savoir

son expression à la membrane et son association avec les modules de signalisation Igα/Igβ afin

de permettre un développement B. Mais on note certaines différences qui permettent de dire que,

comme pour la chaîne γ, le pré-BCR α est moins efficace qu’un pré-BCR µ car on observe un

blocage partiel à la transition pro/préB ainsi qu’une augmentation de l’éditing du BCR

112

manifestée par un ratio κ/λ plus élevé. Malgré ce blocage partiel, une population B à IgA de

membrane est retrouvée dans tous les compartiments B périphériques. Ces B peuvent être activés

après rencontre avec un antigène et être à l’origine d’une réponse spécifique. On remarque

également la présence d’anticorps murins d’isotypes différents dans le sérum de ces animaux,

indiquant que les cellules à IgA de membrane forcée peuvent subir la commutation de classe en

l’absence de Sµ, comme des B à IgM dans le cas de la délétion isolée de Sµ.

Le trait phénotypique le plus marqué reste l’hyperprolifération plasmocytaire. Ces B à IgA de

membrane seraient beaucoup plus activables à l’état basal et ont une grande facilité à se

transformer en plasmocytes après stimulation avec un mitogène d’où l’abondance de plasmocytes

observés dans les différents compartiments lymphoïdes périphériques. Ce trait constitue un point

commun avec le BCR IgG lui aussi hyperactivable (même si l’hyperdifférenciation plasmocytaire

dans tous les modèles d’expression forcée d’un BCR IgG est apparue comme un trait inconstant).

L’IgA rejoindrait donc selon notre étude l’IgG parmi les BCR surtout effecteurs (c'est-à-dire très

efficaces dans les cellules matures stimulées), tandis que la chaîne µ comme la chaîne δ semblent

les plus efficaces composants des pre-BCR et BCR affecteurs qui sous-tendent la maturation B

précoce et permettent à chaque clone B de valider son paratope et de rejoindre, en fonction du

niveau de stimulation que lui confère ce paratope, l’un ou l’autre des compartiments B.

Un dernier point important de notre équipe concerne l’absence d’effet positif de l’expression

d’une IgA membranaire sur le homing muqueux des lymphocytes B alors que les tissus

lymphoïdes associés aux muqueuses sont pourtant le lieu préférentiel de résidence des cellules B

normales à IgA, validant donc l’hypothèse que le homing muqueux des cellules B normales est

initialement réalisé par des cellules à IgM membranaires, qui commutent ensuite sur place vers la

classe IgA.

Contribution personnelle à ce travail :

Ma part de cette étude, en collaboration avec Rada Amin, a consisté en un phénotypage très

détaillé (cytométrie de flux, immunisations, stimulations, tris cellulaires et préparation d’ARN,

d’ADNc, PCR quantitative…) d’animaux préalablement établis au laboratoire mais caractérisés

de façon très préliminaire.

113

Article 2

“B cells carying an IgE BCR are intrisically short-lived”

Sophie Raynal-Duchez, Hezhong Liu, Nadine Cogné, Claire Carrion, Yves Denizot, Jean Sainte-

Laudy and Michel Cogné.

(Manuscrit en préparation)

Cet article préliminaire et encore « en travaux », est consacré à l’étude, par des modèles de

transgenèse et de transfection, de la fonction des IgE de forme membranaire. Il rapporte deux

conclusions principales :

- la chaîne lourde ε des IgE n’est pas capable de jouer un rôle similaire à celui d’une chaîne

µ pendant les étapes précoces de la différenciation, malgré ses homologies de structure

avec les chaînes µ (en particulier pour ce qui concerne l’ancrage membranaire et

l’association avec les modules de signalisation Igα/Igβ du BCR)

- lors de son expression dans une lignée B de phénotype B mature, cette chaîne lourde ε

assemblée au sein d’un BCR, est à l’origine d’un signal constitutif pro-apoptotique.

Ces observations suggèrent fortement que les propriétés mêmes de l’IgE membranaire sont à

l’origine de la quasi-absence des cellules à BCR IgE in vivo chez l’individu sain. Cette absence

est d’autant plus surprenante que in vitro et sur des cultures à court terme, des taux élevés de

cellules à IgE membranaire (voisin des taux de cellules à IgG1 membranaire) peuvent être induits

en présence d’activateurs B polyclonaux et d’IL4.

L’idée que l’expression d’un BCR IgE ne soit possible que de façon transitoire et puisse aboutir à

une différenciation plasmocytaire mais non à une différenciation B mémoire cadre donc bien

avec les observations faites chez l’homme comme chez la souris, et place l’IgE membranaire

dans le rôle d’une molécule auto-régulatrice de la réponse IgE.

Un certain nombre d’expériences restent en cours pour compléter cet article en préparation,

avec en particulier :

- la détermination de la voie d’apoptose en cause dans les transfectants (en particulier en

vérifiant sa sensibilité aux inhibiteurs des caspases)

114

- la décontamination de la lignée εKI par transfert d’embryons afin de pouvoir élever des

animaux homozygotes de façon stable (alors qu’ils meurent actuellement très vite du fait

de déficit immunitaire)

- le croisement des animaux dans un fond p53-/-, pour tester la possibilité de lever ainsi le

blocage de différenciation précoce

- l’établissement de lignées d’animaux transgéniques porteuses de « la construction ε

réarrangée » déjà utilisée pour transfecter la lignée A20.

Le résultat attendu de ces deux expériences serait l’obtention de deux types de lignées : celles

ayant réussi à bloquer l’expression du transgène et possédant donc un système immunitaire

normal, et celles exprimant fortement le transgène IgE dont nous prédirions qu’il devrait alors

induire une importante attrition de l’ensemble des compartiments B.

Contribution personnelle à ce travail :

Ma part de cette étude a été le suivi des animaux εKI depuis le stade F1 et la caractérisation

complète du phénotype, ainsi que la réalisation des constructions utilisées dans la lignée A20,

l’obtention et l’étude des transfectants.

115

Demande de dépôt de brevet

Etablissement et caractérisation d’une lignée de souris transgéniques homozygotes pour la mutation gammaprim

(introduction du gène de chaîne lourde d’immunoglobuline γ1 humaine au sein du locus

IgH murin) Inventeurs : Michel Cogné, Sophie Raynal-Duchez, Eric Pinaud, Nadine Cogné.

Une partie de mon travail de recherche a été la mise au point d’une lignée de souris portant un

BCR modifié codant une chaîne lourde γ1 humaine (criblage des clones ES, suivi des animaux

chimériques puis F1, caractérisation phénotypique complète). Un gène Cγ1 humain a été intégré par

recombinaison homologue au niveau de la région switch µ du locus IgH endogène. L’obtention de

cette lignée présente un intérêt biotechnologique en permettant de produire des IgG1 humanisées

monoclonales chez la souris, la souris étant un modèle idéal pour la production ultérieure

d’hybridomes (Linenberger et al., 2002). L’avantage de ces souris « modifiées » réside dans la

conservation de leur répertoire B, et de leur capacité à générer des réponses spécifiques de forte

affinité vis-à-vis d’antigènes choisis. Les souris « IgG1 » permettront de produire des anticorps

monoclonaux humanisés de classe IgG1 dont les applications seront multiples : par exemple dans le

domaine des bioréactifs (réactifs de diagnostic) et surtout dans des applications thérapeutiques et

pharmacologiques (synthèse d’anticorps thérapeutiques destinés à la prévention et au traitement de

maladies infectieuses, de cancers). Les anticorps humanisés présentant une très bonne tolérance chez

l’homme constituent à l’heure actuelle une voie thérapeutique en plein essor.

Même s’il existe d’autres voies pour produire des IgG1 humaines actuellement (humanisation

in vitro de monoclonaux murins, utilisation de la « xenomouse »), l’un des intérêts majeurs de notre

modèle réside dans la possibilité d’obtenir d’emblée, dès le stade hybridome, des anticorps dont la

chaîne lourde est une chaîne γ1 humaine. Ils permettent donc, devant un pool d’anticorps, de choisir

d’emblée celui qui est le plus efficace dans les tests (alors que lors d’une humanisation in vitro,

prévoir si un anticorps donné restera actif ou sera le plus actif d’un groupe, relève de la divination… )

B Cell Design, start-up en cours de création, rattachée au laboratoire, valorise déjà la lignée

de souris productrices d’IgA monoclonales humanisées (Cogné M. et al., 2003) et se propose de

valoriser cette lignée de souris transgéniques IgG1.

116

Ma contribution personnelle à ce travail :

Ma contribution à ce travail a été la transfection de la construction γ1 KI dans les cellules ES, le

criblage des clones positifs et le phénotypage complet des animaux.

L’aspect biotechnologique mis de côté, il est intéressant de regarder le phénotype de ces souris

sous l’aspect immunologique fondamental. Bien que la question de la capacité d’un BCR IgG à

se substituer à un BCR IgM lors du développement B ait déjà été posée par plusieurs équipes

décrivant des souris transgéniques ou knock-in… elle reste en suspens… Il y a quelques années,

les travaux de Tsubata et Goodnow avaient démontré une fonction hyper-activatrice du BCR IgG,

avec hyperplasmocytose accompagnée d’un fort taux d’IgG sérique, suggérant la notion d’un

BCR IgG « effecteur ». Il avait alors été démontré que ce BCR IgG transgénique n’était pas

sensible à la régulation négative de CD22 via la phosphatase SHP-1… mais ces données viennent

d’être contestées par Waisman et al., début 2007, n’identifiant ni hyper-différenciation

plasmocytaire, ni indépendance par rapport à CD22 dans des cellules B « knock-in pour l’IgG1

murine » qui cette fois sont, en plus, capables de construire un vrai répertoire B diversifié car les

autres modèles étaient des modèles transgéniques utilisant un VDJ déjà réarrangé. Il faut

cependant noter que le modèle de Waisman est biaisé car le gène γ1 utilisé est délété de son site

de polyadénylation « de type sécrété… »… on peut donc imaginer que cette délétion est assez

indigeste pour des cellules voulant se différencier en plasmocytes !!!. Les travaux d’Horikawa

(2007) vont cependant dans le même sens que ceux de Waisman alors que la mutation qu’ils

étudient, ne s’accompagne pas d’une délétion du site polyA de type sécrété. Dans leur modèle, il

s’agit d’un simple remplacement de la partie trans-membranaire et intracellulaire de l’IgM par

celle d’une IgG1 dans un modèle de transgène anti-lysozyme. On peut cependant noter que ce

modèle présente un autre biais : celui de présumer que la spécificité de signal d’une IgG par

rapport à une IgM se résume au rôle de sa queue intra-cellulaire (dans notre modèle, nous avons

l’avantage de travailler avec une chaîne γ1 complète !). Même s’il n’est pas inducteur de

plasmocytose et s’il est soumis à l’inhibition par CD22, le BCR IgG1 pour Waisman et Horikawa

apparaît plus activateur qu’une IgM (en matière de flux calciques) et pouvant lui être substitué

précocément pendant la différenciation des progéniteurs B dans la moelle osseuse mais avec un

ralentissement de la transition proB vers pré-B.

Le modèle KI IgG1 humaine que nous avons décrit dans cette thèse, avec une application

potentiellement plutôt biotechnologique, est encore partiellement étudié et nécessite des

explorations poussées pour qu’on puisse l’opposer aux précédents et comprendre de quels

117

mécanismes relèvent les différences observées. Quoi qu’il en soit, ce modèle manifeste

clairement une hyper-différenciation plasmocytaire attestée par un ratio d’expression Blimp-1 (ou

Xbp-1) / CD79a d’environ 30 dans la rate des animaux homozygotes pour la mutation, et de 75

dans les ganglions drainants et pouvant atteindre des records de 130 après immunisation des

souris. Par ailleurs, un blocage sévère de la maturation B à la transition pro-B/pre-B est observé

mais malgré l’absence d’expression d’IgM/d’IgD, un compartiment B périphérique reste capable

de se différencier chez ces animaux et représente environ 6% des splenocytes totaux. Ces B

peuvent donc être activés après rencontre avec un antigène et être à l’origine d’une réponse

spécifique. Comme pour les souris αKI, on remarque la présence d’anticorps murins endogènes

d’isotypes variés dans le sérum, indiquant que les B IgG1 peuvent subir la commutation de classe

en l’absence de Sµ.

Les différences notables entre les deux lignées γ1KI (Waisman et la nôtre) restent 1) à

notre désavantage, l’utilisation dans notre cas d’une région constante humaine qui peut donc

compliquer la réflexion même si on sait que les régions transmembranaires et cytoplasmiques

IgG murines et humaines sont fortement homologues… (Figure n°24, chapitre IV) et 2) à notre

avantage, l’utilisation d’un gène complet capable de participer à une différenciation

plasmocytaire. En réponse aux doutes que peut susciter le point 1), il est en tout cas frappant de

retrouver dans notre modèle l’hyper-différenciation plasmocytaire d’abord décrite avec des

transgéniques γ1 murine.

Il est à noter que les double-hétérozygotes α/γ, issues de croisement entre souris γ1KI et

αKI, après immunisation antigénique présentent une réponse spécifique IgG1 et IgA à des taux

élevés. La réponse IgA est identique à celle obtenue dans des souris homozygotes αKI mais on

obtient après immunisation une meilleure réponse IgG1 spécifique des souris α/γ par rapport aux

souris homozygotes γ1KI.

De plus amples manipulations doivent donc être réalisées pour comprendre les différences

de phénotypes dans les différents modèles de transgenèse et de knock-in IgG1 mais également

comprendre pourquoi les doubles hétérozygotes α/γ répondent mieux à une stimulation

antigénique que les simples homozygotes γ1… ( la capacité de ces cellules, non seulement à se

différencier, mais aussi à présenter l’antigène aux cellules T et à bénéficier alors de leur aide est

sans doute à cet égard un point qui méritera une attention particulière).

118

119

Etablissement et caractérisation d’une lignée de souris transgéniques homozygotes pour la mutation gammaprim

(introduction du gène de chaîne lourde d’immunoglobuline γ1 humaine au sein du locus

IgH murin)

A. METHODOLOGIE POUR L’OBTENTION DES ANIMAUX MUTANTS ET LEUR

CARACTERISATION

1) Construction du vecteur de ciblage de la recombinaison homologue

Les constructions plasmidiques ont été réalisées à partir du plasmide bluescript SK (pSK)

(Stratagene, LaJolla, CA, USA) et de la souche bactérienne E. coli TG1 (Stratagene, LaJolla,

CA, USA), en utilisant les protocoles classiques de préparation, de clonage et d’analyse de

l’ADN tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M.

AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA).

Le vecteur de recombinaison homologue ou vecteur de ciblage dérivé de pSK, dénommé p-

gamma1KI, comprend : i) un fragment de 6860 pb du gène d’immunoglobuline gamma 1 humain

incluant plusieurs exons codant pour les domaines constants CH1, hinge, CH2 et CH3 et les

exons dits « de membrane » (m1 et m2) de la chaîne lourde d’immunoglobuline γ1 ii) une

cassette néo (fragment de 1,6 kb), iii) des séquences flanquantes homologues à une portion du

locus murin des chaînes lourdes d’immunoglobulines, avec en amont un fragment d’environ 5 kb

correspondant à la région JH-Eµ (fragment DQ 52/JH) en aval d’un autre fragment d’environ 5

kb correspondant au gène Cµ (fragment Cµ).

De manière plus précise, les différents fragments ont été insérés dans le plasmide

bluescript SK, selon les étapes suivantes :

- Dans une première étape, le fragment Cµ a été cloné au site Xho1 de pSK pour donner le

plasmide pA.

- Dans une seconde étape, le fragment DQ 52/JH a été cloné en 5’ du fragment Cµ dans le

plasmide B, aux sites EcoRV- Cla I, pour donner le plasmide pB.

- Dans une troisième étape, une cassette néo a été insérée au site Sal1 entre DQ52/JH et Cµ, pour

donner le plasmide pC.

- Enfin, dans une dernière étape, le fragment Cγ1 de 6860 pb flanqué d’adaptateurs Cla1 et

contenant le gène gamma 1 humain a été inséré entre le fragment JH et la cassette néo au site Cla

I du plasmide pC pour donner le vecteur de ciblage dénommé p-gamma1KI.

120

Les amorces utilisées pour amplifier le gène Cγ1 humain sont :

• Gam1 CH1-5’F : 5’ CAATCGATGCCCGTGAGCCCAGACGAGCCCAGAC 3’

• Gam1 CH1-3’R ; 5’ GCTTCCAGCAGAGACACCCT 3’

• Gam1 CH2-5’F : 5’ CAGCTCGGACACCTTCTC 3’

• Gam1 CH2-3’R : 5’CCGGCCTCTGTCCATGTG 3’

• Gam1 CH3-5’F : 5’CACATGGACAGAGGCCGG 3’

• Gam1 CH3-3’R : 5’ CTGACCCGTGGAAAGAAC 3’

• Gam1 mbexon-5’F : 5’AGCTGACCTCAGGACATT 3’

• Gam1 mbexon-3’R : 5’ GCTCCCATCACGAAGTACAA 3’

La séquence de p-gamma1KI a été vérifiée par séquençage automatique et par analyse de

restriction avec les enzymes ClaI et Xho I, confirmant que le vecteur était apte à permettre une

recombinaison homologue telle que schématisée (Figure 1).

Figure 1 : Représentation schématique de l’évènement de recombinaison homologue obtenu.

2) Transfection de cellules ES et injection dans des blastocystes

Les clones de cellules ES ont été isolés, analysés puis injectés dans des blastocystes de

souris C57/Black 6, en utilisant les protocoles classiques de transgénèse et d’analyse de l’ADN

génomique, tels que ceux décrits dans Current Protocols in Molecular Biology (Frederick M.

Targeted mouse IgH locus

Recombinaison homologue

JH Eµ CµDQ52

NEO

loxP loxP

M222 XbaI-EcoRI

EcoRI7,5kbEcoRI EcoRI

Cδ

Construction Igγ1 humain

JH Eµ Sµ CµDQ52

loxP loxP

M222 XbaI-EcoRI

EcoRI EcoRI

Cδ

12kb

Cγ1

Cγ1

NEO

Targeted mouse IgH locus

Recombinaison homologue

JH Eµ CµDQ52

NEO

loxP loxP

M222 XbaI-EcoRIM222 XbaI-EcoRI

EcoRI7,5kbEcoRI EcoRI

Cδ

Construction Igγ1 humain

JH Eµ Sµ CµDQ52

loxP loxP

M222 XbaI-EcoRIM222 XbaI-EcoRI

EcoRI EcoRI

Cδ

12kb

Cγ1

Cγ1

NEO

Locus IgH murin ciblé

121

AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA). De manière plus précise, des

cellules ES ont été transfectées par électroporation de l’ADN de p-gamma1KI linéarisé au site

Not I. Les clones sélectionnés en présence de généticine ont été prélevés et leur ADN digéré par

EcoRI puis analysé par Southern Blot à l’aide d’une sonde radioactive s’hybridant en dehors du

site de recombinaison homologue, en 5’ du gène constant IgH Delta (δ) et de son site EcoR I.

Figure 2 : A. linéarisation du vecteur avant transfection (ND, non digéré ; NotI, linéarisé par l’enzyme

NotI); B. Southern blot d’un clone mutant (1) et de ses sous-clones (3 et 4) par comparaison à un ADN

non muté (2)

La présence d’un allèle recombinant est visualisée par un fragment d’environ 7,5 kb

(représentant le fragment µ murin et la cassette néo) alors que l’allèle sauvage correspond à un

fragment de 12 kb. Dans ces conditions, sur 192 clones analysés, 1 s’est révélé positif (n°153).

La vérification du caryotype n’a montré aucune anomalie chromosomique (aneuploïdie).

Ce clone a été injecté dans des blastocystes de souris C57/Black 6 en utilisant les

protocoles classiques de transgénèse tels que ceux décrits dans Transgenic Mouse: Methods and

Protocols (Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), V. 209.). Un ♂ chimère, présentant un

degré de chimérisme élevé, a été obtenu et mis en accouplemement avec des ♀ C57/Black 6 afin

d’obtenir des animaux hétérozygotes qui ont été analysés par PCR et ELISA. Une lignée de

souris homozygotes pour le locus IgH recombiné, dénommée ci-après lignée gamma 1 knock-in

ou γ1KI, a ensuite été obtenue par croisement des animaux hétérozygotes.

153Sous-clones

12 kb

7,5 kb

153Sous-clones

12 kb

7,5 kb

λ Hind III N.D. Not Iλ Hind III N.D. Not I

1 2 3 4

122

3) Détection du locus IgH recombiné portant le gène Cγ1 humain (allèle gamma 1

knock-in ou γ1KI) et du locus IgH sauvage (allèle µµµµ sauvage) par PCR

L’ADN génomique d’un échantillon de queue d’animaux homozygotes obtenus comme

précisé ci-dessus, a été analysé par PCR à l’aide des deux couples d’amorces suivants :

- couple spécifique du locus IgH murin non muté (allèle µ sauvage) :

- amorce UpstreamSpe I Smu : 5’ GAG TAC CGT TGT CTG GGT CAC 3’

- amorce SacI-3’Imu : 5’ GAG CTC TAT GAT TAT TGG TTA AC 3’

La réaction d’amplification a été réalisée avec une température d’hybridation de 61°C. Cette PCR

amplifie en 30 cycles un fragment de 91 paires de bases-encadrant le site Spe I-spécifique du

locus IgH murin non muté.

- couple spécifique du locus IgH recombiné portant le gène Cγ1 humain (allèle

gamma1 knock-in ou γ1KI ) :

- amorce NeoI : 5’ GCA TGA TCT GGA CGA AGA GCA T 3’

- amorce Neo2 : 5’ TCC CCT CAG AAG AAC TCG TCA A 3’

La réaction d’amplification a été réalisée avec une température d’hybridation de 55°C. Cette PCR

amplifie en 30 cycles un fragment de 120 paires de bases spécifique du locus IgH recombiné

portant le gène Cγ1 humain.

Une lignée de souris homozygotes pour la mutation γ1KI, dénommée ci-après lignée gamma

1 knock-in ou gammaprim a été établie ; les animaux de cette lignée sont systématiquement et

simultanément négatifs en PCR avec les amorces spécifiques de l’allèle µ sauvage et positifs en

PCR avec les amorce spécifiques de l’allèle gamma 1 knock-in.

Figure 3: Southern Blot sur ADN

génomique de queue de souris

WT (piste A)

hétérozygote γ1-KI (piste B)

homozygote γ1-KI (piste C)

homozygote γ1-KI floxé (piste D)

123

4) Dosage du taux des IgG1 sériques totales en néphélométrie et en ELISA

Les IgG1 humaines sériques ont été dosées par néphélométrie sur un automate BNII de la

société Behring en utilisant le kit Behring IgG1 selon les recommandations du fournisseur.

Ces résultats ont été confirmés en ELISA suivant la technique suivante :

- coating de plaques 96 puits (Maxisorb, NUNC) par incubation une nuit à 4° avec un

anticorps non marqué anti-IgG humaine (monoclonal anti-human IgG, Sigma) dilué au

1/1000ème en tampon Carbonate 0,1 M pH 8,3 (100 microlitres/puits)

- 3 lavages en PBS Tween 0,1%

- saturation des plaques en milieu complet {PBS, 3% BSA}(100 microlitres/puits)

- 3 lavages en PBS Tween 0,1%

- distribution des sérums à tester dilués au 1/100ème et au 1/1000 ème en tampon {PBS, 1%

BSA}(100 microlitres/puits)

- incubation 3 heures à 37°C

- 3 lavages en PBS Tween 0,1%

- distribution d’un antisérum anti-IgG humaines marqué à la phosphatase alcaline

(monoclonal anti-human IgG-AP, SIGMA) dilué au 1/1000ème (100 microlitres/puits)

- 3 lavages en PBS Tween 0,1%

- réaction enzymatique de révélation par addition de PNP en tampon TRIS 0,2M (Sigma)

- blocage de la réaction par addition de soude 3N (30 microlitres/puits)

- lecture en spectrométrie à une longueur d’onde d’absortion de 405 nm.

5) Recherche de l’expression d’un récepteur membranaire de la classe des IgG

humaines à la surface des lymphocytes périphériques des animaux mutants

Préparation des cellules lymphoïdes : La rate, organe lymphoïde secondaire, a été choisie pour

cet expérimentation. Cet organe a été prélevé chez différents animaux mutants homozygotes γ1KI

puis dilacéré en tampon VERSENE (Invitrogen), et filtré sur tamis (40 microns) afin d’obtenir

une suspension de cellules individuelles débarrassée des agégats cellulaires. Les cellules

spléniques ont alors été centrifugées et soumises à une étape supplémentaire de choc osmotique

afin d’obtenir la lyse des globules rouges par reprise du culot cellulaire dans 1 ml d’eau distillée.

Les cellules ont ensuite été immédiatement reprises en milieu complet (RPMI + 10% sérum de

veau fœtal), numérées et conservées sur glace.

124

Marquage à l’aide d’anticorps fluorescents :

- 105 cellules ont été incubées pendant 30 minutes à 4° avec une dilution au 1/100ème d’un

anticorps anti-IgM de souris marqué à l’isothiocyanante de fluorescéïne (Southern

Biotechnologies) et un anticorps anti-IgG humain couplé Alexa 633.

- Les cellules ont ensuite été lavées dans 5ml de PBS.

- Le surnageant a été décanté et les cellules ont été reprises dans 100 microlitres de PBS,

0,5% BSA, 0,1 mM EDTA

Analyse en cytofluorimétrie : sur un cytomètre de flux COULTER XL.

6) Immunisation des animaux

Les animaux ont été immunisés une première fois par injection intra-péritonéale de 20

microgrammes d’antigène P24 (protéine de la pepside VIH-1) diluée dans 200 microlitres de

sérum physiologique et mise en émulsion avec 200 microlitres d’adjuvant complet de Freund

(SIGMA)

Toutes les 2 semaines, les animaux ont subi un rappel vaccinal par injection intra-péritonéale de

20 microgrammes d’antigène P24 diluée dans 200 microlitres de sérum physiologique et mise en

émulsion avec 200 microlitres d’adjuvant incomplet de Freund (SIGMA).

7) Dosage des anticorps spécifiques de l’antigène P24

La présence d’anticorps spécifiques de l’antigène P24 a été recherchée par ELISA 2 semaines,

puis 4 semaines après la deuxième injection de l’antigène suivant la technique suivante :

- coating de plaques 96 puits (Maxisorb, NUNC) par incubation une nuit à 4° avec de

l’antigène P24 à la concentration de 1 microgrammes/ml en tampon Carbonate 0,1 M pH

8,3 (100 microlitres/puits)

- 3 lavages en PBS Tween 0,1%

- saturation des plaques en milieu complet {PBS, 3% BSA}(100 microlitres/puits)

- 3 lavages en PBS Tween 0,1%

- distribution des sérums à tester dilés au 1/100ème et au 1/200 ème en tampon {PBS, 1%

BSA}(100 microlitres/puits)

- incubation 3 heures à 37°C

- 3 lavages en PBS Tween 0,1%

125

- distribution d’un antisérum anti-IgG humaines marqué à la phosphatase alcaline

(monoclonal anti-human IgG-AP, SIGMA) dilué au 1/1000ème (100 microlitres/puits)

- 3 lavages en PBS Tween 0,1%

- réaction enzymatique de révélation par addition de PNP en tampon TRIS 0,2M (Sigma)

- blocage de la réaction par addition de soude 3N (30 microlitres/puits)

- lecture en spectrométrie à une longueur d’onde d’absortion de 405 nm.

- Le taux des anticorps IgG anti-P24 a été exprimé en unités arbitraires établies pour la

moyenne des sérums dilués au 1/100ème et 1/200ème en fonction du rapport Densité optique

sérum testé / Densité optique du sérum témoin.

126

B. PHENOTYPE DES ANIMAUX MUTANTS

1. Mise au point de tests PCR spécifiques de l’allèle muté et de l’allèle non muté

Une lignée homozygote pour la mutation γ1-KI a d’abord été établie. Les animaux de cette lignée

sont systématiquement et simultanément négatifs pour les test « PCR allèle µ sauvage » et

positifs pour le test « PCR γ1-KI».

2. Dosage du taux des IgM murines et des IgG « humaines » sériques totales en

néphélométrie et en ELISA

a. Par néphélométrie, les dosages d’IgG1 humaines sériques ont donné des résultats

totalement corrélés avec ceux du génotypage réalisé par les tests PCR :

- les animaux « contrôles « non mutants » ont un taux nul d’immunoglobulines humaines

de classe IgG1

- les animaux homozygotes γ1-KI ont toujours un taux significatif d’IgG1 humaines, ce

taux variant entre 0,5 et 1 g/l dans le sérum. Par contre, les IgM murines sont

indétectables dans le sérum de ces animaux.

b. En ELISA, des résultats très tranchés permettent également de distinguer hétérozygotes

et homozygotes en ELISA avec des variations très franches : valeurs situées à 0,8 g/l d’IgG1

humaines pour les sérums d’homozygotes dilués au 1/500ème ; valeurs nettement plus faibles

(0,03) pour les sérums d’hétérozygotes même à la dilution la plus faible (au 1/100ème). A l’inverse

lorsque les IgM murines sont dosées en ELISA, on observe un taux normal d’IgM murines (de

l’ordre de 1 g/l) chez les souris contrôles « non mutantes » de même que chez les animaux

hétérozygotes pour la mutation gammaprim. Par contre, le taux des IgM murines est nul chez les

animaux homozygotes gammaprim.

3. Recherche de l’expression d’un récepteur membranaire de la classe des IgG

humaines à la surface des lymphocytes B périphériques des animaux mutants

Les animaux homozygotes porteurs de la mutation γ1-KI ont été phénotypés grâce à la cytométrie

en flux, avec des résultats en complet accord avec ceux donnés par le dosage des

immunoglobulines sériques. Chez ces animaux, on ne détecte aucune expression d’IgM murines.

Pourtant en l’absence d’expression d’IgM, un compartiment de cellules B périphériques CD19+

est capable de se différencier et représente 6 % des lymphocytes spléniques. Ces cellules B

127

périphériques expriment pour environ 40 % d’entre elles une immunoglobuline membranaire de

la classe des IgG1 humaines (Figure 4)

Figure 4: Expression membranaire des IgG1 humaines d’un animal de la lignée gammaprim

comparé à un animal contrôle. Les lymphocytes de la rate ont été marqués avec des anticorps

spécifiques de CD19 et d’IgG1. Pour l’analyse en cytométrie, une fenêtre a été établie sur les

lymphocytes CD19+.

4. Réponse immune des animaux mutants à l’inoculation de l’antigène P24

La présence d’anticorps spécifiques de l’antigène P24 a été détectée par ELISA à partir de J26

(après 2 immunisations – 100 AU), et est fortement démontrées à J47 (3 semaines après la

deuxième injection de l’antigène – 450 AU). En comparaison, il a été vérifié qu’en l’absence

d’immunisation des animaux, le taux des anticorps IgG1 anti-P24 détectés restait inférieur à 5

unités.

128

Figure 5: Taux de réponse en IgG1 humaines d’un animal de la lignée gammaprim immunisé par

l’antigène VIH p24. En abscisses, le délai d’observation en jours (les flèches rouges représentent la

première immunisation à J0, puis les rappels); en ordonnées, le taux des anticorps IgG1 en unités

arbitraires (AU).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

0 10 20 30 40 50 60

129

C. CONCLUSION

Ce travail a reposé sur la réalisation et la caractérisation d’une lignée d’animaux chez lesquels la

mutation γ1-KI a été introduite dans le locus IgH murin avec l’espoir que ces animaux

produiraient des immunoglobulines sériques incluant une chaîne lourde humaine gamma1.

L’obtention de mutants homozygotes pour l’insertion γ1 dans le locus IgH permet donc d’obtenir

des souris produisant des lymphocytes B qui n’expriment que la chaîne γ1 humaine à l’exclusion

des chaînes lourdes murines.

Cette lignée « gammaprim », a été caractérisée comme capable de produire des IgG1 humanisées

au niveau de la chaîne lourde et comme capable de produire des anticorps spécifiques après

immunisation. Nous proposons donc de l’utiliser pour la production d’anticorps monoclonaux

humanisés de classe IgG1 qui pourront trouver des applications spécifiques soit en temps que

réactifs, soit en temps que moyen d’immunothérapie (anti-infectieuse ou anti-tumorale), soit

enfin en temps que système de criblage rapide d’anticorps monoclonaux ayant les propriétés

effectrices d’une IgG1 humaines dans des tests d’activité in vitro ou in vivo.

130

131

Deuxième partie : les glycosaminoglycannes

132

133

Article 3

“Modulation of glycotranscriptome and of glycosaminoglycan biogenesis genes

along B cell lineage differentiation”

Sophie Raynal-Duchez, Virginie Pascal, Nadine Cogné, Chantal Jayat-Vignoles, Virginie

Lespinet, Raymond Julien and Michel Cogné.

(Manuscrit en préparation)

Dans une autre perspective d’étude des phénomènes pouvant modifier la réactivité des récepteurs

de surface de la cellule B, nous nous sommes intéressés à la modulation de la glycosylation au

cours de la différenciation B par l’étude des variations de l’expression de gènes impliqués dans la

glycosylation, afin d’être capables par la suite, de différencier des sous-populations B

correspondant à différents états de maturation, d’activation ou de localisation.

Cette étude du glycotranscriptome, nous a notamment permis de cibler puis d’étudier d’une

manière plus approfondie deux gènes d’intérêt CsGalNacT1 et Extl1 jouant tous deux un rôle

dans la biosynthèse des glycosaminoglycannes. Ces deux gènes sont exprimés de façon plus ou

moins souvent inverse dans la maturation B. CsGalNacT1 étant absent aux stades B au repos

mais exprimé aux stades immatures et B activés alors qu’Extl1 n’est quand à lui pas exprimé aux

stades B immatures, alors qu’il est exprimé au stade mature au repos avec une expression qui

diminue aux stades B activés.

Dans le but de discerner si cette régulation d’expression présente un rôle fonctionnel ou pas, nous

avons choisi de la compromettre et de guetter ce que seraient, s’il y en a, les effets de cette

dérégulation. Alors que peu de données sont disponibles quant au rôle de ces enzymes in vivo,

nous avons donc réalisé des lignées de souris transgéniques surexprimant de façon B-spécifique

ces 2 gènes. Lors de l’amplification des ADNc respectifs de CsGalNAcT1 et Extl1 dans le but de

construire les vecteurs de transgenèse, nous avons amplifié une forme courte du transcrit

CsGalNAcT1 issue d’un épissage alternatif que nous appelons CsGalNAcT1∆. Ce transcrit,

encore inconnu, apparaît spécifique à la lignée lymphoïde (il est seulement détecté dans la moëlle

osseuse, la rate, les ganglions et le thymus) et code une protéine tronquée ayant perdu son site

catalytique et pouvant donc jouer le rôle de dominant négatif.

Ces différentes souris transgéniques CsGalNAcT1FL, Extl1 et CsGalNAcT1∆ ont récemment été

réalisées. Deux lignées de souris transgéniques issues de deux clones ES différents pour Extl1 et

134

CsGalNAcT1FL ont été obtenues alors qu’on ne compte, à ce jour, qu’une seule lignée pour

CsGalNAcT1∆. L’analyse très récente de ces animaux (CsGalNAcT1FL et Extl1) sur une seule

lignée montre certaines différences mais ces différentes pistes restent préliminaires et ne

permettent encore pas de conclure quant à l’importance de ce phénotype, sa reproducibilité, et

donc de déterminer les rôles de ces enzymes dans la lignée B.

Cet article, « en gros travaux » mérite beaucoup plus de manipulations à la paillasse afin de

mettre en évidence les rôles précis et incontestables de ces enzymes in vivo au cours de la

maturation B et donc comprendre de façon plus large, le rôle des GAGs le long de la

différenciation B, du stade B immature au stade très mature, plasmocyte-sécréteur d’anticorps.

Contribution personnelle au travail :

Ma contribution à ce travail a été :

1) de réaliser les purifications de cellules, les préparations d’ARN et de cDNA, de créer deux

« micro-fluidic cards » d’intérêt en choissant des gènes impliqués dans la glycosylation, mais

également l’analyse, le traitement et l’interprétation des données de PCR quantitative

2) d’effectuer les clonages et les constructions B-spécifiques permettant la surexpression des

gènes Extl1 et CsGalNAcT1 (FL et ∆)

3) de transfecter ces constructions dans les cellules ES et de cribler les clones positifs

4) de phénotyper les animaux.

135

Perspectives

136

137

L’état des réflexions sur les isotypes du BCR et leur fonction :

Quelqu’en soit l’isotype, la présence d’un BCR à la membrane du lymphocyte B est

indispensable à sa survie (Lam et al., 1997). La signalisation via le BCR ne se limite cependant

pas à la survie mais contrôle au contraire de multiples choix, notamment entre apoptose, anergie,

prolifération et différenciation tout au long de l’ontogénie B.

La description d’une structure univoque du BCR, associant toujours une molécule d’Ig

membranaire à l’hétérodimère Igα/Igβ, complexe de transduction du signal portant des motifs

ITAM au niveau des deux régions cytoplasmiques, pourrait donner à penser que toutes les Ig

membranaires transduisent le même type de signal « limité » à une signalisation α/β lors de leur

pontage par un ligand. Une comparaison des différentes classes de chaînes lourdes entre elles et

au cours de l’évolution, suggère cependant que la structure des trois domaines (extra-cellulaire /

transmembranaire et intra-cellulaire) de l’Ig elle-même, pourrait moduler cette signalisation. La

question du rôle spécifique des isotypes commutés du BCR reste imparfaitement résolue. C’est

une question importante car l’idée d’un rôle spécialement « affecteur » de l’IgM dans la mise en

place et la sélection initiale du répertoire (où à la fois des signaux positifs et négatifs sont

nécessaires) cadre bien avec la physiologie des cellules immatures, alors que l’idée d’un caractère

plus spécialement « effecteur » des BCR commutés apparaît comme une explication spécialement

séduisante de la dualité entre des réponses humorales primaires, basales et des réponses

secondaires, explosives aboutissant à la génération rapide de cellules sécrétrices d’anticorps de

haute affinité (Manser, 2002). De nombreuses questions méritent cependant clairement d’être

explorées plus avant.

La question du BCR « IgE » est à part, du fait de l’implication des IgE dans une

pathologie très fréquente et parfois gravissime, l’anaphylaxie. Capables de susciter de fortes

réactions immunitaires alors même qu’elles peuvent n’être présentes qu’à des concentrations

inférieures au ng/ml, les IgE spécifiques se doivent d’être contrôlées d’une façon particulièrement

stringente et aucune explication claire ne justifie à ce jour que des cellules facilement

différentiables et identifiables in vitro en présence d’IL4 (Coffman et al., 1993), ne soient par

contraste virtuellement indétectables in vivo. La nature et la localisation des cellules-mémoire à

IgE restent ainsi obscures, alors même que leur existence est indirectement attestée par la

permanence des IgE spécifiques d’allergènes dans le sérum des patients parfois même plusieurs

dizaines années après un contact sensibilisant.

138

En ce qui concerne le BCR IgE, un nombre relativement limité d’études a été publié jusqu’ici,

avec une cohérence imparfaite. Une première étude de transfectants associant la région constante

Cε à un domaine variable défini (sans tester un répertoire) a montré une fonction de l’IgE

similaire mais moins forte que celle de l’IgM dans la lignée immature WEHI-231 : en

l’occurrence une fonction pro-apoptotique en cas de pontage du BCR comme on peut l’attendre

dans une lignée pré-B ! (Batista et al., 1996). Dans une autre étude, le BCR IgE s’est révélé au

contraire (comme l’IgG) insensible à l’inhibition par CD22 et pourrait donc être ainsi considéré

de façon simpliste, comme « hyperactivateur » (Sato et al., 2007). Enfin, des constructions basées

sur des ADNc ε transfectés dans la lignée A20 en association à un seul type de domaine variable

(donc induisant un biais V potentiel) ont suggéré que la forme majeure de l’IgE membranaire

humaine (à espaceur extracellulaire long) était modérement apoptotique en cas de pontage du

BCR, alors que l’isoforme membranaire mineure (à espaceur extracellulaire court) l’était plus

nettement (Poggianella et al,. 2006). Nos résultats avec un fragment génomique entier libre de

s’épisser naturellement vont au-delà puisqu’ils révèlent un signal tonique pro-apoptotique en

l’absence même de pontage du BCR.

Même si de plus amples démonstrations sont nécessaires, l’idée qui ressort de nos travaux, dans

le contexte de la littérature précédente, est que l’IgE membranaire est plutôt inductrice de

différenciation plasmocytaire que de différenciation B mémoire, ce qui cadre bien avec le fait

qu’on ne retrouve les cellules productrices d’IgE qu’en dehors des centres germinatifs

(notamment chez des souris hyper-IgE), là où se localisent normalement les plasmocytes

récemment différenciés (Erazo et al., 2007). Nous pensons donc que l’expression d’un BCR IgE

est une étape transitoire nécessaire à la différenciation des plasmocytes à IgE (qui pourront

constituer la mémoire des réponses anti-infectieuses IgE comme la mémoire de l’anaphylaxie),

mais qu’il s’agit d’une étape forcément brève, l’IgE membranaire condamnant les cellules qui

l’expriment à un suicide rapide. Nos résultats seraient alors en accord avec ceux d’Eraso qui

identifient dans le compartiment mémoire, non pas des B à IgE membranaires, mais plutôt des B

à IgM ou IgG1 membranaire comme capables de participer à des réponses secondaires (sans

préjuger de l’existence de plasmocytes à longue durée de vie). Clairement, beaucoup est encore à

attendre de l’exploitation d’autres modèles transgéniques dans une situation où les cellules

primaires à IgE sont sans doute trop peu abondantes pour se prêter à une analyse in vivo chez

l’homme ou la souris sauvage.

Bien que largement plus explorée par de nombreux articles décrivant des souris transgéniques ou

knock-in, la question de fonction spécifique du BCR IgG n’est pas clarifiée. Les travaux des

139

équipes de Tsubata et Goodnow avaient, il y a quelques années, fait accepter l’idée d’une

fonction hyper-activatrice du BCR IgG, clairement hyper-stimulatrice de la différenciation

plasmocytaire et hors du contrôle de CD22 /SHP-1… (mais là encore, dans des modèles biaisés

par l’utilisation d’un V unique et non pas d’un répertoire diversifié). Ce modèle séduisant vient

de s’écrouler au début de l’année 2007 avec les travaux de Waisman n’identifiant ni hyper-

différenciation plasmocytaire, ni indépendance par rapport à CD22 dans des cellules B « knock-

in pour l’IgG1 murine » et cette fois capables de construire un vrai répertoire B. Le rôle de l’IgG1

dans ces travaux apparaît en fait comme quasi-identique à celui d’une IgM et pouvant lui être

substitué précocément pendant la différenciation des progéniteurs B dans la moelle osseuse. Le

modèle knock-in IgG1 humaine que nous avons décrit dans cette thèse avec une application

potentiellement plutôt biotechnologique est encore compris de façon trop préliminaire pour qu’on

puisse l’opposer aux précédents, mais il manifeste clairement une hyper-différenciation

plasmocytaire attestée par la surexpression de Blimp1 et Xbp1 et un blocage précoce de

maturation à la transition pro-B/pre-B.

Les points qui compliquent la réflexion peuvent être l’utilisation d’une région constante humaine

dans notre cas (même si elle est hautement similaire à son homologue murine dans la région

transmembranaire et intracellulaire)… on peut ainsi s’interroger quant à la bonne association de

la chaîne lourde humaine avec les chaînes légères ou pseudo-légères murines et quant au risque

d’une conformation anormale du récepteur en résultant et perturbant la signalisation en aval ?? la

question du ligand ou des ligands du préBCR reste également posée : une mauvaise association

avec la pseudo-chaîne légère pourrait empêcher l’association avec un ligand (galectine, HSPG…)

tandis que la présence prématurée d’un isotype commuté possédant un long domaine

cytoplasmique pourrait moduler les interactions avec des partenaires intra-cellulaires à préciser.

Par delà d’hypothétiques barrières d’espèces, il est cependant frappant de retrouver dans notre

modèle l’hyperdifférenciation plasmocytaire d’abord décrite avec des transgènes γ1 d’origine

murine. La diversité des phénotypes des multiples lignées transgéniques γ publiées laisse

finalement perplexe puisque certaines lignées réalisent l’exclusion allélique, d’autres pas… leur

niveau d’expression variable comme leur lien avec une seule région V peuvent être à l’origine de

biais incontournables. Enfin, il ne faut sans doute pas sous-estimer le rôle que peuvent jouer les

domaines extracellulaires CH1 à CH3/CH4 du BCR dans sa fonction en tant que récepteur de

membrane. Les travaux qui ont précédemment cherché à apprécier les différences de signalisation

intracellulaire d’IgM et d’IgG simplement en greffant à une IgM la région intracellulaire d’une

IgG ne reflètent sans doute pas la fonction d’un vrai BCR IgG complet (la différence observée à

140

cet égard, entre les formes des mIgE à espaceur extracellulaire court ou long sont

particulièrement illustratives de ce niveau supplémentaire de complexité du récepteur). De plus, il

a été démontré que les simples KO λ5, VpréB1, le double KO VpréB1/VpréB2 et le triple KO λ5/

VpréB1/VpréB2 montraient un blocage au stade préBI-préBII donc les domaines extracellulaires

jouent bien un rôle important dans la signalisation et donc l’induction de la maturation B

(Martensson et al., 1999; Mundt et al., 2001; Shimizu et al., 2002).

Enfin, la question du BCR IgA constitue un terrain encore plus vierge que celui de l’IgE. Notre

laboratoire avait montré dans le passé que les IgA membranaires humaines et en particulier

l’IgA2, s’associaient moins bien que l’IgM au co-récepteur CD19 dans des expériences de co-

modulation après pontage. Nos travaux sur les souris knock-in IgA vont dans le même sens et ne

révèlent pas de phosphorylation de CD19. Si notre modèle IgA peut souffrir de la même critique

que le modèle IgG parce qu’il est hétérologue, les éléments de réponse à cette objection se

trouvent là-aussi dans la très forte identité de séquences entre l’homme et la souris en ce qui

concerne les régions d’ancrage membranaire et intra-cellulaire de l’IgA. Ce modèle manifeste

ainsi comme notre modèle IgG1, une tendance à l’hyperdifférenciation plasmocytaire et un

blocage de maturation précoce à la transition proB/préB. Ces résultats cadrent assez bien avec ce

que l’on sait de la physiologie normale du système immunitaire humain (et murin) ou les cellules

à mIgM dominent très nettement les cellules à mIgA (que ce soit dans le sang périphérique, la

moelle, mais aussi dans les plaques de Peyer ou les amygdales), mais où pourtant, le taux de

synthèse quotidien de l’IgA soluble est très supérieur à celui de l’IgM soluble (proche pour l’IgA

voire supérieur à celui de l’IgG, tout en aboutissant à des concentrations plasmatiques inférieures

du fait de l’exportation et de la déperdition permanente au niveau des muqueuses et de la demie

vie 5 à 6 fois plus courte dans le milieu interne). Même si ces données sont très difficiles à

quantifier in vivo, il n’est cependant pas choquant pour un histologiste ou un pathologiste de

considérer que les cellules primaires à IgA observées in vivo chez le sujet sain sont plus souvent

des plasmocytes (en particulier muqueux) et que les cellules à IgM sont plus souvent des

lymphocytes à Ig de membrane. Même si les expériences basées sur des transfectants (Sato et al.,

2007) n’ont pas montré pour l’IgA l’indépendance par rapport à l’inhibition que peut médier

CD22 (comme cela a été clamé puis contesté pour mIgG), nous pensons donc que le BCR IgA est

constitutivement hyperactivateur (cf l’activation constitutive de phospho-ERK dans notre

modèle) et promoteur de différenciation plasmocytaire (d’où la facilité de réponses IgA T-

dépendantes comme T-indépendantes).

141

L’ouverture d’un nouveau champ d’étude quant à l’importance des glycosaminoglycannes

dans la physiologie de la lignée B :

Toutes les cellules vivantes portent sur leurs lipides ou leurs protéines un réseau complexe et

dense de glycannes formant ainsi des glycoprotéines ou des lipides. Localisés pour la plupart à la

surface cellulaire, les glycannes jouent un rôle fondamental dans les interactions “cellule-cellule”

et “cellule-matrice extracellulaire”, cruciales pour le développement d’organismes

multicellulaires complexes. Ils se trouvent également dans une position privilégiée pour

l’établissement d’interactions avec différents pathogènes. Ainsi, au cours des dernières décennies,

les chercheurs ont mis en évidence leur importance dans la détermination des groupes sanguins

(Kabat, 1956), leurs rôles dans les interactions cellulaires (Roseman, 1970), leurs implications

dans la fécondation (Jego et al., 1980), dans la différenciation erythrocytaire (Liu et al., 1981),

mais également dans certaines maladies où un défaut dans la machinerie de la N-glycosylation

peut conduire, chez l’Homme, à un syndrome de type CDG (Congenital Disorder of

Glycosylation) (Freeze, 2006)…

Bien que la glycosylation soit un vaste domaine, peu de choses sont encore connues dans

la maturation B. Nous savons par exemple, que les B activés des centres germinatifs deviennent

PNA high, que certaines molécules B-spécifiques, comme par exemple les lectines de la famille

des Siglecs, CD22 et récemment Siglec-G sont connues pour moduler le signal du BCR après

activation, que certains glycosaminoglycannes greffés sur des core-protéiques (syndécan comme

CD138 exprimé à la surface des plasmocytes) ou ancrés à la membrane (glypican) interviennent

dans l’adhésion cellulaire, la migration, que d’autres sont connus pour intervenir dans la

signalisation en jouant un rôle dans l’oligomérisation des récepteurs de surface (TNF R)… Il est

également connu que les différents isotypes d’Ig sont glycosylés (O et/ou N-glycosylation)

permettant ainsi le repliement et l’assemblage correct des Ig, améliorant leur transport intra-

cellulaire et les protègeant de la dégradation intracellulaire (pour revue : Wall et Kuehl, 1983).

Par des expériences d’inhibition de la glycosylation, il a été montré que la glycosylation n’était

pas nécessaire pour l’expression des Ig à la membrane des cellules B mais qu’elle était

obligatoire pour la sécrétion par les plasmocytes de certains isotypes. De plus, il est maintenant

clairement établi que les sucres présents dans la région Fc des Ig participent directement à

certaines fonctions effectrices des anticorps comme la fixation du complément, l’ADCC ou les

interactions avec les récepteurs Fc. Des anomalies de glycosylation des Ig sont également

associées à certaines pathologies telles que la polyarthrite rhumatoïde ou certaines néphropathies

142

(néphropathies à IgA, amylose AL, syndrome de Randall) (Allen et al., 1999; Preud'homme et al.,

1994; Stevens, 2000).

Dans une perspective d’étude des phénomènes pouvant modifier la réactivité des

récepteurs de surface de la cellule B, nous nous sommes intéressés à la modulation de la

glycosylation au cours de la différenciation B par l’étude des variations de l’expression de

certains gènes ciblés, impliqués dans la glycosylation, afin d’être capables par la suite, de

différencier des sous-populations B correspondant à différents états de maturation, d’activation

ou de localisation. Cette étude du glycotranscriptome au cours de la maturation B, nous a

notamment permis de cibler puis d’étudier d’une manière plus approfondie deux gènes d’intérêt

CsGalNacT1 et Extl1 jouant tous deux un rôle dans la biosynthèse des glycosaminoglycannes et

étant exprimés différemment au cours de l’ontogénie B. Dans le but de discerner si cette

régulation d’expression présente un rôle fonctionnel ou pas, nous avons choisi de la

compromettre et de regarder les effets éventuels de cette dérégulation en réalisant des lignées de

souris transgéniques qui surexpriment de façon B-spécifique ces 2 gènes. Ces résultats encore

très préliminaires nous montrent certaines pistes d’intérêts mais demandent de plus amples

manipulations. Nous nous attendons à ce que la surexpression des enzymes intervenant

directement dans la biosynthèse des GAGs (que ce soit CsGalNAct1 et Extl1) au cours de la

maturation B induise une plus forte expression de GAGs à la surface des cellules. L’identification

des glycoprotéines porteuses de ces GAGs et de leurs fonctions serait alors l’objectif majeur

suivant. Au moins en théorie, un accroissement d’expression des GAGs à la surface de nos

cellules pourrait avoir des conséquences sur la signalisation/l’oligomérisation de certains

récepteurs induisant une signalisation trop forte ou au contraire masquant des sites d’interactions

avec différents ligands. Les GAGs étant connus pour être des éponges à facteurs de croissance et

chimiokines, le fait de moduler leur présence pourrait avoir un impact sur la concentration de ces

différents facteurs au voisinage des cellules et donc avoir un impact sur la signalisation, les

interactions cellulaires… que les GAGs soient membranaires ou sécrétés. Il est déjà connu que

les GAGs joueraient un rôle dans la différenciation B précoce. Des HSPGs sécrétés par les

cellules stromales ont été mis en évidence en tant que potentiels ligands du pré-BCR chez la

souris (Bradl et al., 2003) mais une seule étude a cependant été réalisée et reste sans suite à ce

jour.

La caractérisation des patrons d’expression du « glycotranscriptome B » correspondant

aux différents états d’activation, de localisation ou de maturation B a non seulement un intérêt

fondamental, mais aussi « valorisable ». Ainsi, dans le cadre d’une collaboration avec le groupe

143

« Lymphomagenèse » dirigé par le professeur J. Feuillard au sein de notre UMR CNRS, nous

essayons de déterminer selon les patrons d’expression de différentes sous-populations B humaines,

quels sont les équivalents normaux de différents types de lymphomes B (folliculaires, LLC,

plasmocytomes) dans la perspective de mettre au point des outils diagnostiques, pronostiques et de

suivi thérapeutique. Pour l’instant une sélection de 27 gènes dont les produits auraient un rôle dans

l’établissement du microenvironnement cellulaire ont été identifiés et permettent de séparer ces trois

types de proliférations (extrèmement différentes et déjà très étudiées mais intéressantes ici pour

valider le pouvoir discriminant du glycotranscriptome). Ces différents patrons d’expression B

normaux peuvent également servir de comparaison à d’autres pathologies de l’immunité B comme la

maladie de Berger qui est une néphropathie à dépôt d’IgA (où les IgA seraient volontiers

hyposialylées et hypogalactosylées).

144

145

Annexes

146

147

Article 4

“RNA surveillance down-regulates expression of nonfunctional κ alleles and

detects premature termination within the last κ exon”

Laurent Delpy, Christophe Sirac, Emmanuelle magnoux, Sophie Raynal-Duchez and Michel

Cogné.

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0305586101

(Manuscrit accepté le 22 Mars 2004 à Proceedings of the National Academy of Sciences, USA)

La recombinaison V(D)J peut induire l’addition ou la délétion de nucléotides de façon aléatoire.

Dans certains cas, ces réarrangements génèrent un décalage du cadre de lecture pouvant induire la

présence de codons stop prématurés (PTC pour Premature Termination Codon) et par

conséquence, la possibilité de produire une chaîne d’immunoglobuline tronquée. Bien qu’une

forte proportion de lymphocytes matures périphériques possède un allèle non fonctionnel aux loci

IgH et/ou IgL, l’expression de chaînes tronquées n’est pas observée dans les cellules B normales.

Laurent Delpy et Christophe Sirac ont voulu montré que les transcrits de chaînes légères κ

possédant des décalages du cadre de lecture provoqués par les recombinaisons V-J (et induisant

ainsi des mutations non-sens) étaient sujets à un processus de surveillance des ARN pouvant

engendrer leur élimination ou l’inhibition de leur épissage et ainsi, permettre le maintien de

l’exclusion allélique des chaînes légères dans des cellules possédant deux allèles réarrangés dont

l’un « hors-phase ».

Contribution personnelle à ce travail :

Ce travail, initié lors de mon stage de maîtrise et achevé au début de ma première année de thèse

a consisté en l’amplification par PCR des jonctions Vκ-Jκ, leur clonage dans des vecteurs PCRII-

TOPO puis le séquençage et l’analyse de ces différents produits de PCR.

148

149

Article 5

“Light chain inclusion permits terminal B cell differentiation and does not

necessarily result in autoreactivity”

Christophe Sirac, Claire Carrion*, Sophie Raynal-Duchez*, Isabelle Comte and Michel Cogné.

(* contribution égale)

www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0509121103

(Manuscrit accepté le 23 Mars 2006 à Proceedings of the National Academy of Sciences, USA)

Lors du développement des cellules B, l’assemblage du BCR se fait normalement selon un

processus ordonné de réarrangement (détaillé dans le chapitre II) aboutissant à ce que chaque

cellule B ne possède qu’un seul type de récepteur à sa surface grâce au phénomène d’exclusion

allélique, essentiel dans la génération du répertoire B. Cependant, plusieurs travaux ont démontré

l’existence d’un faible taux de cellules B périphériques exprimant deux chaînes lourdes distinctes

(Barreto et Cumano, 2000) ou, plus fréquemment, deux chaînes légères, une κ et une λ (Giachino

et coll., 1995). Dans ce travail, nous avons étudié les effets de l’insertion génique d’un gène VκJκ

humain réarrangé en lieu et place des domaines Jκ du locus endogène de la souris. Cette étude a

démontré l’apparition de cellules « inclues » dans les animaux hétérozygotes et homozygotes

pour le transgène, c’est-à-dire exprimant une chaîne légère λ endogène et la chaîne chimérique κ.

Ces cellules participent normalement aux réponses immunitaires et peuvent se différencier en

cellules B mémoires commutées ou en plasmocytes sécréteurs d’anticorps hybrides κ et λ non-

autoréactifs. Cela indique que l’exclusion allélique des chaînes légères n’est pas un pré-requis au

développement de cellules B normales et que la sélection négative des BCR auto-réactifs peut

s’effectuer même sous des conditions d’inclusion.

Contribution personnelle à ce travail :

J’ai essentiellement participé à cette étude lors des révisions demandées pour l’acceptation de ce

papier alors que Christophe avait quitté le laboratoire pour son stage post-doctoral. Mon travail a

en particulier consisté en la mise au point de RT-PCR Quantitative–sybrGreen sur des

échantillons d’ARN de cellules B matures que j’ai préalablement triées afin de quantifier

l’expression des transcrits κ et µ dans les souris hétérozygotes et homozygotes pour la mutation.

150

151

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180

RESUME

La capacité des lymphocytes à répondre de manière spécifique à un grand nombre

d’antigènes étrangers, est le résultat d’un processus de différenciation à l’issue duquel chaque

lymphocyte exprime un récepteur unique à l’antigène. Une longue série de processus d’activation

et de coopération cellulaire faisant intervenir de nombreuses protéines glycosylées ou pas, est

nécessaire avant d’aboutir à la sécrétion d’un anticorps spécifique par une cellule de la lignée

lymphoïde B. Cette réponse présuppose l’expression à la surface cellulaire d’une forme

membranaire de l’immunoglobuline au sein du récepteur des cellules B pour l’antigène (BCR),

dont la spécificité est définie pour chaque clone B.

Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la fonction même du BCR et notamment du

BCR commuté vers IgA et IgE afin de savoir si une chaîne lourde α ou ε était capable de jouer un

rôle similaire à celui d’une chaîne lourde µ et de promouvoir au sein du récepteur B (soit de

classe IgA soit de classe IgE) le développement des cellules jusqu’au stade final du plasmocyte

sécréteur d’anticorps. Pour cela, nous avons réalisé plusieurs modèles de knock-in portant des

BCR modifiés où le gène Cα1 humain dans un cas et Cε humain dans un autre, ont été intégrés

par recombinaison homologue au niveau de la région switch µ afin d’obtenir une lignée de souris

transgéniques n’exprimant que des IgA ou des IgE.

Dans une autre perspective d’étude des phénomènes pouvant modifier la réactivité des

récepteurs de surface de la cellule B, nous nous sommes intéressés à la modulation au cours de la

différenciation B des phénomènes de glycosylation, ceux-ci constituant les éléments majeurs de

maturation post-traductionnelle des protéines et des lipides. Après une première étude

glycotranscriptomique, mettant en valeur l’expression de deux gènes distincts tous deux

impliqués dans la biosynthèse des glycosaminoglycannes, CsGalNacT1 et Extl1, nous avons

voulu étudier d’une manière plus approfondie le rôle de ces enzymes in vivo au cours du

développement B en réalisant des lignées de souris transgéniques surexprimant de façon B-

spécifique ces deux gènes d’intérêt.