Méthodes d’étude en Biochimie

1ère partie:

Les méthodes spectrométriques

Les méthodes spectrométriques

Ensemble de techniques utilisant les propriétés spectrales de la lumière pour effectuer des études qualitatives et quantitatives des molécules dans différents milieux.

Notions fondamentales 1- Propriétés de la lumière a- Nature ondulatoire de la lumière: • la lumière peut être définie du point de vue physique comme un

déplacement transversal d’ondes électromagnétiques qui ne nécessite aucun matériel pour se propager.

• Les ondes électromagnétiques sont caractérisées par les grandeurs suivantes:

La longueur d’onde (λ): distance qui sépare 2 ondes exprimée en nm Le nombre d’ondes: nombre d’ondes par centimètre (1/ λcm) La fréquence (ʋ): nombre d’ondes par une unité de temps. Une oscillation par seconde est égale à 1Hz. T: temps d’une onde en seconde T=1/ʋ La vitesse de la lumière C= 3x 1010 cm/s C= λ / T C = λ.ʋ ʋ = C/λ E → champ électrique.

M →champ magnétique λ →longueur d’onde du rayonnement

b-nature corpusculaire de la lumière : • la lumière est constituée de photons(quanta lumineux), chaque

photon possède sa propre énergie E . La relation entre l’énergie E du photon et la fréquence ʋ est donnée par l’équation de Planck :

E= h . ʋ h: est le constante de Planck (h =6,63.10-34 Joules. Seconde, J.s) • sachant que ʋ = c/ λ. E= h .c/λ « L’énergie du photon est inversement proportionnelle à la longueur d’onde de la radiation lumineuse» • La radiation à la longueur d’onde la plus courte (λ faible) est

celle qui possède le plus d’énergie (E grand) • Les rayons ultraviolets (UV) à faibles longueurs d’ondes sont plus

énergétiques que les rayons infrarouges (IR) à longueurs d’ondes plus élevées.

• En fait, les deux définitions se chevauchent:

• Lumière = onde électromagnétique caractérisée par sa fréquence qui est reliée à son énergie par la relation de Planck

Différents domaines des ondes électromagnétiques :

La lumière visible ne représente qu’une petite partie des ondes électromagnétiques.

• En pratique, le spectre électromagnétique est séparé en plusieurs domaines

Les différents domaines spectraux:

• les ondes radio : dont λ est supérieur a 0,1m

• les micro-ondes : λ de l’ordre du cm au mm

• les infrarouges : λ entre le mm et µm

• le domaine visible : entre 400 et 800 nm

• le domaine ultraviolet : entre 400 à 10 nm

• Les rayons X: compris entre 1nm et 1A

Domaines spectraux et applications : • Les méthodes spectrales, ou méthodes d’analyses par

spectrométrie des molécules, reposent sur des interactions entre les molécules et des quanta lumineux (photons) d’énergies différentes.

• Elles seront désignées selon les domaines spectraux utilisés (spectrométrie IR, spectrométrie UV-Visible…)

• Elles mettent eu jeu selon l’énergie, différentes actions sur les molécules :

- Excitations électroniques (énergie élevée).

- Vibrations et rotations moléculaires (énergie faible).

• L’absorption de la lumière UV ou visible (En ↗) par des molécules conduit à l’excitation des électrons π (doubles liaisons) ou n (pairs d’électrons libres).

• L’énergie absorbée conduit au passage des électrons d’un niveau basal E1 à un niveau plus élevé E2. le retour à l’état fondamental est accompagné soit d’une:

libération de l’énergie sous forme de chaleur avec mesure de l’intensité de la lumière résiduelle et enregistrement de ses variation en fonction de la longueur d’onde : cas de la spectrophotométrie d’absorption moléculaire en UV-visible

libération de l’énergie sous forme de chaleur et d’un rayonnement émis par la molécule en réponse a la lumière incidente et constitution d’un « spectre d’émission » mesurable par fluorimétrie

• Les rayonnements IR, ayant une énergie plus faible (En ↘), provoquent des vibrations moléculaires, c'est-à-dire des oscillations mécaniques entre les atomes des molécules. L’étude de ces phénomènes renseigne sur la structure des molécules. C’est la spectrométrie en IR.

Spectrométrie d’absorption moléculaire en UV-Visible

1- Définition :

• Ensembles de techniques physico-chimiques dans lesquelles l’absorption de la lumière par des solutions est utilisée pour l’identification et l’évaluation quantitative de la substance dissoute.

2- Principe physico-chimique La lumière est considérée comme un flux de photons d’énergie

E = hυ

L’absorption de la lumière UV –visible par des molécules conduit à l’excitation des électrons π ou n, passant d’un état fondamental à un état excité.

L’énergie prise à la lumière est égale à la différence d’énergie entre les niveaux électroniques.

Seules les molécules qui contiennent des systèmes chromophores (doubles liaisons ou électrons libres) absorbent dans le proche UV-visible (propriété mise à profit en spectrophotométrie.

Le spectre visible:

La lumière blanche est dite polychromatique car elle est formée de plusieurs domaines de longueurs d’ondes.

Le spectre de la lumière visible s’étend de 380nm à 750nm.

Un prisme en verre ou en quartz décompose la lumière en ses différents constituants colorés.

La lumière qui correspond à un domaine très étroit de longueurs d’ondes est dite monochromatique.

Constituants colorés de la lumière blanche :

• La lumière blanche est dite polychromatique car elle est formée de plusieurs domaines de longueurs d’ondes.

• Le spectre de la lumière visible s’étend de 380nm à 750nm

• À l’aide d’un prisme , on peut décomposer la lumière en ses différents constituants :

Le rouge : 750nm > λ > 650nm

L’orange : 650nm > λ > 595nm

Le jaune : 595nm > λ > 560nm

Le vert : 560nm > λ > 490nm

Le bleu : 490nm > λ > 435nm

Le violet : 435nm > λ > 380nm

Absorption en fonction de la longueur d’onde

• Une substance en solution, éclairée par une lumière blanche absorbe une partie de cette lumière.

• Plusieurs radiations d’énergies différentes sont totalement ou en partie absorbées .

• la solution prend la couleur de la lumière résiduelle complémentaire de la couleur absorbée.

Exemples:

Une solution aqueuse de carotène parait orange car elle absorbe les radiations: violette, bleue et verte (400nm et 500nm). L’œil perçoit le mélange des couleurs des radiations résiduelles: jaune, orange et rouge.

• Pour une mesure spectrophotométrique d’une solution de carotène, on choisira une radiation bleue ou verte.

Autres exemples:

Le glucose dosé par la méthode de Trinder donne une réaction colorée rouge .

La substance obtenue ,un dérivé du amino4 phénazone absorbe donc la lumière bleue- verte:

λ = 505nm

Le phosphore dosé par la méthode au molybdate forme le bleu de molybdène qui absorbe la lumière rouge

λ ≥ 650nm

La mesure de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline utilise le paranitrophenylphosphate comme substrat. Le paranitrophénol produit, de couleur jaune, absorbe principalement la lumière violette à 405nm.

LOI de BEER - LAMBERT

Si un faisceau lumineux monochromatique d’intensité Io traverse une solution d’une substance absorbante de concentration C contenue dans une cuve de 1cm de trajet optique L, le faisceau lumineux I transmis subit une diminution exponentielle en fonction de C et de L.

I = Io . e – εCL

c’est la loi de Beer-Lambert

C= concentration en mole/l ou en g/l

L= trajet optique en cm

ελ = coefficient spécifique de la substance pour une longueur d’onde donnée.

nommé:

coefficient d’absorption molaire si la concentration est en mole/l

coefficient d’absorption spécifique si la concentration est en g/l.

Conditions d’applications de la loi de BEER-LAMBERT:

Loi est applicable si:

La lumière est monochromatique

le milieu est limpide (éviter la diffusion de la lumière par des particules en suspension)

Le soluté ne réagit pas sous l’action de la lumière

Le pH est constant durant le dosage(éviter les variations des charges électriques des molécules à doser)

La concentration des solutions à doser est faible, de l’ordre du millimole.

Notation en logarithme népérien de la loi de BEER-LAMBERT Notion d’absorbance et de transmittance ou transmission

I=Io. e-εcl I/Io = e-εcl

Ln I/Io = -εcl Ln I o/I = εcl

Ln I o/I = densité optique(D.O) ou absorbance

D.O = ε .c. l La D.O est sans unité I/Io = transmittance ou transmission (T) T est exprimée en pourcentage si le milieu est transparent: I=Io T = 100% si le milieu est opaque: I=0 T= 0%

3- Appareillage:

Les appareils sont appelés des spectrophotomètres: si toute les longueurs

d’ondes proche UV-visible, existent. L’intervalle spectral peut aller de 200 à 1000nm.

Ces appareils sont appelés photomètres ou colorimètres si seules certaines longueurs d’ondes du visibles sont utilisables

A- Sources lumineuses (lampes) • La qualité essentielle d’une source lumineuse est sa stabilité, son énergie

ne doit pas varier au cours d’une mesure.

Il en existe 2 sortes:

Des lampes à solides chauffés : proches des lampes ordinaires, un filament de tungstène est porté à incandescence par un courant électrique.

Lampes à décharge électrique dans les gaz raréfiés: (Lampe à hydrogène ou à deutérium avec ampoule à quartz, Lampe au xénon ….

B- Systèmes de sélection de longueur d’onde ou monochromateurs:

(filtres colorés, prismes, réseaux….)

• Permet de sélectionner la longueur d’onde de la radiation qui va être envoyée sur l’échantillon parmi un mélange complexe de radiations.

• Le pouvoir résolutif de ces monochromateurs sont variés. Ils sont caractérisés par la bande passante ou l’intervalle de longueurs d’ondes sélectionné par le monochromateur.

Transmission

100

50

470 500 570 λ(nm)

caractéristiques d’un monochromateur

bande passante

C- Les cuves: • Elles sont en verre ou en plastique pour les lectures

dans le visible, et en quartz pour les lectures en UV, toutes les cuves ont un trajet optique de 1cm.

• Il y a les cuves ordinaires, les micro-cuves, les cuves circulantes et les cuves à vidange.

• Il faut faire attention aux parois rayées et aux cuves sales. Il faut donc les laver fréquemment avec un détergent ou avec du HCL dilué.

• Il faut utiliser le même type de cuve pour l’échantillon et la référence (étalon).

• Il faut éviter les bulles d’air.

• Il faut fermer la cuve si le solvant est volatile.

D- Les détecteurs : • Ils assurent la transformation du signal lumineux en signal

électrique. – Cellules photoélectriques :

• Certains métaux portés à un potentiel négatif libèrent des électrons sous l’action de la lumière. Cet effet photoélectrique permet la transformation de l’énergie lumineuse en énergie électrique. Cependant, le courant électrique produit est faible, il doit être amplifié.

– Tubes photomultiplicateurs (PM) :

• Le principe de fonctionnement du PM est proche de celui de la cellule photoélectrique auquel a été rajouté un système d’amplification interne.

E- Affichage : • Le galvanomètre permet de mesurer le

courant électrique amplifié. Une digitalisation permet après traitement de l’information dans un convertisseur logarithmique d’obtenir directement le résultat en DO. Pour certains appareils, on peut obtenir les résultats en concentration à l’aide d’un calculateur et d’une imprimante.

4- Applications : Dosage de substrats : suite à une réaction de ce dernier avec un

réactif de nature chimique ou enzymatique: Réaction chimique : un chromogène (substance chimique capable de

donner un produit coloré) va réagir avec le substrat à doser pour donner un complexe coloré qui absorbe à une certaine longueur d’onde (Créatinine/ réactif de Jaffé, Protéines totales/ réactif de Biuret, Albumine/ réactif BCG, Fer/ Ferrozine, BRB/ Diazoréactif….)

Réaction enzymatique : l’analyte à doser sert de substrat à une enzyme qui le transforme (directement ou après une cascade de réactions enzymatiques secondaires) en un produit qui absorbe la lumière UV ou Visible. Ces dosages enzymatiques peuvent se faire en mode cinétique ou en point finale (Glucose/ méthode Glu oxydase ou héxokynase, urée/ méthode uréase, Cholestérol/ Chol estérase, TG/ Tg lipase, AU/ Uricase….)

Dosage des enzymes : par la mesure leur activité catalytique et ceci en suivant, en mode cinétique, la vitesse de disparition du substrat ou l’apparition du produit de l’enzyme, l’un ou l’autre ayant la faculté d’absorber la lumière UV ou Visible (ASAT – ALAT – PAL – GGT – CK – LDH – LIPASE – AMYLASE….)

Spectrométrie des milieux troubles

• Il faut distinguer deux types de méthodes, différentes l’une de l’autres.

• La turbidimétrie qui utilise la mesure de la lumière ayant traversé un milieu trouble dans la même direction que la lumière incidente.

• La néphélométrie qui mesure l’intensité de la lumière diffusée par une suspension. Cette mesure est effectuée à 90 degrés par rapport à la lumière incidente.

Principe des méthodes :

• L’absorption lumineuse des milieux troubles obéit à la loi de Rayleigh, d’expression mathématique complexe qui peur être résumée ainsi :

Io = I absorbée + I transmise+I diffusée

• Io = lumière incidente.

• I transmise = lumière n’ayant pas rencontré de particules.

• I diffusée = lumière diffusée par les particules, que peut rencontrer les récepteurs.

1- Turbidimétrie : Principe : • La lumière transmise correspond aux rayons lumineux

n’ayant pas rencontré de particules sur leur trajet. En milieu trouble homogène, l’intensité transmise est fonction de la concentration de la suspension. La loi de Beer-Lambert peut donc s’appliquer aux milieux troubles si la taille des particules est faible et voisine de la longueur d’onde de la lumière incidente et si la concentration des particules n’est pas très élevée.

• En turbidimétrie, on mesure donc la diminution de l’intensité lumineuse dans la direction de la lumière incidente.

Appareillage :

• La turbidimétrie utilise un spectrophotomètre avec des longueurs d’onde comprises en général entre 620nm et 670nm

Applications: • La turbidimétrie est largement utilisée en

biochimie clinique (dosage de la a1-macroglobuline , la protéine C réactive , l’albumine, la transferrine, apolipoprotéines ..)

• Elle est adaptable sur tous les automates de biochimie pour le dosage des protéines spécifiques.

2- Néphélométrie : Principe et appareillage : • La néphélémétrie mesure la lumière diffusée et nécessite l’emploi

d’un néphélométre qui mesure la lumière UV (250nm à350nm) diffusée dans toutes les directions par rapport à la lumière incidente.

• La mesure du faisceau diffusé est faite perpendiculairement au faisceau incident. La lumière monochromatique utilisée provient d’un rayonnement LASER (light amplification by stimulated emission of radiation) provenant d’une lampe à hélium ou à néon ;

• Ce faisceau lumineux produit une forte densité d’énergie rayonnante, ce qui est particulièrement adapté à la mesure de la lumière dispersée.

• Le rayonnement LASER améliore la sensibilité et la précision des mesures.

• La néphélémétrie est actuellement automatisée, elle permet le dosage d’un grand nombre de protéines spécifiques dans différents milieux biologiques.

Les applications: sont les mêmes que pour la turbidimétrie.

• La néphélométrie est un plus sensible et plus performante pour les dosage des protéines spécifiques, cependant la différence n’est pas notable entre les deux , mises à part lors du dosage des protéines à faibles concentrations (IgE, chaines légères libre…)

• Mais elle a un appareillage spécifique qui n’est pas présent dans tous les laboratoires de biochimie.

• De ce fait, le dosage des protéines s’effectue sur des automates de biochimie utilisant la turbidimétrie

FLUORIMETRIE Généralités :

La luminescence : c’est l’émission de photons obtenus lors du retour à l’état fondamental d’une molécule portée au préalable à un état excité.

La spectrométrie par luminescence regroupe des méthodologies se distinguant par la nature de la source d’excitation.

Telles que :

Nom Source d’excitation

Photoluminescence : UV, Visible, IR

Fluorescence

Phosphorescence

Thermoluminescence chaleur

Chimiluminescence réaction chimique

Spectrométrie d’émission:

Principe physicochimique : • La fluorescence fait partie d’un ensemble de

processus regroupés sous le nom de photoluminescence.

• Il s’agit de l’émission de la lumière à partir d’une molécule se trouvant à un niveau d’excitation électronique obtenu par absorption de la lumière (UV, visible ou IR).

• Les fluorochromes ou fluorophores sont des substances chimiques capable d'émettre de la lumière de fluorescence après excitation.

Le processus de fluorescence peut être scindé en 3 étapes

1-Absorption d’un photon par une molécule qui passe d’un état fondamental à un état électronique excité initial.

2-Passage de l’état excité initial vers un état excité secondaire d’énergie moindre que celle de l’état excité initial de façon non radiative. La perte d’énergie s’effectue sous forme de chaleur.

3-Retour à l’état fondamental avec émission d’un photon moins énergétique que celui absorbé (la fluorescence).

hυ em < hυ ex => λ em > λ ex

APPAREILLAGE

• Les spectrofluorimétres permettent d’enregistrer les spectres de fluorescence en fonction de la longueur d’onde

• fluorimètres :permettent de travailler à longueur d’onde fixe.

1.Sources lumineuses: -Lampe à vapeur de mercure : elle fournit un spectre de raies :

365, 405, 436nm -Lampe à xénon : elle fournit un spectre continu de 200 à

800nm -lampes flash à xénon: délivre un éclairage intense et bref.

2.Filtres et monochromateurs

• Les filtres colorés: les fluorimétres.

• Les monochromateurs à réseau ou à prisme: les spectrofluorimètres

Le filtre primaire ou monochromateur d’excitation: permet de sélectionner

la longueur d’onde à laquelle sera excité le fluorophore

Le filtre secondaire ou monochromateur d’émission: il est placé à 90° du

rayon lumineux excitateur afin de minimiser les interactions de la lumière

d’excitation avec celle d’émission

3.Cuves :

- de section carrée ou rectangulaire, polies sur les 4 faces

- quartz non fluorescent, verre , Polystyrène

- plastique : réduction notable du signal de bruit de fond

4.Détecteur :

-à 90° au faisceau d’excitation

5- Photomultiplicateurs et enregistreurs :

Transformation du signal lumineux en signal électrique amplifié par des amplificateurs pour avoir un signal utile

Applications en biologie clinique :

Le fluorophore est soit intrinsèque, la molécule à doser elle-même :

-Dosage des acides aminés et de leurs métabolites : Phénylalanine, tyrosine, histidine, sérotonine

-Dosage des catécholamines, acide homovanilique….

-Dosage des médicaments et toxiques : Barbituriques, benzodiazépines, phénothiazines…

Le fluorophore est extrinsèque: la molécule à doser est rendue fluorescente en y greffant un marqueur fluorescent (fluorescéine, rhodamine, coumarine, …)

-Dosages enzymatiques ayant pour substrat des dérivés

fluorescents -Dosage des peptides et des protéines- - -Application en génétique moléculaire par l’utilisation de

sonde marquée par un dérivé fluorescent.