Observations preliminaires sur l'accumulation d'hydrocarbures chez Candida steatolytica: relation avec la synthese des lipides

M. ELISABETA GUERZONI', PAOLO LAMBERTINI, AGOSTINO CAVAZZA ET ROSA MARCHETI Dipartimento di Protezione e Valorizzazione agroalimentare, Sezione Mic-robiologica, Uni\lersita di Bologna, Via S. Gicrcomo

n. 7 , 40126, Bologne, Itellie

Accepte le 7 mars 1985

GUERZONI, M. E., P. LAMBERTINI, A. CAVAZZA et R . MARCHETTI. 1985. Observation5 prkliminaires Fur I'accumulation d'hydrocarbures chez Candida steatolytica: relation avec la synthese des lipides. Can. J . Microbiol. 31: 620-624.

Au cours d'une recherche sur les mkcanismes qui reglent la biosynthtse des lipides dans les levures, on a cornpar6 les modeles d'accumulation et la composition des lipides cellulaires de Candida Lsteatolvtic~a et de Lipomyces .starkej.i par rapport aux conditions nutritives. En particulier, on a considkrk une souche de Ccindidcr .stec~tolvtic~a dont la compo5ition lipidique est trks susceptible aux modifications du milieu: en conditions de limitation d'azote et cn prC5ence d'amidon comme source de carbone, on a dktermink une accumulation remarquable d'hydrocarbures linkaires et ramifies, pas encore signalke en littkrature. Au contraire la composition lipidique de Lipomyces starkeyi, qui accumule, dans les mzmes conditions, d'importantes quantitks de triglyckrides, est moins influencke par les conditions de culture.

GLIERZONI, M. E., P. LAMBERTINI, A. CAVAZZA, and R. MARCHETTI. 1985. Observations prkliminaires sur I'accumulation d'hydrocarbures chez Candida steatolytic-a: relation avec la synthese des lipides. Can. J . Microbiol. 31: 620-624.

Different cell lipid accumulation and composition patterns were observed in the yeasts Lipomyce.~ starkeyi and Canclida steatolytica by varying the nutritive conditions. In Lipomyc*es starkeyi 303 which accumulates high levels of lipids as triglycerides, the composition of the different lipid fractions was relatively unaffected by the culture medium. In contrast. the lipid composition of Candida steatolytica 20C was strongly affected by the composition of the medium under conditions of nitrogen limitation and when starch was used as the carbon source, high levels of straight and branched hydrocarbons were observed.

[Traduction de !'auteur]

Introduction TABLEAU I . Combinaisons des sources de carbone et d'azote dans les

L'etude des lipides cellulaires chez les champignons a connu, au cours des dernikres annees, des developpements importants, surtout en ce qui concerne leur r6le dans la morphogenkse (Brennan et Losel 1978), leurs applications taxonomiques (Dart et al. 1976; Yamada et Nazawa 1979; van Eijk et Roeymans 1982; Erwin 1973), leurs relations avec le dimor- phisme cellulaire (Gordon et al. 197 1; Marriott 1975), leur r6le dans les rapports h6te-parasites pour les champignons patho- gknes et leurs rapports avec le metabolisme secondaire (Brennan et Losel 1978; Bu'lock 1965; Turner 197 1 ; Esders et Light 1972; Shaw 1963; Chopra et Khuller 1983).

Si les voies biosynthetiques relatives aux diverses fractions lipidiques sont relativement connues et decrites (Steiner et Lester 1972; Weete 1980; Ratledge 1982), les systkmes regu- latoires qui les contr6lent ont ete peu etudies. En particulier, on n'a pas encore complktement identifie les mecanismes a la base de la capacite d'accumuler d'importantes quantites de lipides, particullere a quelques espkces de champiknons, soit le developpement actif, comme chez Cryptoc*occus terricolus, soit lorsque les autres processus biosynthetiques cessent (Rattray et al. 1975; Ratledge 1982).

Quelques espkces de levures capables de produire des lipides jusqu'a 70% de leur poids sec, ont kte proposees comme sources non conventionnelles de lipides alimentaires (Ratledge 1976, 1978).

Des recherches de l'ecole de Hull (Ratledge 1982; Boulton et Ratledge 198 1 ; Botham et Ratledge 1979; Evans et Ratledge 1983a, 1983b) ont mis en kvidence le r6le joue par quelques enzymes, et en particulier par 1'ATP-citrate lyase, dans le processus de surproduction des lipides, et specifiquement des triglycerides, en conditions de carence d'azote.

Parmi les paramktres des conditions de culture a meme d'in-

'Auteur & qui addresser les demandes de rkimpressions.

milieux de culture

Azote

Concentration Source de carbone Combinaison Source (g/L)

Glucose

(NH4)rS04 ( N H J ) ~ S O ~ (NH41804 Acides aminks Acides aminks (NH,)rSO, (NH4)rS04 (NH4),SO4 Acides aminks Acides aminks Acides aminks

fluencer I'accumulation totale de lipides dans les levures, un rapport carbone/azote (C/N) eleve est le plus determinant (Rattray et al. 1975; Guerzoni et al. 1985).

Au cours d'une selection des levures "oleagineuses" dotees d'activitk amylolytique, on a observe (Guerzoni et al. 1985) des heterogkneites interessantes en ce qui concerne les modkles d'accum1.11ation des diverses fractions lipidiques cellulaires, surtout par rapport aux variations de la composition du milieu. En particulier, des levures non strictement olkagineuses (Ratledge 1982) telles que Cundidu steatolytica, Cryptococcus laurentii et Schwanniomyces occidentalis, ont presente une reponse qualitative et quantitative plus modulee par les condi- tions nutritives, en comparaison aux levures oleagineuses telles que Lipomyces sturkuyi. En conditions d'extreme limitation de la source d'azote, ces levures, caracterisees en general par des pourcentages de lipides cellulaires de 3 a 8%, peuvent presenter une accumulation de lipides allant jusqu'a 20 a 30% de leur

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IVE

RSI

TY

OF

MIC

HIG

AN

on

11/1

2/14

For

pers

onal

use

onl

y.

TAB.LEAU 2. Influence de la composition du milieu sur le contenu (en pourcentage) en lipides totaux cellulaires

Glucose 3% Amidon 3%

(NH4)2S04 (NH4)2S04 (NH4)2S04 (NH4)804 (NH4)2S04 (NH4)2S04 Souche 0,04% 0,12% 0,5% 0.04% 0.12% 0,5%

Candida steatolytica 20C 7,9 1,6 2-1 2,7 2 2 0,5 Lipomyces starkeyi 303 45 ,O 38 ,O L 2 ,O 38 ,O 23 ,O 12,O

poids sec. La susceptibilite de ces especes aux conditions nutri- tives pourrait, a notre avis, offrir d'interessantes opportunites, non seulement en ce qui concerne la production de lipides inhabituels, mais surtout pour I'etude des mecanismes regu- latoires qui contrhlent I'accumulation des divers types de lip- ides dans les levures.

Dans ce travail preliminaire, on a compare les modifications de la composition lipidique d'une souche oleagineuse de Lipo- myces starkeyi et d'une souche non oleagineuse de Candida steatolytica, par rapport aux variations de la composition du milieu, et surtout de la source de carbone.

Materiel et methodes Souches

On a employe deux souches, Candidu steatolytic-u 20C et Lipo- myces starkeyi 303, appartenant a la collection du Departement (Sec- tion microbiologique).

Milieu Le milieu utilise au cours des exgriences avait la composition

suivante (par litre): biotine, 2,5 pg; pyridoxine, thiamine, acide pan- thotenique et acide nicotinique, 100 pg, respectivement; Zn SO4, MnS04, CuS04, et FeCL3, I00 pg, respectivement; inositol, I00 mg; CaCI,, 0,25 g; KH2PO4, 2 g. Les combinaisons des sources de car- bone (amidon ou glucose) et d'azote ((NH4),S04 ou acides aminks (Casaminoacids Difco, exempts de vitamines)) sont reportees au tableau I.

Les analyses de lipides ont Ctk executtes sur des cellules cultivees pendant 7 jours en condition aerobique (agitation horizontale) et en- suite lyophiliskes.

Extraction des lipides L'extraction des lipides a CtC effectuke a I'aide d'un melange

chloroforme- methanol ( I : I ). L'extrait, sipart des cellules par fil- tration et lave avec 0,2 volumes de KC1 0, I M, a 6tC kvapore sous vide, et le residu obtenu a CtC transfer6 avec la mtme melange de solvants dans un ballon jaugC de 10 mL. La quantitk totale de lipides a CtC determinee en poids sec. apres klimination totale du solvant sous vide.

Chromatogruphie en c.ouche mince (TLC) L'Application ponctuelle ( 1 mg) d'echantillons d'extraits lipidiques

totaux a kt6 effectuke sur couche mince Stratocrom Carlo Erba (Milano) de gel de silice (0,25 mm). Le developpement a kt6 effectuC h I'aide d'un melange n-hexane - ether dikthylique (60 : 40, v/v). Les taches ont Cte IocalisCes avec le melange sulfochromique et, pour la chromatographie preparative, avec une solution de dichloro-2, 7 fluo- resckine.

Pour la TLC preparative de la fraction des hydrocarbures, on a employe des couches minces impregnees d'une solution de AgN03 (Gegiov et Georgouli 1983) et dCvelop@es avec un melange de benzkne - n-hexane (80 : 20 v/v).

Analyses en chromatographie a phase gazeuse (GLC) A 1 mg de I'extrait lipidique, on a ajoute quelques gouttes de

diazomethane en solution dans l'ether dikthylique (Fieser et Fieser 1967). Les conditions d'analyse chromatographique ktaient les sui- vantes: appareil Carlo Erba, modkle 41 60 HRGC; colonne capillaire (longueur, 10 m; diamktre, 0,3 mm) recouverte d'un film de SE 52

TABLEAU 3. Pourcentages relatifs des fractions lipidiques cellulaires de Lipomyces starkeyi 303 cultivC sur diverses combinaisons

carbone/azote

Pourcentage relatif

Source de carbone Combinaison AGL SL PL SE TG

Amidon I 2 3 4 5

Glucose 9 10 I I

' NOTA: AGL, acides gras libres; SL, sterols libres; PL, phospholipides; SE, sterols esterifies; TG, triglycerides; tr, < I % des lipides totaux.

(Cpaisseur, 0,10-0,15 p); gaz vecteur: He (flux: 2,5 mL/min); injec- tion: 1 -2 pg d'kchantillon sur colonne.

La temprature du detecteur a ionisation de flamme (FID) Ctait de 350"C, celle du four programmee de 40 a 350°C avec un gradient de 13"C/min.

Les composes ont CtC identifies sur la base des temps de rktention par comparaison avec des tchantillons tkmoins purs.

Resultats Sur la base des donnees presentees au tableau 2, on peut

observer que lorsque les cellules sont cultivees sur le glucose, leur contenu en lipides totaux est plus eleve que lorsqu'elles sont cultivCes sur I'amidon, a parite de rapport C/N. Mkme si la production d'amylase et de glucoamylase par les souches est assez precoce et efficace (Guerzoni et al. 1985), I'hydrolyse, et par consequent la production du glucose, ne procede pas a une vitesse suffisante pour donner la charge energetique (ATP + ~ADP/ATP + ADP + AMP) necessaire a I'accumulation des lipides de reserve (Botham et Ratledge 1979).

Au tableau 3, on presente les pourcentages relatifs des di- verses fractions lipidiques de la souche Lipomyces starkeyi 303, en fonction de la source de carbone et d'azote. Les com- binaisons sont telles qu'indiquees en tableau 1 . Un ac- croissement de la concentration de la source d'azote fait aug- menter les pourcentages relatifs des lipides structuraux comme les phospholipides, et diminuer les lipides d'accumulation comme les triglycerides, excepte pour les combinaisons 4 et 5. On ne rapporte pas, au tableau 3, toutes les conditions de culture adoptees; en effet, la composition lipidique de Lipo- myces starkeyi 303 ne presente que des modifications qual- itative~ peu remarquables par rapport aux variations du milieu.

La composition de la fraction lipidique et les modkles d'ac- cumulation chez Lipomyces starkeyi sont rigles de fagon par- faitement privisible par les conditions de culture, si l'on se base sur les connaissances desormais acquises (Ratledge 1982).

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IVE

RSI

TY

OF

MIC

HIG

AN

on

11/1

2/14

For

pers

onal

use

onl

y.

622 CAN. J. MICROBIOL. VOL. 31, 1985

TABLEAU 4. Pourcentages relatifs des fractions lipidiques cellulaires de Candida steatolytica 20C cultivC sur diverses combinaisons

carbone/azote

Pourcentage relat if

Source de carbone Combinaison AGL SL HC PL SE TG

Glucose

9 10 60 5 tr" I 1 20 25 30 9 tr 10 12 30 15 18 tr 21 12 15 18 17 7 30 14 25 20 16 tr 23

3 13 2 17 4 59 10 21 4 24 4 35 25 27 4 28 3 10 tr 9 tr 15 5 68 7 25 3 22 6 28

10 21 2 21 6 39

NOTA: AGL, acides gras libres; SL, sterols libres; HC, hydrocarbures; PL, phos- pholipides; SE, sterols esterifies; TG, triglycerides; tr, < 1% des lipides totaux.

Le comportement de la souche Candida steatolytica 20C presente quelques aspects qui peuvent Ctre de quelque inter& pour I'etude des interactions entre le mktabolisme azote et la biosynthese de quelques composants lipidiques. Au tableau 4, on presente les pourcentages relatifs aux fractions lipidiques dans des conditions de culture diverses. Les variations quan- titative~ et qualitatives des fractions lipidiques, par rapport aux conditions nutritives, peuvent Ctre ainsi resumees: si la source de carbone est le glucose, les rapports relatifs des diverses fractions lipidiques et leurs modifications, a la variation du rapport C/N, sont qualitativement semblables a ceux deja ren- contre chez la souche L. starkeyi 303, meme si la souche de Cundida steatolytica n'est pas capable d'accumuler des trigly- cerides en quantitk aussi remarquable; c'est a dire que lors de I'augmentation de la concentration en azote, la quantite de lipides structuraux augmente et celle des triglycerides dimi- nue. Lorsque la source de carbone est l'amidon, on peut observer dans toutes les conditions (tableau 4) une fraction constituee d'hydrocarbures qui represente, en certains cas, 80% des lipides totaux. 11 s'agit, comme on I'a demontre au moyen de I'analyse GLC (par rapport a des Cchantillons te- moins purs), de la fraction correspondante, separee par chro- matographie en couche mince, de deux series homologues d'hydrocarbures lineaires pair et impair (fig. 1) et d'hydro- carbures ramifies iso et ante-iso. Une separation par TLC sur gel de silice a demontre qu'il s'agit d'hydrocarbures satures. La comparaison avec les chromatogrammes des echantillons te- moins purs des hydrocarbures a demontre que le nombre de carbones des chaines varie de 21 a 35. Lorsque la source d'azote est I'ammonium, lors de I'augmentation de sa concen- tration dans le milieu, la quantites de triglycerides augmente et celle des hydrocarbures diminue. Lorsque la source d'azote est constituee d'acides amines, le phenomene est moins net, mCme si I'on observe une inversion de la reponse: lors de I'aug- mentation de la concentration en acides aminks, la quantite de triglycerides diminue et celle des hydrocarbures augmente.

Discussion On peut resumer ainsi les donnees obtenues: le com-

portement de L. starkeyi 303, dans toutes les conditions, et de C. steatolytica 20 C, en conditions de limitation d'azote et de large disponibilite de glucose, presentent des analogies quali-

tative~, meme si les quantites de triglycerides et de lipides totaux sont differentes. Au contraire, lorsque la souche 20 C est cultivee en conditions de limitation d'azote et en presence d'une source de carbone a assimilation lente comme I'amidon, elle n'accumule pas de triglycerides, mais des hydrocarbures en quantite elevee. Generalement, la presence d'hydrocarbures est associee aux spores des champignons et plus rarement aux cellules vegetatives (Weete 1972). En ce qui concerne les le- vures, on a observe la presence d'alcanes a chaines lineaire et ramifiee en quantite variant de 2 a 20% (des lipides totaux) chez Debariomyces hunsenii et Pulluluria pullulans (Weete 1972). Dans tous les cas, les alcanes ayant un nombre impair de carbones predominent.

On peut supposer, par analogie avec ce qui a ete observe a propos des bacteries (Albro et Dittmer 1970; Hunter et Rose 197 1 ) et des tissus de plantes superieures (Kolattukudy et Walton 1972; Albro et Dittmer 1970), que les acides gras sont les precurseurs des hydrocarbures formes par un allongement de la chaine et par une decarboxyilation subsequente. A leur tour, les alcanes ramifies peuvent deriver des acides amines ramifies tels que la valine et I'isoleucine. En particulier, selon un mecanisme identifie sur des feuilles de tabac, la valine et I'isoleucine pourraient &re les precurseurs respectifs des paraf- fines impaires et ante-iso-paires (Kolattukudy et Walton 1972). Dans la physiologie des champignons, le r6le des paraffines n'e8t pas completement connu, mCme si I'on a emis, en ce qui concerne les spores, I'hypothese d'une fonction de prevention de la deshydratation (Weete 1972).

Nous n'avons pas encore etabli la localisation de ces hydro- carbures dans les cellules de Candida steatolytica. Toutefois, les quantites si elevees rencontrees dans cette souche, soit superieures a celles des lipides de structure, sont difficilement explicables sur la base d'une fonction uniquement protective. D'autre part, la modulation de ces substances par rapport aux conditions nutritives et le rapport inverse avec les triglycerides et les phospholipides indiquent que cette accumulation est strictement dependante des systemes regulatoires de la synthese des lipides.

Pour I'instant, on ne peut formuler que deux hypotheses: (i) les hydrocarbures jouent un r61e vicariant par rapport aux tri- glycerides ou aux phospholipides et (ii) la synthese des acides gras n'est pas la seule etape limitant l'accumulation des trigly- chides. En effet on a releve, chez Candida steatolytica, une production importante d'hydrocarbures en presence d'un rap- port C/N a mCme de causer une surproduction d'acides gras chez d'autres especes oleagineuses comme Lipomyces starkeyi. Chez Candida steatolytica 20C, ces acides gras non convertis en triglycerides pour des raisons non encore identifiees, pour- raient Ctre transformes en hydrocarbures par allongement et dtcarboxylation, selon le schema de Kolattukudy et Walton ( 1972). A notre connaissance, cette hypothese est toutefois difficilement conciliable avec la presence, en quantite egale, de n-alcanes pairs et impairs. D'autre part, la presence d'isomeres iso et ante-iso peut suggerer des liens avec les acides amines et le metabolisme azote.

D'autres etudes seront necessaires afin de comprendre les mecanismes de contr6le d'une si importante accumulation d'hydrocarbures et, en particulier, les mecanismes de contr6le des enzymes impliquees dans leur biosynthese, ainsi que la localisation de telle fraction lipidique dans les cellules pendant les diverses phases du developpement vegetatif.

Cette recherche preliminaire a mis en evidence, outre une inhabituelle production d'hydrocarbures, comment une souche

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IVE

RSI

TY

OF

MIC

HIG

AN

on

11/1

2/14

For

pers

onal

use

onl

y.

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IVE

RSI

TY

OF

MIC

HIG

AN

on

11/1

2/14

For

pers

onal

use

onl

y.

624 CAN. 3 . MICROBIOL. VOL. 31, 1985

non oleagineuse, mais caracteriske par une extreme sus- ceptibilitk aux conditions nutritives, peut etre utilisee comme instrument pour I'etude de quelques aspects encore obscures de la r6gulation de la biosynthese des lipides cellulaires.

A ~ B R O , P. W., et J . C. DI~TMER. 1970. Bacterial hydrocarbons: occurrence, structure and metabolism. Lipids, 5: 320-325.

BOTHAM, P. A., et C. RATLEDGE. 1979. A biochemical explanation for lipid accumulation in Candida 107 and other oleaginous micro- organisms. J . Microbiol. 114: 36 1 -375.

BOULTON, C. A., et C. RATLEDGE. 198 1. ATP: Citrate lyase, the regulatory enzyme for lipid biosynthesis in Lipomyces starkevi. J . Gen. Microbiol. 127: 169- 176.

BRENNON, P. J . , et D. M. LijsEL. 1978. Physiology of fungal lipids: selected topics. Adv. Microb. Physiol. 17: 47 - 179.

BU'LOCK, J . D. 1965. The biosynthesis of natural products. An intro- duction to secondary metabolism. McGraw-Hill , Londres.

CHOPRA, A., et G. K. KHULLER. 1983. Lipids of pathogenic fungi. Prog. Lipid Res. 22: 189-220.

DART, R. K., J . D. LEE et R. J . STRETTON. 1976. Classification of Ceratocystis and Sporotrychum based on their long-chain fatty acids. Trans. Br. Mycol. Soc. 67: 327-328.

ERWIN, J . A. j973. Lipids and biomembranes of Eucariotic micro- organisms. Editeur: J . A. Erwin. Academic Press, Londres et New York. p. 41.

ESDERS, T. W., et R. J . LIGHT. 1972. Characterization and "in vivo" production of three glycolipids from Candida hogoriensis: 13-glucopyranosyloxidocosanoic acid and its mono- and diace- tylated derivatives. J . Lipid Res. 13: 663 -67 1.

EVANS, T. C . , et C. RATLEDGE. 1 9 8 3 ~ . A comparison of the ole- aginous yeast Candidu curvata grown on different carbon sources in continuous and batch culture. Lipids 18: 623-629.

19836. Biochemical activities during lipid accumulation in Candida curvata. Lipids, 18: 630-635.

FIESER, L. F., et M. FIESER. 1967. Reagents for organic synthesis. John Wiley & Sons, New York. pp. 191,192.

GEGIOV, P., et M. GEORGOULI. 1983. A rapid argentation TLC- method for detection of reesterified oils in olive and olive-residue oils. J . Am. Oil Chem. Soc. 60: 833-836.

GORDON, P. A., P. R. STEWARD et G. D. CLARK-WALKER. 1971.

Fatty acid and sterol composition of Mucor genevensis in relation to dimorphism and anaerobic growth. J . Bacteriol. 107: 1 14- 120.

GUERZONI, M. E., P. LAMBERTINI, R. MARCHETTI et G. LERCKER. 1985. Technological potential of some starch degrading yeasts. StarchIStaerke, 37: 52-57.

HUNTER, K. , et A. H. ROSE. 197 1. Yeast lipids and membranes. Dans The yeasts. Tome 2. Editeurs: H. A. Rose et J . S. Harrison. Aca- demic Press, Londres et New York.

KOLATTUKUDY, P. E., et T. J . WALTON. 1972. The biochemistry of plant cuticular lipids. Prog. Chem. Fats Other Lipids, 12: 119- 175.

M A R R ~ O ~ T , M. S. 1975. Isolation and chemical characterization of plasma membranes from the yeast and mycelial forms of Candida albicans. J . Gen. Microbiol. 86: 1 15 - 132.

RATLEDGE, C. 1976. Microbial production of oils and fats. Duns Food from waste. Editeurs: G. G. Birch, K. J . Parker et J . T. Worgan. Applied Science Publishers, Ltd., Londres.

1978. Lipids and fatty acids. Duns Economic microbiology. ~di teur: A. H . Rose. Academic Press, Londres et New York.

1982. Microbial oil and fats: an assessment of their commer- cial potential. Prog. Ind. Microbiol. 16: 125-206.

RATTRAY, J . B. M., A. SCHIBECI et D. K. KIDBY. 1975. Lipids of yeasts. Bacteriol. Rev. 39: 197-23 1 .

SHAW, M. 1963. The physiology and host-parasite relations of the rusts. Annu. Rev Phytopathol. 1: 259-294.

STEINER, M. R., et R. L. LESTER. 1972. "In vitro" studies of phos- pholipid biosynthesis in Sac.charomyc.es cerevi.siue. Biochim. Biophys. Acta, 260: 222-243.

TURNER, W. B. 197 1. Secondary metabolites derived from fatty acids. Dans Fungal metabolites. Academic Press. Londres et New York. pp. 62-73.

V A N EIJK, G. W., et H . J . ROEYMANS. 1982. Distribution of caro- tenoids and sterols in relation to the taxonomy of Taphrina and Protomyces. Antonie van Leeuwenhoek, 48: 257 - 264.

WEETE, J . D. 1972. Alyphatic hydrocarbons of the fungi. Phyto- chemistry, 11: 1201 - 1205.

1980. Lipid biochemistry of fungi and other organisms. Plenum Press, New York. p. 234.

YAMADA, I. et Y. NAZAWA. 1979. An unusual lipid in the human pathogenic fungus Epidermophyton flocco.sum. B iochim. Biophys. Acta, 573: 433-439.

Can

. J. M

icro

biol

. Dow

nloa

ded

from

ww

w.n

rcre

sear

chpr

ess.

com

by

UN

IVE

RSI

TY

OF

MIC

HIG

AN

on

11/1

2/14

For

pers

onal

use

onl

y.