BIOCHIMIE, 1982, 64, 377-380.

Phospholipases A 2 activables des plaquettes sanguines de rat.

Jacqueline ETIENNE 9, Annick GRUBER FacuIt~ de M~decine Saint-Antoine, et Jacques POLONOVSKI. 27 rue Chaligny, 75012 Paris.

(Recue le 8-1-1982, acceptge apr~s rgvision le 22-3-1982).

R6sum6. S u m m a r y .

Le lysat de plaquettes sanguines de rat poss~de une activitd phospholipasique A~ et renferme des prot£ines activatrices de phospholipases. L'ensem- ble des phospholipases A ~ et des prot~ines activa- trices est obtenu partiellement purifid dans le pre- mier pic d'~lution d'une coIonne de Sephadex GIO0.

Un fractionnement ult&ieur de ces prot~ines sur une colonne de Bleu Sepharose CL 6B permet de s@arer d'une part les protdines activatrices, d'autre part une fraction ne repr~sentant plus que 10 pour cent de l'activitd initiale.

Cette fraction retrouve presque totalement son activit~ initiale aprks addition de la fraction con- tenant les prot~ines activatrices.

L'activit~ phospholipasique des plaquettes san- guines de rat est donc due en partie gt l'action de phospholipases directement actives et de phospho- lipases qui ne doivent leur activitd qu'~ l'associa- tion avec des prot~ines activatrices.

Mots-el~s : phospholipases A 2 / phospholipases aeti. vables / plaquettes,

Rat blood platelet lysate showed high phospho- lipase A~ activity and contained << activating fac- tor >> which increased phospholipase A.e activity. The phospholipase Ae and the << activating factor >> were eluted together in the same first protein frac- tion obtained by chromatography on a G 100 Se- phadex column washed with tris-HCl buffer (pH 7.2).

This mixture of proteins can be further fraction- ated on a Sepharose Blue CL 6B column in 2 pro- tein fractions. The first fraction eluted by tris-HCl buffer (pH 7.2) showed 10 percent of the initial phospholipase activity ; the second fraction eluted by NaCl 1 M-tris HCl buffer (pH 7.2) which s'howed no phospholipase activity, contains activa- ting factor ; if both fractions are mixed the initial phospholipase activity is almost totally restored.

In conclusion, in rat blood platelets, phospho- lipase activity originates in a great part from the association of an << activable phospholipase >> and an << activating factor >>.

Key-words : phospholipase A 2 / phospholipases pla- telets.

In troduc t ion .

Les phospholipases A1 et A2 des plaquettes san- guines ont 6t6 particuli6rement 6tudi6es chez l'homme, le lapin, le cheval soit sur le lysat total, soit apr~s fractionnement subcellulaire [1-6]. L'importance des phospholipases A2 dans les fonc- tions plaquettaires a donn6 lieu h de nombreux travaux essentiellement li6s ~ la lib6ration d'acide arachidonique pr6curseur des thromboxanes et des prostaglandines [7, 8] qui jouent un r61e pr6pon- d6rant darts l'agr6gation.

<> A qui toute correspondance dolt ~tre adress~e.

Leur intervention est 6galement 6voqu6e dans la synth~se du PAF-ac6ther (1-0-alkyl 2-ac6tyl sn- glyc6ryl 3-phosphorylcholine) [9, 10] dans les tra- vaux de Vargaftig et coil [11].

Des phospholipases A2 de plaquettes d'homme et de lapin ont 6t6 purifi6es [4, 12, 13, 14]. Certai- nes phospholipases ne sont en 6tat d'hydrolyser les phospholipides dans les plaquettes qu'apr~s des stimulations sp6cifiques, par exemple par la throm- bine. Les plaquettes de rat ont une activit6 phos- pholipasique relativement plus importante que celle des autres esp~ces [15].

378 I . E t i enne et coll.

Les r6sul ta ts expos6s dans ce t te n o t e m o n t r e n t q u e ce t t e ac t iv i t6 r6sul te erx g r a n d e p a t t i e de l ' a c - t ion d ' u n e p h o s p h o l i p a s e ac t i vab l e p a r un f ac t eu r 6 g a l e m e n t p r6sen t dans les p l aque t t e s [16]. I1 est poss ib le de d i ssoc ie r ce t te p h o s p h o l i p a s e de son a c t i v a t e u r en f r a c t i o n n a n t sur une c o l o n n e de B l e u S e p h a r o s e l ' ex t r a i t p l a q u e t t a i r e p a r t i e l l e m e n t pu- rift&

M a t 6 r i e l e~ M 6 t h o d e s .

Les techniques de pr61~vemen.t du sang sur les rats (m~k~s ou femelles, de 250 ik 300 g) de race Sprague Dawley, d'isolemont du plasma et de pr6paration de lysat de plaquettes on, t 6t6 d6crites pr6c6dema-nent [16]. Les plaquettes sont recueiliies et lav6es darts des conditions 6vitant la contamination par le plasma.

L'activit6 phospholipasique est dos6e en incubant 16 nmoles de phosphatidyl6thanolaxni.n~ 15 rnin ~ 37°C avec agitation avec les prot6ines plaquettaires dans un volume ,total de 2 ml en milieu tampcm tris-HCl 0,05 M (pH 7,2), en pr6sence de CaCh ~ concentration finale 10 I*M dans le milieu (tableau I).

Pour d6finir l'activit6 aotivatrice, des doses croissantes de prot6ines plaquettaires sont add~,tionn6es A une quan- t~t6 donn6e de phosphotipase aeti,vable de mani~re d6terminor la dose permettnm une aetiva, tion maximale de l'enzyme.

Les produits de la r6a~tion : lysophosphatidyl6thanola- m~ne et acides gras sont s6par6s de la phosphatidyl6thano- lamine non d6grad6e ~ l'a, ide de la chromatogral~h~e en couche mince (plaque G 1500 Sch.leieher et Schiill 20 × 20) en phase neutre (claloroforme-m&hanol-eau 65/25/4, v/v). Les taches corresponda'ntes sont rep6rdes par autoradiographie (films Kodak Kodirex) puis gratt6es

TABLEAU I.

Fractionnement de 12 mg de protdines du lysat plaquettaire partiellement purifid sur une colonne de Bleu Sepharose CL 6B.

Prot6ines en mg Phospholipase Activateur

as at as at

Prot6ines du 1 er pie du fractionnement sur Sephadex G 100 12

Fractionnement sur Bleu Sepharose

- Pic I 61u6 par (tris) 4 - Pie ][I 61u6 par (tris NaC1 1M) 6

Mdange Img Pie I 0,050rag Pie I1

650 7 800 12 000 144 000

190 760 0 0 0 0 16 000 96 000

1 200 4 800 (*)

Dosage de l'activit6 phospholipasique : 15 h 20 ~g de pro~t6i,nes du 1 e" pic apr~s fractionnement sur Sephadex G 100. 35 ~. 80 lxg de prot6ines du pie I apr~s fractiomaemem sur Bletl Sepharose. M61ange de 200 ~g des prot6ines du pie I aprbs fractionnement sur Bleu Sepharose.

+ 10 ~g des prot6ines du pic II apr~s fractionnement sur Bleu Sepharose sont incub6s dans les conditions d6crite~ dans << Mat6riel et M6thodes >>.

as: activit6 sp6cifique : ,nomlbre de nmoles de lysophosphatidyl6thanolamine lib6r6es en 1 h par 1 mg de pro- t6ines

at : activSt6 totale : ~ombre de nmoles de lysophosphatidyl&hancrlamine lib6r6es par la totalit6 de la frac- tion co~sid6r6e.

(*) Activit6 totale de la fraction I (4 rag) trait6e par 2 mg du pie. II.

Le substrat est une 6mu:l.sion ultrasonn6e de phospha- tidyl6thanolami, ne marqu6e au 14C, isol6e d'un extrait de Escherichia coli K~,_ (3 000, Institut Pasteur, Paris) cultiv6 en milieu ~c6tate [1¢C] (*). L'activit6 sp6cifique du substrat est de 6 000 dpm par nmole de phosphatidyl&hanolamioe.

(*) Ce travail a b~ndyicid d'une subvention du Com- missariat dt l'Energie Atomique, pour I'achat des moldcttles marqudes.

BIOCHIM1E, 1982, 64, n ° 5.

et leur radioaetivit6 d&ermin6e ~t l'aide d'un spectropho- tom&re ~ scintillation liqt~ide. Le pource~atage de la phos- ph~tidyl6thanolamine hydrolys6e permet de d&erminer l'activit6 phospholipasique.

L'aotivit6 sp6cifique de la phospholipase est d61haie par le nombre de n.moles de lysophosphatidyl6thanolamine lib6r6es en 1 h par I m g de prot6ines ; celle de l'activateur est d6finie par le hombre de umoles de lysophosphatidyl- 6thanolamine litb6r6es en I heure par 1 mg de prot6ines activatrices ngissant in vitro sur une quantit6 d6termin6e de phospholipase activable, dans les conditions optimales.

Phospholipases A~ activables des plaquettes sanguines. 379

La purification partie~Ue du lysat a 6t6 faite ~ l'aide d'un fractionnement su,r ~me colonne de Sephadex G 100 (Pharmacia).

Le second fractionnement a 6~6 effectu6 su, rune colonne de Bleu Sepharose CL 6B (Pharmacia).

Les prot6ines orrt 6t6 das6es saxivazt 1a technique de Lowry et coll. [17] en utili~ant la s6rumalbumine bovine (Sigma) cmaarne prot6~ne de r6f6rence.

R~sultats.

L'activit6 phospholipasique du lysat de plaquet- tes de rat est essentiellement de sp6cificit6 A2 com- me nous l'avons v6rifi6 avec un substrat spdcifique marqu6 en position 2 par l'acide linol6ique [15].

L'activit6 sp6cifique est de 500 h 600 nmoles de lysophosphatidyl6thanolamine torm6es en 1 heure par 1 mg de prot6ines du lysat.

1 °) Fract ionnement sur colonne de Sephadex G 100.

Le fractionnement de 50 mg de prot6ines de l'extrait plaquettaire sur une colonne de Sephadex G 100 (Pharmacia) ~lu6e par une solution tampon

a b s , , r p G , , n 2~o n m

1 -

"1 ~ I h [ R 1 5 - \ ~ C I I x l o _2 I~Ia. 1. - - Fractionnement du lysat plaquettaire partiel-

lement purifi~ sur une colonne de Bleu Sepharose CL 6B.

12 mg de prot6ines plaquettaires partie.tlemen, t purifi6es en solution tampon tris-HC1 0,05 M (pH 7,2) sont frac- tionn6s sur une colonne de Bleu Sepharose CL 6B (K#30).

L'~lution est faite success~vement par le tampon tris- HC1 0,05 M ~H 7,2) pu~s par ce tampon con, tenant NaC1 ~ concentration 1 M.

Les fractions sont recsueillies par 0,7 ml. Bn abscisse : les num~ros des tubes ; en ordonn~e :

les densit~s optiqnes.

tri-HCl 0,05 M (pH 7,2) permet d'isoler dans le premier pic de prot6ines (25 ~ 30 per cent des pro- t6ines totales du lysat) le m61ange de phospholipa- ses et d'activateur.

BIOCH1M1E, 1982, 64, n ° 5.

2 °) Fract ionnement sur colonne de Bleu Sepharose.

L'ensemble des prot6ines du premier pic du fractionnement sur Sephadex est introduit sur une colonne de Bleu Sepharose et 61u6 successivement par une solution tampon tris-HC1 (pH 7,2), pic I, puis par ce m6me tampon contenant NaC1 1 M, pic II (figure 1).

Les prot6ines du pic I correspondant ~t 25-35 pour cent des prot6ines d6pos6es ne renferment environ que 10 pour cent de l'activit6 phospholi- pasique initiale (tableau I) ; les autres fractions, y compris le pic II, n 'en poss~dent aucune.

L'addition des prot6ines du pic II aux prot6ines du pic I fait apparaltre une activit6 phospholipa- sique suppl6mentaire. Les prot6ines du pic I ren- ferment doric une phospholipase directement do- sable et une forme activable par les protdines du pie II.

L'activit6 phospholipasique du pic I e s t maxi- male quand 1 mg de ce pic est trait6 par 0,05 mg du pie II. 0,2 mg du pic II qui contient 6 mg de prot6ines suffit ~ activer la totalit6 du pic I (4 rag) : il y a donc exc6s d'activateur par rapport

la quantit6 de phospholipase ~ activer.

Nous avons v6rifi~ que les prot6ines du pic I trait6es in vitro par un lysat plaquettaire acquit- rent une activit6 suppl6mentaire et que celles du pic II sont capables d'activer la phospholipase plasmatique. Les prot6ines du pic I renferment donc bien une forme activable de l 'enzyme et celles du pic II le << facteur activateur >> [16].

Discussion.

L'activit6 phospholipasique A2 des plaquettes sanguines du rat est donc due ~ plusieurs ph6no- mbnes. I1 existe une ou plusieurs phospholipases directement actives qul repr6sentent environ 15 pour cent de l'activit6 phospholipasique totale du lysat, tandis que la majeure partie de l'activit6 rdsulte de l'association de deux facteurs contenus dans les plaquettes. Ce type d'association a d6jh 6t6 mis en 6vidence dans le s6rum de rat [18].

L'excbs d'activateur par rapport fi la quantit6 de phospholipase ~ activer dans les plaquettes permet d'expliquer l'activation ddj~ observ6e [19] des phospholipases plasmafique et globulaire au cours de la coagulation.

380 I. Etienne et coll.

Les phospholipases A2 tiennent une place im- portante dans la fonction plaquettaire puisqu'elles doivent intervenir dans l 'activation des plaquettes [20] et qu'~t c6t6 des phospholipases C [21-24], elles participent ~t la lib6ration de l 'acide arachi- donique ~t partir des phospholipides membranaires. L 'associat ion de deux prot6ines donnant naissance

une activit6 phospholipasique peut ~tre l 'un des m6canismes de r6gulation des phospholipases A~ plaquettaires.

I1 est possible que d 'autres m6canismes de r6gu- lation puissent ~tre mis en jeu dans la stimulation des plaquettes par les effecteurs exog~nes de l 'agr6gation plaquettaire (thrombine, ionophore 23187, collag~ne, etc...) par exemple en permet- rant l 'accession du calcium au site d'activit6. L ' ac - tivation d 'une phospholipase A~ acide sp6cifique des acides phosphatidiques dont l 'existence a 6t6 montr6e par BiUah et coil [6] r6sulte peut-&re de l 'act ion des produits form6s par la phospholi- pase C sur le phosphatidylinositol selon le sch6ma propos6 par B6r6ziat [20].

I1 serait int6ressant de pouvoir localiser le sys- t~me de la phospholipase activable que nous avons mis en 6vidence.

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