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BIOCHIMIE, 1974, 56, 473-475. Prdsence d'une galactokinase dons les graines germ6es de Fenugrec. Marie-Jos6 lYO6LIE'I"rI et Fran~:~ois P~acnm~ox. Laboratoire de CMmie l~i~loffique, E.R.A. n ° 99 du C.N.R.S. Facultd des Sciences Pbarmueentique$ et Bioloffiques. Universit~ Bv~ii Descartes. 4, avenue de l'Obseroatoire, 75006 Paris. (16-1-197~). De nombreuses graines de L6gumineuses renfer- ment, au lieu d'amidon, des galactomanuanes comme polysaccharides de r6serve. Ce polysaccharide est constitu6 par une chalne centrale compos6e de r6sidus ~-D-mannopyranosyl reli6s entre eux par des liaisons (1--~- 4) et sur lesquels sout branch6es des unit6s a-D-galactopyranosidiques par uue liaison (1 --)* 6). Lors de la germination des graine~ de Fenugrec (Trigonella foenum-graecum, L.), il apparait une acti- vit6 u galactosidasique [1], lib6rant le galaetose partir de la galaetomannane de r~serve. Sql a 6t6 montr6 que le~ V6g~taux sup6rieurs ~taient capables d'utiliser 1¢ galacto,e exog&ne apr~s phosphorylation par une kinase [2, 3, 4~, ~ notre connai~sanee, aucuns travaux n'ont 61~ effeetut!s sue l'utilisatit~u du galaetose endog~ne provenant de l'hydrotyse de galactomannaues de r6serve par les et galaetosidases. Nous d~crivons ici Ia raise en 6vidence, dans les coty16dons et plantules de graines germ6eS de Fenu- gree, d'une galactokinase (ATP : D-galactose-l-phospho- transf6rase, EC 2.7.1.6.) catalysant Ia r6aeti~n : o.-D-galactose Mg2÷ a-o-galact ose-l-phosphate + MgZ+ + ATP ~>" ADP MATERIEL ET METHODES. I) Pr@aration enzymatique. Les graines de Feuugrec, apr6s gonflement dons l'eau (24 heures) sont raises & germer sur eaton pendant 48 heures /t +20°C. Apr6s 61iminatiQn des t~guments et de l'endosperme, les plant~les et cotyledons, corres- pandan,t & 5 g de graines secites, ~ottt broy6s au mar- tier avec du sa]~le et ezx pr6~eace ~e 20 mI d'uu tampon pH 7,50 eonstitu6 par : Tampon Phosphate mona-, di- potassique 0,01 M, ,~ mercaptogthanol 0,0l M, EDTA 0,001 M. Le broyat, pass6 sur gaze, est soumis h une ceutri- fngation h 18.000 g pendant 45 minutes. Le snrnageant de centrifugation, apr6s dialyse contre le tampon d'extraction, constitue la pr6paration enzy- matique, utilis6e pour les essais. L'endosperme des graines, soumis h une extraction identique h celle effectu6e pour les cotyl6dons, conduit h une pr6paration ne pr6sentant aucune activit6 galac- tokinasique. 2) Substrats. L'origine des substrats utilis6s est la suivante : -- Nucl6osides triphosphates (ATP, GTP, CTP, UTP, ITP) : Boehringer, Mannheim, Allemagne. --a-D-galactose [1-1~C] (20,7 mCi/mM) : pr6par6 par le Service des Molecules marquees, C.E.N., Saclay. 3) Milieux enzymatiques. Deux types de milieux r6actionnels ant 6t6 utilis6s : a) l'un avec du galactose x4C~ comme substrat et permettant l'identificatiou des produits de rfiaction, mais aussi certaines mesures d'aetivit6 impossibles par le dosage de I'ADP apparu. b) l'autre avec du galactose non marqu6 comme substrat et permettant la me~ure d'aetivit~ par le do- sage de I'ADP apparu. a) Phosphorylation du galactose ~C. Le milieu r6actionne] est eonstit~6 par : tampon tri- 6thanol-amine 0,5 M, pH 7,50 (10 ~tM), ATP (0,1 .tLM), MgCI~ (0,5 ~M), (x-D-galactose [t-1~C~ (24 X 10-~ ~M, soil 0,5 ~Ci), NaF (0,1 ~M), enzyme (20 Ixl) pour un volume final de 100 i~1. Apr6s nit temps d'ineubation h +25~C variant de 15 minutes h 1 heure, 10 ~p.1du milieu r6actionnel sont chromatographi6s sur papier Sehleicher et Schfill 2043 b Mgl avec le solvant : Isopropanol-M6thyl~thyl- c6tone - Ac6tate d'6thyle - n Butanol - Eau (6:5:3:2:5 en volumes). L'emplacement des produits de r6action est rep6r6 sur les chromatogrammes, salt par autoradiographie (Film radiographique Kodirex, Ets Kodak), salt par .~ scanning >> (cette derni6re technique permettant une ~valuation de l'activit6 enzymatique). b) D~termination de I'actioit~ par le dosaffe de I'ADP apparu. Le milieu r6actionnel est constitu6 par : tampon tri6thanol-amine 0,5 M, pR 7,50 (75 v.M'), ATP (1 ~M), MgC12 (5 ~M), D-galactose (l .~M). NaF (t ~ML enzyme (50 ~xl) pour un volume fi~aI de 500 ~L Apr6s 30 minutes d'incubation ~ +25~C, la r6aetion est arr6t6e par addition de 500 ,tl d'aeide perchlori- que N, glac6. Le surnageant de dfif6cation est additional de 100 ~1 d'une solution de tridthanolamine 0,5 M-earbonate de potassium 0,2 M, aria d'61iminer l'acide perehlorique. Le dosage de I'ADP est ensuite effeetu6 sur 200 ~tl de surnageant par la technique utilisant le syst6me Phospho6nol-pyruvate - Pyruvate-l~inase - Lactieoddshy- drogfnase - NADH [5]. RESULTATS ET DISCUSSION. Identification de l'osylphosphate I~C form& L'incubation d'a-I~-galactose [l-ltC] avec la prepara- tion enzymatique, en p~sence d'ATP et MgCIz, conduit

Présence d'une galactokinase dans les graines germées de Fenugrec

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BIOCHIMIE, 1974, 56, 473-475.

Prdsence d'une galactokinase dons les graines germ6es de Fenugrec.

Mar ie - Jos6 lYO6LIE'I"rI e t Fran~:~ois P ~ a c n m ~ o x .

Laboratoire de CMmie l~i~loffique, E.R.A. n ° 99 du C.N.R.S. Facultd des Sciences Pbarmueent ique$ et Bioloffiques. Universit~ Bv~ii Descartes.

4, avenue de l 'Obseroatoire, 75006 Paris.

(16-1-197~).

De nombreuses graines de L6gumineuses renfer- ment, au lieu d 'amidon, des galactomanuanes comme polysaccharides de r6serve. Ce polysaccharide est constitu6 par une chalne centrale compos6e de r6sidus ~-D-mannopyranosyl reli6s entre eux par des l iaisons ( 1 - - ~ - 4) et sur lesquels sout branch6es des unit6s a-D-galactopyranosidiques par uue l iaison (1 - - ) * 6).

Lors de la germinat ion des graine~ de Fenugrec (Trigonella foenum-graecum, L.), il appara i t une acti- vit6 u galactosidasique [1], l ib6rant le galaetose par t i r de la galaetomannane de r~serve.

Sql a 6t6 montr6 que le~ V6g~taux sup6rieurs ~taient capables d 'ut i l iser 1¢ galacto,e exog&ne apr~s phosphoryla t ion par une kinase [2, 3, 4~, ~ notre connai~sanee, aucuns t ravaux n 'ont 61~ effeetut!s sue l'utilisatit~u du galaetose endog~ne provenant de l 'hydrotyse de galactomannaues de r6serve par les et galaetosidases.

Nous d~crivons ici Ia raise en 6vidence, dans les coty16dons et plantules de graines germ6eS de Fenu- gree, d 'une galactokinase (ATP : D-galactose-l-phospho- transf6rase, EC 2.7.1.6.) cata lysant Ia r6aeti~n :

o.-D-galactose Mg2÷ a-o-galact ose- l -phosphate

+ MgZ+ + ATP ~ > " ADP

MATERIEL ET METHODES.

I) Pr@arat ion enzymat ique . Les graines de Feuugrec, apr6s gonflement dons l 'eau

(24 heures) sont raises & germer sur eaton pendant 48 heures /t +20°C. Apr6s 61iminatiQn des t~guments et de l 'endosperme, les plant~les et cotyledons, corres- pandan,t & 5 g de graines secites, ~ottt broy6s au mar- t ier avec du sa]~le et ezx pr6~eace ~e 20 mI d 'uu tampon pH 7,50 eonstitu6 par : Tampon Phosphate mona- , di- potassique 0,01 M, ,~ mercaptogthanol 0,0l M, EDTA 0,001 M.

Le broyat, pass6 sur gaze, est soumis h une ceutri- fngat ion h 18.000 g pendant 45 minutes.

Le snrnageant de centrifugation, apr6s dialyse contre le t ampon d 'extract ion, consti tue la pr6parat ion enzy- matique, utilis6e pour les essais.

L 'endosperme des graines, soumis h une extract ion identique h celle effectu6e pour les cotyl6dons, conduit h une pr6parat ion ne pr6sentant aucune activit6 galac- tokinasique.

2) Substrats . L'origine des substrats utilis6s est la suivante : - - Nucl6osides t r iphosphates (ATP, GTP, CTP, UTP,

ITP) : Boehringer, Mannheim, Allemagne.

- - a - D - g a l a c t o s e [1-1~C] (20,7 mCi/mM) : pr6par6 par le Service des Molecules marquees, C.E.N., Saclay.

3) Mil ieux enzymat iques .

Deux types de mil ieux r6actionnels ant 6t6 utilis6s : a) l 'un avec du galactose x4C~ comme subst ra t et

pe rme t t an t l ' identif icatiou des produits de rfiaction, mais aussi certaines mesures d'aetivit6 impossibles par le dosage de I'ADP apparu.

b) l 'autre avec du galactose non marqu6 comme substra t et permet tan t la me~ure d'aetivit~ par le do- sage de I'ADP apparu.

a) Phosphory la t ion du galactose ~ C . Le milieu r6actionne] est eonstit~6 par : t ampon t r i -

6thanol-amine 0,5 M, pH 7,50 (10 ~tM), ATP (0,1 .tLM), MgCI~ (0,5 ~M), (x-D-galactose [t-1~C~ (24 X 10-~ ~M, soil 0,5 ~Ci), NaF (0,1 ~M), enzyme (20 Ixl) pour un volume final de 100 i~1.

Apr6s nit temps d ' ineubat ion h +25~C var ian t de 15 minutes h 1 heure, 10 ~p.1 du mil ieu r6actionnel sont chromatographi6s sur papier Sehleicher et Schfill 2043 b Mgl avec le solvant : I sopropanol -M6thyl~ thy l - c6tone - Ac6tate d'6thyle - n Butanol - Eau (6:5:3:2:5 en volumes).

L 'emplacement des produi ts de r6action est rep6r6 sur les chromatogrammes, salt par autoradiographie (Film radiographique Kodirex, Ets Kodak), salt par .~ scanning >> (cette derni6re technique pe rmet tan t une ~valuation de l 'activit6 enzymatique) .

b) D~terminat ion de I'actioit~ par le dosaffe de I 'ADP apparu.

Le milieu r6actionnel est constitu6 par : t ampon t r i6 thanol-amine 0,5 M, pR 7,50 (75 v.M'), ATP (1 ~M), MgC12 (5 ~M), D-galactose (l .~M). NaF (t ~ML enzyme (50 ~xl) pour un volume fi~aI de 500 ~L

Apr6s 30 minutes d ' incubat ion ~ +25~C, la r6aetion est arr6t6e par addi t ion de 500 ,tl d'aeide perchlori- que N, glac6.

Le surnageant de dfif6cation est add i t iona l de 100 ~1 d 'une solut ion de t r id thanolamine 0,5 M - e a r b o n a t e de potass ium 0,2 M, aria d'61iminer l 'acide perehlorique.

Le dosage de I'ADP est ensuite effeetu6 sur 200 ~tl de surnageant par la technique u t i l i sant le syst6me Phospho6nol-pyruvate - Pyruvate-l~inase - Lactieoddshy- drogfnase - NADH [5].

RESULTATS ET DISCUSSION.

Ident i f i ca t ion de l 'osylphosphate I~C form& L'incubat ion d'a-I~-galactose [ l - l tC] avec la prepara-

t ion enzymatique, en p ~s en ce d'ATP et MgCIz, conduit

474 Marie-Josd Foglietti et Francois Percheron.

St la f o r m a t i o n d ' un compos6 radioaet i f de mig ra t i on ident ique St eelle d ' un t~moin d 'ct-D-galactose-l-phos- phate.

Apr6s au torad iographie , l ' emp lacemen t eorrespon- d an t h eerie tache est ~lu6 dn papier /~ l ' eau dist i l ler . L'61uat co neentr6 es t s o u m i s A diffdrents essa i s afin d ' ident i f ier Ie p rodui t form¢ :

1) Le t r a i t e m e n t par ia phospha t a se aeide de P o m m e de Terre condui t k u n eompoz6 radioae t i f de mig ra t i on ident ique St eelle du galactose.

I1 s 'agi t done d ' u n ester phosphor ique de galactose.

2) Cet ester phosphor ique es t acido-labile pu i squ ' i l es t to ta lcment convert i en galactose [1-14C] par t ra i te- m e n t avec H~SO~ 0,02 N (I heure h +ll)0~C).

3) Darts une derni6re exp6rienee, Fester phospho- r ique a pu 6ire t r a n s f o r m 6 en UDP-D-galaetose aprSs incuba t ion en presence d 'UDP-D-glucose et de galac- t o se - l - p h o sp h a t e u r idy l t r ans f6 ra se d 'h~mat ies h u m a i - lies.

La eh romatograph ie dn mi l i eu rdact ionnel rdv61c la pr6sence d ' u n compos6 radioact i f de m i g r a t i o n iden- t ique St eelle d ' u n t6moin d 'UDP-o-galaetose.

Apr6s 61ution de l ' emplaeemen t eo r respondan t eette tache, le p rodu i t form~ a ~t6 earaet6ris6 par les proe6d~s su ivan t s :

a) Apr6s cochromatograph ie avee u n t6moin non marqu6 d 'UDP-n-galaetose , l 'emplaeemen.t du corps radioac t i f coincide aver eelui du tdmoin.

b) La eh romatograph ie de l ' hydro lysa t (H_~SO~ 0,02 N, 1 henre h +100~C) pe rme t d ' ident i f ier du galactose radio.aetif, eoehromatographi~ aver u a tdm,oin de go- lactose n~n marqt t&

c) Apr~s h y d ro ly se e a z y m a t i q u e pa r la phosph~- diest6rase de v e n i n de serpent , la eh roma tog raph i e de l ' hydro lysa t pc rmet d ' identif ier du ga lae tose - l -phos - pha te radioaet i f , cochromatographi6 avec un t6moin rmn marqu6.

Ces 3 essais pe rme t t en t done de eonclnre h la for- m a t i o n d 'UDP-n-ga lac tose /~ pa r t i r de Fester phospho- r ique o]~tenu par aet i tm de la ga lac tokinase de Fenu- gree.

L 'u r idy l t r ans f6 rase d 'h6mat ies 6taut spdeifique de ECt-D-galactose-l-phosphate, la convers ion de Fester phosphor ique synth6t i s6 par l ' enzyme de Fenugrec en UDP-D-galactose pe rmet de eonelure que le galaetosyl- phospha te form6 poss6de la conf igura t ion a.

Propri~tds de l 'enzyme.

La pr6para t ion enzyma t ique n 'es t active que si l ' ex t rac t ion est effectu6e en presence d 'un r fduc teur .

Nous avons eonstat6 la n6cessit6 d 'ex t ra i re Fen- zyme dans un mil ieu r en fe r r aan t du ~ mercapto6thanoL Le choix du r6aetif r~dueteur n 'es t pas indiff6rent pu i sque si le di thiothr6i tol pout r emplacer le ~_ mer- capto~thanol , ]a eyst~ine s 'es t r6v~l~e ineffieace.

Une pr6para t ion r~alisde en t 'absence de r6dt~cfeur s 'es t mont r~e eompl~tememt inact ive et n 'es t pas r~ae- £iv~e par l ' addi t ion ui t6r teure de ~ mereap tod thana l au m o m e n t des essais enzymat iques .

On pout done penser que ]a ga lac tokinase n 'es t s table que dans un mi l ieu s u f f i s a m m e n t r6dueteur.

pH opt imum.

D6termiu~ en presence de t a m p o n t r i 6 thano lamine - HC1 0,5 M, il se s i tue entre pH 7~30- 7,60. Cette zone

d 'activit6 est sens ib lemcnt ana logue aux pH o p t i m a u x des au t res ga lae tokinases d6jtt 6tudides, qu 'e l les soient d 'or ig ines bact6r ienne ou an imale .

In f luence des cations diualents.

L'activit~ es t m a x i m a l e e n pr6sence d 'une concen- t ra t ion de 5 m~M (rappor t ATP/MgCL = I /5) . Cepen- dant , torsque les ions Mg2÷ soar absen t s dn mi l i eu r6act ionnel , la pc6sence de ga lac tose - l -phospha te a pu ~tre d~cel~e.

En pr6senee d ' ions Mn2*, la quan t i t6 de galaetose-1- phospha te n ' e s t que de 27 p. cent par rappor t h cello form6e en pr6senee d ' ions Mg2~.

Les ions Ca2~ et CO2* sont sans effet.

Sp~cificitd de substrats .

Outre le galactose, [a ga lac tokinase de Fenngrec est capable de cata lyzer la phosphory l a t i on de la n-galac- t o sa mine et du n-arabi~ose.

Pour une concent ra t ion en oses de 2 raM, les vi tesses re la t ives de r~action soul los su ivan tes : D-galactose (100), D-galactosamine (64), n -a rab inose (20).

Le D-arabinose n 'es t pas un subs t r a t pour l ' enzyme.

L'ATP est le dona tcu r sp6cifique du groupe phos- phate. Pa rmi los nuet~osides t r i phospha t e s essay6s (GTP, ITP, CTP, UTP), seul I 'UTP condui t St la f o rma- t ion d 'une foible quant i t6 de ga lae tose - l -phospha te (5 p. cent pa r rappor t h cello formde en presence d 'ATP corn.me donateur) .

CONCLUSI~ONS.

La raise en gvidenee d 'une acHvit6 ga tae tok inas ique ehez los g ra ines germ~es de Fenugrec v ien t expl iqner l ' u t i l i s a t i on du galactose lib6r6 pa r l ' a ga lac tos idase tt pa r t i r de la g a l a c t o m a n n a n e de r6serve.

En prgsenee de D-galaetose, d 'ATP et d ' ions Mg2+, eette enzyme eatalyse la f o r m a t i o n d 'a-D-galactose-1- phosphate .

La phosphory la t ion du D-galaetose en a-D-galactnsc- 1-phosphate est une rgaet ion bien eonnue ehez los Marr~mif&res oh une activit6 de ee type a 6t6 d6crite au n iveau du foie de Pore [6], des hdmat ies [7] et du p lacenta [8] h u m a i n s , ma t s auss i chez les micro- o rgan i smes , en par t icul ier les Levures [9, 10] et E. colt [11].

Pa r eontre, l ' i n t c rven t ion d 'une ga lac tokinase lo ts de l ' u t i l i s a t ion du galactose d 'un polysaechar ide de r6- serve v6g6tal ne semble pas, St notre connaissance , avoir dt6 s ignaler j u squ ' a l o r s .

Remereiernents.

Nous ad re s sons tous rtos r cmerc i emen t s tt Mons ieur le P ro fes seu r J. E. Courtois /tour I ' int6r~t qu'iI a portd h c e t ravai l .

BIBL[OGRAPHIE.

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BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 3.

Galac tok inase de graines . 4 7 5

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