BIOCHIMIE, 1974, 56, 473-475.

Prdsence d'une galactokinase dons les graines germ6es de Fenugrec.

Mar ie - Jos6 lYO6LIE'I"rI e t Fran~:~ois P ~ a c n m ~ o x .

Laboratoire de CMmie l~i~loffique, E.R.A. n ° 99 du C.N.R.S. Facultd des Sciences Pbarmueent ique$ et Bioloffiques. Universit~ Bv~ii Descartes.

4, avenue de l 'Obseroatoire, 75006 Paris.

(16-1-197~).

De nombreuses graines de L6gumineuses renfer- ment, au lieu d 'amidon, des galactomanuanes comme polysaccharides de r6serve. Ce polysaccharide est constitu6 par une chalne centrale compos6e de r6sidus ~-D-mannopyranosyl reli6s entre eux par des l iaisons ( 1 - - ~ - 4) et sur lesquels sout branch6es des unit6s a-D-galactopyranosidiques par uue l iaison (1 - - ) * 6).

Lors de la germinat ion des graine~ de Fenugrec (Trigonella foenum-graecum, L.), il appara i t une acti- vit6 u galactosidasique [1], l ib6rant le galaetose par t i r de la galaetomannane de r~serve.

Sql a 6t6 montr6 que le~ V6g~taux sup6rieurs ~taient capables d 'ut i l iser 1¢ galacto,e exog&ne apr~s phosphoryla t ion par une kinase [2, 3, 4~, ~ notre connai~sanee, aucuns t ravaux n 'ont 61~ effeetut!s sue l'utilisatit~u du galaetose endog~ne provenant de l 'hydrotyse de galactomannaues de r6serve par les et galaetosidases.

Nous d~crivons ici Ia raise en 6vidence, dans les coty16dons et plantules de graines germ6eS de Fenu- gree, d 'une galactokinase (ATP : D-galactose-l-phospho- transf6rase, EC 2.7.1.6.) cata lysant Ia r6aeti~n :

o.-D-galactose Mg2÷ a-o-galact ose- l -phosphate

+ MgZ+ + ATP ~ > " ADP

MATERIEL ET METHODES.

I) Pr@arat ion enzymat ique . Les graines de Feuugrec, apr6s gonflement dons l 'eau

(24 heures) sont raises & germer sur eaton pendant 48 heures /t +20°C. Apr6s 61iminatiQn des t~guments et de l 'endosperme, les plant~les et cotyledons, corres- pandan,t & 5 g de graines secites, ~ottt broy6s au mar- t ier avec du sa]~le et ezx pr6~eace ~e 20 mI d 'uu tampon pH 7,50 eonstitu6 par : Tampon Phosphate mona- , di- potassique 0,01 M, ,~ mercaptogthanol 0,0l M, EDTA 0,001 M.

Le broyat, pass6 sur gaze, est soumis h une ceutri- fngat ion h 18.000 g pendant 45 minutes.

Le snrnageant de centrifugation, apr6s dialyse contre le t ampon d 'extract ion, consti tue la pr6parat ion enzy- matique, utilis6e pour les essais.

L 'endosperme des graines, soumis h une extract ion identique h celle effectu6e pour les cotyl6dons, conduit h une pr6parat ion ne pr6sentant aucune activit6 galac- tokinasique.

2) Substrats . L'origine des substrats utilis6s est la suivante : - - Nucl6osides t r iphosphates (ATP, GTP, CTP, UTP,

ITP) : Boehringer, Mannheim, Allemagne.

- - a - D - g a l a c t o s e [1-1~C] (20,7 mCi/mM) : pr6par6 par le Service des Molecules marquees, C.E.N., Saclay.

3) Mil ieux enzymat iques .

Deux types de mil ieux r6actionnels ant 6t6 utilis6s : a) l 'un avec du galactose x4C~ comme subst ra t et

pe rme t t an t l ' identif icatiou des produits de rfiaction, mais aussi certaines mesures d'aetivit6 impossibles par le dosage de I'ADP apparu.

b) l 'autre avec du galactose non marqu6 comme substra t et permet tan t la me~ure d'aetivit~ par le do- sage de I'ADP apparu.

a) Phosphory la t ion du galactose ~ C . Le milieu r6actionne] est eonstit~6 par : t ampon t r i -

6thanol-amine 0,5 M, pH 7,50 (10 ~tM), ATP (0,1 .tLM), MgCI~ (0,5 ~M), (x-D-galactose [t-1~C~ (24 X 10-~ ~M, soil 0,5 ~Ci), NaF (0,1 ~M), enzyme (20 Ixl) pour un volume final de 100 i~1.

Apr6s nit temps d ' ineubat ion h +25~C var ian t de 15 minutes h 1 heure, 10 ~p.1 du mil ieu r6actionnel sont chromatographi6s sur papier Sehleicher et Schfill 2043 b Mgl avec le solvant : I sopropanol -M6thyl~ thy l - c6tone - Ac6tate d'6thyle - n Butanol - Eau (6:5:3:2:5 en volumes).

L 'emplacement des produi ts de r6action est rep6r6 sur les chromatogrammes, salt par autoradiographie (Film radiographique Kodirex, Ets Kodak), salt par .~ scanning >> (cette derni6re technique pe rmet tan t une ~valuation de l 'activit6 enzymatique) .

b) D~terminat ion de I'actioit~ par le dosaffe de I 'ADP apparu.

Le milieu r6actionnel est constitu6 par : t ampon t r i6 thanol-amine 0,5 M, pR 7,50 (75 v.M'), ATP (1 ~M), MgC12 (5 ~M), D-galactose (l .~M). NaF (t ~ML enzyme (50 ~xl) pour un volume fi~aI de 500 ~L

Apr6s 30 minutes d ' incubat ion ~ +25~C, la r6aetion est arr6t6e par addi t ion de 500 ,tl d'aeide perchlori- que N, glac6.

Le surnageant de dfif6cation est add i t iona l de 100 ~1 d 'une solut ion de t r id thanolamine 0,5 M - e a r b o n a t e de potass ium 0,2 M, aria d'61iminer l 'acide perehlorique.

Le dosage de I'ADP est ensuite effeetu6 sur 200 ~tl de surnageant par la technique u t i l i sant le syst6me Phospho6nol-pyruvate - Pyruvate-l~inase - Lactieoddshy- drogfnase - NADH [5].

RESULTATS ET DISCUSSION.

Ident i f i ca t ion de l 'osylphosphate I~C form& L'incubat ion d'a-I~-galactose [ l - l tC] avec la prepara-

t ion enzymatique, en p ~s en ce d'ATP et MgCIz, conduit

474 Marie-Josd Foglietti et Francois Percheron.

St la f o r m a t i o n d ' un compos6 radioaet i f de mig ra t i on ident ique St eelle d ' un t~moin d 'ct-D-galactose-l-phos- phate.

Apr6s au torad iographie , l ' emp lacemen t eorrespon- d an t h eerie tache est ~lu6 dn papier /~ l ' eau dist i l ler . L'61uat co neentr6 es t s o u m i s A diffdrents essa i s afin d ' ident i f ier Ie p rodui t form¢ :

1) Le t r a i t e m e n t par ia phospha t a se aeide de P o m m e de Terre condui t k u n eompoz6 radioae t i f de mig ra t i on ident ique St eelle du galactose.

I1 s 'agi t done d ' u n ester phosphor ique de galactose.

2) Cet ester phosphor ique es t acido-labile pu i squ ' i l es t to ta lcment convert i en galactose [1-14C] par t ra i te- m e n t avec H~SO~ 0,02 N (I heure h +ll)0~C).

3) Darts une derni6re exp6rienee, Fester phospho- r ique a pu 6ire t r a n s f o r m 6 en UDP-D-galaetose aprSs incuba t ion en presence d 'UDP-D-glucose et de galac- t o se - l - p h o sp h a t e u r idy l t r ans f6 ra se d 'h~mat ies h u m a i - lies.

La eh romatograph ie dn mi l i eu rdact ionnel rdv61c la pr6sence d ' u n compos6 radioact i f de m i g r a t i o n iden- t ique St eelle d ' u n t6moin d 'UDP-o-galaetose.

Apr6s 61ution de l ' emplaeemen t eo r respondan t eette tache, le p rodu i t form~ a ~t6 earaet6ris6 par les proe6d~s su ivan t s :

a) Apr6s cochromatograph ie avee u n t6moin non marqu6 d 'UDP-n-galaetose , l 'emplaeemen.t du corps radioac t i f coincide aver eelui du tdmoin.

b) La eh romatograph ie de l ' hydro lysa t (H_~SO~ 0,02 N, 1 henre h +100~C) pe rme t d ' ident i f ier du galactose radio.aetif, eoehromatographi~ aver u a tdm,oin de go- lactose n~n marqt t&

c) Apr~s h y d ro ly se e a z y m a t i q u e pa r la phosph~- diest6rase de v e n i n de serpent , la eh roma tog raph i e de l ' hydro lysa t pc rmet d ' identif ier du ga lae tose - l -phos - pha te radioaet i f , cochromatographi6 avec un t6moin rmn marqu6.

Ces 3 essais pe rme t t en t done de eonclnre h la for- m a t i o n d 'UDP-n-ga lac tose /~ pa r t i r de Fester phospho- r ique o]~tenu par aet i tm de la ga lac tokinase de Fenu- gree.

L 'u r idy l t r ans f6 rase d 'h6mat ies 6taut spdeifique de ECt-D-galactose-l-phosphate, la convers ion de Fester phosphor ique synth6t i s6 par l ' enzyme de Fenugrec en UDP-D-galactose pe rmet de eonelure que le galaetosyl- phospha te form6 poss6de la conf igura t ion a.

Propri~tds de l 'enzyme.

La pr6para t ion enzyma t ique n 'es t active que si l ' ex t rac t ion est effectu6e en presence d 'un r fduc teur .

Nous avons eonstat6 la n6cessit6 d 'ex t ra i re Fen- zyme dans un mil ieu r en fe r r aan t du ~ mercapto6thanoL Le choix du r6aetif r~dueteur n 'es t pas indiff6rent pu i sque si le di thiothr6i tol pout r emplacer le ~_ mer- capto~thanol , ]a eyst~ine s 'es t r6v~l~e ineffieace.

Une pr6para t ion r~alisde en t 'absence de r6dt~cfeur s 'es t mont r~e eompl~tememt inact ive et n 'es t pas r~ae- £iv~e par l ' addi t ion ui t6r teure de ~ mereap tod thana l au m o m e n t des essais enzymat iques .

On pout done penser que ]a ga lac tokinase n 'es t s table que dans un mi l ieu s u f f i s a m m e n t r6dueteur.

pH opt imum.

D6termiu~ en presence de t a m p o n t r i 6 thano lamine - HC1 0,5 M, il se s i tue entre pH 7~30- 7,60. Cette zone

d 'activit6 est sens ib lemcnt ana logue aux pH o p t i m a u x des au t res ga lae tokinases d6jtt 6tudides, qu 'e l les soient d 'or ig ines bact6r ienne ou an imale .

In f luence des cations diualents.

L'activit~ es t m a x i m a l e e n pr6sence d 'une concen- t ra t ion de 5 m~M (rappor t ATP/MgCL = I /5) . Cepen- dant , torsque les ions Mg2÷ soar absen t s dn mi l i eu r6act ionnel , la pc6sence de ga lac tose - l -phospha te a pu ~tre d~cel~e.

En pr6senee d ' ions Mn2*, la quan t i t6 de galaetose-1- phospha te n ' e s t que de 27 p. cent par rappor t h cello form6e en pr6senee d ' ions Mg2~.

Les ions Ca2~ et CO2* sont sans effet.

Sp~cificitd de substrats .

Outre le galactose, [a ga lac tokinase de Fenngrec est capable de cata lyzer la phosphory l a t i on de la n-galac- t o sa mine et du n-arabi~ose.

Pour une concent ra t ion en oses de 2 raM, les vi tesses re la t ives de r~action soul los su ivan tes : D-galactose (100), D-galactosamine (64), n -a rab inose (20).

Le D-arabinose n 'es t pas un subs t r a t pour l ' enzyme.

L'ATP est le dona tcu r sp6cifique du groupe phos- phate. Pa rmi los nuet~osides t r i phospha t e s essay6s (GTP, ITP, CTP, UTP), seul I 'UTP condui t St la f o rma- t ion d 'une foible quant i t6 de ga lae tose - l -phospha te (5 p. cent pa r rappor t h cello formde en presence d 'ATP corn.me donateur) .

CONCLUSI~ONS.

La raise en gvidenee d 'une acHvit6 ga tae tok inas ique ehez los g ra ines germ~es de Fenugrec v ien t expl iqner l ' u t i l i s a t i on du galactose lib6r6 pa r l ' a ga lac tos idase tt pa r t i r de la g a l a c t o m a n n a n e de r6serve.

En prgsenee de D-galaetose, d 'ATP et d ' ions Mg2+, eette enzyme eatalyse la f o r m a t i o n d 'a-D-galactose-1- phosphate .

La phosphory la t ion du D-galaetose en a-D-galactnsc- 1-phosphate est une rgaet ion bien eonnue ehez los Marr~mif&res oh une activit6 de ee type a 6t6 d6crite au n iveau du foie de Pore [6], des hdmat ies [7] et du p lacenta [8] h u m a i n s , ma t s auss i chez les micro- o rgan i smes , en par t icul ier les Levures [9, 10] et E. colt [11].

Pa r eontre, l ' i n t c rven t ion d 'une ga lac tokinase lo ts de l ' u t i l i s a t ion du galactose d 'un polysaechar ide de r6- serve v6g6tal ne semble pas, St notre connaissance , avoir dt6 s ignaler j u squ ' a l o r s .

Remereiernents.

Nous ad re s sons tous rtos r cmerc i emen t s tt Mons ieur le P ro fes seu r J. E. Courtois /tour I ' int6r~t qu'iI a portd h c e t ravai l .

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