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Procédures d’échantillonnagedes eaux souterraines en vue

d’une analyse microbiologiqueÉtat de l’Art

Rapport final

BRGM/RP-56405-FRavril 2008

Procédures d’échantillonnagedes eaux souterraines en vue

d’une analyse microbiologiqueÉtat de l’Art

Rapport final

BRGM/RP-56405-FRavril 2008

Étude réalisée dans le cadre des projetsde recherche du BRGM 2007-2008

C. BerhoAvec la collaboration de

F. Garrido, S. Roy

Vérificateur :

Nom : C. CROUZET

Date :10/12/08

Signature :

Approbateur :

Nom : G.HERVOUËT

Date :

Signature :

En l’absence de signature, notamment pour les rapports diffusés en version numérique,l’original signé est disponible aux Archives du BRGM.

Le système de management de la qualité du BRGM est certifié AFAQ ISO 9001:2000.

Mots clés : Eau souterraine, Échantillonnage microbiologique, Bactérie, État de l’art. En bibliographie, ce rapport sera cité de la façon suivante : Berho C. (2008) – Procédures d’échantillonnage des eaux souterraines en vue d’une analyse microbiologique. État de l’Art. Rapport final BRGM/RP-56405-FR, 26 p. © BRGM, 2008, ce document ne peut être reproduit en totalité ou en partie sans l’autorisation expresse du BRGM.

Procédures d’échantillonnage des eaux souterraines en vue d’une analyse microbiologique - État de l’Art

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Synthèse

Dans le cadre d’une amélioration constante du contrôle de la pollution des eaux, la Direction de la Recherche a souhaité, au travers des projets cadres METRENV 2007 et METRO 2008 et du projet cible « mesure sur site » s’intéresser au développement de méthodologies d’échantillonnage fiables et efficaces des eaux souterraines. Une partie de ce projet cible est dédiée à l’échantillonnage des matériaux dits « biologiques » et plus particulièrement les bactéries. La première étape est en conséquence la réalisation d’un état de l’art portant sur les différentes méthodologies et procédures utilisées pour l’échantillonnage microbiologique des eaux souterraines afin de pouvoir à terme proposer une méthodologie d’échantillonnage fiable, efficace et pertinente.

Ce rapport s’attache à présenter les difficultés liées au prélèvement microbiologique ainsi que la pratique la plus couramment utilisée à savoir l’échantillonnage au travers d’un puits en abordant les étapes allant du prélèvement lui-même jusqu’au transport et à la conservation des échantillons avant l’analyse en laboratoire.



Sommaire

1. Problématique...............................................................................................7

2. Objectifs de l’échantillonnage microbiologique ........................................9

3. Échantillonnage dans des puits ou forages.............................................11

3.1. LOCALISATION DU PUITS...............................................................................11

3.2. MÉTHODES DE CONSTRUCTION DU FORAGE ............................................12

3.3. PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS ................................................................12 3.3.1. Pompage et effet de puits ......................................................................12 3.3.2. Matériel ..................................................................................................13 3.3.3. Protocole d’échantillonnage ...................................................................17

3.4. TRANSPORT ET CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS ............................19

4. Conclusion ..................................................................................................21

5. Bibliographie...............................................................................................23

Annexe 1 - Principales étapes de l’échantillonnage de matériaux dits « biologiques » (bactéries) dans une eau souterraine..............................25



1. Problématique

La mise en place au BRGM de projets de recherche consacrés à la caractérisation des processus biogéochimiques et géomicrobiologiques, notamment pour caractériser les principales réactions ayant lieu dans les aquifères, et dans le sous-sol en général, nécessite, entre autre, de développer et de maîtriser des méthodologies d’échantillonnage garantissant l’intégrité des échantillons sur lesquels seront réalisées des analyses et des études expérimentales.

Dans ce contexte, la Direction de la Recherche a souhaité, au travers des projets cadres METRENV 2007 et METRO 2008 et du projet cible « mesure sur site » s’intéresser au développement de méthodologies d’échantillonnage fiables et efficaces des eaux souterraines. Une partie du projet cible est plus particulièrement dédiée l’échantillonnage des matériaux dits « biologiques » et plus particulièrement les bactéries. En effet, l’échantillonnage des eaux souterraines constitue un enjeu important, notamment dans le but de caractériser leur état microbiologique ou les réactions bactériennes directes ou indirectes qui peuvent avoir lieu, au sein des aquifères, au contact de phases minérales ou de polluants. Avant même d’évoquer les différentes analyses microbiologiques qui pourront être réalisées, un véritable enjeu réside dans l’optimisation de la représentativité de l’échantillonnage qui permettrait de garantir le prélèvement d’un nombre à la fois limité d’échantillons mais représentatif de l’hétérogénéité des aquifères. Cette optimisation de la stratégie d’échantillonnage est primordiale pour garantir l’intérêt et la pertinence des études qui en découlent, notamment pour extrapoler les résultats obtenus en laboratoire vers le terrain. Il est très vraisemblable que cette optimisation de la stratégie d’échantillonnage des eaux souterraines ne peut se faire qu’en associant différents niveaux d’expertises (hydrogéologues, chimistes, géochimistes, microbiologistes…).

Il est bien connu que l’activité biologique est susceptible d’influencer le devenir des polluants dans la subsurface, ce qui explique l’intérêt de connaître les bactéries et les processus biologiques impliqués (McNabb et Mallard, 1984 ; Azadpour-Keeley, 2005). Bien que les technologiques de forage et de carottage aient permis des avancées dans la connaissance de la microbiologie de la subsurface (essentiellement pour une profondeur inférieure à 100 m), l’obtention d’échantillons d’eaux et de solides représentatifs de la subsurface constitue un obstacle majeur dans le cadre d’études microbiologiques et géochimiques (Frederickson et Phelps, 1997). La microbiologie des eaux souterraines reste relativement connue en comparaison avec l’activité microbienne du sol impliquée dans les cycles biogéochimiques des éléments (carbone, sulfure, azote) (Azadpour-Keeley, 2005). Elle suscite également moins d’intérêt que celle des eaux de surface (McNabb et Mallard, 1984). Une des raisons qui peut être invoquée est notamment les difficultés de l’étape d’échantillonnage telles que la mise en œuvre de techniques de forage et de carottage spécifiques associés à des coûts élevés ce qui rend couteux et difficile l’obtention d’un nombre d’échantillons suffisant pour étudier la répartition spatiale des microorganismes dans la subsurface (McNabb et Mallard, 1984 ; Frederickson et Phelps, 1997). D’autre part, la difficulté du prélèvement d’un échantillon microbiologique est double : non seulement l’échantillon

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prélevé doit être représentatif du milieu à étudier comme pour tout échantillon, mais il ne doit pas être contaminé par des microorganismes étrangers au milieu d’étude au cours de l’étape de prélèvement (McNabb et Mallard, 1984 ; Chapelle, 2000). L’échantillonnage d’une eau souterraine pour analyse microbiologique est donc une étape délicate qui requiert une attention toute particulière de façon à éviter toute contamination (Britton et Gresson, 1987 ; Thierrin et al. 2003).

L’objectif de ce rapport est de réaliser un état de l’art bibliographique des technologies et méthodologies existantes pour le prélèvement des eaux souterraines en vue d’une analyse microbiologique (bactéries) afin de pouvoir proposer une méthodologie d’échantillonnage, de transport et de conservation optimale des échantillons depuis le terrain jusqu’au laboratoire. Seules les spécificités du prélèvement d’eau souterraine en vue d’une analyse microbiologique sont exposées. Les bonnes pratiques générales en matière d’échantillonnage des eaux souterraines ne sont pas rappelées.



2. Objectifs de l’échantillonnage microbiologique

Il est tout d’abord primordial de définir quel est l’objectif général de l’échantillonnage microbiologique d’une eau souterraine avant de proposer une procédure d’échantillonnage. Les raisons de la recherche des microorganismes peuvent être diverses et variées. L’analyse microbiologique peut avoir plusieurs objectifs tels que (Azadpour-Keeley, 2005 ; McNabb et Mallard, 1984 ; norme NF EN ISO 19458, 2006) :

- définir les conditions favorables à la multiplication ou à la mort des bactéries ;

- déterminer les facteurs environnementaux affectant le transport et la survie de microorganismes étudiés ;

- définir la distribution horizontale ou verticale de pathogènes ou d’organismes indicateurs dans la subsurface ;

- connaître la qualité de l’eau telle qu’elle sera utilisée et détecter les pathogènes présents dans une alimentation d’eau potable ;

- connaître la qualité de l’eau du puits et/ou étudier la stratification biologique dans un puits ;

- connaître la qualité de l’eau souterraine et/ou analyser des microorganismes présents dans un aquifère ;

- concevoir des actions de remédiation du sol ou de l’eau souterraine ;

- déterminer la capacité des bactéries à dégrader les contaminants présents dans les eaux souterraines et le sol ou leur contribution dans le transport et le devenir des polluants.

La stratégie d’échantillonnage doit donc être adaptée en fonction de l’objectif final de l’étude. En général, l’échantillonnage d’une eau souterraine est effectué dans un puits mais celle-ci peut également jaillir naturellement à la surface sous forme de sources superficielles ou peu profondes. Dans ce cas, il est possible d’utiliser le même matériel que pour des eaux de surface. Ces sources ne reflétant probablement pas précisément la population bactérienne présente dans la subsurface, ce cas ne sera donc pas traité dans ce rapport. En adéquation avec les besoins du service EPI, l’état de l’art est consacré à l’échantillonnage microbiologique des eaux souterraines en vue de l’analyse de bactéries présentes dans l’aquifère au travers de puits ou de forages.

De la même manière, les analyses microbiologiques réalisées sur les échantillons d’eaux souterraines dépendent de la problématique de l’étude et sont généralement les suivantes :

- quantification de la biomasse bactérienne ;

- étude de la biodiversité totale ;

- étude de la biodiversité fonctionnelle ;

- isolement et caractérisation de certains micro-organismes d’intérêts ;



- caractérisation des réactions de dissolution/précipitation et oxydation/réduction en lien avec la mobilité et la transformation de polluants organiques et inorganiques.

Elles visent soit à déterminer la microflore bactérienne totale soit certains types de bactéries (aérobies, anaérobies, hétérotrophes, autotrophes…).



3. Échantillonnage dans des puits ou forages

L’échantillonnage des eaux souterraines au travers de puits ou de forage est probablement la méthode la plus facile à mettre en œuvre. Elle constitue un moyen efficace pour évaluer les propriétés microbiologiques et géochimiques d’un aquifère à des échelles locales ou régionales. En effet, en comparaison avec la collecte d’échantillons issus de carottage, elle fournit une flexibilité considérable en termes de lieux d’échantillonnage ou de nombre d’échantillons et peut constituer une alternative à l’échantillonnage de solides de la subsurface lorsque celui-ci ne peut pas être effectué. Elle présente cependant des inconvénients bien connus (Frederickson et Phelps, 1997 ; Chapelle, 2000 ; Britton et Gresson, 1987 ; McNabb et Mallard, 1984) :

- Le forage du puits est susceptible d’entraîner une contamination du milieu à étudier. En effet, des bactéries peuvent être inoculées dans le milieu au cours du forage et de la construction du puits. Il sera alors difficile de discriminer les microorganismes propres au milieu, de ceux introduits au cours de l’opération de forage.

- Le forage lui-même constitue une modification du milieu, l’eau à proximité du puits n’étant probablement plus représentative de l’eau souterraine, on parle d’effet de puits. Par exemple, l’introduction d’oxygène est susceptible de modifier la diversité microbiologique de manière qualitative ou quantitative (prolifération de bactéries aérobies en milieu naturellement anaérobie par exemple).

- Le dernier inconvénient plus théorique concerne la représentativité des bactéries présentes dans les eaux. En effet, la plupart des bactéries sont liés aux sédiments de subsurface et la relation entre les microorganismes dans l’eau souterraine et ceux dans les sédiments n’est pas identifiée. À titre d’exemple, Hazan et al., (1991) ont montré que les sédiments d’un aquifère oligotrophe présentent des communautés bactériennes caractéristiques et denses qui ne reflètent pas celles présentes dans l’eau souterraine, ce qui implique que l’échantillonnage des communautés bactériennes dans les sédiments est incontournable dans le cadre d’études de biorémédiation in situ.

Il existe donc de nombreux facteurs tels que la localisation du puits dans l’aquifère, la construction du forage, et les procédures d’échantillonnage mises en œuvre qui peuvent influencer les données microbiologiques lors de prélèvements d’eaux souterraines dans des puits (McNabb et Mallard, 1984). Aussi, la mise en place d’un plan d’échantillonnage microbiologique approfondi intégrant les conditions hydrogéologiques du milieu, la mesure des paramètres physico-chimiques et chimiques, est indispensable dans le cadre de l’évaluation de l’impact d’activités humaines sur la qualité de l’eau souterraine par exemple (Azadpour-Keeley, 2005).

3.1. LOCALISATION DU PUITS

Comme pour la mise en place d’un programme d’échantillonnage en vue d’une analyse chimique, la définition et la conduite des programmes d’échantillonnage microbiologique doivent absolument prendre en considération les conditions



hydrogéologiques du milieu puisque celles-ci conditionnent le choix de l’équipement et la position des points de prélèvement (Azadpour-Keeley, 2005). D’autre part, la connaissance de la position du puits au sein de l’aquifère est indispensable afin d’interpréter au mieux les données collectées tant microbiologiques que chimiques (McNabb et Mallard, 1984). Dans le cadre du suivi d’une contamination par exemple, il est bien évident que les puits doivent être situés dans le panache de pollution ainsi qu’à l’extérieur de ce panache afin d’en évaluer l’impact (McNabb et Mallard, 1984 ; Azadpour-Keeley, 2005). Il est également important de tenir compte de la présence d’autres types de puits (puits d’irrigation, puits d’AEP) dont le pompage pourrait altérer le mouvement du panache dans l’aquifère. Le nombre et la localisation des puits de monitoring sont à déterminer en fonction de la géométrie du panache, du débit de l’eau souterraine et du degré de confiance requis pour éventuellement démontrer le phénomène d’atténuation naturelle (durée, efficacité) (Azadpour-Keeley, 2005).

3.2. MÉTHODES DE CONSTRUCTION DU FORAGE

Les méthodes de construction d’un forage ont également une influence sur la microbiologie des eaux échantillonnées. Les travaux de forage sont généralement réalisés dans des conditions non aseptisées et l’utilisation de forage rotary à la boue, classiquement utilisé pour le forage de puits AEP ou pétrolier, est à proscrire pour la construction de puits de monitoring destinés à l’échantillonnage microbiologique. En effet, les fluides de forage contiennent des bactéries et d’autres additifs potentiellement sources de nutriments pour ces bactéries exogènes au milieu d’étude. Si ce type de construction de forage est tout de même nécessaire, il est recommandé d’introduire des traceurs dans la boue de forage pour évaluer la contamination biologique potentielle induite par l’opération de forage. D’autre part, le tubage de puits de monitoring doit être composé de matériel inerte (téflon, acier inoxydable, polystyrène, carreau de céramique) de façon à ne pas altérer la composition des échantillons. Enfin, avant la construction du puits, le tubage ainsi que les matériaux du massif filtrant placé dans l’espace annulaire autour de la crépine doivent être nettoyés à l’eau ou au détergent puis rincés à l’eau distillée (McNabb et Mallard, 1984, Azadpour-Keeley, 2005). L’utilisation de désinfectant est à proscrire si des analyses chimiques sont également envisagées (McNabb et Mallard, 1984).

3.3. PRÉLÈVEMENT D’ÉCHANTILLONS

Dans les meilleures circonstances, on considère que l’accès à l’eau souterraine à analyser se fait par un puits bien positionné et bien construit de façon à ce que l’eau présente dans le puits soit représentative de l’aquifère. Il reste donc à prélever un échantillon représentatif sans le contaminer au cours de l’opération de prélèvement (McNabb et Mallard, 1984 ; Azadpour-Keeley, 2005).

3.3.1. Pompage et effet de puits

Le pompage pour le prélèvement d'échantillons d'eau dans un forage constitue la technique la plus pratique et la plus communément utilisée. Il peut exister des forages équipés d’un dispositif permanent de pompage et en général munis d’un robinet ou



d’une sortie métallique permettant le prélèvement mais également des forages sans dispositif (norme NF EN ISO 19458, 2006).

La première difficulté de l’opération est de prélever un échantillon microbiologique représentatif car le pompage et l’échantillonnage lui-même sont sources de perturbations telles que la perturbation de la colonne d’eau lors du pompage, la remise en suspension de particules, l’introduction de gaz atmosphériques, le dégazage de l’eau, l’apport de matériaux de la paroi du puits par les forces physiques générés par le pompage ou encore celui de biofilms constitués par des bactéries exogènes au milieu qui se seraient développés dans le puits (dans le casing ou le massif filtrant) (Frederickson et Phelps, 1997 ; Azadpour-Keeley, 2005 ; Roy Cullimore, 2007). Une étude récente de Kwon et al., 2008 laisse supposer que la zone pour laquelle le puits influence les paramètres biologiques serait plus étendue que celle pour les paramètres physico-chimiques : alors que les paramètres physico chimiques (pH, température, potentiel d’oxydoréduction) peuvent être stables après une purge équivalente à 5 fois le volume du puits, d’autres paramètres biologiques (profil de la communauté microbienne) ou chimiques sensibles à l’activité biologique (telles que les concentrations en ions ferreux, sulfates, H2, CH4) demandent une durée plus conséquente pour atteindre la stabilisation. La communauté microbienne dans un puits ou à sa proximité serait donc fonction du temps de pompage appliqué. Il s’avère que le débit de pompage peut avoir une influence sur la concentration totale en bactéries et sur la diversité bactérienne elle-même (Petruzzi, 2004). Il est donc recommandé d’effectuer les prélèvements par pompage à faible débit (Azadpour-Keeley, 2005).

La deuxième difficulté est de s’affranchir des effets de puits. Si un puits n’est pas pompé régulièrement, la colonne d’eau est en contact avec l’oxygène de la surface et devient non représentative de l’aquifère. Cette colonne abrite donc une population bactérienne caractéristique du puits mais pas de l’aquifère (Frederickson et Phelps, 1997). Les puits d’alimentation d’eau potable, industriels ou d’irrigation pompés de manière continue offrent probablement les échantillons les plus représentatifs de l’aquifère. Cependant, la plupart du temps, ces puits sont soit non disponibles soit non appropriés à l’échantillonnage microbiologique. La prise de l'échantillon aura donc lieu après avoir renouvelé à plusieurs reprises le volume d'eau contenu dans le forage en maintenant le niveau de la nappe par réglage des débits de purge (Thierrin et al., 2003 ; McNabb et Mallard, 1984). Il est cependant important de rappeler que ces opérations destinées à renouveler l’eau de puits doivent être correctement réalisées : un pompage excessif peut induire des modifications des propriétés physico-chimiques et biologiques de l’eau souterraine à échantillonner (augmentation de la turbidité, phénomènes de dilution des composés présents …).

3.3.2. Matériel

a) Matériel de prélèvement

Il existe une grande variété de matériels destinés à l’échantillonnage des eaux souterraines via un puits tels que des échantillonneurs ou bailers, des pompes aspirantes (péristaltiques ou centrifuges) et des systèmes à déplacement positif



(pompes submersibles électriques, pompes à inertie…). Le choix est principalement dicté par des facteurs tels que la profondeur de l’eau, la taille du forage et le débit de pompage. L’équipement utilisé ne doit en aucun cas contaminer ou modifier l’échantillon prélevé. Pour cela, le matériel doit être dans l’idéal, complètement inerte, bon marché, réutilisable, facile à nettoyer, à stériliser, facilement utilisable sur site de manière autonome (sans énergie électrique externe) et pouvant délivrer des débits variables de pompage (Frederickson et Phelps, 1997 ; McNabb et Mallard, 1984). Chacun de ces moyens de prélèvement est associé à des problèmes spécifiques pour l’obtention d’un échantillon non contaminé.

Le principal inconvénient des bailers réside dans la difficulté à obtenir un échantillon représentatif de l’aquifère. En effet, les opérations nécessaires destinées à renouveler l’eau dans le puits doivent être conduites de façon à ne pas contaminer le bailer. Il faut également procéder de façon à ce que les bailers ne contaminent pas l’échantillon par introduction des corps étrangers présents à la surface de l’eau (McNabb et Mallard, 1984).

Concernant les pompes, les pompes péristaltiques ou les pompes d’aspiration de faibles volumes reliées à des tuyaux stérilisés par autoclave peuvent être utilisées pour de l’eau à une profondeur inférieure à 8 m (Britton et Gresson., 1987). Le prélèvement est effectué grâce à un flacon stérile collecteur placé à la sortie du tubage stérile (passé à l’autoclave) en sortie de puits et avant la pompe, ce qui limite l’exposition de l’échantillon à l’air. Toutes les pompes créant un vide peuvent être utilisées pour l’échantillonnage microbiologique en plaçant un flacon collecteur à paroi épaisse avant la pompe (McNabb et Mallard, 1984).

Au-delà de 8 m, d’autres pompes telles que des pompes munies d’un moteur à essence (gaz-powered pumps) ou les pompes en verre stérilisables à chaud peuvent être utilisées bien qu’elles soient relativement fragiles. D’autres pompes « gas–powered squeeze pumps » autoclavables qui peuvent être introduites dans des puits de faible diamètre ont également été développées.

Les pompes portables submersibles restent les pompes les plus commodes à utiliser. Bien qu’il soit difficile voire impossible de les stériliser, elles peuvent être désinfectées par circulation d’une solution chlorée (Britton et Gresson, 1987). La norme NF EN ISO 19458 préconise l’utilisation de ce type de pompe dans le cas de forage ou de puits sans dispositif de pompage permanent. Un système de prélèvement par seringue après renouvellement du volume du puits peut également être envisagé. Il existe des seringues en verre de contenance relativement grande (250, 500 ml ou plus) qui permettent de prélever des volumes suffisants pour conduire des analyses par la suite. (Thierrin et al., 2003).

Enfin certains auteurs ont également testés du matériel plus spécifique. Stevens et al., (1993) ont utilisé des cartouches en PVC remplies de sable et connectées en ligne avec le tubage en sortie d’un puits artésien afin de piéger les bactéries susceptibles de se lier à des surfaces de sables lors de la recherche des propriétés microbiologiques d’un aquifère profond et confiné. Pedersen et Ekendahl (1992) ont étudié la communauté microbienne d’un soubassement cristallin profond en Suède en utilisant



des réacteurs de biofilms contenant des lames de microscope (passées au préalable dans un four à moufle à 425 °C pendant 4 h) utilisées comme substrat pour fixer les bactéries. Enfin, Petruzzi et Silliman (2006) ont utilisé un échantillonneur passif utilisant des membranes de dialyse pour échantillonner des bactéries présentes dans un puits au sein d’un aquifère de sables et de graviers dans le nord de l’Inde. L’étude a démontré la capacité de ce système d’échantillonnage à :

- maintenir un équilibre dynamique en termes de comptage total de bactéries par rapport aux concentrations en bactéries à l’intérieur et à l’extérieur des cellules de dialyse ;

- échantillonner les communautés bactériennes dominantes observées dans les échantillons à proximité des cellules de dialyses ;

- obtenir des résultats comparables (reproductibilité) sur différentes cellules de dialyses montées sur le même support.

Cependant, il n’a pas été possible de déterminer le temps minimum d’exposition (dû a priori à la variabilité naturelle et temporelle de la population bactérienne présente dans l’eau souterraine). D’autre part, des communautés bactériennes supplémentaires ont été identifiées par DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) dans les cellules des dialyses par rapport à l’analyse conduite directement sur l’eau entourant cette cellule. Ce résultat nécessite des recherches plus approfondies afin d’identifier avec certitude la cause de ce phénomène (contamination des cellules de dialyse, contamination de l’eau distillée présente à l’intérieur des cellules, population bactérienne effectivement présente mais à des concentrations très faibles pour être identifiées lors de l’analyse directe sur l’eau…).

La densité des bactéries dans les eaux souterraines étant assez faible (103 à 105 cellules/ mL), il existe du matériel permettant de concentrer la biomasse lorsque c’est nécessaire (système de filtre en fibre creuse à flux tangentiel). Il est bien évident que les filtres doivent être rincés et désinfectés avant chaque usage. Ils peuvent être également passés à l’autoclave sans être altérés bien que les fabricants ne garantissent pas l’intégrité des filtres après cette opération (Frederickson et Phelps, 1997).

b) Préparation des flacons

D’une manière générale, les flacons utilisés pour le prélèvement d’échantillons microbiologiques doivent être propres et stériles. Différents types de flacons peuvent convenir tels que des flacons en plastique qui peuvent être passés à l’autoclave (PP ou téflon) (Britton et Gresson, 1987), des flacons en plastique à usage unique tels que des flacons en Polyéthylène (PE) (norme NF EN ISO 19458, 2006) ou flacons en verre borosilicaté (norme NF EN ISO 19458, 2006 ; Britton et Gresson, 1987). En général, le verre est préféré en cas de réutilisation (norme NF EN ISO 19458, 2006 ; Johnston, 2007). Le volume des flacons doit être adapté en fonction de l’analyse à conduire par la suite et est généralement de 200 à 500 ml (Thierrin et al., 2003).



Différents dispositifs de fermeture des flacons sont possibles à condition qu’aucun composé bactériostatique ou nutritif ne soit produit pendant la stérilisation (norme NF EN ISO 19458, 2006 ; Britton et Gresson, 1987) :

- bouchon en verre dépoli ;

- bouchon en plastique pour les flacons en verre ;

- cape à pression en plastique pour les flacons et bocaux en plastique ;

- capsule à vis métallique ou plastique pour les flacons en plastique et/ou en verre.

Il convient que les ouvertures des flacons munis de bouchons en plastique ou en verre disposent également d’une autre protection contre la contamination (ex. : papier d’aluminium) (norme NF EN ISO 19458, 2006).

En cas de réutilisation, les flacons et les dispositifs de fermeture doivent être nettoyés à l’aide d’un détergent non toxique exempt de phosphore et rincés à l’eau desionisée ou distillée (norme NF EN ISO 19458, 2006). Les flacons avec leur dispositif de fermeture desserré sont passés à l’autoclave à 121+/-3 °C pendant 15 mn (norme NF EN ISO 19458, 2006 ; Britton et Gresson, 1987) de façon à stériliser toutes les surfaces et sont serrés après stérilisation. Les bouchons en verre peuvent être autoclavés séparément ou simultanément en utilisant un séparateur en papier ou en aluminium pour éviter le coincement du bouchon lors du refroidissement (norme NF EN ISO 19458, 2006).

La stérilisation des flacons en verre peut être effectuée dans un four pendant au moins 1 h à 170+/-10 °C. Dans ce cas, un séparateur papier ou un bout de ficelle sera placé entre le bouchon en verre dépoli et le goulot pour éviter qu’il se coince lors du refroidissement. L’USGS préconise une durée minimale de 2 h concernant la stérilisation au four (Britton et Gresson, 1987). La date de stérilisation des flacons doit être notée et le procédé de stérilisation doit être contrôlé à l’aide d’indicateurs chimiques ou biologiques.

Lorsqu’aucune autre méthode de stérilisation n’est possible, les flacons peuvent être désinfectés par immersion dans de l’eau bouillante pendant au moins 30 mn. Immédiatement après ébullition, les flacons sont vidés et fermés avec des capsules bouillies emballées dans du papier propre. La qualité des flacons de prélèvement en verre ou en plastique, qu’ils soient préparés au laboratoire ou dans le commerce, doit être vérifiée par des essais de stérilité (norme NF EN ISO 19458, 2006).

Pour des prélèvements par immersion, les flacons doivent être stériles à l’extérieur comme à l’intérieur et protégés par du papier kraft (à maintenir au sec après le passage à l’autoclave), du papier aluminium ou dans un sachet extérieur en plastique. Si le sachet ne peut pas être passé à l’autoclave, la stérilisation devra se faire au moyen de rayons gamma ou par l’oxyde d’éthylène. Le sachet sera ouvert juste avant le prélèvement et pourra également servir de gant pour tenir le flacon avant de le placer sur un matériel de prélèvement stérilisé. La paroi extérieure du flacon peut également être désinfectée au moyen d’un désinfectant (isopropanol). Après séchage,



le flacon est immergé. Ceci n’est pas adapté aux bactéries sporulées (norme NF EN ISO 19458, 2006).

Certains types d’eaux requièrent des conditions de préparation de flacons particulières. Pour des eaux contenant du chlore ou des chloramines, il est préconisé d’ajouter du thiosulfate de sodium à 100 mg/L dans les flacons de prélèvement avant passage à l’autoclave. Pour des eaux présentant des concentrations en métaux supérieures à 0,01 mg/L, il est préconisé d’ajouter un agent chélatant (EDTA par exemple) dans les flacons avant stérilisation (Britton et Gresson, 1987 ; norme NF EN ISO 19458, 2006).

3.3.3. Protocole d’échantillonnage

a) Purge du puits

La plupart des stratégies d’échantillonnage des eaux souterraines pour analyse microbiologique est relativement simple et basée sur un prélèvement après une purge de un ou plusieurs volumes de la colonne d’eau (Chapelle, 2000). Il n’existe cependant pas de règle générale concernant le nombre de purges nécessaire avant de collecter les échantillons. Concernant les prélèvements pour les analyses chimiques, il est recommandé de pomper 1 à 10 fois (McNabb et Mallard, 1984) ou de 3 à 5 fois le volume du puits avant collecte de l’échantillon (Puls et Barcelona, 1996) selon les auteurs ou de mesurer des paramètres physico-chimiques (température, pH, conductivité) lors des pompages afin qu’ils soient stables avant le prélèvement (McNabb et Mallard, 1984). Concernant les analyses microbiologiques, le nombre de purge peut varier de 3 à 10 fois le volume du puits (Chapelle, 2000). Une étude réalisée en Allemagne a montré qu’un pompage équivalent à 3 fois le volume du puits permettait d’obtenir des échantillons présentant un nombre de bactéries constant (McNabb et Mallard, 1984). La norme NF EN ISO 19458 préconise un pompage prolongé (à un débit de purge permettant de maintenir le niveau piezométrique stable) jusqu’à l’obtention d’une température d’eau et d’une conductivité constantes ou jusqu’à trois renouvellements au moins du volume du puits (norme NF EN ISO 19458, 2006).

b) Décontamination

Le prélèvement nécessite de nombreuses précautions de façon à ne pas contaminer l'échantillon lors du prélèvement. La contamination des échantillons peut être minimisée en stérilisant tout le matériel susceptible d’être en contact avec l’échantillon. La décontamination doit être effectuée avant chaque prélèvement.

Les puits munis d’un dispositif permanent de pompage présentent généralement un robinet qui sera utilisé pour effectuer le prélèvement. Dans ce cas, le robinet doit être désinfecté à la flamme (éventuellement à l'acétone ou à l'alcool) (Thierrin et al., 2003 ; norme NF EN ISO 19458, 2006).

Pour les puits sans dispositif permanent, les échantillons peuvent être prélevés à l’aide de pompes portables de surface, submersibles ou de bailers. Concernant l’utilisation de bailers, le prélèvement peut être réalisé par immersion en utilisant un flacon lesté et



stérilisé suspendu par un fil en nylon que l’on descend rapidement dans le puits de façon à éviter l’introduction de corps étrangers présents à la surface de l’eau (McNabb et Mallard, 1984). Il faut alors veiller à ce que le flacon ne touche pas les parois du puits lors de la descente (Johnston, 2007). Une autre alternative est de purger le puits avec une pompe stérile et de collecter ensuite l’échantillon avec un bailer stérilisé. Certains bailers peuvent être stérilisés par autoclave (McNabb et Mallard, 1984) ou à l’aide d’une solution chlorée suivi d’un rinçage à l’eau distillée (MDBC 1997).

Pour les pompes submersibles, la désinfection est effectuée par immersion puis circulation d’une solution chlorée suivie d’un rinçage à l’eau distillée (Johnston, 2007). Un rapport technique de la commission du Murray-Darling Basin donne des recommandations plus précises sur la manière de procéder (MDBC 1997) :

La décontamination doit être effectuée à l’extérieur de la zone d’échantillonnage. Des feuilles plastiques sont placées autour du site d’échantillonnage pour empêcher toute contamination provenant du sol. L’usage de gants propres et stériles et de vêtements propres est conseillé. La pompe est immergée dans un bac contenant 20 l d’eau non contaminée et 100 ml d’hypochlorite de sodium préparée au moins 4 h avant le prélèvement puis elle est actionnée de façon à ce que le tuyau soit complètement rempli de solution. La solution chlorée est ensuite emprisonnée dans le tuyau à l’aide d’un film plastique. La pompe et le tuyau associé restent alors dans le bac de façon à décontaminer l’extérieur du tuyau pendant 15 mn. Ensuite, il est préconisé de pomper au moins 20 l d’eau distillée pour le rinçage du système et de rincer l’extérieur du tuyau. Après séchage à l’air libre, l’équipement est prêt pour le prélèvement. Si le tuyau semble sale, il est préconisé de vaporiser une solution d’alcool à 70 % ou de l’hypochlorite de sodium. Il est également conseillé de faire un blanc de décontamination en prélevant un échantillon d’eau propre après pompage de façon à le comparer à celui avant pompage (Johnston, 2007 ; MDBC 1997).

c) Collecte des échantillons

La collecte des échantillons est une étape assez simple. L’approche la plus facile est de rincer et remplir des flacons stériles préparés au préalable au laboratoire avec de l’eau souterraine provenant directement du tubage en sortie de puits. Le couvercle des flacons destinés à recevoir l’échantillon sera ôté juste avant l’introduction de l’échantillon dans le flacon. En aucun cas, le bouchon ou le goulot du flacon ne doivent entrer en contact avec les mains du préleveur ou le tuyau (Thierrin et al., 2003). Une fois l’échantillon prélevé, un espace d’air doit être laissé dans le flacon pour faciliter le mélange de l’échantillon par agitation excepté dans le cas de l’échantillonnage d’un milieu anaérobique afin de ne pas oxyder les espèces chimiques réduites ou d’inhiber les bactéries anaérobies strictes. La fermeture des flacons doit être étanche (Frederickson et Phelps, 1997 ; Britton et Gresson, 1987 ; Johnston, 2007). Enfin, Il est conseillé de prélever plusieurs échantillons car il arrive souvent que les bactéries ne soient pas détectées dans chaque échantillon prélevé (Johnston, 2007).



d) Paramètres d’échantillonnage

La diversité et le nombre de bactéries présentes dépendant fortement des conditions physico-chimiques du milieu, il est conseillé de mesurer des paramètres physico-chimiques (température, pH, potentiel d’oxydoréduction, conductivité, turbidité, oxygène dissous) dans le milieu échantillonné (Azadpour-Keeley, 2005).

3.4. TRANSPORT ET CONSERVATION DES ÉCHANTILLONS

Le transport des échantillons du terrain au laboratoire doit être effectué à l’abri de la lumière, au froid dans des caisses isothermes (utilisation de blocs réfrigérant ou glace fondante) (Thierrin et al., 2003 ; Britton et Gresson, 1987 ; norme NF EN ISO 19458, 2006). Quelques précautions sont à prendre (Britton et Gresson, 1987 ; norme NF EN ISO 19458, 2006) :

- éviter le contact direct entre les échantillons et les blocs afin d’éviter la congélation des échantillons ;

- le nombre, le volume et la position des blocs en fonction du nombre d’échantillons, de la masse et de la température initiale des échantillons doivent être ajustés ;

- les échantillons ne doivent pas être totalement immergés dans l’eau pendant le transport.

Il est admis que l’analyse des échantillons doit être effectuée le plus rapidement possible après échantillonnage. Il existe différentes préconisations en matière de température à maintenir selon le laps de temps entre le prélèvement et l’analyse. D. Roy Cullimore (2007) indique que si l’échantillon peut être analysé dans un délai ne dépassant pas quatre heures, il doit être maintenu à une température proche de sa température originelle (+/- 5 °C). Dans le cas contraire, l’échantillon devra être stocké sur de la glace afin de supprimer l’activité microbienne.

La norme NF EN ISO 19458 (2006) préconise une température de 5+/- 3 °C et d’autres auteurs préconisent des températures de conservation variant de 2 à 10 °C (Johnston, 2007 ; MDBC 1997). Il convient de toute façon de réduire au maximum le délai d’analyse pour éviter l’évolution des caractéristiques chimiques et microbiologiques de l’échantillon pendant le stockage. Si le transport a une durée supérieure à 8 h, la norme NF EN ISO 19458 (2006) impose de surveiller et d’enregistrer la température. La durée de stockage maximale recommandée avant analyse varie de 6 h (Britton et Gresson, 1987 ; Thierrin et al., 2003) à 24 h (MDBC 1997) selon les auteurs.

Dans tous les cas, les conditions de transport de stockage jusqu’à la prise en charge de l’échantillon par le laboratoire doivent être enregistrées et faire l’objet d’une documentation (norme NF EN ISO 19458, 2006, Thierrin et al., 2003)



4. Conclusion

L’échantillonnage d’une eau souterraine comprend différentes étapes telles que la préparation du prélèvement, le prélèvement proprement dit, le conditionnement et le stockage de l’échantillon avant l’analyse. Chacune de ces étapes doit être maîtrisée afin de s’assurer de la fiabilité des résultats d’analyse. Les prélèvements pour les analyses microbiologiques requièrent une attention toute particulière de façon à ne pas contaminer les échantillons lors du prélèvement (Annexe 1). Ce rapport fait le bilan des recommandations et des pratiques existantes en matière d’échantillonnage des eaux souterraines au travers de puits en vue d’une analyse microbiologique. Il pourra servir de base de travail à l’élaboration d’un protocole adapté en fonction du matériel disponible. Cependant, la plus grande difficulté relative de l’échantillonnage microbiologique est d’obtenir un échantillon représentatif de la population bactérienne présente dans l’aquifère. En effet, des questions subsistent quant à la pertinence de l’échantillonnage microbiologique des eaux souterraines au travers de puits ou forages. La plupart des bactéries présentes dans la subsurface étant liées aux sédiments, la population bactérienne présente dans les eaux souterraines n’est pas représentative de manière qualitative et quantitative de l’ensemble de l’aquifère. D’autre part, les opérations de forage peuvent conduire à l’introduction de bactéries exogènes et surtout à des changements de l’environnement biogéochimique dans le puits ou à sa proximité. Aussi, l’extrapolation des données obtenues sur les eaux souterraines à l’ensemble de l’aquifère présente des incertitudes. Conduire une caractérisation approfondie incluant à la fois l’analyse de l’eau souterraine et celle d’échantillons issus de carottage selon une procédure bien définie est donc recommandé, afin de connaître au mieux les bactéries présentes dans la subsurface.

Afin de compléter cet état de l’art, des tests sur site mettant en œuvre différents protocoles d’échantillonnage couplés à des analyses microbiologiques pourraient être envisagés afin d’étudier l’influence de certains facteurs sur le type de population bactérienne échantillonnée :

- vitesse de pompage ;

- nombre de renouvellement du puits ;

- profondeur d’échantillonnage ;

- désinfectant utilisé ;

- niveau de remplissage des flacons ;

- température et durée de stockage des échantillons.

Ces tests pourraient permettre de définir un protocole optimisé permettant l’échantillonnage de l’ensemble des bactéries présentes dans une eau souterraine.



5. Bibliographie

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Chapelle F. H. (2000) - Microbiological sampling of subsurface environments in Ground water microbiology & geochemistry, second edition, John Wiley and sons, 526 p.

Fredrickson J.K. and Phelps T. J. (1997) - Subsurface Drilling and sampling, in Manual of Environmental Microbiology Edited by Christon Hurst, Ronald Crawford, Jay Garland, David Lipson, Aaron Mills and Linda Stetzenbach, ASM Press, ISBN 1 55581 087 X, 893 p.

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Johnston D. (2007) - EPA Guidelines EPA667/07 - Regulatory monitoring and testing, Groundwater sampling ISBN 978-1-921125-48-5, http://www.epa.sa.gov.au/pub_list.html, Juin 2007.

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McNabb, J. et G. Mallard (1984) - Microbiological sampling in the assessment of groundwater pollution. In: Groundwater pollution microbiology, GF. Bitton and C. P. Gerba John Wiley & Sons, New York NY, pp. 235-260.

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NF EN ISO 19458 (2006) - Qualité de l'eau. - Echantillonnage pour analyse microbiologique, Novembre 2006.

Pedersen K. and Ekendahl S. (1992) - Assimilation of CO2 and Introduced Organic Compounds by Bacterial Communities in Groundwater from Southeastern Sweden Deep Crystalline Bedrock Microbial Ecology, 23, p.1-14.



Petruzzi N.M. (2004) - Bacteria mobilization and diversity as a function of rate of extraction from a monitoring well. Master thesis, Department of Civil Engineering and Geological Sciences, University of Notre Dame, Notre Dame, Indiana.

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Thierrin J., Steffen P., Cornaz W.S., Vuataz F.D., Balderer W., Looser M, avec la contribution de Zobrist J., Zumstein J. (2003) - Guide pratique Echantillonnage des eaux souterraines, Editeur Office fédéral de l’environnement, des forêts et du paysage (OFEFP ; DETEC) en collaboration avec la Société suisse d’hydrogéologie (SSH), Berne.



Annexe 1

Principales étapes de l’échantillonnage de matériaux dits « biologiques » (bactéries)

dans une eau souterraine



Préparation de la campagne d’échantillonnage/ Définition de la stratégie d’échantillonnage

-Définition de l’objectif de l’échantillonnage microbiologique-Choix des paramètres à analyser et des analyses microbiologiques à effectuer…-Localisation du/des puits, définition du nombre d’échantillon et de la fréquence d’échantillonnage : assurer la représentativité spatio-temporelle de l’échantillon-Choix et préparation et décontamination (autoclave, stérilisation, désinfection…) du matériel : pompes, bailers, flaconnage propre et stérile (PP, téflon, PE, verre)

Etape d’échantillonnage- Construction du/des forages avec des précautions particulières: évaluation de la contamination biologique par les boues de forage, utilisation d’un tubage en matériau inerte de type téflon, acier inoxydable, polystyrène…-Décontamination/désinfection de pompes submersibles sur site avant chaque de prélèvement -Purge du puits (nombre du purges à définir) et mesure de paramètres physico-chimiques (obtention de paramètres constants), - Collecte des échantillons avec une grande précaution afin d’éviter toute contamination- Rédaction d’un rapport d’échantillonnage

Transport et conservation des échantillons- À l’abri de la lumière, au froid (différentes préconisations selon les auteurs : àtempérature de 2 à 10 °C ou à température originelle de l’échantillon si analyses effectuées en moins de 4 h)- Contrôle de la température à effectuer- Enregistrement des données de transport et de conservation

Analyses microbiologiques des échantillons au laboratoire- Conservation des échantillons au froid- Réalisation des analyses microbiologiques le plus rapidement possible

Centre scientifique et technique

Service métrologie, monitoring, analyse 3, avenue Claude-Guillemin

BP 36009 – 45060 Orléans Cedex 2 – France – Tél. : 02 38 64 34 34

Documents

Procédures d’échantillonnage des eaux souterraines en …infoterre.brgm.fr/rapports/RP-56405-FR.pdf · analyse microbiologique (bactéries) afin de pouvoir proposer une méthodologie