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Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediene Faculté des Sciences Biologiques Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire Groupe : 2 Master en Génie-Biologique & Innovation Technologique Réaliser par: BENTALEB Kawther BOULAHBEL Houria BELATACHE AMINA Proposé par : Contrôle microbiologiques des médicaments Madame : OUSSEDIK

controle microbiologique des médicaments

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Université des Sciences et de la Technologie Houari BoumedieneFaculté des Sciences Biologiques

Laboratoire de Biologie Cellulaire et Moléculaire Groupe : 2

Master enGénie-Biologique & Innovation Technologique

Réaliser par:BENTALEB KawtherBOULAHBEL HouriaBELATACHE AMINA

Proposé par :

Contrôle microbiologiques des médicaments

Madame : OUSSEDIK

Le plan:1/Introduction2/Les techniques microbiologique3/Contrôle microbiologique de l’ environnement 4/ Contrôle microbiologique des médicaments 5/ Application sur le contrôle microbiologique des médicaments 6/Conclusion

Le médicament est l’un des produits de consommations le plus délicat

C’est pourquoi la stabilité et la régularité de ce produit est une exigence dans la fabrication pharmaceutique , et pour

l’atteindre il faut une mise en place d’un contrôle de la qualité soigneusement dirigé par un système d’assurance qualité . parmi ces contrôles on a le contrôle microbiologique

INTRODUCTION

• afin d’appliquer le contrôle microbiologique il faut d’abord savoir les différents origines des contaminations accidentelles qui peuvent toucher la santé des patients surtout lors du mélanges des matières premières qui sont résumé ci-dessous

Origine de contamination des produitspharmaceutiques

Contamination par les surfaces et le matérielBiocontamination d’origine humaine

Contamination par l’airContamination par l’eau

Matière premièresConditions de fabrication

Condition de stockage

Dans le but d’identifier toutes causes ou agent nuisibles afin de réduire ou d’éliminer ces

contaminations pour assurer l’innocuité et la stabilité du médicament pendant toute la durée de sa

validation des contrôles de qualité sont réaliser y compris physico-chimique et microbiologique.

Est une série d’épreuves:

qualitatives (contrôle microbiologique ,toxicologique) de dosage (contrôle physico-chimique)

auxquelles doivent être soumis avant sa commercialisation tout produit terminé et produit intermédiaire et matière première, suivant les techniques décrites dans le dossier d’autorisation de mise sur le marché par la pharmacopée afin de répondre aux normes prévues

Contrôle de la qualité:

défini les critères de pureté des matières premières ou des préparation entrant dans la fabrication des médicaments et

les méthodes d’essai et d’analyses à utiliser pour assurer leur contrôle dans

le but d’unifier la composition des médicaments et d’indiquer le mode de préparation de certains médicaments

Pharmacopée européenne

Afin d’apprécier la qualité microbiologique d'un médicament durant le procédé de fabrication des différents étapes sont utiliser dans le but de rechercher et dénombrer dans les différents échantillons prélevés les microorganismes suivant:•Les bactéries aérobies viable totale: concerne tous les microorganismes aptes a se multiplier a des températures moyennes•Les levures et moisissures: sont responsables de nombreux phénomènes d'altération d'enzymes hydrolytiques(amylases, protéases, lipases ,...)•Les germes spécifiques «  Staphylococcus aureus , Pseudomonas, E.coli , entérobactéries.

Analyse microbiologique

Techniques de microbiologie

Techniques de microbiologie

Stérilisation

ensemencement

isolement

Techniques de stérilisation

La stérilisation est une opération qui vise à détruire tous les micro-organismes d'un objet de façon durable.

objectif

contrôler les micro-organismes.prévenir une éventuelle contamination

Stérilisation par la

chaleur Stérilisation

par gazStérilisation par

action des

radiations

Stérilisation

par des agents chimiq

ues

Stérilisation par

filtration

A/ Stérilisation par la chaleur

I. Chaleur sèche

On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».

a/ Flambage

Le passage dans la flamme (bec BUNSEN) de la surface de matériel non inflammable assure une parfaite stérilisation. On stérilise de cette façon les fils de platine et les pipettes Pasteur.

b/ Four PasteurC'est un four - étuve à air chaud et sec. Il est utilisé pour la stérilisation de la verrerie videLa verrerie à stériliser doit être propre et sèche, bouchée avec du coton et emballée dans du papier solide.Elle est alors disposée à l'intérieur du four et subit un chauffage de :- 30 minutes à 1 heure à 170° - 180°C  - 2 heures à 160°C.Le matériel ainsi stérilisé sera laissé dans l'étuve jusqu'à son refroidissement, puis stocké à l'abri des poussières.  

I. Chaleur humide

La stérilisation par la chaleur humide, reconnaît trois modalités:

la stérilisation à l’autoclave

La Pasteurisation

La Tyndallisation

I. Chaleur humide

la stérilisation à l’autoclave

Autoclave : c’est un appareil indispensable dans un laboratoire de microbiologie. Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, à une T° de 120°C pendant une durée qui varie en fonction du milieu, de la température utilisée et du volume des récipients. Ce procédé tue toutes les cellules végétatives et les endospores.

I. Chaleur humide

La Pasteurisation

la pasteurisation est un traitement à chaud de liquides, tuant des pathogènes mais pas forcément toutes les bactéries. Les températures de la pasteurisation se situent entre 75 à 80°C

Principe de la pasteurisation

I. Chaleur humide

La Tyndallisation

La tyndallisation est une série de 3 chauffages bref à des températures de 70°C à intervalles réguliers, ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. Par exemple la destruction des pathogènes du lait se fait par un cycle de 63°C pendant 30 minutes suivie de 73°C pendant 15 minutes

B/ Stérilisation par filtration

La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 µm. Les micro-organismes sont trop gros et sont donc retenus par le filtre. Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles comme: certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques

Principe :C’est une technique de séparation non dénaturante à travers des membranes poreuses

B/ Stérilisation par filtration

La phase traversant la membrane Est appelée « Perméat ».

la phase retenue par la membrane est appelée« Rétentat ».

C/ Action des agents chimiques

I / Antiseptiques-Tuent les cellules vivantes, microorganismes et autres. Leur action est quasi instantannée. Ils agissent à l'intérieur de l'organisme ou à sa surface : teinture d'iode, , permanganate de potassium, eau oxygénée

II / Désinfectants- Empêche les contaminations humaines et animales- vapeurs ( formol, gaz sulfureux, oxyde d'éthylène )- liquides ( phénols, sulfate de cuivre, de fer, eau de Javel, permangante de potassium )-solide ( chaux vive )

III / AntibiotiquesSubstances d'origine naturelle ou obtenues par synthèse chimique. On distingue :- les antibiotiques bactériostatiques qui stoppent la multiplication des bactéries sans les détruire- les antibiotiques bactéricides qui tuent les bactéries

L'emploi d'agents chimiques vise la destruction d'espèces bactériennes déterminées au sein d'une flore poly-microbienne.

C/ Action des radiations

La radio-stérilisation est opérée par exposition du produit à un rayonnement

ionisant , le principe repose sur l’ionisation et l’excitation des atomes des cellules et leur milieu avec formation de radicaux libres ; la

rupture des liaisons protéiques altère les acides nucléiques des bactéries.

E/ sterilisation par gaz

L’évolution des dispositifs médicaux et l’utilisation de plus en plus répandue des

contenants en matière plastique (polymériques), se qui nécessite de technique de stérilisation à basse température efficace, facile à mettre en

œuvre , valable autant pour le petit matériel que des grands volumes (locaux).

Techniques de microbiologie

Stérilisation

ensemencement

isolement

Techniques d’ensemensement

L’ensemencement consiste à déposer dans un milieu neuf des germes prélevés dans un milieu de culture mère. Le transport est en général effectué avec une anse ou une

pipette Pasteur..

A / Ensemencement avec une anse: B/ ensemencement avec la pipette Pasteur

Les milieux de culture

Les milieux d’enrichissement:

permettant de favoriser la croissance d’une espèce en faible

quantité dans un échantillon.

les milieux d’isolement: permettant la

croissance de plusieurs espèces bactériennes

les milieux sélectifs: favorisant la

croissance d’un type bactérien particulier tout en inhibant celle

des autres types bactériens.

Les milieux de cultures les souches Température d’incubation

Tryptocaséine de soja (TSA) Germes totaux 35°C

Sabouraud levures et moisissures 25°CMac Conkey Escherichia coli 35°CVogel –johnson Staphylococcus aureus 35°CCetrimide Pseudomonas aeruginosa 35°C

Gélose agar lactosée ou saccharosée

Salmonella 35°C

On distingue plusieurs types de milieux de culture selon leur fonction

A / Ensemencement avec une anse:

- flamber l’ouverture du tube

- stériliser l’anse en la portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser refroidir dans la zone stérile.

- prélever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage :

. repiquage sur milieu solide : repiquer en déplaçant en zig zag l’aiguille sur la surface de l’agar, du fond du tube vers l’ouverture, en prenant soin de ne pas érafler la gélose

. repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prélevé à l’intérieur de la boucle

- repasser dans la flamme l’aiguille à ensemencer en la portant au rouge. L’aiguille est prête pour un nouvel ensemencement .

flamber l’ouverture des tubes, flamber légèrement les cotons, boucher

B/ ensemencement avec la pipette Pasteur :

Les manipulations se différencient des précédentes par quelques détails :

   - la pipette est passée rapidement dans la flamme.

  - l'effilure est cassée à la pince dans la zone stérile.

 - on aspire les bouillons de culture

  - on souffle pour ensemencer dans le tube stérile.

- la pipette ne sert qu'une fois.

Techniques de microbiologie

Stérilisation

ensemencement

isolement

Techniques d’isolement

 Pour étudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture pure. Deux techniques sont alors utilisées :

1/ La méthode des stries 2/ La méthode des dilutions

1/ La méthode des stries

- porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone stérile et avec l'autre main entrouvrir la boite de culture ( solide ) ou le tube ( liquide )

prélever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite ou le tube et prendre la boite vierge

. Flamber l'anse, la laisser refroidir et repartir perpendiculairement à la direction

- les boites de Pétri sont mises en position renversée à l'étuve à 30°C. Observer après 24 à 48 heures selon le cas ( la position renversée permet à l'eau de condensation de s'évaporer

2/ La méthode des dilutions

 Cas d'un ensemencement en surface par étalement d'un milieu liquide :

- les dilutions sont faites dans de l'eau distillée ou dans un

liquide physiologique de type Ringer

- numéroter des tubes à essai de 1 à 10,

chaque tube contient 1 ml de liquide de

dilution

- homogénéiser par aspirations

successives et souffler la dilution 1, en

prélever 0.1 ml et verser dans le tube 2.

- dans le tube 1, à l'aide d'une pipette stérile, ajouter 0.1 ml de la suspension fournie, rincer la pipette trois

fois.

Ainsi de suite jusqu'à l'obtention de la dilution n°10.

I/Contrôle microbiologique environnemental

le contrôle d’environnement est un domaine qui prend de plus en plus d’importance du fait de son lien avec une éventuelle contamination des produits pharmaceutiques

OBJECTIF

Identifier les voies de contamination possibles

mettre en place des actions correctives avant que le produit ne soit contaminé

Contrôle microbiologique environnemental

PersonnelAir et Eau

Locaux

Air et Eau

1/ Air : Vue sa richesse en microorganismes, il doit être filtré rigoureusement

dans des zones à atmosphères contrôlées . Un contrôle est aussi exercé sur les paramètres physiques du système de

traitement d’air : pression, débit, température, hygrométrie But : Estimer la charge microbienne de l’air, à des différents lieux définis du

local. Principe: La méthode utilisée est dite la méthode statique ou de sédimentation Mode opératoire :

l’exposition des boites de Pétri ouvertes renfermant un milieu de culture standard (gélose nutritive) pendant 4 heures

incuber à 37°C pendant 48 heures

dénombrement des particules donnant naissance à des colonies sédimentées

Air et Eau

1/ Air : Vue sa richesse en microorganismes, il doit être filtré rigoureusement

dans des zones à atmosphères contrôlées . Un contrôle est aussi exercé sur les paramètres physiques du système de

traitement d’air : pression, débit, température, hygrométrie

2/ Eau (concernant surtout les médicaments obligatoirement stériles):

Le niveau de qualité attendu nécessite la mise en œuvre de traitements capables d’éliminer les sels minéraux (déminéralisation), les micro-organismes, et de supprimer toute activité pyrogène (provocant de la fièvre) par l’absence d’endotoxines . Parmi ces traitements, on connait l’osmose inverse qui est un système de filtration qui, sous l’effet de la pression, permet de retenir les minéraux, les particules, les micro-organismes, en fonction de leur taille.

2/ Eau (concernant surtout les médicaments obligatoirement stériles):

Le niveau de qualité attendu nécessite la mise en œuvre de traitements capables d’éliminer les sels minéraux (déminéralisation), les micro-organismes, et de supprimer toute activité pyrogène (provocant de la fièvre) par l’absence d’endotoxines . Parmi ces traitements, on connait l’osmose inverse qui est un système de filtration qui, sous l’effet de la pression, permet de retenir les minéraux, les particules, les micro-organismes, en fonction de leur taille.

Personnel

Les tenues doivent être stériles, donc conçues pour ne libérer ni fibres ni particules et doivent retenir les particules émises par l’opérateur

Tenue

Cagoule qui renferme

totalement les cheveux

Masque couvre le

bas du visage

Lunette qui raccorde la cagoule et le masque

Combinaison Serrée

complétées par des bottes

But : estimer la charge microbienne retrouvée sur les mains gantées des opérateurs.

Principe : méthode des empreintes digitales.

faire une empreinte des cinq doigts pour les deux mains (droite, gauche et, chacune dans une boite), sur un milieu gélosé nutritif coulé sur boite de Pétri.

Incuber à 37°C pendant 48 heures.

Expression des résultats : en UFC/ 5 doigts.

Locaux

situés dans un environnement qui représente un risque minimum de contamination

Dans les zones à atmosphère contrôlé (ZAC) , les surfaces doivent être

Lisse

imperméable

sans fissures

Réduire l’accumulation des microorganismes

Utilisation des produits de nettoyage et désinfectant stériles pour éviter même le développement des souches résistantes

But : révéler les types de microorganismes présents sur les surfaces planes ou bombées.

But : révéler les types de microorganismes présents sur les surfaces planes ou bombées. Principe: technique de l’écouvillonnage qui réside à des prélèvements à l’aide d’un

écouvillon.

Humidification de l’extrémité de l’écouvillon par l’eau distillée,•Rouler doucement l’écouvillon sur la surface à contrôler soit 25 cm2. ,•Réaliser des suspensions bactériennes de 5 ml,•Ensemencer un inoculum de 1 ml dans deux boites de Pétri pour chaque écouvillon,•Incuber à 32°C pendant 5 jours.

Mode opératoire :

Lecture des résultats : en UFC par boite.

On distingue 2 catégories d'enceinte stérile :1.Les enceintes physiquement fermées dénommées isolateurs2.Les enceintes physiquement ouvertes à flux d'air laminaire dénommées hottes à flux d'air laminaire

prélèvements à l’aide d’un écouvillon : une petite brosse cylindrique qui sert à nettoyer l'intérieur des récipients à col étroit

Les hottes à flux d'air laminaireLes hottes à flux d'air laminaire sont des enceintes qui sont traversées par un flux d'air qui se déplace à une vitesse uniforme suivant des lignes parallèles.Le principeLe principe des hottes à flux d'air laminaire consiste à absorber de l'air et à le filtrer avec un filtre HEPA avant de le projeter sur la paillasse de travail. Ce flux d'air entraîne un effet piston qui repousse les micro-organismes.

Le rôle de la filtration est double : - apporter de l'air propre dans la zone de travail. - éviter l'élimination de produits dangereux dans l'environnement

L’isotechnie Elle consiste à créer une barrière physique entre l’opérateur, qui se trouve dans une zone non-stérile, et les équipements dans lesquels se déroulent les étapes critiques du remplissage et du bouchage des médicaments (injectables surtout.) Les manipulations s’effectuent de l’extérieur, à travers :

gants étanches fixés à la paroidemi-scaphandre.

L’isotéchnie a été conçue pour réduire sensiblement les risques de contamination de l’environnement des

produits fabriqués de façon aseptique.

1 / La filtration sur membrane

une méthode efficace d’analyse de la contamination microbienne ou particulaire des solutions aqueuses. Elle est largement utilisée pour :

Le comptage des bactéries hétérotrophes

Le comptage des

champignons (levures et

moisissures)

L’isolation de E. coli,

Pseudomonas sp., Lactobacillus sp.

etautres

Principe :C’est une technique de séparation non dénaturante à travers des membranes poreuses

La phase traversant la membrane Est appelée « Perméat ».

la phase retenue par la membrane est appelée« Rétentat ».

Produits obligatoirement stériles :consiste à vérifier l’absence de contamination bactérienne dans les substances ,les préparations et les produits qui doivent être stériles selon la pharmacopée.

Produits non obligatoirement stériles :il s’agit du dénombrement des germes aérobies viables totaux (les bactéries ,levures et moisissures ) et de rechercher des micro-organismes spécifiés :Escherichia coli,Pseudomonas

On a deux types de contrôles:

Médicaments obligatoirement stérile

Procédure :A/ Filtrez 100 mL de l’échantillon avec une membrane Pall à l’aide d’un entonnoir de filtration et d’un système à vide.Tous les organismes présents dans le prélèvement se concentrent à la surface de la membrane.

Membranes

Entonnoirs a usage unique

B / L’échantillon est versé dans l’entonnoir et si nécessaire, la membrane est rincée une fois ou plusieurs fois pour éliminer les substances inhibitrices qui étaient présents dans l'échantillon

C/ Placez le filtre à membrane dansla boîte de Pétri préparée. Procédez àl’incubation à la température appropriéependant le délai prévu.

D /Comptez les colonies sous ungrossissement 10-15x et identifiezle type de contamination.

Avantages

Isoler et de dénombrer les micro-organismes, tout en indiquant s’ils sont présents ou absents en à peine

24 heures.

Permet de concentrer de

grands volumes d’échantillons.

Autorise l’isolation et le comptage de

colonies discrètes.

Réduit le délai de préparation par rapport aux autres

méthodes traditionnelles

2 / Ensemencement par inclusion :

Rappel: L’ensemencement est une opération qui

consiste à déposer dans un milieu de culture stérile des germes prélevés à partir d’une culture

mère (milieu naturel) ou culture pure , le transfert est généralement effectué avec :

• Un fil à ensemencer.

• L’anse de platine.

• Une pipette Pasteur.

Milieu gélosé fondu

solidificationEchantillon dilué

Incubation

Lecture des UFC

3/ Ensemencement en stries :

C’est une méthode classique d’isolement par dissémination des germes microbiens aérobies (bactéries et levures) à la surface des milieux de culture solides.

Le mélange microbien est transféré au bord d’une boite de Pétri gélosée à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’un écouvillon et étalé à la surface d’une boite en suivant un motif défini

4/ Méthode NPP du nombre le plus probable:

But : estimation du nombre de bactéries dans des échantillons solides ou liquides contaminés

difficilement analysé par la filtration sur membrane

Principe :

Témoin Echantillon dilué en série + milieu de culture

Incubation 24h à 44,5°C(Croissance des bactéries )

Noter le nombre de tubes positifs selon les tables du NPP basées sur la loi du Poisson.

Après ces différentes techniques effectuées

sur les matières premières et les produits

semi-fini , on procède pour une deuxième

fois à une filtration sur membrane mais

réalisée sur le produit fini et qu’elle est suivie

d’un ensemencement direct

5 / Ensemencement direct

Inoculum S’il ya des troubles

Repiquage sur milieu frais

Incubation au moins 4 jours

24 jours

6/ Test de recherche des microorganismes

Les germes totaux :Concerne tous les micro-organismes capable de se multiplier à des températures

moyennes

les germes fongiquesConcerne tous les micro-organismes capables de secréter des enzymes hydrolytiques provoquant plusieurs phénomènes d’altération.

Entérobactéries

Escherichia coliStaphylococcus

aureus

Les salmonelles

LES MICROORGANISMES SPECIFIQUES :

Dans le but de rechercher ces différents microorganismes , on effectue des repiquages c’est-à-dire des transplantations des cultures pures sur des milieux de

culture neufs spécifiques pour chaque microorganisme:

Les milieux de cultures les souches

Tryptocaséine de soja (TSA) Germes totaux

Sabouraud levures et moisissures

Bouillon Mac Conkey Agar Mac Conkey

Escherichia coli

Vogel –johnson Mannitol Salt Agar

Staphylococcus aureus

Agar Cetrimide Pseudomonas aeruginosa

Gélose agar lactosée ou saccharoséebouillon soja RVS

Salmonella spp

7 /Lecture des colonies :

Type de germes dénombrés

Observation des coloniesAvant utilisation Après utilisation

Germe fongique

(Gélose Sabouraud)

E. Coli (Gélose Mac Conkey)

Pseudomonas aeruginosa

(Gélose au Cétrimide)

Salmonella spp(Gélose SS)

Staphylococcus aureus

(Gélose Vogel-johnson)

Les repiquages effectués sont suivis d’un dénombrement par la technique du nombre le plus probable

7/ Recherche de pyrogènes :

C’est un test obligatoire pour tous les solutés injectables dont le volume de conditionnement est supérieur ou égal à 15 ml,

Des microorganismes susceptibles de provoquer des réactions

d’hyperthermie à l’injection le plus souvent par les endotoxines

bactériennes des bactéries Gram négatif

Les pyrogènes sont recherchés dans l’eau , les produits intermédiaires et les produits finis en effectuant deux tests :

Essai in vivo

Essai in vitro

1. Injection d’une solution de NaCl 0.9% apyrogène 1 à 3 jours afin d’exclure les animaux ayant une variation de température trop importante.

2. Injection durant 4 minutes dans la veine marginale de l’oreille du liquide préchauffé à 38.5°C.

Utilise un lysat de cellules sanguines du crabe limulus (arthropode), qui a la propriété de floculer (coaguler) en présence d’endotoxines de bactéries à Gram négatif.

Les symptômes de pyrogénicité

Frissons intenses Cyanose,

Un pouls rapide accompagné de dyspnée

Des douleurs lombaires

Donc : l’apyrogénicité définie comme l’absence respective de micro-organismes viables et de substances pyrogènes, constitue un critère de qualité microbiologique et de sécurité pour l’administration des médicaments ou l’utilisation des dispositifs médicaux chez l’homme. Le contrôle de ce paramètre, en terme d’objectif, de conditions opératoires et d’interprétation des résultats, est fixé par la Pharmacopée pour les médicaments et normes pour les dispositifs médicaux.

Application sur le contrôle microbiologique de médicament

Application N°1

Contrôle microbiologique,

d’une suspension buvable pour enfant,

obligatoirement stérile,

anti-inflammatoire non stéroïdien

« ALGIFEN® » durant sa production

et son conditionnement. 

Forme et présentation ALGIFEN® est une

suspension buvable réservée aux nourrissons

et à l’enfant de 3 à 12 ans dosée à 20 mg/ml dans

des flacons de 125ml avec un bouchon doseur gradué

en ml ou pipette pour administration orale graduée en Kg .La

posologie usuelle est de 20 à 30 mg/kg 3 à 4 fois

par jour.

Antalgique

Antipyrétique

Anti-inflammat

oire

Pharmacothérapie du médicament :

Traitement symptomatique des affections

douloureuses et/ou fébriles

ALGIFENE

IbuprofènePolysorbate 80

Acide citrique anhydre

Sorbitol 70%

Eau purifiée

Gomme xanthane

SaccharoseGlycérol

Benzoate de sodium

Acésulfame potassique

Rouge de cochenille A

Edétate disodique

Arôme banane

Arôme Fraise vanille

Composition chimique du médicament :

Contrôle microbiologique de l’eau purifiée

Dénombrement des bactéries viables totales

Dénombrement des levures et moisissur

es

Résultats du contrôle microbiologique de l’eau purifiée

Bactéries viables totales.

Levures et moisissures

Contrôle microbiologique d’ALGIFEN®

2 lots au début du conditionnement 2 lots au milieu du conditionnement 1 lot à la fin du conditionnement

Un mélange de 10ml

Dilution dans 90mL d’une solution tampon peptonée au chlorure de sodium

Solution A

Dénombrement des bactéries viables

totales.Recherche de germes

spécifiques Escherichia coli

Dénombrement des germes

aérobies viables totaux.

Milieu TSAIncubation à 30-35°C pdt

5jrs

Milieu SabouraudIncubation à 20-25°C

pdt 5jrs

Pré-enrichissement sur 90 mL

de bouillon peptoné à la caséine de Soja.

Incubation à 37°C pdt 48hUn enrichissement sur bouillon

MacConkey à44°C pdt 24h puis un isolement sur gélose de

MacConkey.

le médicament ALGIFEN® est de bonne qualité tout au long de son processus de fabrication, et est définis comme étant prêt à la

consommation pour le plus grand bonheur des parents,

ALGIFEN® présente l’avantage d’être commercialisé à moindre cout, de fait qu’il soit localement produit, ce qui

diminue les charges.

Conclusion2:

Application N°2

Présentation de médicament :

Classe thérapeutique:le Maalox® appartient à la classe des antiacides et pansements gasto-intestinaux.

Nom commercial: Maalox®.

Principes actifs : Hydroxyde de magnésium (E527), Hydroxyde d'aluminium.

Laboratoire : Sanofi-Aventis France.

DCI: Hydroxyde d’aluminium et hydroxyde de magnésium.

le MAALOX est un médicament qui traite les manifestations douloureuses de l'hyperacidité des voies digestives supérieures, la gastrite, l'ulcère

gastroduodénal, l'hernie hiatale et l' oesophagite. La production de la suspension MAALOX s'effectue à

partir d'une dilution à l'eau purifiée de sa forme primaire le « PREMIX » auquel on rajoute aussi de

l'eau déminéralisée.

Présentation de médicament :

Ce médicament existe sous 4 formes :

comprimé

suspension buvable (flacon de 250ml)

Suspension buvable en flacon de 250ml goût menthe.

Suspension buvable en sachets-dose de 20 x 4 ,3 ml goût citron

Comprimés à croquer goût menthe.

Comprimés à croquer sans sucre goût citron.

Composition de Maalox®:

PA-hydroxyde de magnésium (10g/flacon) -hydroxyde d'aluminium (8.75 g/f)

Excipients

l'acide chlorhydrique concentré-une huile essentielle de menthe poivrée-sorbitol concentré à 70%-D- mannitol-Saccharine sodique

Conservateurs parahydroxybenzoate de méthyle (Nipagine)-parahydroxybenzoate de propyle (Nipazol)

Analyse microbiologique de Maalox®:

Analyse microbiologique de Maalox®:

La recherche et le

dénombrement:

des germes totaux

Concerne tous les micro-organismes aptes

à se multiplier à des températures moyennes

des germes fongiques

Sont responsables de nombreux phénomènes d’altération dus à leur pouvoir de sécrétion

d’enzymes hydrolytiques (amylases, protéases,

lipases, etc.)

Analyse microbiologique de Maalox®:

Escherichia coliElle représente l'une des causes majeures des diarrhées

aigues et des infections intestinales.

Entérobactéries Constituent un grand groupe de bactéries ayant une forte similitude, certaines sont dangereuses et provoquent des

problèmes sanitaires d'où l'importance de leur recherche

Staphylococcus aureus

Recherchée systématiquement dans le produit fini du fait de l'excrétion de nombreuses substances toxiques (enterotoxines, hémolysine) provoquant des infections

graves

Les salmonelles Sont des agents de Gastro-entérites, elles sont parmi les

principales bactéries responsables de toxi-infection.

La recherche de 4 types de germes spécifiés suivants:

AirPréparation des boites de pétri

TSA Sabouraud Tergitol

Germes totaux Germes fongiques

Germes pathogènes

30-35° C pendant 5 J 22-25° C pendant 24h à 48h 30-35° C pendant 24h à 48h

Ramener les boites à la T° du labo et vérifier l’absence de croissance microbienne

Exposition des boitesPendant 4 h

Incubation à 37° pdt 3jrs

+ 15 ml de milieu sabouraud à 45°C, laisser refroidir à 25°C pendant 5 J

+ 15 ml de milieu TSA à 45°C, laisser refroidir et incuber à 37°C pendant 3 J

1 ml dans chaque boite de pétri

10 ml de la suspension à analyser (prémix)

90 ml Tampon peptoné

e au NaCl

Dénombrement des germes totaux

Dénombrement des germes fongiques

Ensemencement en masse

Prémix

10 ml de l’eau à analyser

90 ml Tampon peptonée au NaCl

Dénombrement des germes totaux

Dénombrement de P.aeruginosa

Déposer la membrane sur milieu TSA

37°C, 48h

Bouillon BCS

Gélose au cétrimide

entonnoir

Mb filtrante0,45µm

30°c, 5 jrs

Étalement de 1ml

10ml

Eau purifiée

Introduire 200ml d’une solution tampon pH 7,2 et boucher à l’aide d’un bouchon cardé

Flacons à tester

Dénombrement des germes totaux

Recherche des germes pathogène

Déposer la mb sur milieu Mac Conkey Déposer la mb sur milieu TSA

Laisser en contact 1 à 2 h

Flacons

10 ml de la suspension à analyser (Maalox)

90ml Tampon

phosphater

1 ml dans chaque boite

Dénombrement des germes totaux

Dénombrement des germes fongiques

Dénombrement de Staph.aureus

+ 15 ml de milieu TSA à 45°C, laisser refroidir et incuber à 37°C pendant 3 J

+ 15 ml de milieu sabouraud incuber à

25°C pendant 5 J

+ Vogel Jonhson incuber à 37°C

pendant 3 J

Maalox® et eaux de rinçage

10 ml de la suspension à analyser (Maalox)

1 ml

Gélose Mac-Conkey. incuber à 37°C pendant

48 h

Gélose au cétrimide. incuber à 37°C pendant

48 h

Gélose SS. incuber à 37°C pendant 48 h

Pour la recherche de E.Coli

Pour la recherche de Salmonella sp

Pour la recherche de P.aeruginosa

10 ml de la suspension à analyser (Maalox)

1 ml

Gélose Mac-Conkey. incuber à 37°C pendant

48 h

Gélose au cétrimide. incuber à 37°C pendant

48 h

Gélose SS. incuber à 37°C pendant 48 h

Pour la recherche de E.Coli

Pour la recherche de Salmonella sp

Pour la recherche de P.aeruginosa

Dénombrement de Pseudomonas aeruginosa sur Gélose au Cétrimide

Avant utilisation Après utilisation

Les colonies sont verdâtres et fluorescentes.

Dénombrement de Salmonella sur Gélose SS

les colonies sont transparentes avec centre noir.

Avant utilisation Après utilisation

Dénombrement de Staphylococcus aureus sur Gélose Vogel-johnson

les colonies sont noires avec un halo jaune.

Les résultats sont exprimés en Unités Formant Colonie par millilitre ou par gramme (UFC/ml ou /g). le comptage peut s’effectuer soit par comparaison visuelle à un abaque fourni par le fabricant, soit par compteur laser (ceci nécessitant un milieu non opaque).

Le contrôle Les normesL’air Germes totaux ≤ 10 2 UFC/cm2

Germes fongiques ≤ 10 2 UFC/cm2

(pharmacopée Européenne 2002)

Le prémix « PA + excipients » Germes totaux ≤ 10 2 UFC/gGermes fongiques ≤ 10 2 UFC/gGermes pathogènes : S.aureus: Abs P.aeruginosa: Abs E.coli: Abs Salmonella.sp: Abs

L’eau purifiée Germes totaux ≤ 10 2 UFC/mlP.aeruginosa : Abs/10ml(pharmacopée Européenne 2002)

Les flacons Germes totaux ≤ 10 3UFC/mlGermes pathogènes : Abs/10ml(pharmacopée Européenne 1997)

Maalox® et eaux de rinçage Germes totaux ≤ 10 2 UFC/mlGermes fongiques ≤ 10 2 UFC/mlGermes pathogènes : Abs

Résultats:

une très bonne qualité microbiologique révélée par l’absence même de la flore fongique mais étant donné que le Maalox® est regroupé dans la catégorie des préparations pharmaceutiques non obligatoirement stériles, on peut noter la présence de quelques germes totaux et fongiques a condition que cela reste toujours dans les normes exigées par le partenaire.

Si Maalox® reste conforme aux normes tout au long de son processus de fabrication, à partir des matières premières (prémix, eau purifiée et eau oxygénée) et articles de conditionnement jusqu’au produit fini, défini comme étant prêt à la consommation.

Application N° 3

Notre choix s’est porté sur un médicament non obligatoirement stérile « Mycocide®», qui est

une pommade dermique hydrophobe présentée sous forme d’un tube de 15g. ce médicament est une association de trois

principes actifs et de deux excipients (tableau).

Vu sa composition, « Mycocide ®» est indiquée pour le traitement des dermatoses corticosensibles sur infectées par un germe

sensible à la néomycine et/ou par un Candida.

Forme et présentation

composants formule définition RôlePrincipes

actifsTriamcinolone acétonide (0,1g)

C24H31FO6Glucocorticoïde synthétique présente sous forme d’acétonide

Anti-inflammatoire stéroïdien à activité modérée.

Néomycine sulfate (0,25)

C23H46N6O13

XH2SO4

Mélange de sulfate et d’aminoside produits par Streptomyces fradiae

Antibactérien à effet bactéricide (inhibition de la synthèse protéique bactérienne).

Nystatine(10 MUI)

C47H75NO17 Substance chimique très complexe produite par Streptomyces noursei

Antifongique à activité fongistatique (augmentation de la perméabilité des champignons). Elle est efficace essentiellement sur les Candida

Excipients (100g)

Huile de vaseline épaisse

Entre C22 et C35 Mélange d’hydrocarbures saturés liquides, obtenus à partir de pétrole.

Excipient de surface pour les pommades hydrophobes.

Cire de polyéthylène

Dérivé pétrolier Conférer une consistance à la pommade.

Composition du médicament

Méthodes d’analyses microbiologiques du produit fini A partir de chaque lot, cinq échantillons sont prélevés et destinés à être examinés. L’évaluation de la propreté microbiologique passe par deux étapes principales à savoir la préparation des solutions, et l’isolement dans les milieux de cultures sélectifs.

1. Préparation de solutions (solution A)

Dissolvez 10g de Mycocide

®

90ml d’une solution peptonée au chlorure de sodium additionnée au

Tween (pH =7)

deux dilutions décimales.

2. Recherche de germes spécifiques

• Milieu d’enrichissement pour les Entérobactéries

(solution B) :Dissolvez 10 g de Mycocide

®

100ml de bouillon lactosé

incuber à 37°C pdt 2-5 heures.

• Milieu d’enrichissement pour S.aureus et

P.aeruginosa (solutionC) 10ml solution A

100ml de bouillon peptoné de caseine de soja

incubez à 37°C pdt 24h

3. Isolement des germes sur milieux sélectifsGermes recherchés

Milieu de culture Ensemencement Incubation Dénombrement

Germes aérobies viables totaux

gélose peptoné à la caséine soja pour les bactéries, et gélose Saboureaud pour les levures et moisissures

Ensemencer en profondeur 1ml de la solution A et de chaque dilution dans aux moins deux boites de pétri.

32 à 35°C pendant 2 à 5 jours pour les bactéries et à 25°C pendant 2 à 5 jours pour les levures et moisissures.

Comptage des colonies apparues à la surface des géloses en UFC/G

Entérobactéries et certaines autres

bactéries gram-

Bouillon Mossel Ensemencer 1ml de la solution B dans le bouillon Mossel à 3 dilutions décimales dans un milieu liquide

35 à 37°C pendant 18 à 24 heures

Méthode du nombre le plus probable (NPP)

Pseudomonas aeruginosa

Gélose Cetrimide Ensemencer en surface quelque goutte de la solution C

37°C pendant 72 heures

Comptage des colonies apparues à la surface de gélose en UFC/g

Staphylococcus aureus

Gélose Vogel Johnson Ensemencer en surface quelque goutte de la solution C

37°C pendant 24 heures

Peptone de viande 10gExtrait de viande 1g

NaCl 10gMannitol 10g

Rouge de phenol 0,025gSulfate de polymixine B 0,010g

Agar agar 12-14g

Tryptone 10g/lEtrait de levure 5g/lMannitol 10 g/lPhosphate dipotassique 5g/lChlorure de lithium 5g/lGlycine 10g/lTellurite de photassium à 10g/l 20mlRouge de phenol 0,0 25 g/lThiosulfate de sodium 0,60 g/lLecithine de soja 0,30 g/lTween R 80 2,5 g/lHistidine,Hcl 0,10 g/lAgar 17 g/l

Résultat des analyses microbiologiques du produit fini

N° de lot des germes

Recherchés1 2 3 4 5 NORMES (Pharmacopée

Européenne 2005)

Germes aérobies viables totaux 0 0 15 0 5 ≤ 500 UFC/g

Entérobactéries et certaines autres bactéries Gram-

<10 <10 <10 <10 <10 ≤ 50 UFC/g

Pseudomonas aeruginosa Absence Absence Absence Absence Absence Absence

Staphylococcus aureus Absence Absence Absence Absence Absence Absence

Une révélation d’une flore mycélienne appartenant au genre Penicillium et Mucor qui sont des germes saprophytes de l’environnement.

Résultats des tests d’identifications des germes trouvés dans l’air :

COLONIE ASPECT MACROSCOPIQUE

Aspect microscopique Le genre

Colonie 1 Colonie blanche, ronde, cotonneuse.

Thalle ramifié cloison. Penicillium

Colonie 2 Colonie marron, rhizoïde.

Thalle non cloisonné non ramifié avec tête

sphérique.

Mucor

1. Résultats d’identification macroscopique et microscopique des moisissures trouvés dans l’air.

Points de prélèvement

Germes identifiés UFC/boite %

Au dessus de la cuve de pesage des

huiles

S.SaprophyticusS.epidermidis

S.simulansStaphylococcus sp

Mucor

2017421

3731

16.663.71.85

Au dessus de la cuve de stockage

S.epidermidisS.Saprophyticus

S.simulansMucor

5243

31.2512.5

16.6618.75

Au dessus des remplisseuses des

tubes

S.epidermidisS.Saprophyticus

S.simulansS.intermedius

Staphylococcus sp

9210881

76.038.266.616.61

1

2. Répartition des germes trouvés dans l’air

Résultats des tests d’identification des germes trouvés chez le personnel 

Zone de prélèvement

Opérateur UFC/5 doigts

Mains droite Mains gauche

Zone de production

Opérateur1 8 5

Opérateur2 6 16

Zone de conditionnement

Opérateur3 92 167

Résultats de dénombrement des germes trouvés chez le personnel

Les résultats révèlent la présence d’une charge microbienne importante chez l’opérateur n°3 du conditionnement qui peut être due à diverse manipulations effectuées par cet opérateur avec non respect des règles des BPF.

Les germes identifiés appartiennent aux genres Staphylococcus et Penicillium.

Conclusion:

D’après les résultats des analyses microbiologiques de produit fini, nous constatant l’absence totale de germes pathogènes (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus), et la présence non significative des germes aérobies viables totaux (bactéries, levures et moisissures), ce qui explique la bonne qualité microbiologique du produit, ce ci est due : - Au respect des bonnes pratiques de la fabrication. - A la composition de la pommade (présence d’antibiotiques). - L’efficacité du processus du nettoyage et de désinfection.

Le médicament est sensé guérir un mal et non pas l’engendrer, pour cela il doit satisfaire a l’attente légitime du consommateur concernant en particulier sa composition, sa teneur en substance actives, son identité, sa quantité, sa date de fabrication et de péremption, son mode d’utilisation Le contrôle microbiologique permet :

de garantir une bonne qualité hygiéniqueminimiser les pertes dues à des mauvaises

conditions de stockage et donc avoir le moins possible de produits non conformes.

garantir un bon rendement

Conclusion