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1. Introduction :

L’eau est l’élément le plus demandé et le plus essentiel dans la vie. On l’utilise quotidiennement pour

différentes applications, par exemple l’alimentation et le lavage des aliments ou de matériels… Et pour

ces buts ou d’autres l’eau doit représente des qualités microbiologique et physico-chimiques

satisfaisantes.

Dans cette TP nous sommes plus intéressants par le recherche dans l’échelle microbiologique,

l’orientation de TP été vers : la réalisation des analyses sur l’eau, le rechercher des différents types des

germes, la comparaison entre les germes présent dans deux types d’eau (eau potable (de robinet) et

l’eau pollué) en plus l’identification des germes.

Notre groupe a été choisi pour les recherches dans l’eau pollué.

Les germes visés pour la recherche sont :

-les germes aérobies mésophiles et psychrophiles dans le milieu PCA gélosé : cette recherche

indique plusieurs critères ; l’origine de cette eau, les traitements qu’il a subi. C’est à dire une

évaluation de cette eau, un indicateur de la qualité générale et de la stabilité. La recherche des germes à

20°C indique la recherche des germes pathogènes ou résistants.

-les coliformes totaux à 30°c dans le milieu BCPL : permet de signalé une contamination fécale

d’origine animale, c'est-à-dire une évaluation de risque de présence des germes pathogènes.

-les streptococcus type D dans le milieu Rothe : c’est une recherche d’un germe pathogène. Pour

l’évaluation des risques sanitaires de cette eau.

2. Matériel et méthodes :

a.matériel :

Les verreries :

Tube à essais, boite de pétri, des portoirs à tubes, flacons, pipettes pasteur, pipettes à 5ml et à 1ml, des

lames, des lamelles, cloche de Durham. (Tout le matériel doit être stérile).

Les appareils :

Microscopes, Compteur colonie, incubateur, bec bunsen.

Les milieux de cultures utilisés :

Représenté dans l’annexe I

Les indicateurs chimiques :

Rouge de méthyle, réactif de Vogs-Proskauer, le réactif de Kovacs.

2

d. méthodes d’analyse :

1. le premier jour :

Pour la recherche des FAMT/FAPT :

On a réalisé des dilutions à partir de la solution mère. Trois tubes contiennent 9 ml d’eau

physiologique stérile préparées par l’enseignant, avec une pipette stérile de 1 ml on ajout 1 ml à partir

de flacon qui contient la solution mère et met dans le premier tube «c’est le tube de dilution (10-1

) »,

après une homogénéisation été réalisée. Avec la mémé pipette on a prend 1 ml à partir de tube de

dilution (10-1

) et met dans le deuxième tube « c’est le tube de dilution (10-2

) ». Avec la mémé pipette

on a prend 1 ml à partir de tube de dilution (10-2

) et met dans le troisième tube « c’est le tube de

dilution (10-3

) ». Après On a met 1 ml de solution de dernier tube de dilution (10-3

) dans chaque boites

pétri. Après on a collé les boites par 10 à 15 ml de milieu PCA préparé et liquidifié par l’enseignant

et on a effectué des mouvements en forme de ∞ pour bien mélanger l’inoculum, après la solidification

de milieu on a incubé les boites à 30°C et 20°C pendant 72 heures. (Selon le schéma 1).

Eau à

analysé

10-1 10-2 10-3

PCA

37°C

EP2

10-2

PCA

20°C 10-3

EP2

Incubation à 37°C et à 20°C.

1 ml 1 ml

3

Pour la recherche des coliformes totaux :

La méthode utilisée c’est « 333 », dans la quelle, on a utilisé neuf tubes remplies (9 ml) par le milieu

BCPL et chaque tube contient une cloche de Durham préparé par l’enseignant, par différents

concentrations, trois tubes doubles concentrés (D/C) et six simple concentrés (S/C).

Pour les trois tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée, On a

ajouté 1 ml de la même solution dans trois tubes simples concentrés et 0.1 ml (=trois gouttes par

pipettes pasteur) de la solution mère dans les trois tubes simples concentrés qui restes. Il faut bien

mélanger les tubes et chasser le gaz dans les cloches. Après on a l’incubation à 37°C pendant 24 à 48

h. (Selon le schéma 2).

Double concentré simple concentré simple concentré

L’incubation à 37°C pendant 24 à 48 h.

Pour la recherche des streptococcus type D :

La méthode utilisée c’est « 511 », dans la quelle, on a utilisé septe tubes remplies (9 ml) par le milieu

Rothe préparé par l’enseignant, par différents concentrations, cinq tubes doubles concentrés (D/C) et

deux tubes sont simple concentrés (S/C).

Eau à

analysé

10 ml 1 ml 0.1 ml

4

Pour cinq tubes doubles concentrés on a ajouté 10 ml d’eau à partir de la solution à analysée, On a

ajouté 1 ml de la même solution dans un tube simple concentré et 0.1 ml (=trois gouttes par pipettes

pasteur) de la solution mère dans un tube simple concentré qui reste. Après on a l’incubation à 30°C

pendant 24 à 48 h. (Selon le schéma 3).

Double concentré simple concentré

Incubation à 30°C pendant 24 à 48 h

2. le deuxième jour :

On a fait la lecture des résultats et le dénombrement sur touts les milieux à l’aide des tableaux de

l’indice NPP.

On a essai d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope photonique.

A partir de milieu BCPL (seulement les tubes positifs et de préférence les tubes doubles concentrés

positifs) on a fait un repiquage sur le milieu BCPL gélosé pour but de séparer les colonies

produites pour être facile à identifie, ce repiquage faite par culture en surface, on a met la pipette

pasteur dans le milieu BCPL et faire des stries sur la gélose collé déjà sur les boites et refroidie,

l’inoculum été ensemencé à 30°C pendant 24. (Selon le schéma 4).

Eau à

analysé

10 ml 1 ml 0.1 ml

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3. le troisième jour :

On a essai une autre fois d’observer les germes présent dans le milieu Rothe à l’aide de microscope

photonique.

A partir de milieu BCPL gélosé on a prend une colonie par la pipette pasteur et met dans trois

différents tubes par différent mode d’ensemencement, le premier tube est collé par le milieu citrate

de Simmons (solidifié en position inclinée) l’ ensemencement fait par des stries sur la surface de la

pente par pipettes pasteur, le deuxième est collé par le milieu Kigler-Hajana (solidifié en position

semi-inclinée) l’ ensemencement fait par piqure centre (dans le culot) après des stries sur la surface

de la pente par pipettes pasteur, le troisième tube est remplis par le milieu Clark et Lubs (milieu

liquide) l’ ensemencement fait par l’entrée de la pipettes pasteur dans le milieu, les trois tubes sont

pour but d’identification biochimique de la colonie sélectionnée, les trois tubes sont ensuite

incubées à 30°C pendant 24h. (Selon le schéma 5).

BCPL

37°C

EP2

Incubation à 37°C pendant 24h.

Tube

+

6

4. le quatrième jour :

On fait la lecture des résultats sur le milieu PCA (lecture après 72h).

La lecture directe de résultat sur le milieu Citrate de Simmon et de milieu Kigler-Hajana.

On a divisé la culture de milieu Clark et Lubs dans deux tubes, dans le premier tube on a ajouté

des gouttes de solution rouge de méthyle, dans le deuxième tube on a ajouté des goutte de α-

naphtol(VP1) et des gouttes de solution de soude à 16% (VP2). le principe de ces réactifs dans

l’annexe II.

4. Résultat et discutions :

Pour la recherche des FAMT/FAPT :

On a fait la lecture sur les boites qui contiennent le milieu PCA après 72h seulement la boite incubée

à 30°C contient des colonies, trop chargé, pour facilite la lecture on a divisé la boite en quatre, on a

estimée le nombre des colonies présentent d’un quart, il est de 145 colonies à peut prés.

Alors le nombre des bactéries dans 1ml de solution égale :

Milieu Citrate

de Simmons

Milieu Kigler-

Hajana

Milieu Clark

et Lubs

Incubation à 37°C pendant 24h.

L’eau

peptonée

7

N = (150 ×4) ×102

= 60000 UFC/ml.

Donc le nombre des bactéries aérobies mésophiles totale présentent dans cette eau égale 60000

bactéries par un millilitre. (Schéma 6).

Pour le dénombrement des coliformes totaux :

Le dénombrement se fait à partir des tubes s tubes dits positives sont :

Les tubes à virage de couleur (couleur jaune).

présentent un dégagement de gaz (les cloches rempliées par le gaz).

Par la méthode NPP on a estimée le nombre des coliformes totaux présentent dans l’eau, la méthode

de calcule est la suivante :

EP2

10-2

PCA

37°C

150

colonies

3×10

D/C

3×0.1

S/C

3×1

S/C

+ + + + + + + + +

3 3 3

8

Le nombre 333 correspond à > 1100 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactéries calculés

égale :

(1100 × 10) = >11000 bactéries dans 100ml.

L’identification biochimique des coliformes:

Les souches pressentant dans le La boite appartient à la famille d’entérobactérie les tests suivants

utilisés pour l’identification des genres de cette famille, notre colonie choisis présente les caractères

suivants :

Indole RM VP Citrate

Escherichia coli + + - -

Enterobacter - - + -

Klebsiella - - + -

citrobacter - + - +

la réaction d’ RM : cette réaction rendre la teinture de milieu en rouge, montre que le pH de

milieu est inférieur à 4.5, Donc RM positive.

La réaction VP : dans notre cas cette réaction ne produise pas une coloration rouge à la surface de

tube (la coloré été jaune foncé), indiqué l’absence d’acétoïne. Donc VP négative.

Indole : l’apparition d’un anneau rouge en surface par l’ajout de réactif de Kovacs, indique la

présence d’indole. Avec la colonie choisis l’anneau rouge n’apparaisse pas. Donc indole négatif.

Citrate : l’utilisation (dégradation) de citrate traduit par l’alcalinisation de milieu et changement de

couleur vers le bleu, notre milieu reste vert donc la souche sélectionnée n’utilise pas le citrate.

Donc elle est citrate négatif.

Lactose, glucose, H2S, gaz : la lecture directe sur le milieu après 24h d’incubation, donne les

résultats suivantes : dans le culot, le virage au jaune traduit par une acidification due à l’utilisation

du glucose (glucose+), l’apparition de bulles dans le culot traduit par la production de gaz (gaz+),

un noircissement du à la formation de sulfure de fer (H2S+), dans la pente le virage au jaune due à

la persistante de l’acidification( la souche utilise le glucose qui est en faible quantité, après elle

utilise le lactose), donc lactose (+).

À partir de ces résultats les caractères de cette souche sont similaires avec sels d’Escherichia coli,

donc on peut dire que la souche choisis est Escherichia coli.

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Recherche des streptococcus groupe D:

Les tubes dits positifs sont les tubes présentant un trouble microbien

La lecture sur le milieu Rothe après 24h à 30°C est la suivante :

Le nombre « 400 » correspond à 15 dans le tableau NPP. Donc le nombre des bactéries égale :

15 bactéries dans 100ml.

5. Conclusion :

A partir des analyses qu’on les fait, on peut évaluer la qualité de cette eau. Le nombre énorme de

FAMT indique que cette eau ne subi aucun traitement. Encore les résultats d’analyses de coliformes

confirment la pollution et la contamination (d’origine animale) de cette eau, l’identification de genre

E.coli et la présence des streptococcus affirme la présence des germes pathogènes dans l’eau.

La conclusion des analyses induisent que l’eau analysé est impropre à la consommation par ce que il

est contaminé, donc il faut prend des précautions lors de la manipulation de cette eau.

Autre information sont acquises dans cette TP par exemple :

L’application des certains techniques tel que le prélèvement, l’ensemencement, le collage des boites,

l’incubation, le repiquage, la réalisation des tests biochimiques et quelques techniques de lavage et de

stérilisation des matériels. Aussi l’évaluation des risques sur le manipulateur.

RM+

5×10

D/C

1×1

S/C

1×0.1

S/C

+ + + + _ _ _

4 0 0

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Annexe I : Tableau représente les milieux de cultures utilisées et leurs compositions.

Le milieu La composition pH Remarque

Milieu PCA gélosé

(plate count

agar)

Peptone

Extrait de levure

Glucose

Gélose

5g

2.5 g

1 g

15g

7.2

Milieu

BCPL (bouillon

lactosé au

pourpre de

bromocrésol)

Peptone

Extrait de viande

Lactose

Pourpre de bromocrésol

5 g

3 g

10 g

25 mg

7

Milieu

Rothe (bouillon)

Peptone

Glucose

Chlorure de sodium

Phosphate bipotassique

Phosphate monopotassique

Azide de sodium

20 g

5 g

5 g

2.7 g

2.7 g

0.2 g

7

Milieu Simmons

(gélose au citrate

de Simmons)

Sulfate de magnésium

Phosphate monoammonique

Phosphate dipotassique

Citrate de sodium

Chlorure de sodium

Bleu de bromothymol

gélose

0.2g

1g

1g

2g

5g

80mg

12g

6.8 Solidifier en

position inclinée

Milieu Kligler-

Hajana (milieu

lactose-glucose-

SH2 de Kligler-

Hajana)

Peptone

Extrait de viande

Extrait de levure

Lactose

Glucose

Sulfate ferreux

Chlorure de sodium

Hyposulfite de sodium

Rouge de phénl

gélose

20g

3g

3g

10g

1g

0.3g

5g

0.3g

2.5mg

15g

7.4 Solidifié en

position semi-

inclinée

Milieu Clark et

Lubs

Peptone

Phosphate dipotassique

Glucose

10g

2g

5g

7

L’eau peptonée Peptone exempte d’indole Chlorure de sodium

15g 5g

7.2

Annexe II : le principe des milieux d’identification.

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Milieu Simmons :

C’est un milieu gélosé incliné contenant un indicateur coloré (Bleu de bromothymol). Le citrate est la

seule source de carbone, la croissance cellulaire est accompagner fréquemment d’une alcalisation qui

se traduit par le virage de milieu au bleu, donc citrate(+).

Recherche d’indole :

L’indole est issu de l’hydrolyse du tryptophane. Après culture de 24h sur l’eau peptonée, l’indole est

caractérisé par le réactif de Kovacs. Quelques gouttes de réactif sont ajoutées au milieu : après

agitation, la présence d’indole se manifeste par apparition d’un anneau rouge en surface.

Milieu Kligler-Hajana :

C’est un milieu gélosé semi-incliné, combiné, il permet la lecture des plusieurs caractères : utilisation

du glucose, avec ou sans gaz, utilisation du lactose, production de H2S.

Les principaux résultats :

Zone du tube Caractère recherché aspect Conclusion

Culot

(anaérobiose)

glucose Inchangé Glucose -

Jaune Glucose +

Pente (aérobiose) lactose Jaune Lactose -

rose Lactose +

Culot

ou jonction culot-

pente

Gaz en glucose bulle Gaz +

Inchangé Gaz -

H2S Noir H2S +

Inchangé H2S -

Milieu Clark et Lubs :

Permet d’établir la voie de fermentation subie par le germe cultivé. Soit la fermentation d’acides

mixtes ou la fermentation butane-indole. Les réactions sont suivis par les deux réactifs ; Rouge de

méthyle et de Vogs-Proskauer. La lecture des résultats :

La réaction teinte L’indication Résultat

RM Rouge pH<4.5 RM+

jaune Ph >6 RM+

VP Rouge Présence d’acétoïne VP+

aucune Absence d’acétoïne VP-

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