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Département de Microbiologie
Cours
Techniques de Contrôle Microbiologique
Réalisé par
HAICHOUR NORA
Destiné aux étudiants de 3ème année « Microbiologie »
2020-2021
Université Ferhat Abbas Sétif 1
Faculté des Sciences de la
Nature et De La Vie
الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية
والبحث العلميالتعليم العالي وزارة
1طيفسجامعة فرحات عباس،
والحياةكلية علوم الطبيعة
i
Table des matières Table des matières.................................................................................................................................. i Listes des figures et des tableaux .......................................................................................................... ii Techniques de contrôle microbiologiques ............................................................................................ 1 1. Objectifs du contrôle microbiologique .............................................................................................. 1
1.1. Qualité hygiénique ..................................................................................................................... 1 1.2. Qualité marchande ..................................................................................................................... 1
2. Politique de contrôle ......................................................................................................................... 2 2.1. Les spécifications microbiologiques ........................................................................................... 2 2.2. Niveaux de contrôle .................................................................................................................... 3 2.3. Fréquence des contrôles ............................................................................................................. 3 2.4. Paramètres à contrôler ............................................................................................................... 3
3. Prélèvement, transport et préparations des échantillons ................................................................ 4 3.1. Prélèvement des échantillons .................................................................................................... 4
3.1.1. Echantillonnage ................................................................................................................... 4
3.1.2. Fréquence des prélèvements .............................................................................................. 8
3.1.3. Conditions du prélèvement ................................................................................................. 8
3.1.4. Prélèvement en surface ....................................................................................................... 9
3.1.5. Prélèvement de produits liquides ..................................................................................... 10
3.1.6. Prélèvement de produits solides ....................................................................................... 10
3.2. Emballage et transport des échantillons .................................................................................. 10 3.3. Préparation de l’échantillon ..................................................................................................... 10 3.4. Techniques de dilutions ............................................................................................................ 11 3.5. La revivification......................................................................................................................... 13
4. Techniques classiques de numérations ........................................................................................... 13 4.1. Numération microscopique ...................................................................................................... 13 4.2. Numération en milieu solide .................................................................................................... 15
4.2.1. Technique de numération dans la masse de la gélose ...................................................... 15
4.2.2. Technique de numération en surface de la gélose ........................................................... 16
4.2.3. Dénombrement après filtration sur membrane ............................................................... 16
4.3. Numération en milieu liquide .................................................................................................. 17 4.3.1. Dénombrement à un seul essai ......................................................................................... 18
4.3.2. Dénombrement à essais multiples «technique du nombre le plus probable NPP» ......... 18
5. Autres méthodes d’évaluation de flores microbiennes .................................................................. 19 5.1. Spectrophotométrie ................................................................................................................. 19 5.2. Spectrométrie de masse ........................................................................................................... 20 5.3. Cytométrie de flux .................................................................................................................... 20 5.4. Impédancemétrie ..................................................................................................................... 20
6. Identification des microorganismes ................................................................................................ 21 6.1. Caractères morphologiques ..................................................................................................... 21 6.2. Caractères culturaux ................................................................................................................. 21 6.3. Composition chimique .............................................................................................................. 22 6.4. Caractéristiques métaboliques ................................................................................................. 22 6.5. Caractéristiques sérologiques .................................................................................................. 22 6.6. Pouvoir pathogène ................................................................................................................... 23
7. Réalisation du contrôle.................................................................................................................... 23 7.1. Contrôle des matières premières ............................................................................................. 23 7.2. Contrôle de la fabrication ......................................................................................................... 24 7.3. Contrôle du nettoyage et de la désinfection ............................................................................ 24 7.4. Contrôle des produits finis ....................................................................................................... 25
ii
Listes des figures et des tableaux Figure 1. Distribution des échantillons d’après l’ICMSF ......................................................................... 6
Figure 2. Ecouvillonnage ........................................................................................................................ 9
Figure 3. Broyeurs pour échantillons solides........................................................................................ 11
Figure 4. Préparation des dilutions ...................................................................................................... 12
Figure 5. Cellule de Malassez ............................................................................................................... 14
Figure 6. Lecture de la cellule de Malassez .......................................................................................... 15
Figure 7. Filtration sur membrane ....................................................................................................... 17
Figure 8. Galeries d’identification ........................................................................................................ 22
Figure 9. Lames gélosées...................................................................................................................... 24
Tableau 1. Composition de certains diluants ....................................................................................... 11
Tableau 2. Dénombrement en milieu liquide à un seul essai ............................................................... 18
Tableau 3. Dénombrement par la technique du nombre le plus probable .......................................... 18
Tableau 4. Table de Mac Grady ............................................................................................................ 19
Tableau 5. Concentration cellulaire approximative par spectroscopie ................................................ 20
1
Techniques de contrôle microbiologiques
Les fabrications dans les bio-industries supposent la maîtrise des développements microbiens, aussi
bien des souches de cultures utilisées en fermentation, si une telle étape intervient dans la fabrication,
que des microorganismes contaminants. En effet, un levain dont le taux de croissance serait trop faible
ne permet pas de réaliser des fermentations correctes. Par ailleurs des microorganismes contaminants
peuvent perturber, à des degrés divers, le déroulement de la fabrication et mettre en cause la qualité
et la conservation du produit final.
1. Objectifs du contrôle microbiologique Les contrôles doivent permettre de garantir une bonne qualité hygiénique et une bonne qualité
marchande du produit fabriqué. De plus, les contrôles doivent permettre de minimiser les pertes dues
à des mauvaises conditions de fabrication et donc d’avoir le moins possible de produits non conformes.
1.1. Qualité hygiénique Une altération de la qualité hygiénique met en cause la santé du consommateur, le produit altéré
conduisant à des intoxications alimentaires de gravité diverse suivant la nature des microorganismes
en cause. Cette altération est généralement invisible. Elle est due à un développement de
microorganismes pathogènes produisant des toxines, deux cas peuvent alors se présenter :
- la toxine est excrétée dans le produit (exotoxine). A partir d’une certaine quantité de toxine, le
produit est dangereux à consommer même si le microorganisme n’est plus vivant dans le produit. C’est
le cas de staphylocoques pathogènes ou de Clostridium botulinum ;
- la toxine n’est pas secrétée mais reste dans les cellules microbiennes (endotoxine). Pour que le
produit soit dangereux pour le consommateur, le microorganisme doit être présent et vivant. C’est le
cas des entérobactéries par exemple.
Les contrôles microbiologiques permettent donc d’éviter la présence de microorganismes dans les
produits afin de ne pas risquer une altération de la qualité hygiénique des produits finis ou au moins
détecter ces microorganismes s’ils sont présents dans les produits finis avant leur commercialisation.
1.2. Qualité marchande Une altération de la qualité marchande modifie la texture et la qualité organoleptique du produit.
Cette altération bien que généralement non dangereuse pour la santé du consommateur, rend le
produit non commercialisable. Cette altération survient lorsque la technologie mise en œuvre pour
assurer la stabilité microbiologique a été défaillante. La nature des microorganismes responsables de
ces altérations dépend étroitement du type de produit et de la technologie mise en œuvre. Exemple,
des levures osmophiles peuvent se développer et donc altérer (gonflement) un produit sucré à faible
activité d’eau si ce facteur n’a pas été parfaitement maitrisé.
L’altération de la qualité marchande se produit généralement lentement au cours du stockage. Les
contrôles microbiologiques ont pour objectif de détecter les microorganismes pouvant être
responsables de ces altérations, et de vérifier l’efficacité des technologies après leur application afin
de stocker et de commercialiser les produits microbiologiquement stables.
2
La bonne qualité microbiologique (hygiénique et marchande) est fonction de très nombreux facteurs ;
le microbiologiste se doit néanmoins de définir le plus rapidement possible la notion quantitative et
qualitative de flore normale de son produit ou de ses matières premières (microorganismes
«habituels» et tolérables) et d’une flore contaminante dont le seuil de tolérance sera défini en
fonction du risque que fait courir cette flore au consommateur.
La Technologie est l’aptitude à la transformation et à la distribution. La qualité d’un produit doit
satisfaire tous les utilisateurs. Le consommateur n'est pas le seul utilisateur (les transformateurs,
artisans et industriels, les distributeurs, magasins et grandes surfaces, attendent eux aussi des
caractéristiques précises des produits), il s'agit des «Qualités Technologiques». Exemple : qualité
boulangère d'une farine de blé, qualité de rétention d'eau d'une viande destinée à la salaison, qualité
de conservation d'un yaourt, ...
2. Politique de contrôle La politique de contrôle dans chaque usine doit être établie en faisant appel à la réflexion et au bon
sens pour éviter des pertes importantes dues à des interventions tardives. Le contrôle microbiologique
doit donc permettre de surveiller pas à pas les fabrications. Le contrôle microbiologique occupe une
place privilégiée dans les procédures de mise sous assurance-qualité. Il comporte quatre démarches
en interaction :
- L’évaluation (par exemple d’un niveau de qualité existant) ;
- La définition d’un objectif (amélioration de la qualité) ;
- La préparation (mise en place de moyens nécessaires pour atteindre l’objectif retenu) ;
- L’exécution (réalisation de la production à l’aide des dispositifs mis en place).
Le système HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) ou encore ADPCM (Analyse des Dangers et
des Points Critiques pour leur Maîtrise) utilise une démarche où le contrôle microbiologique joue un
rôle essentiel. En effet, à chaque point critique, en se basant sur des critères microbiologiques, un
niveau seuil (défini) de contamination microbienne ne doit pas être dépassé.
Le contrôle microbiologique a deux fonctions distinctes :
- Evaluer la qualité microbiologique d’un produit ou d’une matière première ;
- Maîtriser un point critique sur une chaine de production.
2.1. Les spécifications microbiologiques Les spécifications microbiologiques sont des critères applicables pendant et après la préparation afin
de s’assurer que l’hygiène et les conditions de production sont satisfaisantes et en accord avec la
règlementation. Les parties prenantes d’un marché y trouveront des garanties.
Les normes sont des spécifications microbiologiques adoptées par la législation qui s’adressent au
produit fini et fixent les limites acceptables de présence de microorganismes donnés dans des produits
bien définis.
Il existe actuellement de nombreux organismes nationaux ou internationaux qui se préoccupent de
l’établissement de critères de qualité microbiologique comme :
3
FAO (Food and Agriculture Organisation)- L’OMS (Organisation mondiale de la Santé)- L'ISO
(Organisation Internationale de Normalisation)- Le comité technique 34 (CT34) concernant les produits
agroalimentaires- Le Codex alimentarius crée en 1963 par la FAO et l'OMS- Le CEN (Comité européen
de normalisation) ...
2.2. Niveaux de contrôle Les contrôles doivent être répartis en trois groupes :
- Les contrôles préventifs sont effectués sur les matières premières et les différents adjuvants.
Dans le cas où le processus de fabrication fait intervenir une fermentation, des contrôles
microbiologiques sur le levain sont nécessaires.
- Les contrôles en cours de fabrication comprennent les contrôles microbiologiques sur le produit lui-
même mais aussi sur les facteurs ayant une influence sur la qualité du produit comme l’hygiène des
matériels, des locaux et du personnel. Le nombre des contrôles est défini suivant la longueur des
chaines de fabrication (durée) et les risques de contamination possible.
- Les contrôles des produits finis déterminent la qualité microbiologique du produit fini et sa
conformité aux normes officielles ou aux normes établies par l’usine.
2.3. Fréquence des contrôles Il n’y a pas de règle absolue quant à la fréquence des contrôles à réaliser. Pour chaque type de
fabrication, dans chaque usine, la fréquence des contrôles est à établir sur la base de l’expérience et
en fonction des moyens disponibles.
2.4. Paramètres à contrôler Les microorganismes à rechercher varient suivant la technologie et les caractéristiques physico-
chimiques du produit en cours de fabrication et du produit fini. Il n’est donc pas possible de donner
une liste des microorganismes à rechercher, chaque fabrication étant un cas particulier, mais l’on peut
cependant dégager quelques orientations générales :
- Les microorganismes responsables d’une altération de la qualité hygiénique, comme les germes de
contamination fécale (entérobactéries) ou les germes pathogènes de contamination de produits
manipulés (staphylocoques) sont moins systématiquement recherchés dans les produits faisant
intervenir une biotechnologie que dans les autres produits alimentaires. Certains produits par leurs
propriétés physico-chimiques (pH, activité d’eau, alcool) ne permettent pas le développement de ces
microorganismes. Cependant dans certains produits (les laits fermentés, les yaourts, les additifs
alimentaires ou les produits à usage pharmacologique), ces microorganismes et particulièrement les
coliformes doivent être recherchés notamment dans les produits finis.
- Les microorganismes responsables d’une altération de la qualité marchande et d’une perte de
rendement devront être recherchés du début de la fabrication (matières premières), jusqu’au produit
fini. Les microorganismes à rechercher dépendent étroitement du produit en cours de fabrication, les
levures dans les produits sucrés ou les produits acides, bactéries lactiques ou acétiques dans les
produits acides, moisissures dans les produits peu hydratés.
4
- Dans les biotechnologies mettant en œuvre un levain bactérien les contaminants les plus redoutés
sont les bactériophages. Il convient donc de contrôler les levains et de prendre des précautions contre
ces microorganismes en cours de fabrication.
3. Prélèvement, transport et préparations des échantillons Les résultats des essais et leur interprétation sont valables et significatifs si l’échantillon soumis est
représentatif du lot et que l’intégrité du produit est assurée depuis le prélèvement jusqu’à l’analyse.
Deux objectifs principaux doivent être visés lors du prélèvement des échantillons :
- Obtenir un échantillon représentatif, c’est-à-dire qui est une image fidèle de l’ensemble d’un lot
homogène ou hétérogène, afin de conclure sur ce lot ;
- Obtenir un échantillon intègre afin d’assurer le maintien de l’état du produit tel qu’il
existe au moment de l’échantillonnage jusqu’à l’analyse. Toutes les mesures nécessaires doivent donc
être prises pour prévenir toute contamination, prolifération ou destruction microbienne durant la
manutention et l’entreposage des échantillons.
Comme pour tout échantillon soumis à des essais microbiologiques, lorsque des produits peuvent faire
l’objet d’une action légale (saisie, poursuite, confiscation ou élimination), la chaîne de froid et la chaîne
de possession doivent être respectées. Il doit être possible de démontrer que l’échantillon a été
conservé chambré, réfrigéré ou congelé, selon le cas, et qu’il n’y a pas eu d’interruption de la
possession à partir du prélèvement jusqu’à l’analyse.
3.1. Prélèvement des échantillons La taille de l’échantillon d’un produit de même nature réparti en portions unitaires doit être au moins
de 5 unités (lieu de fabrication ou de distribution), de 5 unités pour les conserves. Le laboratoire doit
disposer d’environ 500 g de produits, soit 5 fois 100 g, ces 100 g pouvant être fournis par une ou
plusieurs pièces. Si le prélèvement de 5 échantillons s’avère trop élevé par rapport à la production il
est procédé à un étalement dans le temps des prélèvements. Ces prélèvements doivent avant tout
respecter des règles d’asepsie et de représentativité. La prise d’essai destinée à la préparation de la
suspension mère et de ses dilutions doit correspondre aux parties superficielles et profondes
notamment pour les produits en tranche, hachés, divisés et les plats cuisinés par exemple. Pour les
produits liquides elle est effectuée sur le produit «homogénéisé» ou sur les parties superficielles et
profondes. Dans le cas d’examens microbiologiques faisant suite à une maladie de type toxi-infections
alimentaires (TIA) il faut rechercher les germes dangereux (pathogènes, toxinogènes) et leurs toxines
aussi bien dans les prélèvements de surface que dans la masse.
3.1.1. Echantillonnage
Un échantillonnage représentatif est essentiel quand l’analyse a pour but de détecter la présence de
germes pathogènes ou de toxines qui peuvent être distribués de façon hétérogène dans l’aliment ou
quand la commercialisation d’un produit dépend de la qualité microbiologique en relation avec les
normes imposées par la législation.
L’objectif de l’échantillonnage influencera le type de plan d’échantillonnage, la nature des paramètres
demandés et l’interprétation du résultat des essais.
5
Il est nécessaire, en tout premier lieu, de tenir compte du contexte et d’établir le but
poursuivi lors du prélèvement des échantillons :
- complément à une visite d’inspection ;
- programme de surveillance ou étude de profil ;
- contrôle de la qualité ;
- recherche de pathogènes dans l’environnement ;
- poursuites, saisies ;
- vérification de l’efficacité des procédés de nettoyage ;
- suivi d’un résultat non conforme.
- Echantillon, une quantité de produit prélevé d’un lot et soumis à des essais en laboratoire. Un
échantillon peut consister en une ou plusieurs unités d’échantillonnage.
- Unité d’échantillonnage, portion ou contenant individuel de produit prélevé au hasard dans un lot.
Une unité d’échantillonnage peut correspondre à un échantillon.
- Cadre d’échantillonnage, le regroupement de toutes les unités qui nous intéressent, dans un
espace-temps bien défini. L’échantillon décrit la population dont il est issu pour une période de
temps et un espace précis.
Exemples :
- La vérification de la qualité de la glace comparée à la vérification de la potabilité de l’eau utilisée pour
produire la glace.
- La vérification de la qualité d’un sandwich au poulet comparée à la qualité du poulet cuit avant
manipulations.
- Le cadre d’échantillonnage des fromages fabriqués à Sétif durant l’année en cours ne représente pas
nécessairement la population de fromages fabriqués l’année précédente, de même qu’il ne représente
pas la population des fromages fabriqués en Algérie. Dans ce cas, il faut préciser que le cadre
d’échantillonnage est l’ensemble des fromages fabriqués pendant une année sur un territoire
particulier, à Sétif.
⃝ La Commission Internationale des Normes Microbiologiques relatives aux denrées alimentaires
ou ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods) a défini des
méthodes d’échantillonnage pour l’analyse systématique des produits alimentaires. Le principe de
base est : un échantillon analysé donne des résultats non satisfaisants s’il renferme des
microorganismes dangereux ou s’il contient des germes en nombre supérieur à une limite au-delà
de laquelle il devient potentiellement dangereux.
Les réglementations fixant des exigences obligent à prendre en considération une combinaison de
critères. Le but est de se faire une meilleure idée de la répartition de la contamination, et en même
temps d'intégrer une notion d'avertissement. Dans ce cas, les critères sont représentés par les lettres
n, M, m et c :
n étant le nombre d'échantillons individuels devant être prélevés (généralement 5, parfois 10) ;
6
M une valeur maximum absolue qui ne peut être dépassée par aucun des n échantillons analysés ;
m une valeur maximum relative qui est toujours inférieure à M. Le symbole m représente la limite
permettant de répartir les échantillons en 2 groupes : les acceptables (valeur ≤ m) et les inacceptables
(valeur ≥ m). Pour certains microorganismes dangereux m peut être égal à 0.
c le nombre d'échantillons parmi ces n qui peuvent dépasser la valeur m (mais qui doivent évidemment
toujours être inférieurs à M).
Exemple :
Il y a pour le nombre de staphylocoques dans le fromage au lait cru une exigence dont les valeurs sont
n = 5, M = 10000/g, m = 1000/g et c = 2. Cela signifie que 5 échantillons doivent être prélevés, qu'aucun
d'entre eux ne peut contenir plus de 10000 staphylocoques par gramme et que 2 échantillons au
maximum peuvent avoir une valeur comprise entre 1000/g et 10000/g. Pour les pathogènes, souvent
on ne mentionne que n et c=0, ce qui suppose implicitement que M = m = 0 (pathogène absent dans
tous les n échantillons).
Quand un microorganisme donné est toléré dans un aliment 3 catégories d’échantillons sont définies :
- catégorie 1 (acceptables sans réserve)
- catégorie 2 (acceptables mais avec une limite)
- catégorie 3 (inacceptables).
m sépare la 1ère et la 2ème catégories et M la 2ème et la 3ème (figure 1).
Figure 1. Distribution des échantillons d’après l’ICMSF
3.1.1.1. Plan d’échantillonnage
Le nombre d’échantillons à prélever est déterminé en fonction de la situation. Le plan
d’échantillonnage est grandement influencé par le risque à la santé et l’hétérogénéité du lot. Il existe
deux types de plan d’échantillonnage qui sont applicables à des systèmes «aliments-germes-
consommateurs» bien identifiés.
7
- Plan d’échantillonnage à 2 classes
Ce plan donne des résultats permettant de déterminer 2 classes de contaminations. Ce type de plan
n’accepte aucune tolérance et correspond le plus souvent aux conclusions : absence dans (le résultat
est bon et le produit jugé satisfaisant) ou encore présence dans (le résultat est mauvais et le produit
est déclaré impropre à la consommation). Avec un plan d’échantillonnage à 2 classes (catégories 1, 3),
n représente le nombre d’échantillons examinés. Il existe deux possibilités pour ce type de plan :
- utiliser la notion de présence ou absence
- déterminer la tolérance ou non des numérations supérieures à la valeur critique m
Le symbole c représente le nombre d’échantillons tolérés au-delà de la valeur seuil, nombre qui permet
de juger le lot comme satisfaisant.
Exemple : Pour les viandes de volailles contaminées en surface par Salmonella : m = 0 n = 5 c = 1
Pour la plupart des autres produits on a avec cette bactérie et d’autres microorganismes très
dangereux (Listeria, Brucella , etc ) : m = 0, n = 5 et c = 0.
Pour les viandes de boucherie conditionnées sous vide ou non, réfrigérées ou congelées on a pour la
Flore Aérobie Mésophile m = 5.104, n = 5 et c = 0.
La rigueur du plan dépend des valeurs de n et de c. Plus grand est n pour une valeur donnée de c,
meilleure sera la qualité des lots acceptés. A l’inverse, si pour une valeur donnée de n, c augmente, la
rigueur du plan diminue.
- Plan d’échantillonnage à 3 classes
Ce plan est basé sur la reconnaissance de 3 catégories d’échantillons en fonction de leur niveau et
nature de contamination : celle inférieure ou égale à m, celle comprise entre m et le seuil M, celle
supérieure à M. La valeur S constitue le seuil de toxicité.
Avec un plan d’échantillonnage à 3 classes (catégories 1, 2, 3), il existe pour c un facteur de précision
supplémentaire qui est le nombre d’échantillons tolérés dont les charges microbiennes sont comprises
entre m et M. La présence d’échantillons entre m et M n’est pas souhaitable mais tolérée. Pour les
valeurs supérieures à M les lots ne peuvent pas être acceptés pour la commercialisation. Ce plan à 3
classes permet de déterminer par des calculs appropriés la probabilité selon laquelle un lot sera
accepté ou refusé en fonction du nombre d’échantillons défectueux qu’il contient. S’il n’y a pas
d’échantillon avec une valeur supérieure à M on est ramené au plan à 2 classes.
Le plan est choisi en fonction de l’estimation du risque pour la santé et du mode d’utilisation de
l’aliment. Les germes sont classés en fonction du risque qu’ils font courir au consommateur en :
- Germes entraînant un risque sévère (Clostridium botulinum, Salmonella typhi, S. paratyphi, Shigella
dysenteriae, Vibrio comma , Brucella melitensis, Listeria monocytogenes , Clostridium perfringens type
C, virus de l’hépatite A).
- Germes entraînant un risque moyen avec possibilité de large diffusion (Staphylocoques
entérotoxinogènes, Salmonella typhimurium et les autres sérotypes, autres Shigella, Vibrio
parahaemolyticus , Escherichia coli entéropathogènes, Streptocoques b hémolytiques).
8
- Germes entraînant un risque moyen sans grande diffusion (Bacillus cereus, Brucella abortus,
Clostridium perfringens, Salmonella arizonae, Francisella tularensis, Yersinia enterocolitica,
Pseudomonas aeruginosa , Campylobacter jejuni , etc...).
Le plan à 3 classes est le plus souvent adopté ; la valeur de m est déterminée par les résultats de
l’analyse de nombreux échantillons sur des lots jugés satisfaisants. La valeur de M est plus difficile à
fixer et est fonction du produit, de la bactérie recherchée et de la méthode employée.
Les valeurs de n et c sont choisies en fonction du niveau souhaité d’acceptabilité ou de rejet des lots.
Il est évident que plus n sera grand et plus c sera petit et meilleur sera le contrôle réalisé.
Valeurs numériques des critères d'un plan a trois classes
m : fixé par décret (surtout fonction du germe, du consommateur type et de l'aliment) tous les résultats
égaux ou inférieurs à m sont considérés comme satisfaisants
M : seuil limite au-delà duquel les résultats sont considérés comme non satisfaisants sans que le
produit soit dangereux. Les valeurs de M sont fixées à : M = 10 m quand les dénombrements sont
réalisés en milieux solides et M = 30 m pour des numérations en milieu liquide
n : nombre d'unités composant l'échantillon
c : nombre d'unités de l'échantillon donnant des valeurs entre m et M
Qualité du lot
Satisfaisante ou acceptable : aucun résultat ne dépasse M
Satisfaisante : les valeurs déterminées sont inférieures à : 3 m lors de numérations en milieu solide et
10 m en milieu liquide.
Acceptable : les valeurs déterminées sont comprises entre : 3 m et 10 m en milieu solide et 10 m et 30
m en milieu liquide avec le plan n = 5 et c = 2.
Non satisfaisant : des valeurs supérieures à M.
⃝ Cas particulier des conserves
Les conserves doivent satisfaire à des épreuves permettant de vérifier leur stabilité / stérilité. Ces
épreuves consistent en deux étuvages de 5 échantillons à 37°C pendant 7 jours (ou à 30°C pendant 10
jours) et à 55°C pendant 7 jours. A l’issu de ces épreuves on observe l’éventuel bombage (il faut aussi
que le pH entre les unités étuvées et les unités témoins ne dépasse pas 0,5).
Par microscopie (après étalement d’un volume donné voisin de 10 µl de produit puis fixation et
coloration au bleu de méthylène par exemple) on compte sur 20 champs le nombre de germes
respectivement observés à partir de la boîte incubée (n) et de la boîte témoin (n’). n / n’ doit être
inférieur à 100.
3.1.2. Fréquence des prélèvements
L’échantillonnage doit être réparti dans le temps en fonction du niveau de production et des risques
de contamination.
3.1.3. Conditions du prélèvement
Les conditions essentielles à respecter pour le prélèvement sont d’abord le respect des règles
d’asepsie (travail correct du microbiologiste) et la non modification des flores présentes dans le
9
produit. Dans la mesure du possible, les échantillons du produit à analyser doivent être amenés au
laboratoire dans leur conditionnement d’origine, ce qui évite certaines contaminations.
Si le produit se présente sous forme de grands volumes (réservoirs à lait etc...) s’assurer de la bonne
homogénéité de la répartition des micro-organismes ; une partie représentative du produit sera
prélevée stérilement. Il est parfois nécessaire de réaliser des prélèvements à divers niveaux de
l’aliment (surface, profondeur d’un aliment solide) ou après broyage et homogénéisation.
Les manipulations effectuées au cours du prélèvement ne doivent en aucun cas être à l’origine d’une
contamination : nécessité d’utiliser des instruments stériles et de travailler stérilement.
Certains instruments doivent être stérilisés sur les lieux du prélèvement. Le trempage dans l’alcool et
le flambage sont parfois insuffisants car la température atteinte n’est pas assez élevée. Il est nécessaire
d’utiliser des flacons propres, secs, étanches, à col large stérilisés au four Pasteur (30 minutes à 1 heure
à 170° - 180°C ou 2 heures à 160°C ce qui a pour but d'éviter le brunissement du coton) ou par
autoclavage à 121°C pendant 30 min ou encore à usage unique et stériles ; leur taille doit être adaptée
au volume de l’échantillon. Les récipients peuvent être en verre, en métal ou en matière plastique
(polyéthylène, polycarbonate, polypropylène). Les récipients de prélèvement doivent posséder un
système de fermeture hermétique. Le prélèvement d’un produit non emballé doit être réalisé dans la
zone de stérilité d’un bec bunsen ou d’un système équivalent.
3.1.4. Prélèvement en surface
L’objectif de ce prélèvement est l’évaluation du nombre de bactéries sur des surfaces (tables de travail,
ustensiles, verres, etc.) et la vérification des procédures de nettoyage et d’assainissement.
- Ecouvillonnage, un écouvillon de coton hydrophile est immergé dans une solution stérile de Ringer
au 1/4 ou dans un bouillon tryptone-sel additionné de Tween (0,5‰). Le prélèvement est effectué par
frottement sur la surface du produit ; l’écouvillon est alors immergé dans 10 ml de Ringer au 1/4 ou 10
ml de bouillon tryptone-sel. L’analyse est réalisée à partir de la suspension ainsi obtenue (figure 2)
.
Figure 2. Ecouvillonnage
- Rinçage : cette méthode est utilisée dans le cas de récipients ou de tuyauteries ; un volume connu de
solution stérile est introduit dans le matériel à analyser. Après agitation, le liquide est récupéré et
soumis à l’analyse.
- Méthode des empreintes : un ruban adhésif préalablement stérilisé par les UV est appliqué sur la
surface à étudier. Après quelques secondes de contact il est retiré et appliqué sur la surface d’un milieu
gélosé approprié. Après quelques heures de contact à la température d’incubation désirée il est retiré
et la boîte est incubée jusqu’à apparition des colonies.
10
- Méthode du cylindre : un cylindre creux de section connue est appliqué sur la surface à analyser ; on
y introduit alors quelques ml de diluant stérile et après quelques secondes de contact, le diluant est
retiré et analysé.
3.1.5. Prélèvement de produits liquides
La technique varie avec le produit, le volume et la forme du contenant. Il faut néanmoins toujours
s’assurer de la parfaite homogénéisation du liquide (agitateurs) avant de prélever à la pipette (ou avec
un flacon lesté stérile ou autre) le volume nécessaire à l’analyse.
3.1.6. Prélèvement de produits solides
Selon le produit, le prélèvement sera effectué au scalpel, à la sonde (fromages et produits mous) ou à
la pipette harpon. La surface est souvent éliminée avant de procéder au prélèvement. Si le produit est
hétérogène (plats cuisinés, conserves etc.) il faut s’assurer de la bonne représentativité du
prélèvement.
3.2. Emballage et transport des échantillons Quand le prélèvement aseptique a été réalisé, chaque échantillon doit être identifié ; toutes les
informations doivent figurer sur l’étiquette de prélèvement et être inscrites à l’aide d’un crayon à
encre indélébile. Identifier, si nécessaire, un code ou un numéro qui relie l’échantillon au lot d’origine.
Noter la température initiale, l’heure du prélèvement, la date et la température de transport.
Les échantillons doivent être immédiatement réfrigérés (dans une glacière propre) s’ils ne sont pas
stables à température ambiante. Les échantillons dont la conservation est assurée à température
ambiante, tels les boîtes de conserve et les produits secs, peuvent être expédiés sans réfrigération.
Les échantillons sont alors transportés le plus rapidement possible au laboratoire en maintenant les
conditions initiales dans lesquelles se trouvait le produit. L’analyse devrait être réalisée dans l’heure
qui suit le prélèvement.
Pour un produit congelé s’assurer qu’il n’y ait pas de décongélation pendant le transport (ce produit
peut être gardé pendant 1 mois avant d’être analysé). La congélation d’un produit provoque une
diminution plus ou moins importante du nombre de germes qu’il contient. Il faut veiller à ce que la
température du produit prélevé soit au moins égale à -18°C, transporter le produit à cette température
et décongeler à l’air ambiant à température voisine de 20°C pendant un temps inférieur à 3 heures,
temps suffisant pour atteindre une texture qui permette le prélèvement.
3.3. Préparation de l’échantillon
Quelle que soit la nature initiale du produit, l’analyse microbiologique s’effectue toujours à partir d’une
suspension. Après ouverture aseptique, l’échantillon sera «homogénéisé» (liquide) ou broyé dans un
volume connu de diluant stérile (solide) ce qui constitue en fait la première dilution.
11
Figure 3. Broyeurs pour échantillons solides
Pour les produits liquides (ou semi-liquides) une agitation manuelle vigoureuse en présence de billes
de verre permet d’obtenir une homogénéité satisfaisante.
Pour les produits solides diverses techniques de «broyage» sont utilisables :
Broyage manuel au Potter ou en présence de sable stérile ou de billes de verre (mortier) ; ou broyage
avec un broyeur électrique à couteaux (figure 3). Au cours du broyage les germes doivent être
dispersés mais non détruits ; la température ne doit pas trop s’élever (le récipient peut être placé dans
de la glace). Le broyage s’effectue en général avec 10 volumes (ou 9) de diluant pour 1 “volume” de
produit (par exemple 10 g de produit et 100 ml (ou 90) de diluant stérile). Le diluant peut être de l’eau
distillée, de l’eau physiologique, du Ringer au 1/4 ou une solution tryptone-sel, etc.
3.4. Techniques de dilutions
Au cours de la préparation des échantillons (et des dilutions) les microorganismes peuvent être inhibés
ou même altérés par le changement du milieu lié à l’addition de diluant (changement de pH mais
surtout de force ionique). L’effet bactéricide de certains diluants est connu : ainsi Staphylococcus
aureus est «tué» en quelques heures dans de l’eau distillée de même que la plupart des
entérobactéries (E. coli) ; il en est de même pour Streptococcus pyogenes dans du sérum physiologique
ou dans du Ringer au 1/4 et pour Escherichia coli dans de l’eau salée à 8,5‰. Actuellement il paraît
souhaitable, sauf indication complémentaire à un type donné de produit à analyser, de réaliser les
préparations et les dilutions des échantillons à analyser dans une solution de tryptone sel. Tous ces
diluants (tableau 1) sont stérilisés à 121°C pendant 20 minutes.
Tableau 1. Composition de certains diluants
Tryptone sel Ringer (solution mère) Eau physiologique Eau peptonée tamponnée
Tryptone (1g)
NaCl (8.5g)
Eau distillée
(1000ml)
pH = 7
NaCl (9g)
KCl (0.42g)
CaCl2 (0.48g)
NaHCO3 (0.2g)
Eau distillée (1000ml)
NaCl (9g)
Eau distillée (1000ml)
Bacto peptone (20g)
NaCl (5g)
Na2HPO4 (9g)
KH2PO4 (1.5g)
Eau distillée (1000ml)
pH = 7.2
12
Les dilutions nécessitent la présence de nombreux tubes à essais contenant le plus souvent 9 ml de
diluant stérile et de nombreuses pipettes stériles de 1 et 10 ml. Les pipettes peuvent être remplacées
par des systèmes de pipetage automatique munis de cônes à usage unique (figure 4).
Toutes les manipulations sont à effectuer avec toutes les précautions d’asepsie exigées en
microbiologie. L’introduction éventuelle d’un contaminant ou la contamination de l’opérateur ne
doivent jamais se produire.
Figure 4. Préparation des dilutions
Le récipient contenant le liquide à diluer est agité manuellement avec précaution pour éviter les
projections pendant une dizaine de secondes.
On prélève stérilement 1 ml de ce liquide (aspirer et refouler une fois avant le prélèvement) que l’on
introduit dans un tube contenant 9 ml de diluant stérile.
Le tube est agité par des mouvements de rotation ou au moyen d’un Vortex. On obtient ainsi une
dilution au 1/10.
Avec une nouvelle pipette de 1 ml on prélève 1 ml de cette dilution que l’on introduit dans un
nouveau tube de diluant de 9 ml ; on obtient une dilution au 1/100 et ainsi de suite jusqu’au niveau
de dilution recherché.
13
3.5. La revivification Les micro-organismes sont souvent «endommagés» mais non tués au cours des traitements
technologiques (déshydratation, chaleur, froid, etc.) appliqués aux produits alimentaires ou par suite
de leur vieillissement. Ces altérations se reflètent dans certaines de leurs propriétés physiologiques en
particulier au niveau de leur phase de latence qui est augmentée ou de leurs besoins nutritionnels ou
encore quant à leur sensibilité aux conditions de milieu défavorables (pH, sels biliaires, colorants, sels,
etc.). En général ces altérations sont réversibles et après leur disparition les bactéries récupèrent leurs
propriétés initiales, en particulier au niveau de leur croissance ou de leur pouvoir pathogène.
La nécessité de faciliter le «rétablissement» des cellules ayant subi des altérations sublétales, c’est-à-
dire leur «réanimation» ou encore leur revivification, s’impose avant de les soumettre à des milieux
sélectifs souvent peu favorables à la croissance du fait de la présence d’inhibiteurs. En effet, la
présence de cellules endommagées peut entraîner des variations dans les numérations ou porter à
croire qu’il n’y a pas ou peu de germes et donc pas ou aucun risque pour le consommateur. Ceci est
particulièrement important quand il s’agit de déterminer si des micro-organismes pathogènes ou
indicateurs sont présents ou non.
4. Techniques classiques de numérations Le terme « dénombrement d’une flore » signifie que l’analyse microbiologique doit permettre de
quantifier dans l’échantillon une flore particulière. Le résultat d’une telle analyse quantitative est
rendu sous forme d’une concentration en micro-organismes (appartenant à une flore particulière) par
unité de masse ou de volume d’échantillon.
Bien que de nombreuses techniques de numération soient utilisables, il n’existe pas à l’heure actuelle
de technique parfaite. Certaines méthodes ne permettent pas de différentier les germes vivants des
germes morts, d’autres s’avèrent incapables de compter individuellement les cellules microbiennes
lorsque celles-ci sont associées (Staphylococcus, Streptococcus, mycélium, etc) et permettent
d’évaluer des unités formant colonies (UFC) ou des unités formant trouble (UFT)
4.1. Numération microscopique Il s’agit d’un dénombrement par observation directe ; la numération cellulaire est réalisée par
comptage au microscope, à l’aide d’une lame de comptage spéciale ou cellule de numération ou
hématimètre (Cellule de Malassez) (figure 5). En effet, Il existe deux grands types principaux de cellules
de numération (Cellule de Thoma et la Cellule de Malassez, la plus courante).
14
Figure 5. Cellule de Malassez
Une cellule de numération est une lame porte objet dans laquelle est creusée une chambre de
comptage de volume connu. C’est une lame épaisse en verre, comportant des rigoles et un quadrillage.
Lorsque la suspension cellulaire est trop concentrée, il est nécessaire de réaliser une dilution préalable
de façon à permettre le comptage des cellules au microscope.
Le volume de comptage est déterminé par la surface du quadrillage gravé sur la lame et la profondeur
de la chambre. Le volume correspondant au quadrillage total est égal à 1 mm3 = 10-6 dm3 (10-3 cm3
donc 1µl), Chaque rectangle correspond à un volume 100 fois plus faible, soit 0,01 mm3 = 10-8 dm3.
• Humecter les deux plateaux latéraux. Faire adhérer parfaitement la lamelle aux plateaux latéraux :
pour cela placer la lamelle sur ces plateaux, puis à l’aide des pouces posés sur la lamelle, exercer une
pression sur la lamelle tout en pratiquant un mouvement de va et vient jusqu’à perception d’une
résistance.
• Placer la cellule de comptage sur une surface plane. Homogénéiser la suspension cellulaire, et
prélever celle-ci à l’aide d’une pipette Pasteur. Remplir la chambre de comptage par capillarité, en
plaçant la pointe de la pipette légèrement inclinée près de la lamelle sur la plate-forme centrale
quadrillée. Le remplissage doit être fait en une seule fois, sans bulles d’air, et sans faire déborder le
liquide dans les rigoles. Laisser sédimenter les cellules sur le quadrillage quelques minutes, et passer à
la numération.
• Observer à l’objectif x10 pour repérer la position du quadrillage, et vérifier l’homogénéité de la
répartition des cellules à compter (si la répartition est mauvaise, recommencer).
• Observer ensuite à l’objectif x40 pour réaliser le comptage (1 rectangle par champ).
• Compter les cellules contenues dans 4, 10, 20 ou dans la totalité des 100 rectangles du quadrillage.
15
Remarque : pour les cellules chevauchant les lignes de quadrillage, compter seulement celles qui
chevauchent 2 arêtes du rectangle sur 4 (en pratique, on choisit de prendre en compte les cellules
chevauchant la ligne horizontale supérieure, et la ligne verticale droite).
Figure 6. Lecture de la cellule de Malassez
• Après utilisation, la lame porte-objet et la lamelle planée sont immergées dans un bain d’eau de Javel
pendant 5 minutes, puis sont rincées avec de l’eau distillée et essuyées avec du papier (sans frotter,
en particulier au niveau du quadrillage).
Après avoir effectué la manipulation, on calcule la concentration cellulaire de la suspension de cellules
étudiée. N = (n /V) x f
-n : nombre de cellules comptées
-V : volume de comptage
-f : facteur de dilution
-N : nombre de cellules par litre
4.2. Numération en milieu solide
Cette méthodologie est le plus fréquemment réalisée dans des boîtes de Pétri. Elle repose sur le
principe que toute bactérie vivante introduite dans la masse ou en surface d’un milieu gélosé favorable
donne en principe naissance après incubation à une colonie macroscopique. Le nombre total de
colonies correspond alors au nombre d’UFC présents dans l’inoculum.
4.2.1. Technique de numération dans la masse de la gélose
Les milieux gélosés (répartis en erlenmeyer ou en flacon de 15 ml) sont liquéfiés au bain-marie
bouillant ou au four à micro-ondes, puis maintenus en surfusion dans un bain-marie à 45 ±1°C. 1 ml du
liquide dans lequel on veut connaître le nombre de micro-organismes est introduit au centre de la
boîte de Pétri posée bien à plat dans la zone de protection du bec Bunsen. L’inoculum peut être réparti
en gouttes sur le fond de la boîte. Afin de n’utiliser qu’une seule pipette stérile pour toutes ces
opérations il est recommandé de commencer l’ensemencement par la dilution la plus grande pour
terminer avec le liquide non dilué. Les essais sont pratiqués en duplicata (ou triplicata si possible) pour
chaque dilution.
Sur chaque boîte l’origine de l’analyse, le milieu utilisé et la dilution correspondante sont enregistrés
(sur le côté de façon à ne pas être gêné par la suite pour le comptage).
16
4.2.2. Technique de numération en surface de la gélose
100 à 500 microlitres (pipette graduée ou mieux pipette automatique) du milieu à analyser sont
déposés à la surface de la gélose et immédiatement répartis de façon uniforme à la surface du milieu
au moyen d’un ensemenceur stérile du type pipette râteau. La pipette râteau est «stérilisée» entre
deux étalements par immersion dans de l’éthanol, l’éthanol adsorbé sur le verre étant ensuite
enflammé.
Après la période d’incubation nécessaire, procéder au comptage des colonies pour chaque boîte
contenant moins de 300 colonies. Dans le cas de microorganismes donnant des colonies de taille
élevée, la valeur 300 paraît très élevée. Il est possible que 2 unités microbiennes ou plus se retrouvent
à proximité immédiate lors de l'inoculation et donnent une seule grosse colonie.
Le calcul de la concentration en micro-organismes [N] présents dans l’échantillon essai est une
moyenne pondérée à partir des résultats de 2 dilutions successives.
Pour que le calcul soit valable, il est nécessaire de compter sur au moins une boîte contenant au moins
15 colonies.
• Σc la somme de toutes les colonies comptées sur toutes les boîtes retenues (et tel que au moins une
des boîtes comptées contenait au moins 15 colonies).
• V le volume inoculum appliqué à chaque boîte (généralement 1ml en masse et 0.1ml en surface)
• n1 le nombre de boites retenues à la première dilution (en général 2).
• n2 le nombre de boites retenues à la deuxième dilution (en général 2).
• d le taux de dilution de la première dilution retenue pour les comptages sur boîte.
Arrondir le résultat calculé à deux chiffres significatifs.
Si aucune boîte ne contient au moins 15 colonies, faire la moyenne arithmétique des colonies
comptées sur les 2 boîtes de la plus petite dilution d et tenir compte de cette dilution. Bien préciser
dans l’expression du résultat qu’il s’agit alors d’une estimation en rédigeant ainsi : « nombre estimé
de micro-organismes par millilitre = ... ».
4.2.3. Dénombrement après filtration sur membrane
Dans certains produits liquides (eau, solutés pharmaceutiques buvables ou injectables...), les
microorganismes sont à une concentration très faible (voire nulle si le produit est stérile). Leur
dénombrement (en UFC par unité de volume) impose donc de «concentrer les microorganismes» pour
pouvoir compter des colonies. Cette méthode consiste à faire passer un certain volume d’échantillon
(ou de ses dilutions) au travers d’une membrane filtrante dont la porosité moyenne de 0,45 µm ou
0,22 µm sur laquelle sont retenus les microorganismes recherchés.
Le filtre est alors posé sur la surface d’un milieu gélosé, face portant les micro-organismes vers le haut.
Après incubation, les colonies formées à la surface du filtre sont comptées.
17
Figure 7. Filtration sur membrane
Le nombre de colonies présentes sur la membrane permet de calculer la concentration bactérienne N
en nombre d’Unités Formant Colonie (UFC) par ml selon la formule :
Où n : nombre d’UFC sur la membrane, V : volume de produit filtré en ml
4.3. Numération en milieu liquide Cette méthode présente certains avantages tels que la possibilité d’étudier un caractère biochimique
du germe difficilement mis en évidence sur milieu gélosé comme la production de gaz (cloche) ou
encore d’effectuer facilement la numération avec une phase de revivification. Si les conditions
optimales de croissance sont réunies, un seul micro-organisme présent dans l’inoculum introduit dans
un milieu liquide se développe en y créant un trouble. La lecture des tubes contenant le milieu liquide
et ensemencés avec l’inoculum est de type binaire :
- Résultat négatif si absence de trouble et/ou de modification du milieu : il y a moins de un
microorganisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide ;
- Résultat positif si présence de trouble et/ou de modification du milieu : il y avait au moins un
microorganisme présent dans l’inoculum introduit dans le milieu liquide.
Le volume de l’inoculum : le plus souvent = 1 ml (parfois 10 ml)
Le choix des dilutions à tester : dépend de la population estimée, le but étant d’obtenir, pour une
analyse statistique optimale des résultats :
- une dilution contenant moins d’un microorganisme dans l’inoculum utilisé
- une dilution contenant plus d’un microorganisme dans l’inoculum utilisé
Le choix du nombre d’essais par dilution dépend de la précision souhaitée pour les résultats en fonction
de leur analyse statistique. En général trois tubes sont ensemencés par dilution, un ou deux tubes sont
ensemencés si une précision moins importante est suffisante, cinq tubes ou même plus sont
ensemencés si une précision plus importante est demandée.
18
4.3.1. Dénombrement à un seul essai
Dans ce cas, 1 tube par dilution est ensemencé avec 1 ml d’inoculum. Exemple de résultats
obtenus (tableau 2) :
Tableau 2. Dénombrement en milieu liquide à un seul essai
Dilution 100 10-1 10-2 10-3 10-4
Résultat + + + - -
- il y a au moins un micro-organisme dans l’inoculum (1 ml) de la plus grande dilution (10-2) présentant
encore un trouble : la concentration est donc d’au moins 102 micro-organismes par ml de produit ou
de « suspension mère » non dilués ;
- il y a moins de un micro-organisme dans l’inoculum (1 ml) de la première dilution (10-3) ne présentant
plus de trouble : la concentration est donc strictement inférieure à 103 micro-organismes par ml de
produit ou de « suspension mère » non dilués.
Le résultat peut s’exprimer selon l’intervalle : 102 ≤ N micro-organismes/ml < 103. La concentration du
produit analysé est comprise entre 102 et 103 micro-organismes dans 1 ml.
4.3.2. Dénombrement à essais multiples «technique du nombre le plus probable NPP»
Cette méthode repose sur une analyse statistique et fournit par calcul des nombres les plus probables
(NPP). Ce dénombrement s’effectue en utilisant les tables de Mac Grady, le nombre caractéristique de
la série réalisée est une combinaison de trois chiffres :
- Chaque chiffre correspond au nombre de tubes « positifs » pour une dilution donnée ;
- Les trois chiffres correspondent à trois dilutions successives ;
- Le chiffre des centaines correspond à la plus faible dilution (donc à la plus forte concentration en
micro-organismes), celui des dizaines à la dilution intermédiaire et celui des unités à la plus grande
dilution.
Parmi les différentes combinaisons, celle correspondant au nombre le plus grand et, si possible,
inférieur à 330 est retenue (correspond à une meilleure répartition des micro-organismes dans les
dilutions).
Tableau 3. Dénombrement par la technique du nombre le plus probable
19
Exemple (tableau 3) : cinq dilutions ont été ensemencées à raison de trois essais par dilution ; trois
combinaisons (de trois chiffres) sont possibles avec les résultats obtenus. Parmi les trois combinaisons
de trois chiffres possibles (332 ; 321 ; 210), laquelle choisir ? Le nombre le plus élevé et inférieur à 330
est sélectionné ; dans cet exemple, il s’agit de 321. Si les dilutions sont insuffisantes, on peut utiliser
des nombres caractéristiques comme 333, 332 ou 331.
Le nombre caractéristique de la série est reporté dans une table statistique de Mac Grady (tableau 4).
On y lit le Nombre le Plus Probable (NPP) de microorganismes présents dans l’inoculum de la dilution
correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique. Exemple : 321 correspond au NPP
de 15. Cela signifie qu’il y a statistiquement quinze bactéries dans l’inoculum de la dilution 10-(n+1).
Le résultat est exprimé selon l’équation :
N : nombre de micro-organismes par ml de produit ; NPP : nombre lu dans la table ; K : facteur de
dilution (inverse de dilution) correspondant au chiffre des centaines du nombre caractéristique
(combinaison retenue) ; V : volume de l’inoculum (1ml en général).
Si le produit analysé est solide, on prépare une « suspension mère » de produit en introduisant « x » g
de produit dans « 9 x » ml de diluant. Cela correspond à une dilution au 1/10 du produit. Le nombre
de microorganismes par g de produit analysé est donc N x 10.
D’autres méthodes préconisent le nombre caractéristique le plus faible portant de préférence «0»
dans la colonne des unités (par exemple dans ce cas 210).
Tableau 4. Table de Mac Grady
5. Autres méthodes d’évaluation de flores microbiennes
5.1. Spectrophotométrie
Le trouble d’une suspension microbienne (bactéries, levures) est proportionnel à la biomasse présente
dans la suspension. Cette technique ne distingue pas la biomasse morte de la vivante, mais son intérêt
principal est sa rapidité et sa facilité d’application. La mesure peut se faire à l’aide d’un
20
spectrophotomètre en assimilant l’absorbance mesurée entre 600 et 650 nm à celle du trouble. Ce
principe est également celui de la méthode des étalons de Mac Farland (solutions troubles obtenues
traditionnellement par précipitation de sulfate de baryum). On peut comparer visuellement le trouble
d’une suspension microbienne à celui d’un étalon artificiel pour en estimer sa concentration. En effet,
le trouble développé par chaque étalon est assimilable à une concentration bactérienne selon le
tableau de correspondance suivant :
Tableau 5. Concentration cellulaire approximative par spectroscopie
Etalon Mac Farland numéro 0.5 1 2 3 4
Chlorure de Baryum à 1% (ml) 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4
Acide sulfurique à 1% (ml) 9,95 9,9 9,8 9,7 9,6
Concentration cellulaire approximative (x108 UFC/ml) 1,5 3,0 6,0 9,0 12,0
Absorbance à 600nm 0,132 0,257 0,451 0,582 0,669
5.2. Spectrométrie de masse La spectrométrie de masse peut être utilisée dans les laboratoires de microbiologie comme une
alternative ou un complément aux techniques d’identification de bactéries. L’analyse nécessite une
colonie isolée, à partir de laquelle le spectre de masse obtenu est comparé avec la bibliothèque de
spectres de l’appareil. Une identification est alors proposée avec une indication du niveau de confiance
allant de 0 à 3. L’identification est correcte pour plus de 80% des isolats voire davantage. La lyse
incomplète des bactéries peut-être l’une des causes d’une non-identification. L’enrichissement
progressif de la bibliothèque de spectres contribue à réduire les erreurs d’identification de
microorganismes rares.
5.3. Cytométrie de flux Il s’agit d’une alternative rapide (24 h) pour réduire le temps de stockage en industrie agroalimentaire
pour remplacer la méthode traditionnelle lente. La technique est basée sur le marquage fluorescent
des organismes viables présents dans le produit. L’échantillon à analyser est envoyé dans une veine
liquide. Un rayon laser permet d’activer la fluorescence des bactéries vivantes. Un système optique
permet de détecter et de mesurer l’émission de fluorescence. La comptabilisation des signaux détectés
pour un volume d’échantillon donné permet de connaître le nombre de bactéries vivantes par unité
de masse ou de volume de l’échantillon à analyser.
5.4. Impédancemétrie L'évaluation de la qualité bactériologique à l'aide des techniques normalisées pose souvent des
problèmes à l'industriel qui désire connaître rapidement la qualité de la matière première mise en
œuvre. L'impédance est une technique indirecte d'estimation d’une flore microbienne. Elle utilise les
modifications de conductance d'un milieu de culture, en raison de la croissance et du métabolisme de
la flore microbienne de l'échantillon. Ces modifications sont liées à la dégradation des substrats du
milieu en molécules plus petites, plus mobiles et d'une charge électrique plus élevée comme celle des
protéines en acides aminés ou des hydrates de carbone en lactate.
Généralement, cette production d'ions devient suffisante pour entraîner une modification significative
de la conductance du milieu (seuil de détection) lorsque le niveau de la population microbienne atteint
106 à 108 micro-organismes/ml. Le temps (ou nombre de doublements de la population) nécessaire
pour atteindre le seuil de détection sera d'autant plus grand que le niveau de germes initial sera faible.
21
Il existe une relation linéaire décroissante entre le temps de détection du changement de conductance
et le nombre initial de micro-organismes.
6. Identification des microorganismes La connaissance des caractéristiques phénotypiques, génotypiques et biologiques d'un
microorganisme est essentielle pour le différencier des autres microorganismes. Cependant,
l’identification reste difficile car il n’y a pas une seule méthode universelle, certaines marchent pour
des microorganismes mais pas d’autres. La majorité des bactéries ne sont pas cultivables (entre 0,1 et
10% cultivables). Plusieurs démarches sont nécessaires et possibles pour identifier un microorganisme
et définir une espèce.
6.1. Caractères morphologiques L’étude simple par microscopie permet de distinguer la forme d’une bactérie par exemple. La forme
d’un microorganisme est un caractère stable conditionnée par l’expression coordonnée de nombreux
gènes, une similitude morphologique sous-entend une parenté phylogénétique. Les bactéries peuvent
être sous forme de coque, bacille, spiralée, filamenteuse. Chez certaines on peut retrouver des formes
étoilées ou carrées.
D’autres caractères morphologiques sont pris en considération comme la mobilité (implantation de
flagelles), la présence de capsule, présence de spore (sa position et si elle est déformante).
L’observation en microscopie est nécessaire mais insuffisante pour répertorier des espèces
bactériennes. En plus la forme bactérienne n’est pas un caractère stable. Les structures facultatives ne
sont pas forcément présentes (perte momentanée du flagelle, spore). Chez les bactéries il n’y a aucun
lien entre forme et phylogénie.
6.2. Caractères culturaux Les types tropiques sont déterminés par la source de carbone et la source d’énergie
(photolithotrophes, photoorganotrophes, chimiolithotrophes, chimioorgatrophes). Le type tropique
dépend du génome et son expression.
L’étude de la croissance s’effectue sur des milieux naturels, complexes ou synthétiques. Un milieu
électif facilite la croissance d’un microorganisme comparé à d’autres microorganismes. Un milieu
sélectif est utile en rajoutant des substances toxiques pour garder la bactérie à tester.
L’examen macroscopique permet de voir comment la bactérie s’est développée sur son milieu de
culture (forme, aspect, couleur).
Les relations vis-à-vis de l’oxygène sont un critère pour différencier des bactéries. Les bactéries ont
besoin d’enzymes pour dégrader l’oxygène (peroxydases). Pour mettre en évidence les relations des
germes avec l’oxygène, un milieu gélosé en tube est ensemencé et permet d’avoir un gradient
d’oxygène du haut vers le bas.
- Aérobie strict : utilisation d’oxygène ;
- Aérobie facultatif : plusieurs types métaboliques, densité plus importante avec oxygène ;
- Anaérobie obligatoire : absence d’oxygène ;
- Anaérobie aérotolérant : oxygène ne favorise pas la croissance ;
- Micro-aérophiles : oxygène ne doit pas être trop important.
22
6.3. Composition chimique La paroi des bactéries à Gram positif est différente de celle des Gram négatif. Une coloration de Gram
permet de mettre en évidence les différentes parois. Mais il y a des bactéries à Gram «variable». Dans
certains cas la coloration prend et dans d’autres non. Dans ce cas un test à la potasse est effectué pour
distinguer les Gram+ des Gram- (les bactéries à Gram négatif forment un filament entre la lame et
l’oese).
Les cytochromes, des protéines impliquées dans les séries de transports d’électrons. Ils existent sous
une forme réduite et une forme oxydée. Les cytochromes possèdent des propriétés spectrales et
donnent deux spectres (un pour la forme réduite et l’autre pour la forme oxydée), il y a un décalage
plus ou moins important du pic sur les deux spectres. Ce décalage est spécifique des différents
cytochromes. Ce critère n’est pas utilisé seul mais il peut être très pertinent utilisé avec d’autres.
6.4. Caractéristiques métaboliques Il y a une extrême diversité entre les différents métabolismes bactériens. Il a y a donc des équipements
enzymatiques très différents et spécifiques de certains groupes bactériens. L’identification (figure 8)
est effectuée en utilisant des tubes à essais contenants différents substrats avec des indicateurs
colorés. Mais cette méthode est difficile pour typer des bactéries : grand nombre de tubes, procédure
longue.
Il existe des systèmes miniaturisés comme la galerie API, mini-cuves dans lesquelles il y a divers
substrats incubés avec la bactérie à étudier. La coloration des différentes cupules est comparée au
catalogue/logiciel. Méthode très utilisée car très simple d’utilisation, peu d’encombrement, peu chère.
Mais est-ce que les réactions choisies par le constructeur sont pertinentes ?
Figure 8. Galeries d’identification
6.5. Caractéristiques sérologiques Lorsqu’un corps étranger entre dans un organisme, il y a synthèse d’anticorps spécifiques des
antigènes. Les anticorps sont utilisés pour l’identification bactérienne car ils sont spécifiques.
23
Pour cela il faut disposer d’anticorps pour constituer une sérothèque (des souches bactériennes sont
injectée à des lapins et vont produire des anticorps qui seront prélevés). La réaction antigène-anticorps
forme un précipité visible à l’œil nu. Plusieurs tests sont utilisés (test de l’anneau de précipitation, test
d’immunodiffusion d’Ouchterlony, réactions d’agglutination, marquage des anticorps pour faciliter la
visualisation, Méthode ELISA, …).
6.6. Pouvoir pathogène Pour des bactéries pathogènes, dans certains cas l’analyse des symptômes de l’hôte contribue au
moins partiellement à la détermination de la bactérie.
En plus de ces méthodes l’identification des microorganismes peut se faire en utilisant des approches
moléculaires.
7. Réalisation du contrôle La maîtrise de la qualité microbiologique (hygiénique obligatoire et marchande souhaitée par le
fabricant mais aussi le consommateur) passe par un ensemble de démarches qui vont du contrôle (des
matières premières brutes, en cours de transformation ou de produit fini) aux pratiques de bonnes
fabrications en passant par l’identification des principaux points critiques du système de production /
distribution, le plus souvent par une démarche HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point ou
système d'analyse des dangers et points critiques). Ces analyses prennent aujourd’hui largement place
dans la plupart des usines et des réseaux de distribution et permettent (par la réalisation de contrôles
judicieux, une bonne évaluation de la qualité et une mise en évidence d’éventuelles contaminations)
les actions correctives qui en découlent.
7.1. Contrôle des matières premières Le contrôle microbiologique des matières premières doit permettre de vérifier que celles-ci ne
renferment pas de microorganismes risquant de gêner le déroulement de la fabrication ou, de
microorganismes qui, ne pouvant être éliminés par les technologies mises en œuvre, pourraient altérer
le produit fini. Il faut distinguer les biotechnologies comprenant une étape de fermentation ou non.
- Avec fermentation
Pour qu’une fermentation se déroule dans de bonnes conditions, il faut, théoriquement, ensemencer
le levain dans un milieu stérile, sauf dans des cas particuliers où la fermentation est conduite avec des
microorganismes indigènes.
Le contrôle des matières premières dans les industries de fermentation est ramené le plus souvent, à
un contrôle de stérilité ou à un contrôle de propreté microbiologique du milieu. En effet, si pour
certaines industries (antibiotiques, acides aminés,…), le milieu doit être stérile, pour d’autres, comme
la brasserie, un milieu faiblement contaminé peut être utilisé, mais il ne faut pas qu’il renferme de
microorganismes spécifiquement dangereux pour cette industrie.
- Sans fermentation
Dans le cas de bio-industries ne mettant pas en œuvre une fermentation (technologie enzymatique),
la qualité microbiologique doit être maintenue à l’aide des facteurs physico-chimiques habituels : pH,
activité de l’eau (Aw), température. Au niveau des matières premières, les contrôles microbiologiques
consistent à rechercher les microorganismes potentiellement dangereux.
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7.2. Contrôle de la fabrication Dans les industries de fermentation, les contrôles consistent essentiellement à apprécier l’évolution
des populations microbiennes dans le milieu au cours du temps, aussi bien le développement du levain
que l’apparition et le développement des contaminants.
Pour ces contrôles, les techniques microscopiques sont les plus utilisées :
- La technique du compte-cellule permet de faire une numération approximative des cellules de levain
et donc permet de vérifier son développement. Les techniques de coloration (gram, bleu de
méthylène) permettent d’évaluer une contamination bactérienne dans le cas de levains à champignons
(levures ou moisissures) mais aussi dans le cas des levains bactériens par les différences de formes ou
de Gram des contaminants par rapport aux bactéries du levain.
- La technique d’immunofluorescence peut être utilisée pour la recherche de contaminations
bactériennes dans les moûts de fermentation.
- la cytométrie de flux permet de détecter plusieurs types de microorganismes séparément (ex, des
bactéries et des levures). Cela peut être appliqué au suivi de fermentation en culture pure (détection
de contaminants) ou en culture mixte (évaluation simultanée du développement de chaque
population).
- les méthodes de culture peuvent être utilisées quand un délai de réponse est toléré.
- Dans les industries utilisant des cultures aérées, des contrôles sur l’efficacité des systèmes de
filtration stérilisante de l’air sont nécessaires.
- Dans les industries ne présentant pas une étape de fermentation, les paramètres de transformation
(s’ils sont bien maitrisés) ne permettent que quelques développements microbiens. Au cours de ces
processus, le contrôle microbiologique porte sur la recherche de germes dangereux.
7.3. Contrôle du nettoyage et de la désinfection Entre deux fabrications, les locaux et les installations doivent être nettoyés et désinfectés avant d’être
réutilisés. Les barèmes de désinfection (nature du produit, concentration/temps de contact) sont
définis en fonction de la nature et du nombre de microorganismes à détruire.
Différentes techniques sont applicables suivant les matériels à contrôler.
- Pour les contrôles microbiologiques des surfaces, les techniques les plus utilisées sont les techniques
par impression. Elles consistent à prélever les germes de ces surfaces par contact direct avec le milieu
de culture qui sert à les révéler. Cette technique peut être mise en œuvre avec les boites «contact» ou
tampon de gélose ou avec les lames gélosées (figure 9). Ces lames existent avec différents milieux de
culture selon le type de microorganismes recherchés.
Figure 9. Lames gélosées
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Pour le contrôle de dispositifs moins accessibles (robinet, canules, …), il est recommandé d’utiliser la
technique d’écouvillonnage : l’écouvillon imprégné de liquide stérile est frotté sur le dispositif à
contrôler puis immergé et agité dans un liquide stérile. L’analyse de ce liquide est effectuée par des
techniques classiques et donne des indications sur le niveau de contamination et la nature des germes
présents.
La technique d’ATP métrie est bien adaptée au contrôle des traitements de nettoyage-désinfection.
Dans ce cas, un écouvillonnage est effectué sur le matériel ou la surface à contrôler. L’ATP est ensuite
mesuré sur la solution de rinçage de l’écouvillon.
Cette valeur représente aussi bien l’ATP microbien que l’ATP de cellules animales ou végétales et est
donc un indice de propreté de la surface contrôlée.
- l’air renferme des particules (poussières) sur lesquelles les microbes (levures et moisissures le plus
souvent à l’état de spores et aussi des bactéries) sont adsorbés. Selon leur concentration (nombre de
microorganismes/unité de volume d’air), ils représentent un risque plus ou moins élevé de
contamination secondaire.
Différents phénomènes sont à l’origine de la contamination de l’air : la manipulation de certaines
matières (ex. les graines) qui émettent une grande quantité de poussière. Les emballages sont souvent
des sources importantes de contamination. Les personnes sont aussi responsables de la dissémination
de particules certaines étant chargées de microorganismes.
Il est donc intéressant de faire des contrôles microbiologiques sur l’air ambiant. La technique la plus
simple consiste à déposer des boites de Pétri contenant un milieu gélosé, ouvertes aux endroits à
contrôler. Cette technique, si elle est appliquée à des intervalles de temps réguliers, de suivre une
évolution et donc mettre en évidence une augmentation de la charge microbienne de l’air. En outre, il
existe des appareils utilisés pour le contrôle de l’air de façon plus rationnelle.
Toutes les techniques de contrôle de la désinfection du matériel et de l’air ambiant ne conduisent pas
à des valeurs absolues. Il convient donc de standardiser les délais opératoires pour que les résultats
aient une signification relative et donnent une idée de l’évolution de la qualité microbiologique des
matériels et des locaux.
7.4. Contrôle des produits finis Les contrôles microbiologiques des produits finis portent sur leur qualité hygiénique et leur qualité
marchande, et sont plus ou moins importants suivant la nature des produits et leur destination.
En effet, dans certains cas, le contrôle est ramené à une recherche de quelques microorganismes
dangereux pour le produit mais dans d’autres cas, le produit devant être stérile (produits destinés
aux injections intraveineuses, par exemple) les contrôles sont beaucoup plus nombreux et sévères.
Par ailleurs, il existe pour certains produits des normes ou des critères de qualité microbiologique :
les contrôles porteront alors sur ces paramètres.
L’analyse microbiologique traditionnelle des produits finis est quand même indispensable car elle
permet avec une certaine inertie d’éviter, dans le cas où des produits dangereux ou non conformes
seraient fabriqués, leur commercialisation ou leur consommation. Ce type de contrôle souvent
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pratiqué par des laboratoires officiels (Contrôle et Répression des Fraudes) n’est pas préventif et ne
permet pas de maîtriser la qualité microbiologique des produits fabriqués. Utilisé seul, il se révèle sans
grand intérêt et souvent même inutile si sa mise en œuvre est longue et sans suite.
En conclusion
Les techniques microbiologiques classiques sont longues et demandent un délai de réponse trop
important pour être utilisées couramment pour un contrôle de la fabrication.
Les méthodes mises en œuvre doivent être simples, donner une réponse suffisamment rapide pour
qu’une correction soit éventuellement possible dans la fabrication, et doivent être peu coûteuses, de
façon à pouvoir multiplier les contrôles et mieux surveiller la fabrication, sans alourdir excessivement
les coûts de production.
Les techniques microscopiques (observation directe, coloration de gram ou immunofluorescence)
présentent des caractéristiques de simplicité, rapidité et faible coût et sont donc à mettre en œuvre,
si cela est possible, chaque fois qu’une réponse rapide est indispensable. Toutefois la sensibilité des
techniques microscopiques n’étant pas toujours suffisante, il est recommandé de faire, en parallèle,
un contrôle par des méthodes classiques de culture, sur les produits finis.
Quand un grand nombre d’échantillons doit être analysé, la méthode peut être automatisée avec un
système d’analyse d’image ; appareil permettant la préparation d’échantillon (filtration sur membrane
et marquage à l’acridine) et le comptage automatique des bactéries marquées sur la membrane. Il est
plus particulièrement destiné au contrôle de la qualité des laits.
L’observation microscopique est, en particulier, utilisable dans toutes les biotechnologies faisant
intervenir une phase de fermentation : cette étape peut alors être contrôlée efficacement par la
recherche des contaminants sur des préparations microscopiques, à l’aide d’anticorps spécifiques ou
des sondes nucléiques couplés à des fluorochromes.
La cytométrie en flux permet d’obtenir un résultat très rapide puisque le comptage des
microorganismes est effectué en une minute après un marquage de 10 à 15 minutes. La sensibilité de
la méthode est de l’ordre de 102 à 103/ml pour des levures et de 104/ml à 5.104/ml pour des bactéries,
dépendant de la présence de particules autofluorescentes dans le milieu. Son utilisation est simple.
Pour les contrôles en cours de fabrication, les techniques microbiologiques classiques peuvent,
quelquefois être efficacement remplacées par des contrôles physico-chimiques liés à la présence de
contaminants comme le pH.
Si les méthodes par culture doivent être employées, il faut les automatiser pour accélérer les lectures.
