Quelques aspects de la synth6se protbique dans les muscles thoraciques en dbveloppement de Schistocerca gregaria (Forsk.)'

C. R H C H A R D ~ ET K. D. CHAUDHAWY DCpurtement de Biochiinie de b FucultC de Mkdecine, Untt:ersttP E a t d . Qukhec IOe, QuPhec

R e ~ u le 15 septembre 1971

RICHARD. C., et CHAUDHARY, K. D. Quelques aspects de la synth&se protkique dans les muscles thoraciques en ddveloppement de Schistocercu greguria (Forsk.). Can. J . Biochem. 90, 1226-1237 (1972).

Les psiysomes sbtenus de la fraction postmitochondriale a partir des muscles thoraciques sont dissocies en monomeres lorsqu'ils ssnt traitks A la WNase pancrkatique. Cependant, lorsque la preparation provenant de la fraction ribossmale est soumise ii la WNase pancrkatique, il en rCsulte une association des monomeres en des aggregats plus denses. Dans le but d'ktudier l'incorporation d'acides aminks, les caractkristiques d'un milieu acellulaire provenant des muscles thoraciques ont CtC dkcrites et ont ete cornparties a des systemes similaires provenant d'autres organismes s u d'autres tissus. GTP semble inverser ['inhibition cause par la cycloheximide. La capacitk d'incorporation d'acide amink des fractions microsomales et ribosomales preparees a partir des muscles thoraciques A difT6rent.s stades de developpement a Cte Ctudiee en prCsence et en absence de poly U exog&ne. Les deux fractions repondent A E'addition de poly U. Cepndant, les ribosomes requierement une plus grande concentration du copolym~re pour atteindre une complete saturation. La signification des rksultats prCsentCs est discutee dans ce rapport.

RICHARD, 63.. and CMAUDHARY, K. B. Quelques aspects de la synthese proteique dans les muscles thoraci- qucs en dkveloppement de Schistocerca gregaria (Forsk.). Can. J. Biochem. 9, 1226-1237 (1972).

Polyssmes obtained from the postmitochondrial fraction of the thoracic muscles undergo disassociation into monomers when treated with pancreatic WNase. In contrast, the preparations obtained from microsomes on RNase treatment result in the association of monomers into heavier aggregates. A combined treatment with trypsin, however, renders the polysomes sensitive to RNase action. Characteristics s f a cell-free amino acid incorporation system have been described and compared with similar systems obtained from other organisms or tissues. GTP seems to reverse the inhibition caused by cycloheximide. Amino acid incorporation capacity of the microsomaI and ribosomal fractions prepared from the thoracic muscles at digerent stages of development was investigated in the presence and absence of added poly U. Both the microsomal and ribo- somal preparations respond to the addition of poly U. However, the ribosomes require higher concentrations s f this copolymer for attaining full saturation. The significance of the findings reported in this investigatioaa is discussed.

Introduction I1 a kt6 d6montrk rkcemment qu'une dkcrsis-

sance progressive du noanbre de pslysomes accompagne la maturation des r6ticulocytes (11, du cerveau (2) et du muscle (3) chez les mamma- fkres. Par ailleurs, peu de travaux ont kt6 eEectues chez les insectes qui sRrent en tant qu'espkes animales bien des particularit& bio- logiques interessantes csmme la mktamorphsse et la diapause. Ainsi %es muscles thoraciques sont particulikrement appropriks A l'ktude des processus morphsgenktiques. Ckez 5'. gregaria (African desert locust), les muscles thoraciques se prstent bien ii des ktudes de dkveloppement a cause de la croissance considkrable accomplie

par ce tissu et complktke en seulement 13 jours (4).

Le muscle squelzttique embryonnaire auquel s'apparentent les muscles thoraciques, ressemble au systkme des rkticulocytes ( 5 ) en ce qu'il a une bible activitk en nuclease. ses riksssmes me sont pas attaches aux membranes et une grande proportion de la syntkkse proteique cellulaire est en cause dans la synthkse de protkines spkcifiques.

Le prksent travail a pour but de vkrifier la capacitk de synthkse protkique in a;k'tro au cours du dkveloppement et de mettre en corrklation ces donnkes dans la syntkkse in t?A:o kvaluke dans un prkckdent travail (6).

'Ce travail a etk subventionne par le Conseil des Re- cherche~ MCdicales (K.D.C., MA-3144), et par le Ministere de I'Education de la Province de Qukbec. MatPricl exptrimr~ltsrl

2NouveIEe adresse: Section de Biologie, UniversitC du L'elevage des criquets a ce laboratoire a Cte decrit QuCbec A Chicoutimi, Chicoutimi, Quebec. precedemanent ( 6 ) . A la suite dar dkveloppement embryon-

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TABLEAU 1. Effet de la purification sur Bes caractkristiques spectrales, sur le rendement et sur le pour centage de RNAa des microsomesb et des ribosomes

-- -- - -- - -

Rendement Rapport des mg RNA/ 1 00 g muscle D.O. RNAlprotein

Fractions (poids frais) (2601235) (mg/100 mg) - - - - - - - -- Ribosomes

(DOC 0.5 x) 1.10 1.25 1.60-1.85 0.43-0.49 Microsomes 1.11-1.23 1.55-1.75 0.41 0.49

"Le RNA s ete mesure par la rnkthode a I'orcinol et les proteines par la mCtkode de Lowry (voir Brotocole expbimental).

"Les microsomes et les ribosomes ont ete obtenus de la fa~on decrite (voir Protocole experi- mental) en reprenant dans les deux cas Le dernier culot successivement dans KMT et KMTilO. Ckaque valeur reprksente le minimum et le maximum obtenus de trois experiences.

naire qui dure environ 13 ii 15 jours. les larves subissent quatre mues pendant les 12 jours qui suivent. Le 5e stade dure 6 ri 7 jours; il est suivi de la 5e et dernitre mue (ima- ginale) qui resuite en l'emergence de I'adulte. L'insecte atteint la pleine maturite sexuelle 10 jours aprks la mue imaginale.

Pr&p~ratiot.o des microsomes et dm ribosomes Les muscles thoraciques sont dissequb 8 froid et avec les

precautions usuelles pour eviter les contaminations bac- teriennes. Les muscles sont homogeneis~s au Potter- Elvehjem A raison de 4 ml de tampon KMT (KC1 0.25 M , MgCI, 0.01 M e t Tris 0.01 M, pH 7.4) froid par gramme de muscle. Apres une filtration sur coton fromage, le sur- nageant (SC) est obtenu en centrifugeant B 15 000 x g pour 10 rnin ri 2 ' C. I1 faut centrifuger le SC A 105 000 x g pendant 90 min pour obtenir Ia fraction microsomale dans le culot. Les microsornes sont obtenus du dernier culot en homogeneisant dans 2 volumes de KMT/10 (KMT diluC de 10 fois) et en centrifugeant 10 min a froid a 15 000 x g. Le surnageant sert de source de microsomes. Pour obtenir Bes ribosomes, le culot de 105 000 x g est repris dans 2 volumes de KMT froid. puis traite au DOC 0.5% pendant 20 rnin a 2 "C, et centrifuge a 15 000 x g pour BO min a froid. Le dernier surnageant est centrifugk a 105 000 x g pendant 90 rnin A froid: le culot repris de la m&me f a ~ o n dans KMT/10 contient les ribosomes.

Skparation sur. gradient et jinctionnement des polj~somes Les polysomes sont dpares a partir de la fraction SC ou

de la fraction ribosomique sur un gradient IinCaire de sucrose 15-PO%, en y deposant de 5 a 20 unites de densitk optique 260 nm et en centrifugeant le gradient dans la t@te SW 25.1 de la Spinco (modde L) A environ 4 "C pendant 3 h. Des fractions de 0.5 A 1.0 mi sont par la suite recueillies a froid en perGant le fond du tube pour les mesures de densite optique et de radisactivitk.

dans un volume total de 1.50 ml: crkatine phosphokinase (CPK) 10 pg; crCatine phosphate (CP) 0.66 mM; adCnosine triphosphate (ATP.Na,H.3H20) 2 m M ; guanosine tri- phosphate (GTP.Na,H,-2H,O) 0.5 m M ; tris(hydrexy- methy1)aminomCthane (Tris-HCl, pH 7.4 B 37 "C) 0.01 M ; chlorure de potassium (KCI) 0.12 M ; chlorure de magnk- sium (MgC1,6H20) 10 mM; 0.2 2.0 mg de RNA ribosomal ou microsomal: 3 10 mg de la fraction "enzyme a pH 5" (8 ) ; 0.5 pCi du mklange d'acides amines marques uniform6 ment au 14C (New England New Nuclear) (10 mcilmmol), ou 0.5 pCi de phCnylalanine-U-'4C (50 mciimmol). La reaction amorcee par l'addition de 1' "enzyme a pH 5" esk poursuivie A 37 '6 pendant 30 min et arrttee par addition de 3 ml d'acide trichloracetique (TCA) '9.5% contenant selon le cas 1 mgiml de phknylalanine-12C ou 1 mglml du melange des acides aminks. Les tubes sont shauffks a 90 'C pendant 15 min puis refroidis a la temp6rature de la chambre. Le prCcipitC est recueilli selon la technique de Mans et Novelli (8) sur papier filtre apres des lavages successifs de 10 ml de TCA 5%, d'kthanol contenant de I'acktate de potassium 10% (9), d'kthanol-ether (3: 1) et d'kther. Le precipite est dissous dans 0.4 ml de NCS (solubilisateur) en chauffant 90 min a 60 "C; le volume est port6 A 15 ml avec le mklange tolutne-POPOP @-bis- 2(4-methyl-5-phCnyloxamly1)benzene.

Mkthodes anulytiyues L'estimation des protkines a Cte faite par la mCthode de

Lowry et nl. (10) avec l'albumine de serum de boeuf (Sigma, 1 x cryst.) comme standard. Le RNA a Ctk mesurC par la mkthode a l'orcinol telle que decrite par Ashwell (1 1) Avec le RNA de levure (Calbiochem., highly polymerized, A grade) comme standard.

Traitements ditlers Lies polysomes Conditions optimales Les traitements des polysomes a la ribonuclease pancrea- Apr& avoir ktabli les conditions optimales

tique (RNase), et A la trypsine ont Cte effectuks A 2 "C a pH 7.6 selon des concentrations et un temps mentionnCs plus d'homogknkisation. nous avons vkrifik l'effet de loin. La fraction "C" de la bentonite prkparee de la fapon la force ionique sur le rUldernent ~ o l ~ s o m i q u e ~ dkcrite par Peterman ('3) a servi h verifier la presence de Une force ionique de 0.5 obtenue par l'utilisa- ribonuclkase endoghe. tion de diffkrentes concentrations en KG1, nous Essai de /'incorporation des acides amints a permis d'obtenir le rneilleur rendement. Les

Le milieu d'incubation 6tait forme des composds suivants caractkristiques spectrales des prkparations de

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FIG. 1. Effet de la RNase sur le profil polysomique obtenu de la fraction SC. Le surnageant postmitochondrial (SC) a Ct6 extrait de la fkqon dCcrite dans Protocole expkrimental des individus du 5e stade de 4 jours. Le SC a et6 trait6 a Ba RNase pancrkatique pendant 15 min A 2 L C A pH 4.6 ii raison de 2 ,ug!ml. Les SC trait6 et non trait6 ont CtC dkposks sur un gradient linkaire de sucrose 15-38% tamponnk, reposant sur un coussin de sucrose 50%. Le profil polysomique a CtC obtenu en centrifugeant le gradient pendant 3 h A 25 000 r.p.m. dans la tCte SW 25.1 de la Spinco (LB A 4 "C. La fleche verticale indique le dessus du gradient. La flkche horizontale se dCgageant du "S" indique la direction de la skdimentation. (0) SC nontraitk; (A) SC trait6 A la RNase. Nous avons v6rifiC la reproducibilitk des profils au moins dans trois Cchantillons diffkrents.

rnicrosomes et de ribosomes ont 6tk verifikes dans nos conditions expkrimentales. Le tableau 1 montre que les preparations ne sont pas exemptes de contamination protkique. Com- parees aux valeurs de Peterman (7) nous esti- mons que notre preparation contient moins de 20Q4 de protkines contaminantes.

Efer de la RIVase La ribonuclkase pancrkatique (RNase) exerce

un effet partiellement hydrolysant sur le profil polysomique extrait de la fraction SC. La figure 1 montre que la diminution de la densitk optique des polysomes n'est pas toujours exacte- ment egale a son augmentation au niveau des monosomes et des sous-unitks de S moindre, mais qu'une certaine quantitk d'unitks de den- sit6 optique en surplus pourrait suggerer un certain effet d'agrkgation. Par contre, les rap- ports des densitks optiques (260 nm/235 nm) sont abaissks d'environ I$:./, sous l9eRet de la RNase, mais seulement au niveau des poly- somes (tubes 10-12) par comparaison a 5% au

niveau des monssomes. L'action de la RNase pour un temps prolong6 ne change pas davan- tage l'allure du profil. L'extraction de la fraction SC en prksence de bentonite n9a pas cause de changements dans Bes profils.

Cependant, lors du traitement de la fraction ribosomique, la RNase ne semble pas avoir hydrolysk les polysomes. La figure 2 a-e mon- trent qu9il y a eu transfert d'unitks de densitk optique de la rkgion monomkrique vers la rkgion des polysomes. Une rkassociation non spkcifique d9unitks ribosomiques (et possible- ment de sous-unitks) expliquerait ce transfert, m2me si nous ne sommes pas assurks que la RNase n'a pas effectivement agi. Cette agrkga- tion s'est manifestke par des fractions riboso- miques extraites a divers stades de developpe- ment. La figure 3 appuie la possibilite d'une rkassociation en agrkgats en indiquant que Ba phknylalanine-P4C like a une faible quantitk de ribosomes monomkriques se retrouve, apres l'action de la RNase, au niveau des agrkgats de diverses dimensions.

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1 3 5 7 1 1 IS 19 23 27 31

Tube # +-S P

dessus

FIG. 2. Effets de difftrentes quantites Be RNase sur le profil obtenu de la fraction ribosomique. Les profils polysomiques ont CtC obtenus de la faqon indiquee dans la section Protocole exptrimental, a partir des ribosomes extraits des animaux du 5e stade 4 jours. Les autres conditions et la regrodueibilitt sont les mCmes que eelles dCcrites A la figure 1. (a) TCmoin non traitC; ( k ) traiternent a 2.2 pg de RNase!rnl; (c) traitement a 4.4 pg de RNase/mI; (4 traitement a I I pg de RNase/mI; (e) traitement a 22 pg Be RNase/ml. Voir p. 1236 pour les parties c, d et e.

E.et combink de la RNase et de la trypine enzyme proteolytique. La figure 4 confirme Tsiapalis et al. (12) ont prktendu qu'il est cette sensibilisation qui est partielle avec un

possible de sensibiliser les polysomes h l'action traitement de 0.1 pg de trypsine, mais complete de la RWase en faisant agir conjointement une avec 5 pg. Tout le mathiel qui sedimente

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Tube # e - S f

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Tube t% - S 4

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FIG. 3. ERet de la RNase sur Ie rnarquage in tjirjo. Des adultes de 8 jours ont CtC inject& avec 0.5 pCi de phknylalanine- "C (4) pendant 4.0 rnin avant d'extraire les ribosomes et de les traiter a Ia RNase, comme on le desrit a la Fig. 2. On a rnesure la densite optique du ternsin (0) et sa radioactivite ( x ); de la fraction traitke a laRNase (5 pgjml pendant 30 rnin B 2 "C), nous avons rnesure la densiti. optiqueBU) et sa radioactivitk (a). Nous avons reproduit I'allure des profils au rnoins dans trsis experiences diffkrentes.

Tubs * +S des!sur

FIG. 4. Effet de la trypsine cornbinke ;P la RNase sur le prsfil obtenu de la fraction ribosomique. Les rnCmes conditions que celles decrites a la figure 2 ont Cte employees. Les traitements aux enzymes sont concomittants. (0) TCrnoin;( n) traite- ment A la RNase (2 pg/ml) et a la trypsine (0.1 pgjml); (A) traitement la RNase (2 pgjml) et A la trypsine (5 pgiml).

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T.~BLEAU 2. Caractkristiques du milieu d'incubatisn du systkme acellulaire d'incorporation des acides aminks

-- - -- -- -- -- - - - - - A - - - - - -

Experiment No. Conditions du systkme" d.p.m./mg RNA microsomal O,/, inhibition

-- - -

Milieu complet Omissions

CPK, CP, ATP ATP GTP KC1

RNA Enz. pH 5 Acides amines-' 'C

(phenylalamine-14C),

Milieu eomplet Additions

RNase (2 pg) RWase ( 10 pg) Chloramphknieol M ,

conc. finale) ChloramphCnicoi (10- M ,

cone. finale) (en prksence de 0.36 mg prot. enz. a

5)

"kes conditions d'incubatisn sont celles decrites dans Protocole expkrimental. On a employ6 0.26 mg de proteines (enzymes a pH 9, et 0.42 mg de RNA microssrnal qui a CtC extrait des muscles thoraciques des insectes de 5e stade de 6 jours. Les resultats se sene reproduits i f 11 %.

TABLEAU 3. Eflet d'inhibiteurs sur le taux d'incorporation in l!itr.o des acides aminks

Conditions du d.p.rn./mg systkrne" RNA microsomal % inhibition

Milieu complet 660 Milieu complet

cyclsheximide (1 575

Milieu complet cyelo%aeximide (10 ~(68) 547

Milieu complet puromycine (5 Pg) 457

Milieu complet pkarornycine (50 big) 375

Milieu eomplet puromycine 65064 ~ g ) 342

Caract&riss.tiquss du syst2ms ace/lulaire d 'incorporation dcs acides aminks

Apr&s avois determine qu'une incorporation maximale est obtenue avec BO mM de MgCl, et 120 mM de KCl, nous avons trouvk que le 2-mercaptokkhanol cause 50% d'inhibition B une concentration de 1 mM. I1 faut proceder i l'incubaiion A pH 7.5 et avec 2 mM d'ATP pour obtenir une incorporation maximale, sur une pkriode de 30 min. Bans ces conditions expCri- mentales l'augmentation d'incorporation est proportionnelle a la concentration en RNA microsomal jusqu'h 0.42 mg. L'eRet de diffk- rentes quantites de la fraction "enzyme a pH 5" a etk ktudie. L'augmentation de l'incorporation n'est pas proportionnelle a la concentration proteique de cette fraction.

Bans ces dernikres conditions optimales les caractkristiques du milieu d'incubation sont

"Les conditions sont identiques a celles dkrites au tableau 2. Les rk~umees au tableau 2. o n remarque la neces- rCsultats onb kt6 reproduits avec une deviation de 10%. site du systkme rkgknkrateur d'energie, de

B'ATP, dam WNA (microsomal), de Ba fraction rapidement et qui correspond a la fraction des "enzyme a pH 5" et des acides aminks. L'ab- polysomes se retrouve au niveau des mono- sence du GTP et des cations cause une inhibition somes ou d'unites infkrieures. impostante. &'addition de WNase au milieu

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TABLEAU 4. Effet du GTP sur I'inhibition de l'incorporation des acides amines par le cycloheximide

- - - - -- -- - -

O/, de variation -- - - - - -- -- --

Par rapport Par rapport d.p.m./mg au milieu au milieu

Conditions de systemeO RNA microsomal complet sans GTP - --- - -

Milieu complet (GTP 0.5 mlW) 612 0 Milieu sans GTP 3 16 - 48 0 Milieu sans GTP +

cyclohex. (10 pg) 107 - 83 - 66 Milieu (avec GTP 0.005 mM)

+ cyclohex. ( I 0 pg) 198 - 68 - 37 Milieu (avec GTP 0.05 mM)

+ cyclohex. (1 0 pg) 418 - 32 + 32 Milieu (avec GTP 0.5 mM)

+ cyclohex. (1 0 pg) 529 - 14 + 67

"Les conditions sont Bes m&mes que celles decrites au tableau 2. Ces rksultats sont les moyennes de trois experiences et ont ete reproduits avec une deviation inferieure B & 15%.

TABLEAU 5. Taux de synthkse protkique in ritro des microsomes et des ribosomes en fonction du dCveloppementa - -- -- - - -. - - -

d.p.m./mg d.p.m./rng Age RWA rnicrosomal WNA ribosomal

--

5e stade, 4 jours 587 445 5e stade, 6 jours 616 538

Adulte, 1 jour 704 490 Adulte, 2 jours 738 8 15 Adulte, 4 jours 890 1027 Adulte, 10 jours 375 225

"Les conditions d'hcubation sont celles decrites dans la section Protocole expCrirmental. La fraction "enzyme & pH 5" a Ctt extraite chez des aduItes de 2 jours. La fraction des rmierosomes et des ribosomes des divers Ages ont kte extraites de Ia facon dkcrite. PhCnylalanine-U-14C (8.5 pCi) a Cte p l ad dans le milieu d'incuba- tion. Les rbultats pour chaque Lge ont CtC obtenuq avec pas plus de 0.4 mg de RNA ; les valeurs ont t t t obtenues avec des quantites variables de RNA se basant sur la linearite du taux d'incorporation par rapport a la quantitk de RNA, pour des vakurs infkrieures a 0.40 mg. Nous avons employe 0.24 mg de protkines (enz. a pH 5) pour ces incubations. Les resultats sont difficilement reproductibles et peuvent dtvier jusqu'h 30%. Chaque valeur represente une moyenne de trois dkterminatisns.

complet amkne une inhibition pratiquemen t totale. Le chloramphenicol qui inhibe la syn- thkse protkique bacterienne, est sans effet sur notre systkme.

Pour des fins de comparaison avec d'autres organismes et d'autres tissus, notre systkme d'incorporation a kt6 soumis aussi a l'effet de quelques inhibiteurs (tableau 3). Pour des con- centrations klevkes en puromycine et en cyclo- heximide, on obtient un maximum de 50% et 17% d'inhibition, respectivement. Si nous ajou- tons des concentrations croissantes de GTP en

prksence de cycloheximide, les rksultats ex- primes au tableau 4 montrent que l'inhibition par le cycloheximide en absence de GTP est renverske par ce dernier aux concentrations indiqukes. Le GTP semble exercer une action antagoniste, un bloeage de l'effet inhibiteur du cycloheximide.

Capacitk de synthPse protkique ties microsomes en jonct ion du dkceloppement

La fraction des microsomes, prkparke selon nos conditions, peut incorporer les acides aminks. Les rksultats obtenus a partir d'extraits de differents iiges sont exprimks au tableau 5. La capacitk maximale d'incorporation se situe chea les adultes de 4 jours pour les deux fractions. On constate au 5e stade et au dkbut du stade adulte une incorporation moins grande pour la fraction ribosomale. Cependant entre le minimum au 5e stade et le maximum au stade adulte dans la fraction microsomale, l'incorporation n'augmente que de 50%, alors que dans la fraction ribosomale, l'augmentation est de plus de 100%.

Stimulation de l'incorporation par le poly U au cours du dkveloppement

Les ribosomes tels que nous les avons isolks peuvent Etre encore liks a une certaine quantite de mRNA. Pour savoir qu'elle est cette quantitk ou rkciproquement qu'elle est leur capacitk de se lier un homopolymkre synthktique, on peut mesurer le taux de saturation par l'acide

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FIG. 5 . Taux de saturation par I'acide polyuridylique des ribosomes de diEerents Ages. Les ribosomes sont prepares tels que dCcrits dans Protocole experimental. La suspension ribosomale est ajoutk au milieu optimal d'incubation completi par I'addition de la fraction enzyme A pH 5. La L-phenylalanine-14C (4) (0.5 pCi par tubej a etC utilisCe A la place du melange contmercial d'acides anninCs. Un Cchantillon en double sans poly U est incub6 en mCme temps que les Cchantillons de chaque stade qui contiennent le messager exogkne de faqon ii mesurer le pourcentage de stimulation. RNA ribosomal (0.32 mg) et 0.26 mg de protkines (enzyme a pH 5 ) ont ete additionnes. (0) 5e stade, 4 jours;( I>) 5e stade, 6 jours: ( A ) adulte, 1 jour;(m) adulte, 4 jours; ( 0 ) adulte, 10 jours. Les profils gCnCraux etaient reproductibles dans trois echantillons diR6rents.

FIG. 6 . Conrparaison des taux de stimulation par I'acide polyuridylique des microsomes et des ribosomes. Les suspensions microsomales et ribssomales sont prkparees de la faqon decrite dans Protocole experimentat et incubbes coglame dkcrit A la figure 5. RNA microsomal (0.29 mg) et 0.26 mg de protkines (enzymes A pH 5 ) ont Ctk additionnks. ( 0 ) Microsomes du 5e stade, 4 jours: (m) microsomes d'adultes de 4 jours; (0) ribosomes du 5e stade, 4 jours: (U) ribosomes d'adultes Qe 4 jours. La reproducibilite des profils etaie la mCme que celie decrite pour la figure 5 .

Le tableau 6 montre que cette capacite d'incor- poration augmente au cours de la croissance jusqu'a l'adulte de 4 jours. L9incorporation dans les protkines est d'environ deux a trois

polyuridylique (poly U). La figuse 5 msntre que fois plus importante que dans la polyphknyla-

150 pg de poly U sature complktement les lanine. Le rapport protkineIpolyphtnylalanine

ribosomes des individus adultes, et que 200 pg demeure toutefois assez semblable, manifestant

est nkcessaire au 5e stade. Nous avons alors une 1Cgkre augmentation graduelle jusqu'a l'ige

vkrifi6 si du DOC entralnait quelque adulte de 2 jours, et dkcroissant aussi progres-

modification de %a capacitk de liaison a un sivement .

homopolymkre synthktique, en comparant aux Discussion memes stades de dtveloppement, le taux de La figure dkmontre la prksence de poly- stimulation de l'incorporation des acides amints somes et d,agrkgats de diff6rentes dimensions par le La figure indique que les dans les extraits de muscles thoraciques en microsomes sont plus rapidement saturks que dCveloppement de S. gregaria dont les profils les ribosomes. La saturation des microsomes obtenus ont une allure qul se rapproche davan- est en effet complbte par un traitement de 100 tage de celle qui a ttk mise en tvidence par pg ou 156% pg de poly U. Tsiapalis et al. (12) chez la mouche domestique. Rapport grotkkize/golyphPnylalanine omm me rapport6 par ces auteurs nous trouions

Les ribosomes des muscles thoraciques de kgalement moins d'aggrkgats lourds dans notre Schistocerca gregaria peuvent incorporer A dif- preparation, Bar contre, les travaux de Litvak fkrentes Ctapes de croissance la phknylalanine et Agosin (13) chez la mouche domestique, dans les protkines et dans la polyphknylalanine. montrent que les polysomes prkdominent.

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TABL.EAU 6 . Taux d'incorpsration de la ~,-~hknylalanine-U-'4C par des ribosomes de diffkrents Bges aux conditions de saturation de poly U"

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d.p.m./rng RNA ribosomal

PrstCinec/ Sans poIy U Avee poly U b PolyphCnylalanine polyphenylalanine

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5e stade. 4 jours 425 588 B 63 5e stade, 6 jours 547 738 191

Adulte, 1 jour 515 690 175 Adulte, 2 jours 853 1803 250 Adulte, 4 jours 1089 1546 457 Adulte, 10 jours 282 417 135

"Les conditions sont les mCmes que celles dkcrites a la figure 5. bPoly U 200 irg a etC ajoutk aux milieux d'incubation pour le 5e stade et pour Be stade adulte. Ces quantites

saturenb complktement les ribosomes monomeriques (voir la figure 5j. "Ce rapport a kt15 calculk selon Murthy (2). 11 reprksente le rapport polysornesimonosornes qlaand tous les

ribosomes monomCriques libres sont saturks avec poly U en prksumant que le poly U n'influence pas I'incor- poration des acides aminks dans le systkme acellulaire.

Certains chercheurs n'ont trouvk qu'une laire traitee. La Rkdase montre une action quantitk moindre de polysomes dans le muscle que dans le foie (14, 15) en emgloyant un systeme tamponne ii faible force ionique; d'autres cependant ont pu obtenir avec un systeme tamponne de force ionique suffisam- ment elevee un rendement kleve en polysomes, comparativement a celui obtenu du foie d'une meme organisme (3, 16). Meme si nous avons employ6 une force ionique aussi elevee que 0.5, le rendement ne s'est pas aussi considkrablernent accru que ne l'a constatk Heywood et al. (16) pour le muscle embryonnaire de poulet ; l'allure des profils n'a cependant pas kt6 rnodifik.

Le traitement au DOC est employe pour solubiliser les membranes et en libkrer les poly- somes. Ees caracteristiques spectrales et les profils traites au DOC montrent a la suite de Tsiapalis et al. (12) que le DOC n'augmente pas le rendement des polysomes. Fast (17) a dkjh rapport6 que la composition en phospholipides des membranes chez la mouche est differente de ceIIe des tissus des mammiferes. Tsiapalis et al. (12) ont interprktk ces rksultats pour expllquer la resistance de ces membranes B I'action du DOC, Cependant, dans le contexte present, nous ne savons pas si ceci peut s'appliquer aux tissus de tous les insectes, incluant les muscles de locust.

Les polysomes extraits de plusieurs orga- nlsmes sont tres sensibles a de faibles concen- trations de WNase (I$-28). Nous avons obtenu des resultats diffkrents selon la fraction cellu-

partiellement hydrolysante lorsqu'elle agit sur les polysomes prkpares a partir du surnageant postmitochondrial. Des rksultats inattendus ont kt6 obtenus en faisant agir la RNase sur les polysornes prkpares A partir de la fraction microsomale. Par ultracentrifugation analyti- que Henney et Storck (21) en 1964 ont montrk que les ribosomes de Neurospora crassa s'agrk- gent si on les traite avec 25 pg de Rbdase par millilitre. Chez Musca domestiea, les rksultats de Tsiapalis et a%. (12) indiquent que 0.5 pg de RNase par millilitre suffit pour Faire apparaftre de l'agregation des ribosomes. Le profil con- tr6le (figure 24) ne rnontre gas de materiel lourd qui pourrait, sous l'action de la RNase, Stre a l'origine d'une plus grande abondance de mate- riel polysomique plus leger. Au contraire, la fraction correspondante au polysomes apparait progressivement aux dkpens des monosomes au fur et a mesure d'une augmentation de la concentration en RNase traitante. On ignore encore jusqu'a prksent la nature des agiregat produits sous lqaction de la RNase et leur mecanisme de formation. On reconnait 2i cer- taines sous-unitks protkiques la forte tendance a une interaction spontanke. C9est le cas pour les protkines myofibrillaires, le coIIag&ne et la y- globuline (22). Lors de la synthkse de nouvelles chaines gslypeptidiques, il est possible que ces chaines interagissent et interviennent pour stabiliser les polysomes. TsiapaIis ur ad. (12) avancent que dam certaines circonstances, les

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particules ribosomiques ne sont pas retenues ensemble que par le mRNA, mais aussi par la chahe polypeptidique en voie de formation. 11s ont suggkrk que la chaine native est un agent de liaison non seulement des ribosomes liks aux membranes de rkticulum, mais encore des poly- somes libres. De plus la figure 3 suggkre que la radioactivitk associke a des protkines se dis- tribue dans les fractions polysomiques lorsque la RNase agit sur les polysomes marques in uiuo. Ces rksultats appuient davantage l'hypothkse de l'intervention des chaines polypeptidiques en croissance dans le phenomkne d9agregation des ribosomes.

Un traitement lkger a la trypsine, desagrkge les polysomes en monosomes dans le foie (23- 25) et les reticulocytes (25). La protkolyse de certaines protkines qui auraient un r61e a jouer dans l'agrkgation des ribosomes, seraient la raison de l'obtention de monosomes. Cepen- dant, Rabinowitz et ul. (23) rapportent que dans le muscle cardiaque, il est nkcessaire de traiter l'assemblage ribosomique non seulement avec la RNase ou la trypsine mais avec les d e w pour obtenir des ribosomes monomkriques. B'autres auteurs ont obtenu des rksultats simi- laires dans les polysomes de poulet qui syn- thktisent le collagkne (26) dans les agregats ribosomiques isoles des ganglions lymphatiques (lymph node) qui synthktisent la y-globuline (27). Nos rksultats (figure 4) suggkrent une action semblable grice a la combinaison de deux enzymes: la RNase et la trypsine. La trypsine sensibiliserait les polysomes a la RNase en abolissant leur capacitk de s'agrkger, comme le suggkre Tsiapalis et a!. (12).

Le systkme acellulaire d'incorpsration des acides aminks extraits des muscles thoraciques de Schkstocerca gregarka est partiellement sem- blable a celui qui a kte extrait chez plusieurs espkces d'insectes (3. 28-32). I1 requiert pour atteindre une activitk maximale: ATP. GTP. des ions, des microsomes, la fraction "enzymes A pH 5" et des acides aminks. En utilisant ce systkme En vktro nous trouvons que le taux d9incorporation augmente en fonction du dkve- loppement des muscles thoraciques pour les quatre premiers jours du stade adulte (tableau 6). Nous confirmons ainsi nos rksultats antk- rieurs obtenus in uiuo (6). L'inhibition de la synthkse protkique par la puromycine et la cyclsheximide est moindre que celle trouvke

dans le systkme des mammifkres, le chloram- phenicol s'avkrant inefficace et suggkrant aBors qu'il n'y a pas de contamination bactkrienne. Cependant, la faible inhibition d'incorporation par la cycloheximide peut &re modifik par diEkrentes concentrations de GTP. Nous ne pouvons que supposer qu'un meme site est concern6 et que plusieurs hypothkses non vkri- fikes s'offrent a nous. Nous croyons que l'ktape de la translocation a laquelle participe le GTP (33) est possiblement ce site. Le cycloheximide pourrait empgcher le dkplacement des ribo- somes le long du mRNA et leur attachement en une structure polyribosomique (34. 35).

Les adultes de 4 jours dkmontrent une capa- citk maximale de synthkse proteique qui coin- cide avec un taux important de mRNA en- dogkne. Ces rksultats sont un accord avec le fait que les adultes de cet iige montrent un rapport polysome/monosome Clevk tel que determine par le rapport protkinelpolyphenylalanine.

1. MARKS, P. A., RIPKIND, R. A., et BANON, B. : Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 50, 336 (1963).

2. MURTHY, M. R. V.: Biochim. Biophys. Acta, 119, 599 (1 966).

3. SRIVASTAVA, U.: Arch. Bischem. Biophys. 130, I29 (1969).

4. TANGUAY, R., et CHAUDHARY, K. B. : Can. J. Biochem. 49, 357 (1971).

5. HEYWOOD, S. M.: Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 34, 799 (1969).

6. RICHARD, C., TANGUAY, R., et CPIAUDHAWY, K. B.: Cytobios, 145 (1971).

7. PETERWAN, M. L.: Duns The physical and chemical properties of Ribosomes. Elsevier Publishing 60. 1964. p. 62.

8. MANS, R. J., et NOVELLI, G. B.: Arch. Biochem. Biophys. 94, 48 (1961).

9. STEELE, W. J., OKAMURA, N., et BUSH, H.: Biochim. Biophys. Acta, 87, 490 (1964).

10. LOWRY, H. O. , ROSEBROUGH, N. J.. FARR, A. L., et RANDALL. R. J. : J. Biol. Chem. 193. 265 (1951).

11. ASHWELL, G. : Datzs Methodes in enzymology. Vol. 3. Edit& par S. P. Cslowick et N. B . Kaplan. Academic Press Inc., New York. 1957. pp. 88 -90.

12. TSIAPALIS, C. M., HAYASHI, Y., $t ~ H E F U R K A . W.: Nature, 214, 358 (1967).

13. LITVAK, S., et AGOSIN, M. : Biochemistry, 7. 1560 (1968). 14. FLOWINI, J. R., et B ~ N E R , C. B.: Biechemistry, 4, 253

(1965). 15. EARL, 6 . N., et KORNER, A. : Biochem. J. 94,721 (1965). 16. HEYWBBD, S. M., DOUBEN. R. M., et RICH, A.: ROC.

Natl. Acad. Sci. 57, 1802 (1967). 17. FAST, P. G. : Mem. Entomol. Soc. Can. 37, 5 (1964). 18. PENMAN, S., SCHENEW, K., BECKER, Y., et BARNELL, Q.:

Prec. Natl. Acad. Sci. 49, 654 (1963). 19. WETTSTEIN, F. 0 . . STACHLIN. T.. et NOLL, H.: Nature,

197, 430 (1963).

Can

. J. B

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nly.

RICHARD ET CHAUDHARY: SYNTHESE PROTEIQUE BANS LES MUSCLES THORACIQUES 1237

20. WARNER, J. R., KNOPF, P. M., et RICH, A.: Proc. Natl. Acad. Sci. 49, 122 (1963).

21. HENNEY, H. R., et STORCK, W.: Proc. Natl. Acad. Sci. 51, 1050 (1964).

22. ZAK, R., NAIR, K. G., et RABINOWITZ, M.: Nature, 210 169 (1966).

23. RABINOWITZ, M., ZAK, R., KELLER, B., RAMPERSAD, Q., et WOOL. I. G. : Proc. Natl. Acad. Sci. 52, 1353 ( 1964).

24. AEPHNUS, K. F.: Biochemistry, 2. 341 (1965). 25. NAIW, K. G., ZAK, R., et RARINOWITZ, M.: Bio-

chemistry, 5, 2674 (1966). 26. KRETSINGEW, W. H., MANNER. G., GOL'LD, B. S., et

RICH, A.: Nature, 202, 438 (1964). 27. MAMMER, G., et GOUED, R. S.: Nature, 205,670 (1965).

28. LITVAK. S., MANCILLA. J., et AGOSIN, M . : C0mp. Biochem. Phys. 21, 441 (1967).

29. Fox, A. S., KAN, J., KANG, S. H., and WALLIS, B.: J. Bisl. Chem. 240, 2059 (1965).

30. ILAN, J., et LIPMANN, F.: Acta Biochem. Pol. XIII, 353 (1966).

31. ILAN. J.: J. Biol. Chem. 243, 5859 (1968). 32. SRIVASTAVA, U., et CHAUDHARY, K. D.: Arch. Int.

Physiol. Biochem. 77, 213 (1969). 33. LENGYEL. P., et WLL, D. : Bacterial. Rev. 33,264 (1969). 34. WETTSTEIN. F. D., et PENMAN S. : Biochim. Biophys.

Acta, 87, 525 (1964). 35. COLOMBO, B., F E L I C ~ T I , L., et BAGLIQNI, C.: Biochem.

Biophys. Res. Commun. 18, 389 (1965).

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