RRMMSSBB

H2 QUANTITATIVE NMRFOR WINES CARACTERISATION

JM FRANCONI

UMR 5536 / CNRS Université Victor Segalen

146 rue Léo-Saignat

33076 BORDEAUX CEDEX

RRMMSSBB

Spécifique Naturel Isotopique Fractionnement

S N I F

RRMMSSBB

LES INVENTEURS DU CONCEPT

SNIF NMR

G. J. MARTIN M.L MARTIN

RRMMSSBB SNIF NMR

REFERENCES

L.A.I.E.M EUROFINS

S. AKOKAM TRIERWEILLERF MABON

Fondamental research Economical valorisation

G. MARTIN

RRMMSSBB SNIF NMR

STABLE ISOTOPE

Définition: Stable isotope

P

N

P

P

PN

P

P

N

P P

P

nucleus

RRMMSSBB

Lo représente la quantité d ’isotope lourd

Le représente la quantité d'isotope léger

ISOTOPIC RATIO R = Lo / Le(en ppm)

Abondance isotopique A = Lo / (Le+Lo)

la déviation isotopique i = ((Ri - Rref) / Rref).1000

R i rapport isotopique d'une substance i

R ref rapport isotopique d'une référence

SNIF NMR

STABLE ISOTOPE QUANTIFICATION

RRMMSSBB SNIF NMR

In foods and beverages we can find the following isotopes:

isotopes abundance référence

H2 / 1H 0.015% H2O V.SMOW

C13 / C12 1.11% CaCO3 PDB

N15 / N14 0.37% N2 de l'air

O18 / 016 0.20% H2O V SMOW

STABLE ISOTOPES

RRMMSSBB SNIF NMR

Range of variation of isotopic composition

C13 H2

40 % 500 %<

70 X

C13 / C12 H2 / H1

RRMMSSBB SNIF NMR

Difference between deuterium and proton

NP P

proton deutérium

électron électron

RRMMSSBB

O

H

DO

H

HO

D

D

H2O HOD D2O

SNIF NMR

0.015% 2.25 ppm

WATER ISOTOPIC DISTRIBUTION

RRMMSSBB SNIF NMR

deutérium(D/H) distribution

Soleil

mercure

Vénus

La Terre

Mars

155ppm

16 000ppm

900ppm

espace 0.01ppm

RRMMSSBB SNIF NMR

(D/H) variation with latitude

130ppm

160ppm

RRMMSSBB

(D/H) diminue

(D/H) diminue

SNIF NMR

(D / H) variation with altitude and ocean distance

RRMMSSBB SNIF NMR

ISOTOPIC FRACTIONNEMENT MECHANISM

eauA B

EVAPORATION

Liquid phase Gaz phase

D / H liquide > D / H vapeur

RRMMSSBB SNIF NMR

A-[D] B-[D] + C

THERMODYNAMIC

FRACTIONNEMENT - ORIGIN

éthanol

RRMMSSBB SNIF NMR

A B + C

KINETIC

FRACTIONNEMENT - ORIGIN

AHAHAHADAD

AH BHBHBH

AD

BD

RRMMSSBB SNIF NMR

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT

IN THE VINE ?

RRMMSSBB SNIF NMR

GROUND

H2O

H2O évaporation

Different isotopicdistribution

H2O sol

CLIMAT

PLANT

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT

RRMMSSBB SNIF NMR

CLIMAT EFFECT

(D / H) élevé

high evaporation Lowevaporation

(D / H) faible

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT

RRMMSSBB SNIF NMR

SOL EFFECT

eaueau

clay sand

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT

RRMMSSBB SNIF NMR

PLANT EFFECT

Isotopicfractionmentgenerated by

metabolism reactions

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT

RRMMSSBB SNIF NMR

Inter molecular

Intra molecular

Isotopicfractionmentgenerated by

metabolism reactions

PLANT EFFECT

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT

RRMMSSBB SNIF NMR

Pour le deutérium

GJ Martin, ML MartinJournal de Chimie Physique1983,80,n°3

PLANT EFFECT

NATURAL SPECIFIC FRACTIONNEMENT

RRMMSSBB SNIF NMR

FRACTIONNEMENT

C4C4C4

C3

RRMMSSBB SNIF NMR

FRACTIONNEMENT

dC13Metabolic pathway

dDEnvironmental effect

Mais (C 4) Blé (C 3)

RRMMSSBB SNIF NMR

WINE CARACTERISATION

THE PLANT IS FIXED (vine C3)THE MOLECULE IS FIXED (wine ethano)

The differences are related to

CLIMAT

PROCESS

RRMMSSBB SNIF NMR

FRACTIONNEMENT

Isotopic distribution for ethanol

CH3 - CH2 - OH

CH3 - CH2 - OH

CH3 - CH2 - OD

CH3 - CH2 - OHCH3 - CHD - OH

CH2D - CH2 - OH

CH3 - CH2 - O

H

CH3 - CH2 - O

H

CH3 - CH2 - OH

RRMMSSBB

CH3 - CH2 - OH CH3 - CH2 - OH

Statistical distribution3 2 1

SNIF NMR

Natural distribution

Isotopic distribution for ethanol

RRMMSSBB SNIF NMR

MEASUREMENT

RRMMSSBB SNI F NMR

3 STEPS FOR WINE ANALYSIS

SAMPLEPREPARATION

NMRACQUISITION

POSTPROCESSING

RRMMSSBB SNIF NMR

SAMPLE PREPARATION

Rendement100%

Extraction-purification

WINE ETHANOL

Alcool 95%

DISTILLATION

RRMMSSBB SNIF NMR

MEASUREMENT TOOLS

MASS SPECTROMETRY

permet d ’obtenir le rapport isotopique global. Les produits à analyser sont préalablement transformés en H2O ou CO2

- sensible- précise

RRMMSSBB

QUANTITATIVE NMR

permet d ’obtenir le rapport isotopique de chacun des isotopomères

(molécule mono substituée sur un des sites moléculaires) La méthode permet de connaître la répartition isotopique sur chacun des sites moléculaires et de mesurer les fractions molaires des différentes espèces isotopiques

- peu sensible

SNIF NMR

MEASUREMENT TOOLS

RRMMSSBB SNIF NMR

QUANTITATIVE NMR

High magnetic field (400 Mhz) concentrated sample 15 mm tube diameter average with a big number of scans avoiding T1 saturation

-TA >= 5* T1- flip angle (90°,..)

broad band decoupling lock system (F19) avoiding NOE effect

SENSITIVITY IMPROVEMENT

RRMMSSBB SNIF NMR

Quantitative NMRdeutérium

Quadripolar momentum

électrons

NOE effect does not existnucleus

RRMMSSBB SNIF NMR

ETHANOL DEUTERIUM SPECTRUM

CH3—CH2--OH

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RELATIVE ISOTOPIC RATIO

R = 3 I II / I III

I II teneur isotopique du site méthylène

I III teneur isotopique du site méthyleDans une répartition statistique ---> R = 2

On constate un appauvrissement du site méthyle par rapportau site méthyléne

RRMMSSBB SNIF NMR

STATISTICAL ANALYSIS

SDM data

NMR Data

X Y Z

variable

X

Z

I2

Data Base

Individus

123

nY

Factorial analysisACP,AFD,réseaux de neurones

G1 G2

G3

External data(climat,geology,…)

RRMMSSBB SNIF NMR

WINE CHAPTALISATION CONTROL

Ethanolicfermentation

Wine sugar

distillation

wineÉthanolVine

(,sol,climat)

Sucrebetterave

canne

RRMMSSBB

(D/H en ppm)

sugar CH2D CHD

Beet(n=120) 90 (0.06) 122.4 (0.1)

grape (n=130) 101 (0.08) 131 (0.1)

cane (n=126) 109.6 (0.07) 119.9 (0.1)

G J Martin, M L MartinAnnual report on NMR Spectroscopy, Volume 31 1995

SNIF NMR

WINE CHAPTALISATION CONTROL

RRMMSSBB

sugar (%) T % en éthanol R chaptalisation(% sugar)

0 9.28 2.479 0.050.5 9.43 2.495 0.571 10.08 2.505 0.861.5 10.54 2.532 1.412 11.09 2.55 2.09

Détection 0.5%

SNIF NMR

WINE CHAPTALISATION CONTROL

RRMMSSBB

Wine isotopic composition is related to

- wine fermentation process- vine climatenvironment

Vin sec : influence négligeable du procédé de vinification car le mout initial est entièrement transformé

ex blancs de Loirenormal R= 2.522chaptalisé R =2.594

SNIF NMR

WINE CHAPTALISATION CONTROL

RRMMSSBB

Wine authentification

en O18, D, C13

SNIF NMR

RRMMSSBB

x

xx

x

x

r

rrr

R

?

WINE AUTHENTIFICATION

RRMMSSBB SNIF NMR

QUANTITATIVE NMR

PERPECTIVES :

Measurement sensitivity improvement

ERETIC (L Barantin, S Akoka)Magnetisation transfer (INEPT,DEPT)

Extention to other product

RRMMSSBB SNIF NMR

OTHER APPLICATIONS

RRMMSSBB SNIF NMR

ANETHOLES (natural et synthetic)

Axe éthylénique

Axe méthylique

Axe Aromatique

RRMMSSBB

VANILLINE

L lignineG guaïacol

N gousse de vanille

SNIF NMR

RRMMSSBB

NICOTINE

SNIF NMR

RRMMSSBB

Nicotine extraite de la feuille de tabac

SNIF NMR

RRMMSSBB

RRMMSSBB SNIF NMR

LES OUTILS DE MESURE - RMN

Elle est connue pour ses applications:

- Imagerie médicale (anatomique, diagnostique, fonctionnelle)

- Chimie structurale (élucidation des structures et conformation des macromolécules)

- Analyse quantitative

- faible sensibilité- grande spécificité- mise en évidence de faibles différences

RRMMSSBB SNIF NMR

LA RMN QUANTITATIVE

POST-TRAITEMENT DES SPECTRES

multiplication du signal d ’induction libre par une fonction exponentielle constante

correction de phase automatique

intégration entre des bornes définies

simulation et lissage des signaux

RRMMSSBB SNIF NMR

La mesure de la répartition isotopique du deutérium sur la molécule d ’éthanol informe sur:

- l ’environnement géo-climatique de la vigne (terroir).

- le procédé de vinification.

Détection de la chaptalisation et caractérisation de l ’origine des vins

RRMMSSBB SNIF NMR

LE FACTIONNEMENT NATUREL SPECIFIQUE

Il se produit aussi un fractionnement isotopique intra-moléculaire

(la répartition intramoléculaire du deutérium sur les différents sites s ’écarte d ’une répartition statistique)

RRMMSSBB

PERSPECTIVES:

Observation d ’autres molécules (lipides)

Mesure du SNIF du C13 par RMN QUANTITATIVE

les premiers résultats (B Zhang, S Akoka) sont encourageants

SNIF NMR

RRMMSSBB SNIF NMR

LA RMN QUANTITATIVE

OPTIMISATION DE LA RESOLUTION SPECTRALE

(Pour différencier des signaux voisins)

F(Hz)

F bande passante en Hz

A temps d ’échantillonnage du signal

N nombre de points(taille mémoire)

la résolution R = 1/Ale théorème de l ’échantillonnage impose2.F.A = N

Pour le deutérium par exemple F=600Hz N=16K R = 0.15Hz

RRMMSSBB SNIF NMR

LA RMN QUANTITATIVE

DEUTERIUM - CARBONE 13

Le C13 est un candidat moins bon que le deutérium pour l ’analyseisotopique par RMN quantitative

- Le T1 est élevé (S/B diminue)

- La large bande de fréquence rend le découplage Incomplet et difficile à réaliser

- Il existe un effet NOE résiduel

-La gamme de variation des rapports isotopiques est réduite

RRMMSSBB SNIF NMR

JM FRANCONIUMR 5536 / CNRS Université Victor Segalen146 rue Léo-Saignat33076 BORDEAUX CEDEX