R.Mastronicola, S.Cortese, E. Beulque , V.Gillon, G.Faure ,JL Merlin, G.Dolivet Institut de cancérologie de Lorraine & CHRU Nancy

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Tumeurs des VADS

■ Contexte

■ Patients souffrant de carcinome épidermoïde des VADS ■ 14 000 nouveaux cas par an ■ Facteurs de risque : tabac, alcool, HPV

■ Principale cause de décès : développement de métastases

■ Place importante de la chirurgie dans le traitement des cancers VADS

■ Effet de la chirurgie sur la dissémination de cellules tumorales?

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Epithelial-mesenchymal transition(EMT)

■ The epithelial–mesenchymal transition. EMT is a morphogenetic process in which epithelial cells lose their characteristics and gain mesenchymal properties during embryogenesis and during progression of cancer. Carcinoma cells acquire a mesenchymal-like state in order to facilitate their migration and invasion. The EMT process is induced and regulated by effectors such as growth factors (TGFβ), as well by hypoxia. It is characterized by loss of epithelial markers (E-cadherin, cytokeratins, occludin, and ZO-1), gain of mesenchymal markers (N-cadherin, vimentin, and fibronectin) and high expression of MMPs, which help cancer cells grow and spread.

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Freire-de-Lima L.Sweet and sour: the impact of differential glycosylation in cancer cells undergoing epithelial–mesenchymal transition. Front. Oncol., 2014

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Molécules médiatrices spécifique d'organe

■ Un gène particulier peut être responsable d'effets multiples

Des gènes différents peuvent contribuer à l'acquisition d'une caractéristique particulière.

■ Il a été décrit des signatures d'expressions géniques associées aux organes spécifiques de métastases dans des modèles expérimentaux,

-> validés dans le cancer du sein humain.

■ La comparaison des lignées parentales de cellules cancéreuses aux lignes métastatiques organotrophes a identifié des gènes médiateurs de métastases osseuses, pulmonaires et cérébrales.

Gene mediating organ specific breast cancer metastasis. Breast cancer genes promoting organ-specific metastasis to bone, lung and brain have been identified.

Lorusso, G. and C. Ruegg "New insights into the mechanisms of organ-specific breast cancer metastasis." Seminars in Cancer Biology 22(3): 226-233 2011

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Lorusso, G. and C. Ruegg "New insights into the mechanisms of organ-specific breast cancer metastasis." Seminars in Cancer Biology 22(3): 226-233

Complexité de la circulation des CTC/DTC

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Signification des marqueurs cellulaires

■ Signalisations

■ Migrations

■ Adhésion cellule-cellulaire

■ Division cellulaire

■ Angiogenèse

■ Cancérisation

■ CK 17, 18, 19, EGFR, Ep-CAM, SCCA, Elf3, EphB4, CEA6

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Processus métastatique lié à l’acte chirurgical ?

■ Cellules tumorales circulantes (CTCs)

■ Cellules tumorales disséminées (DTCs)

■ Cellules tumorales restantes après l’acte

■ Intérêt diagnostique

■ Intérêt pronostique

■ Techniques adaptées (RT-PCR, CellSearch etc..)

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Contexte

■ Recherche de marqueurs prédictifs d’évaluation du risque métastatique (dissémination tumorale)

■ Mise en place d’une étude clinique ■ Echantillons analysés : contenu de drain de Redon

■ Objectifs ■ Présence de DTCs dans le champ opératoire cervical?

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Patients et Méthodes : étude Redon

■ Étude non interventionnelle (Juillet 2012 - Août 2013)

■ 14 patients inclus

■ Information et recueil de non opposition

■ Bénéficiant d’un évidement cellulo-ganglionnaire cervical

■ 12 pour un carcinome épidermoïde de la tête et du cou ■ Stade tumoral: 6T2N2xM0, 3T3N3M0, 3T4N3M0

■ 2 pour une adénopathie métastatique cervicale (adénocarcinome d’origine éthmoïdale et mammaire)

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Patients et Méthodes

■ Analyse du contenu des drains aspiratifs (Redon)

■ Drains posés en région cervicale en fin d’intervention

■ Prélevés 4 jours après la chirurgie et analysés dans les 3 jours

■ Marquage immunomagnétique et fluorescent (CellSearch)

■ Marqueurs utilisés : ■ DAPI ■ EpCAM ■ CK 8,18 ,19 ■ CD 45

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Matériels et Méthodes

Drains collectés dans les 3 jours suivant l’intervention

Analyse par technique de cytométrie (Veridex®)Étape de

filtration

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Matériels et Méthodes■ Cellsearch®

1. Sélection et enrichissement 2. Marquage fluorescent

3. Détection

D’après Alix-Panabières et al .Trends in Molecular Medicine, 2010

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Résultats

■ 9 patients positifs / 14 (69%)

■ ≥ 2 DTC/7,5ml d’échantillon) ■ DTC/7,5ml : 3-2094

■ Détection de cellules tumorales disséminées ■ Carcinome épidermoïde ■ Adénocarcinome

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Résultats

■ Cellules tumorales disséminées ■ Morphologie cellulaire différente selon la nature

histologique ■ Intensité de marquage variable ■ Taille variable

Carcinome épidermoïde Adénocarcinome

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Corrélation avec les emboles lymphatiques

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Discussion 1

■ Cellules tumorales retrouvées dans les drains ■ Échantillons de drains peuvent être analysés par Cellsearch®

■ Différences morphologiques entre les deux types cellulaires ■ Carcinome épidermoïde / adénocarcinome

■ Cellules tumorales retrouvées à proximité du site opératoire ■ Dissémination de cellules à distance (organes secondaires)

depuis la tumeur primaire ■ Emboles lymphatiques? ■ Impact des drains aspiratifs?

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Discussion 2

■ Lien établi entre la présence de cellules et les

conséquences cliniques? ■ Nombre réduit de patients

■ À l’avenir : ■ Effectif élargi

■ Drain de Redon : déchet? Prélèvement biologique?

■ Marqueurs plus spécifiques ! sous populations cellulaires

■ Signification ■ Enjeu de la prise en charge du patient?

■ Marqueur de l’efficacité des traitements peropératoire?17

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Conclusion étude Redon

■ Présence de cellules tumorales au niveau du site opératoire quelques jours après la chirurgie

■ Recherche des marqueurs spécifiques dans les CE VADS

■ Rôle des emboles lymphatiques?

■ Evolution Technologie CellSearch ou autre?

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Etude CTC : Contexte

Les CTCs sont des cellules tumorales issues de la tumeur primitive détectées dans le sang (recirculantes?)

■ Spontanément ■ Après chirurgie

■ Valeur pronostique?

■ Potentiel métastatique?

■ > 5 CTC 7,5 ml mauvais pronostique

■ Différents phénotypes de CTC ( quiescents , niches, organes)

Malignant characteristics of circulating tumor cells and corresponding primary tumor in a patient with esophageal squamous cell carcinoma before and after surgery.

Ren C et Al. Cancer Biol Ther. 2011 Apr 1;11(7):633-8. Epub 2011 Apr 1.

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Contexte

▪ Comment détecter la présence de CTC dans les cancers des VADS?

▪ CellSearch, cytométrie en flux, RT- PCR.

▪ Comment déterminer si il existe un lien entre l’acte chirurgical et le taux de CTC?

▪ Quelles perspectives thérapeutiques en fonction des résultats?

Xi et al.2007: Optimal Markers for real-time quantitative reverse trascription PCR detection of circulating tumor cells from melanoma, breast, colon, esophageal,head and neck, and lung cancers. Clinical Chemistry 53:7 1206-1215.

PROTOCOLE CTCs

▪ Objectif principal (40 patients)

▪ Détermination de l’impact chirurgical sur le taux des CTCs en pré, per et post chirurgie de CEVADS de stade III et IV

▪ Objectif secondaire

▪ Comparer 2 techniques RT-PCR (Sybr®Green) CellSearch (Veridex®)

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Patients et Méthodes

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Marqueurs testés

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▪CPP

▪ 40 patients inclus : 28 pts Stade Iva 5 pts Stade IVb 5 pts Stade III 2 pts Stade I

parmi les patients 3 ont refusé la chirurgie et 3 avec antécédents de cancer

PROTOCOLE CTCs

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Résultats bruts EphB4

-300

0

300

600

900

1200

EPHB4_1 EPHB4_2 EPHB4_3

Series1Series2Series3Series4Series5Series6Series7Series8Series9Series10Series11Series12Series13Series14Series15Series16Series17Series18Series19Series20Series21Series22Series23Series24Series25Series26Series27Series28Series29Series30Series31Series32

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Résultats bruts : PVA

-60

-30

0

30

60

90

120

PVA_1 PVA_2 PVA_3

Series1Series2Series3Series4Series5Series6Series7Series8Series9Series10Series11Series12Series13Series14Series15Series16Series17Series18Series19Series20Series21Series22Series23Series24Series25Series26Series27Series28Series29Series30Series31Series32

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Profils variables de variation du taux de CTC

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Variation de marqueurs significative en RT-PCR

■ Ep-CAM : antigène de différenciation pan-épithélial. Son expression est retrouvée dans nombreux carcinomes

■ CK18 : cytokératines impliquées dans l’organisation du cytoplasme et les mécanismes de communication cellulaire

■ CEA : glycoprotéine impliquée dans l’adhésion cellulaire.

■ EphB4 : récepteur type tyrosine kinase maturation et remodelage des vaisseaux, croissance et

migration de cellules tumorales variation significative EphB4 p 0.0003 CEA p 0.006 CK18 p 0.0011 EP-CAM p 0.0299

Non significative Elf 3 p 0.0764 CK19 p 0.2525 EGFR p 0.2158 SCCA p 0.6551 PVA p 0.0542

Résultats au CellSearch

Présence d’une CTC. Le noyau est coloré en rouge, avec EGFR en vert. Elle est –CD45 +CK 8, 18,19 +DAPI.

EGFR p value:0,01

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Conclusion

■ La détection de la variation des CTCs au décours de l’acte chirurgical montre des résultats a été significative et spécifique

■ Les variations sont différentes selon les marqueurs testés (CK 18, CEA, EphB4,Ep-CAM) et les patients

■ La variation de l’EGFR au cellsearch pourrait traduire la variation de la masse tumorale totale

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Perspectives

■ Développer des études prospectives diagnostiques et pronostiques des CTCs/DTCs ( protocole CTC VADS 2017)

■ Adapter le traitement médical péri opératoire (thérapies ciblées pour EphB4+EGFR cancer poumon XL 647) ■ Pietanza et all Phase II study of the multitargeted tyrosine kinase inhibitor XL647 in patients with non-small-cell lung cancer. J Thorac Oncol. 2012 May;7(5):856-65.

■ Association des thérapies ciblés personnalisées

■ Poursuivre les travaux de recherche sur la dissémination cellulaire per opératoire (lit opératoire, berges?)

■ Destruction spécifique des cellules tumorales disséminées?

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Réalité augmentée dans la traque des résidus tumoraux tissulaires en per opératoire

Lina BOLOTINE, Gilles DOLIVET

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Axes de recherche Dpt chirurgie oncologique ICL

■ Deux axes consensuels ■ Réalité augmentée ■ Photodiagnostic per opératoire (fluorescence) ■ Chirurgie assistée (Robot) ■ Navigation ■ Chirurgie robotique

■ Biologie tumorale périopératoire

■ Protocoles de recherche clinique multidisciplinaires

Réalité augmentée biologie

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Utilisation de la fluorescence

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Image guided surgery in the management of head and neck cancer

Invisible near-infrared (NIR) fluorescent free or conjugated agents

NIR fluorescent dyes ___________________________________________________________ Indocyanine green Cy5.5 Cy7 Irdye 800 CW QuantumDots (nanoparticles)

M.W. weight (Da) 320 1069 720 45-200 NA

λexc (nm) 779 675 794 775 Broad spect.

λem (nm) 806 695 775 796 808

Toxicity Low Low Low Low ND

Clearance Hepatic Hepatic Hepatic Hepatic Hepatic

Characteristics of NIR fluorescent dyes

NIR dyes Aim Detection rate __________________________________________________________________ Cetuximab IRDye 800 First in humans Tumor/background ratio detection microsc 5.2 (LUNA imagingsystem) fragments

Anti-EGFR nanobody Detection & resection Tumor/background ratio IRDye 800 orthotopic tongue tumors (FLARE)

ICG-HSA SLN intraoper mapping Fluor signal/ in H&N patients surrounding tissue 8.7 (miniFLARE) ICG SLN mapping in recurrent Signal/background 9.9 nasopharyng carcinomas (SPY system)

Preclinical and clinical studies of NIR fluorescence in H&N cancers managment

Iqbal H, 2016

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Aptamers as targeting agents Aptamers are oligonucleic acids or peptide molecules that bind a

specific target molecule. Aptamers are generated using Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX)

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Aptamers as targeting agents

Resu l t s : Ap tamer se lec t i on and i n v i t ro characterisation

RNA aptamer has been selected by cell-SELEX, using HEK293-KDR cells as target.

The cell target of this aptamer is a membrane receptor which can be internalized.

Aptamers are coupled:

with alexa Fluor 647 for cytometry study with alexa Fluor 546 for microscopy study

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Aptamers as targeting agents Flow cytometry experiments

Screening of aptamer targeting for several cell lines:

Cell line % labeled cels MCF-7 92 FaDu 82 U87 (negative control) 1 …

The selected aptamer binds with a high rate to MCF-7 and FaDu cells

M1

M1

U87

FaDu

MCF -7

Violet : Apt -alexa 546; Green : sytox green; Blue : control oligoNT

M1

M1

M1

M1

U87

FaDu

MCF -7

Violet : Apt -alexa 546; Green : sytox green; Blue : control oligoNT

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FaDu

Microscopy studies

Aptamer-alexa 546

Scramble oligoNT-alexa 546

U87

Aptamers as targeting agents

Aptamers target FaDu Aptamer is internalised in the cells

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Aptamers as targeting agents

The selected aptamer is able to be uptaken by cancer cells

Studies are in progress to link aptamer to nanostrauctures loaded with NIR fluorophore

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43

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CHIRURGIE de DEMAIN ?

■ Moins de chirurgie conventionnelle

■ Développement de la chirurgie mini-invasive, laparoscopie et chirurgie robot assistée

■ Nécessité de confronter les techniques d’imagerie avec la (les) réalité (s) augmentée (s)

■ Nécessité de développer des salles HYBRIDES

■ Bloc opératoires dédiés à la chirurgie oncologique

Le futur des blocs opératoire de chirurgie oncologique?

Gilles DOLIVET le 15 Octobre 2016